Universidad San Sebastián

Facultad de Odontología
Sede Valdivia

BIOQUÍMICA_ODON0007
TRABAJO PRÁCTICO
DETERMINACION DE GLUCOSA

MÉTODO DE GLUCOSA OXIDASA/PEROXIDASA

(GOD/PAP)

INTRODUCCIÓN
Los métodos enzimáticos para cuantificar glucosa han ganado popularidad
gracias a la mayor especificidad y simplicidad de los análisis. Uno de estos, es el
que utiliza una reacción acoplada a 2 enzimas: Glucosa oxidasa (GOD) y
Peroxidasa (PAP). La primera actúa directamente sobre el sustrato (glucosa)
originando ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. Este último, por acción de la
peroxidasa, libera un oxígeno el cual interactúa con un aceptor de oxígeno, dando
lugar a un cromógeno que puede cuantificarse fotométricamente y cuya
absorbancia es directamente proporcional a la concentración de glucosa.

FUNDAMENTO

GOD
Glucosa + O2 + H2O ⎯⎯⎯⎯⎯> ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol ⎯⎯⎯⎯> 4-(p-benzoquinonamonoimino)-
fenazona + 4H2O

MUESTRA

Utilizar de preferencia suero fresco no hemolizado o plasma heparinizado.

VALORES DE REFERENCIA

Suero 70 - 105 mg/dl (ayuno)

PROCEDIMIENTO

1.- Rotular 2 tubos de ensayo: B (blanco) y X (muestra)

2.- Adicionar 1 ml de solución reactiva a todos los tubos.

3.- Preincubar la solución reactiva por 2-5 min a 37ºC

4.- Agregar 10 μl de agua al tubo B y 10 μl de muestra al tubo X y mezclar sin

sacar los tubos del baño.

5.- Incubar por 10- 15 min a 37ºC (advertencia: cualquier variación de la

temperatura durante la incubación puede afectar en forma importante el resultado)

6.- Dejar enfriar 5 min a temperatura ambiente

7.- Leer la absorbancia contra el blanco reactivo a 515 nm (o dentro del rango de
500-530 nm). El color es estable hasta por 1 hora.

CURVA DE CALIBRACIÓN

Solución Material Agua Concentración

Tubo
reactiva referencia destilada
Nº
ml μl μl mg/dl mM
1 1 ⎯ 10,0
2 1 2,5 7,5
3 1 5,0 5,0
4 1 7,5 2,5
5 1 10,0 ⎯

1.- Una vez agregada la solución reactiva, preincubar 2 a 5 min. a 37ºC. Nota: el
agua del blanco y los tubos de la curva de calibración también se puede agregar
antes de la preincubación.
2.- Adicionar el material de referencia de acuerdo al esquema anterior.
3.- Continuar a partir del paso 5 del procedimiento para la muestra.

La reacción es lineal hasta 500 mg/dl. Para concentraciones superiores, diluir la

muestra con suero fisiológico repetir la determinación y multiplicar el resultado por
el factor de dilución.
REACTIVOS

1.-Solución reactiva:
Glucosa oxidasa 6.000 U.I/l
Peroxidasa 1.500 U.I./l
4-aminofenazona 1,64 mM
Tampón fosfato 0,1 M [pH 8,0]
Fenol 2,6 Mm

2.-Patrón de referencia:
Se pesan 300 mg de glucosa anhidra para preparar 100 ml de material de
referencia en agua destilada (P.M glucosa = 180).

METODO DE REFERENCIA:

La FDA ha propuesto como el método de referencia para la glucosa un

procedimiento totalmente enzimático utilizando hexocinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (2). Passey y col. hicieron una revisión exhaustiva de 10 métodos
de glucosa y han utilizado el procedimiento de la hexocinasa como el método de
referencia..

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

Hexocinasa
Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP
Mg++

G-6-PDH
+
Glucosa-6-fosfato + NAD 6-Fosfogluconato + NADPH + H+

La glucosa es fosforilada por la hexocinasa (HK) en presencia de trifosfato de

adenosina (ATP) y magnesio para formar glucosa-6-fosfato (G-6-P) y difosfato de
adenosina (ADP). La G-6-P es oxidada a continuación por la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G-6-PDH) en presencia de dinucleótido de nicotinamida adenina-
fosfato (NADP+) produciendo 6-fosfogluconato y NADPH.
La formación de NADPH produce un aumento en la absorbancia a 340 nm que es
directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra.
RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA
La muestra de elección es suero fresco, claro y no hemolizado. El suero debe
separarse de las células tan pronto como sea posible para minimizar la
descomposición de la glucosa por el proceso de glicólisis. En muestras
adecuadamente procesadas, las concentraciones de glucosa son estables hasta
por 3 días a 4°C.

CÁLCULO Y RESULTADOS

Resultados
La concentración de glucosa se expresa en mmol/L ( ó en mg/dL).

