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Mecanismos patogénicos de

Escherichia coli

Dr. Fernando Navarro García


1). Nataro JP and Kaper JB,
Clinical Microbiology
Reviews, 11:142-201 (1998)
2). Kaper JB, Nataro JP and Mobley HLT
Nature reviews 2:123-140 (2004)
Escherichia coli

Familia Enterobactericeae
Tribu Escherichia
Bacilo Gram Negativo
Anaerobio facultativo predominante en colon
Escherich 1884
Serotipificación Kauffman 1944
Tamaño de su genoma 4 X 109 pb
Escherichia coli Patogénica
Síndromes clínicos

Infección del tracto urinario

Meningitis/sepsis

Enfermedad entérica (diarrea)


Escherichia coli Diarreogénica

1. E. coli enterotoxigénica (ETEC)


2. E. coli enteropatogénica (EPEC)
3. E. coli enterohemorrágica (EHEC)
4. E. coli enteroagregativa (EAEC)
5. E. coli enteroinvasiva (EIEC)
6. E. coli con adherencia difusa (DAEC)
Patogenicidad de Escherichia coli
Diarreogénica
Serotipos característicos
de Escherichia coli diarreogénica
Características
clinicoepidemiológicas de E. coli
Categoría Síndrome Distribución Edad de
clínico geográfica incidencia
ETEC Diarrea acuosa Países en Niños, viajeros
desarrollo adultos
EPEC Diarrea acuosa Países en Bebes menores
desarrollo de 6 meses
EIEC Disentería Mundial Niños mayores
de 1 año,
preescolares
EHEC Colitis Países en Niños de 2 a 7
hemorrágica, desarrollo, años
HUS Latinoamérica
EAEC Diarrea Países en Principalmente
persistente desarrollo infantes
DAEC Diarrea acuosa Desconocido Preescolares
Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune system
Lippincott Williams and Wilkins
Diagnóstico fenotípico

•Ensayo de adherencia con células HEp-2

Diagnóstico de EPEC, DAEC y EAEC

•Se observan tres patrones de adherencia

•Adherencia localizada (LA) BFP


•Adherencia agregativa (AA) AAF/I y II
•Adherencia difusa (DA) F185
Adherencia Localizada (LA)
Adherencia Agregativa (AA)
Adherencia Difusa (DA)
Fimbrias de adhesión
Factores de colonización de E. coli

CFA/III fimbriae of ETEC (5-7 nm) CFA/I fimbriae of ETEC (5-7 nm) P pili of UPEC (10 nm)

CS3 fibrillar structure of ETEC (2-3 nm) BFP of EPEC (>10 µm) Thin, coiled aggregative curli fibres
Virulencia

Estrategia de E. coli
•Colonización de la mucosa
•Evasión de las defensas del huésped
•Multiplicación
•Daño a los tejidos del huésped

Principales Causas de Diarrea


•Producción de enterotoxina (ETEC y EAEC)
•Invasión (EIEC)
•Adherencia intima (EPEC y EHEC)
Toxinas y efectores de E. coli
Patogénica (1/2)
Toxinas y efectores de E. coli
Patogénica (2/2)
Versatilidad del genoma de E. coli

Plasmidos relacionados con virulencia


•Fimbrias
•Toxinas
•Genes reguladores
•Moléculas de adhesión
Islas de patogenicidad
•Locus de adhesión y esfacelamiento (EPEC y EHEC)
Elementos individuales
•Transposones (tal como ST)
•Codificado en fagos (tal como Shiga toxin)
Elementos genéticos móviles en
E. coli patogénica
Mecanismo de patogenicidad en
E. coli diarreogénica

Categoría Plásmido de Interacción Toxinas


virulencia con mucosas
ETEC 60 Md CFA LT, ST
EPEC 60 Md BFP, EspC*
Intimina
EIEC 140 Md IPAs ShET-2
EHEC 60 Md Intimina ShET 1 y 2
EAEC 65 Md AAF EAST1, Pet
DAEC 60 Md F1845, OMP Ninguna
AIDA-1

Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune system
Lippincott Williams and Wilkins
Factores de Virulencia de E. coli
(1/2)
Factores de Virulencia de E. coli
(2/2)
ETEC
•Elabora al menos un miembro de los dos grupos de
enterotoxinas conocidas como ST y LT (termoestable y
termolábil), estimulan al intestino y provoca excesiva
secreción de fluidos.

•Involucrada en brotes epidémicos transmitidos por agua


ó alimentos, alrededor de 79,420* casos por año en EU.

•Características clínicas : diarrea acuosa o sanguinolenta,


dolor abdominal con o sin fiebre, nauseas.

•Enfermedad se desarrolla de 1 a 3 días del contacto con


la bacteria, usualmente por un periodo de 3 a 4 días.

*http://www.cdc.gov
Factores de Colonización de ETEC

•CFAs (CS, coli surface antigen) cfa (I ) a b c d


•Codificados en plásmidos
Nombre original CS Diámetro (nm)
CFA/I* CFA/I 7
CSI* CSI 7
CS2* CS2 7
CS4* CS4 6
CFA/III+ CS8 7
Longus+ CS21 7
CS3♠ CS3 2-3
CS5 ♠ CS5 5
*Rigids rods, + Bundle-Forming, ♠ Fibrillar
ETEC

ETEC

Enterocito Diarrea acuosa


ETEC

Toxina Termolábil (LT)


•Tóxinas oligoméricas
•LTI expresada por cepas patógenas para
humanos y animales.
•80% de identidad con CT
•Proteína de 86 kDa
•Gen elt reside en plásmido
•subunidad A de 28 kDa LT1
•Cinco subunidades ídénticas B de 11.5 kDa
•LTII Animales, rara en humanos
•57 a 55% de identidad a LTI y CT
•Gen etx
Mecanismo de Acción de LT
Cl- NaCl

Células Células
de las absorbentes
criptas

Fosforilación
A de proteínas
B
Cinasa A

NAD
ATP cAMP
Proteínas G ADPr
GDP β GTP
α γ
α adenilato ciclasa
GTP “activada”
Toxina termoestable (ST)

•Toxinas monoméricas con residuos de cisteínas


•Genes encontrados en plásmidos
•STa: ETEC, Y. enterocolítica, V. cholerae No-O1
•Variantes STIa ó STp y STIb o STh
•Idénticos en 13 residuos necesarios para Cl- NaCl

enterotóxicidad
•Incrementa niveles de GMPc STa
Receptor/
Guanilate
cyclase C
•STb: Encontrada solo en ETEC
GTP cGMP G-kinase
•Induce daño histológico
Enterocito
Pruebas en ETEC

Detección de LT Detección de ST

Células Y1 adrenales Asa ligada de conejo


EPEC

Patotipo productor de diarrea infantil en países en desarrollo.


Histopatológicamente lesión A/E “attaching and effacing”
•Adhesión intima Bacteria y membrana celular.

Se producen cambios en el citoesqueleto con acumulación


de actina.
Estructura semejante a un pedestal.
•Hafnia alvei, Citrobacter rodentium, EHEC.
Las lesiones A/E contiene altas concentraciones de
filamentos de actina polimerizados (F-actina) además de
proteínas como talina, ezrina y cadenas ligeras de miosina.
Genes de Patogenicidad

LEE
Cromosoma escRSTU escCJ escV escN tir orfU eae espADB

Type III secretion apparatus

EPEC EAF
bfp A G B C U perA B C EAF probe
pilin OMP
Modelo de patogénesis de EPEC

1. Adherencia localizada
• EAF, BFP
2. Transducción de señales
3. Adherencia intima
Adherencia localizada de EPEC
Isla de patogenicidad LEE