Cálculo
A
Glucosa mmol/L (ó en mg/dL) = —— x concentración del estándar
As

A = absorbancia de la muestra desconocida

As = absorbancia del estándar

Ejemplo
0.325
Glucosa mmol/L (mg/dL) = ———— x 8.4
0.604

= 4.5 mmol/L (ó 81 mg/dL)

0.325 = absorbancia de la muestra desconocida

0.604 = absorbancia del estándar

8.4 mmol/L (151 mg/dL) = concentración del estándar

BIBLIOGRAFIA

1. Tietz, N.W. "Fundamentals of Clinical Chemistry" (1976).

2. United States Department of Health, Education and Welfare, Food and
Administration. In Vitro
Diagnostic Product s for Huma n Use, Proposed Establishment of Glucose, Fed.
Regist. 39, No. 126, 24136-24147 (1974).
3. Passey, R.B., Gillum, R.L., Fuller, J.B., Urry, F.M., Giles, M.L., Evaluation and
Comparison of Ten Glucose Methods and the Reference Method Recommended in
the Proposed Product Class Standard (1974), Clin. Chem. 23, 131-139 (1977).
4. Burtis, C.A., Ashwood, E.R., Editors, Tietz Textbook of Clinical Chemistry,
Second Edition, W.B.
Saunders Company, Philadelphia, PA (1994).
5. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd ed., AACC
Press, Washington (1990).
 PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA (PTG)

MÉTODO DE GLUCOSA OXIDASA/PEROXIDASA (GOD/PAP)

INTRODUCCIÓN
En la práctica médica, el diagnóstico de la diabetes mellitus se establece
mediante la demostración de una glicemia en ayunas superior a 140 mg/dl en
niños y adultos ambulatorios y que han ingerido una dieta normal. Es habitual
confirmar el valor originalmente elevado realizando una nueva determinación de
glicemia. Cuando los valores en ayunas y postprandiales (después de dos horas
de una comida normal) son limites, se recomienda efectuar una prueba de
tolerancia a la glucosa para confirmar el diagnóstico.

FUNDAMENTO

GOD
Glucosa + O2 + H2O ⎯⎯⎯⎯⎯> ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol ⎯⎯⎯⎯>4-(p-benzoquinonamonoimino)-
fenazona + 4H2O

MUESTRA

Utilizar de preferencia suero fresco no hemolizado o plasma heparinizado.

Obtenido según el protocolo de la prueba:
Se debe tener seguridad de que el paciente ha ayunado durante al
menos 10 horas y no mas de 16 horas. El paciente debe estar en reposo,
relajado y sin fumar. También es necesario determinar con certeza que el
paciente no esté bajo medicación de ningún tipo, ya que diferentes drogas
interfieren con el metabolismo de los hidratos de carbono o con los
métodos de laboratorio que se utilizan para determinar glicemia.
La glucosa debe ser bebida dentro de 5 minutos en solución acuosa
a una concentración que no sobrepase los 250 g/l. Se ha visto que una
dosis de 75 g de glucosa es la cantidad que permite la mayor
discriminación en los adultos. En los niños, la dosis es de 1,75 g de
glucosa/kg de peso.
 VALORES DE REFERENCIA

Ningún valor sobre 200 mg/dl

PROCEDIMIENTO

Se entregarán 4 muestras correspondientes a la glicemia basal (tiempo 0,

T0), glicemia a 1 hora, 2 horas y 3 horas respectivamente, pertenecientes a un
paciente en estudio. La glicemia se determinará por el método de GOD-PAP y
luego se construirá el gráfico glicemia versus tiempo, para poder realizar la
interpretación del resultado

1.- Rotular 5 tubos de ensayo: B (blanco) y T0, T1, T2 y T3(muestra)

2.- Adicionar 1 ml de solución reactiva a todos los tubos.

3.- Preincubar la solución reactiva por 2-5 min a 37ºC

4.- Agregar 10 μl de agua al tubo B y 10 μl de muestra a los tubos muestra y

mezclar sin sacar los tubos del baño.

5.- Incubar por 10- 15 min a 37ºC (advertencia: cualquier variación de la

temperatura durante la incubación puede afectar en forma importante el resultado)

6.- Graficar los valores de glicemia en el tiempo y se interpreta la curva obtenida.

RESULTADOS

Considerando el periodo que requiere la glucosa para alcanzar la

circulación (absorción intestinal y distribución), los niveles máximos de glicemia
deberían alcanzarse a la media hora después de la ingestión.
La elevación de la glicemia debería provocar una rápida estimulación de la
secreción de insulina, la cual ejercerá su efecto hipoglicemiante en los diferentes
tejidos blanco Ej: tejido adiposo, muscular y hepático. Por tal motivo, se espera
que un individuo normal logre reducir los niveles de glicemia en forma sustancial a
las dos horas, alcanzando niveles cercanos a los basales a las tres horas.
 Cuando un paciente no logra controlar la glicemia durante este periodo, se
concluye que presenta tolerancia disminuida o intolerancia a la glucosa
dependiendo del grado y rapidez con que se reduzca la glicemia.
Los criterios más comúnmente aceptados para la interpretación de un
resultado de la PTG son:

1 valor mayor o igual a 200 mg/dl tolerancia disminuida

2 valores mayores o iguales a 200 mg/dl diabetes mellitus

Sin embargo, también es importante considerar la forma de la curva y el

valor basal.
Hay que tener presente que la validez de la prueba de tolerancia a la
glucosa, es dependiente de múltiples condiciones que deben cumplirse. Por
ejemplo la presencia de una infección, una enfermedad que afecte el metabolismo
de los hidratos de carbono ej: hipo o hipertiroidismo, síndrome de Cushing,
acromegalia, etc. Invalidan la prueba. Igualmente, la convalecencia afecta la
validez de la prueba.