 Secreción:
Secreta cinco proteínas: EspA, EspB, EspD y EspF
(sistema tipo III)
Están codificadas en una isla de patogenicidad de 35.6
kb llamada LEE
Tir (receptor para intimina), adhesina de EPEC,
codificada dentro de LEE
EspA, EspD y EspB forman un translocón
Sistema de secreción tipo III en
EPEC
Señales de transducción EPEC

Isla de patogenicidad LEE 35 kb


Proteínas del sistema de secreción tipo III (sec, esp)
EspA, EspB, EspD, Intimina
Aumento de Ca+2 intracelular en células epiteliales
Fosforilación de proteínas (PKC y Miosina)
•aumenta la permeabilidad de la uniones estrechas
intracelulares

Fosforilación de tirosina Hp90 es parte de la lesion


A/E y su distribución se presenta bajo la bacteria
adherida, en la parte superior del pedestal.
Señales de transducción EPEC
Adherencia Intima EPEC
•Intimina, proteína de membrana externa de 94
a 97 kDa.
•Genes eae presentes en EPEC, EHEC, C.
Rodentium y H. alvei.
•Región Carboxilo terminal, sitio de unión al
receptor en la célula epitelial Tir.
•Resultados con voluntarios demostraron que la
intimina participa activamente en la
patogenicidad.
•Podría jugar un papel preponderante en la
inmunidad a la reinfección.
Adherencia Intima EPEC
EPEC Lesión A/E
Pedestales: EPEC Lesión A/E
Proteínas EPEC

Esenciales para el fenotipo A/E


EspA 25 kDa
EspB 38 kDa
EspD 40 kDa

Proteína EspC
Auto transportadoras, sistema de secreción
Tipo IV
MUTACION EN GEN NO AFECTA 1998
Señales de transducción
Daño A/E
Cualquier otro fenotipo patogénico
Proteína EspC
•espC marco de lectura abierta con 3,924 pb.

•Molécula precursora de 140 kDa, secretada por el


sistema tipo V como una proteína activa de 110 kDa.

•No está presente en LEE

•PAI espC, G-C (40.5%)


Motivo de serina proteasa EspC

MNK GGDSGSG

Péptido señal Dominio pasajero Dominio β

Tomado de : Stein et al. 1996. J. Bacteriol. 178:6546-54


Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.
Enterotoxicidad de EspC

espC

pJML174

Tomado de : Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.


EspC de EPEC

•Produce efectos citotoxicos sobre células


epiteliales.
•Se une y degrada a fodrina in vitro.
•EspC necesita ser internalizada para producir daño
al citoesqueleto, la internalización se lleva a cabo a
las 8 horas.
•El daño al citoesqueleto producidos por EspC se
debe probablemente a su motivo de serín proteasa.
•EspC se internaliza por receptores en la membrana
de las células epiteliales, aunque la naturaleza del
receptor se desconoce.
Efectos de EspC en células
epiteliales
Citotoxicidad Citoesqueleto Internalización Transfección

d
e

r
Regulación de factores de
virulencia de EPEC
EHEC
Colitis hemorrágica (HC)
•Dolor abdominal, diarrea acuosa, diarrea con sangre y
fiebre escasa.
•Brote de enfermedad por alimentos en 1983 asociado
con hamburguesas mal cocidas.
Sindrome urémico hemolítico (HUS)
•Diarrea inicial aguda indistinguible de HC.
•Falla renal aguda, trombocitopenia, anemia hemolítica
Escherichia coli O157:H7
•SLT (Shiga like toxin) “SLTEC”
•Verotoxina “VTEC”
•Lesion A/E

EHEC
Genes de patogenicidad

Cromosoma
EHEC
Stx
EAST1
Enterohemolisina
OMP intimina 94 a 97 kDa
Plasmido
60 MDa
Genoma de EHEC secuenciado
Shiga like toxin
Principal factor de virulencia de EHEC
•Stx1 y Stx2
•Toxina identica a Stx1 de S. dysenteriae I
•Estructura A-B clásica de la familia de toxinas Shiga
•Subunidad B se une a un receptor glicolipido (Gb3).
Subunidad A
•Peptido A1 contiene la actividad enzimática.
•Se trasloca a el citoplasma, actua en la subunidad
ribosomal 60S (N-glicosidasa adenina de 28s rRNA).
Efectos
•Hemorragia y edema en la lamina propia.
•Necrosis focal e infiltración de neutrófilos.
•Se infiltra en torrente sanguíneo.
•Inflamación de células endoteliales glomerulares y
deposición de plaquetas y fibrina.
EHEC citotoxicidad in vivo e in
vitro

Síndrome disentérico Monocapa de células Vero


Epidemiología
Reservorio
•Ganado vacuno, ovejas, carneros, gatos, perros,
gallinas, cerdos.
•Anualmente se reportan 200,000 casos y 250 muertes
por EHEC.

Transmisión
Periodo de incubación de 3 a 4 días.
•Alimentos y bebidas.
•Persona a persona.

Diagnóstico
•Aislamiento de la bacteria en agar SMAC.
•Serotipificación
•ELISA
•Detección de stx, fliC, eae, pO157
EAEC
Definición
•No secreta enterotoxina LT o ST.
•Patrón de adherencia agregativo (AA).

Patogénesis
•Aumenta la secreción de moco.
•Localización de la bacteria entre el moco y la célula.
•Toxina PET (plasmid encoded toxin).
•Fimbrias AAF/I y AAF/II

Modelo
•Colonización y localización inicial.
•Aumento en la secreción de moco.
•Elaboración de citotoxina PET.
Detección y Diagnóstico

Patrón de adherencia agregativa


•Aislamiento del microorganismo.
•Ensayo en células HEp-2.
•Serotipos asociados a EAEC.

Plásmido
•Sondas de DNA.
•PCR.
Adhesión de EAEC en intestino
Structural subunit of the fimbria
Role of the fimbria on the adhesion to
intestinal mucosa
Daño a celulas epiteliales
por EAEC
Factores tóxicos EAEC

 Enterotoxina 1 termoestable de EAEC (EAST1)


produce incremento en la secreción de iones,
codificada en el pAA, 6 kDa

Pic (proteína implicada en la colonización intestinal)


116 kDa, motivo de serín-proteasa, mucinasa,
cromosomal
Pet (toxina codificada por plásmido)
Efecto enterotóxico de EAST1
PET

 Toxina de 104 kDa


 Codificada por el plásmido pAA en la bacteria
 Posee un motivo serín-proteasa (GDSGSP)
Sistema de secreción tipo V
(proteínas autotransportadoras)
 Miembro de la subfamilia SPATE
(serín-proteasas autotransportadoras de
Enterobacteriaceae)
Alignment of Pet protein with its closest
homologs, EspP, EspC, and SepA

Dr. Fernando Navarro-García


Pet - Plasmid encoded toxin
Serine protease domain

Signal α-domain β-domain

Cleavage Cleavage

Fernando Navarro Garcia


AUTOTRANSPORTER PROTEIN

Signal peptidase Outer membrane protease

RGD motif
Serine protease
Extended N- active site Walker
terminal signal (GDSGSP) RGD motif A box
sequence

(AXB)
C-terminal motif
Signal peptidase ([Y/W/V/I/f]-X-[F/W])
recognition site
Autoproteolysis antiparallel β-sheet structure
Role in virulence

N-terminal α-domain β-domain


signal sequence

Dr. Fernando Navarro-García


Type IV Secretion
A B C
External milieu

Outer
membrane
β-barrel
formation
Translocation of α-domain

Periplasm
Cleavage of signal
sequence
Inner
membrane
Cytoplasm
GSP machinery
Polyprotein
Fernando Navarro Garcia
Morphologic effect of Pet protein on
epithelial cells

Dr. Fernando Navarro-García


Proteolytic activity of Pet protein on
zymogram gel
pCEFN1
pCEFN1 – + PMSF

203
116
Pet
83

48

33
28

SDS-PAGE Zymogram Dr. Fernando Navarro-García


Construction of Pet S260I mutant
α-domain β-domain β-domain N-terminal
A Role in virulence?
B sequence
N-terminal Autoproteolysis?

signal sequence Native Pet


1019NLNKRMGDLR...
Serine protease active site C- Pet S260I mutant
1019NLNKRMGDLR...
(GDSGSP) Native Pet terminal
antiparallel β-sheet structuremotif
260

(GDIGSP) Pet S260I mutant


D
et

C
60I
60I

eP

1.6
S2
S2

tiv

N ativ e Pe t p ro te in
t
t

Na
Pe
Pe

1.4 S 260I m u tan t

1.2

proteinase K

O.D . (280 nm)


1.0

0.8

0.6
Pe t p rotein
0.4

0.2

0.0

0 20 40 60 80 100 120 140

Fractio n N o .

Dr. Fernando Navarro-García


Enterotoxic and Cytotoxic Activities of
Pet Protein
Hep-2 cells HT29 cells
4

3
A
Pet
∆PD (mv)

-1

200 B
∆Isc (µA/cm 2)

100
PetS260I

0
1

0I
t
RT

Pe

26
PO

tS
Pe
pS

Fernando Navarro García


Both Pet and its mutant are internalized
but only Pet produces cytoskeletal damage

Untreated Hep-2 cells Hep-2 cell cytoskeleton


stained with anti-Pet visualised by FAS

Pet-treated Hep-2 cells


Pet-treated Hep-2 cells

S260I-treated Hep-2 cells S260I-treated Hep-2 cells

Dr. Fernando Navarro-García


Fodrin is cleavaged by Pet and occurs within
11th repetitive unit
Espectrinα II 109 kDa
(Fodrin)
(Fodrin)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
NH2 COOH
809 AAs 1529 AAs
GST 8 9 10 11 12 13 14
Fodrin-GST NH2
Fodrin COOH
A
( 8-14)
72 kDa 37 kDa

1 h in

30 in
1 hmin
30 in
m

m
m
M

4h
4h
6h
8h

8h
2h
2h

6h
10
10
W
C

C
250

0
0

150
100
75

50
37

25
B SDS-PAGE Immunoblot C
Inmunocolocalization of Pet, fodrin
and actin within HEp-2 cells

A B C D

E F G H
20 µm
Portada mostrando la interacción de Pet y
fodrina dentro de células epiteliales
Pet
Efectos enterotóxicos
•En preparaciones de yeyuno de rata
4Incremento en la secreción de iones por las células
epiteliales (cámara de Ussing, ↑ ISC y ↑ PD)
4 Acortamiento de las vellosidades
4 Exfoliación de células

4 Liberación de moco

Efectos citotóxicos
4 Liberación de los contactos focales
4 Redondeamiento de la célula

4 Contracción del citoesqueleto

4 Pérdida de las fibras de estrés


Ambos efectos no son producidos cuando se bloquea la
actividad de serín-proteasa
EIEC
Definición
•Bioquímica, genéticamente, patológicamente
relacionada a Shigella spp.
•Invasión del epitelio colónico.

Invasividad
•Mediada por pInv 140 MDa
•Locus cromosomal mxi y spa aparato de secreción tipo
III.
•IpaA,B,C,D necesarias para el fenotipo de invasividad.
•VirG provoca nucleación de los filamentos de actina y
movimiento a través del citoplasma.
EIEC genes de virulencia

EIEC
Cromosoma
Plasmido
140 MDa

SS tipo III
EIEC modelo de patogénesis

•Penetración de la célula
epitelial.
•Lisis de la vacuola endocítica.
•Multiplicación intracelular.
•Movimiento direccional a
travéz del citoplasma.
•Traslocación a células
adyacentes.
Polimerización de actina por
bacterias
Diagnóstico EIEC

Prueba de Sereny.
Sonda pMR17 derivado
pInv.
Sonda ial derivada pInv.
PCR ial.
ELISA para detectar
ipaC.
Fimbrias de adhesión