La Utilización Industrial

de microorganismos
recombinantes
La inmovilización celular y
enzimática.
 Inmovilización
• Confinamiento físico de una enzima o
célula en una determinada región
del espacio, de manera que su
actividad catalítica se retenga, y
pueda ser reutilizada.
•
• 1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New
Hampshire, USA.
 Biocatalizadores
inmovilizados
• Enzimas, células u organelos celulares
que se encuentran en un estado tal
que se permite su reutilización.
• las enzimas y las células pueden
transformarse en catalizadores
heterogéneo.
• El biocatalizador se confina a una
región determinada a través de la
cual se pasa la solución del sustrato,
que sale como un producto, libre de
catalizador.
 Homogéneo: uso único

Operación continua

Reutilización

Heterogéneo: uso continuo

 COMPONTETES
DE LOS
BIOCATALIZADORES
INMOVILIZADOS

Enzimas
Células muertas Células
vivas

Durante la Necesidad de
inmovilización debe mantener su
estructura
mantenerse la organizada
estructura evitándose
el impedimento
estérico del sitio
activo
 Requisitos para poder caracterizar un
biocatalizador inmovilizado
•
1.- DESCRIPCIÓN GENERAL

1.1.- Esquema de reacción

1.2.- Enzima y microorganismo

1.3.- Tipo de soporte

1.4.- Método empleado para la

inmovilización
 Requisitos para poder caracterizar un
biocatalizador inmovilizado


 2.- PREPARACIÓN DEL

CATALIZADOR INMOVILIZADO


2.1.- Método de inmovilización, condiciones

de reacción.
2.2.- Rendimiento por peso seco, actividad

del sobrenadante.
 Requisitos para poder caracterizar un
biocatalizador inmovilizado


 3.- CARACTERIZACION FISICO-

QUIMICA


3.1.-Forma del biocatalizador

3.2.-Diámetro medio de partícula húmeda

3.3.-Capacidad de hinchamiento

3.4.-Comportamiento en columnas

3.5.-Abrasión en reactores agitados

3.6.-Abrasión en reactores de lecho

fluidizado.
 Requisitos para poder caracterizar un
biocatalizador inmovilizado


 4.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR

INMOVILIZADO.


 4. 1.-Velocidad de reacción.


 4.2.- Efecto del tipo de buffer y pH



 4.3.- Estabilidad del biocatalizador en el

almacenamiento

 MÉTODOS DE
INMOVILIZACIÓN:
RETENCIÓN FÍSICA
 RETENCIÓN QUÍMICA


 

• Confinamiento en • Enlaces covalentes

matrices • Adsorción
– En geles o polímeros
• Reticulado (cross-
– Micelas reversas
linking)
• Confinamiento en 
membranas
– En fibras huecas
– En reactores de
membrana

Prof. J.M.Sánchez Montero, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid,

 MÉTODOS DE
INMOVILIZACIÓN

Confinamiento Adhesión

Unión 1.- No específica

Membranas Geles Adsorción 2.- Intercambio iónico
Covalente
3.- Hidrofóbico
4.- Pseudoafinidad
5.- Afinidad
X
1.- Láminas
2.- Fibras cóncavas o huecas H +
3.- Encapsulación H
O -

Coloran t e CH2OH
Lectina
O
Ab
OH Ag
OH OH
http://www.uned.es/fac-quim/quimi_inor1/INMOVILIZACION.htm
Métodos de Inmovilización

Inmovilización
Retención física
química
Sin formación de enlaces covalentes Con formación de enlaces covalentes

Atrapamiento o Entrecruzamient
Adsorción Unión covalente
inclusión o
 Métodos de Inmovilización

Inmovilización por Adsorción

Interacción física, no específica (puentes de hidrógeno
interacciones hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones
de van der Waals) entre la proteína enzimática y el soporte.

ü El método más sencillo

ü De aplicación general
ü Coste moderado

Uniones ü Estabilidad limitada, se requiere un

Reversibles control
No covalentes riguroso de las condiciones de trabajo
para
evitar pérdidas de enzima por desorción.
Alumina, carbón activo, vidrio
Resinas cambiadoras
 Métodos de Inmovilización

Inmovilización
Retención física
química

Atrapamiento o Entrecruzamient
Adsorción Unión covalente
inclusión o
 Métodos de Inmovilización

Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa

Formación de un polímero altamente entrecruzado

en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en
los poros de la matriz polimérica formada.

üSe requiere controlar las condiciones de

polimerización para que no se produzcan
alteraciones en la molécula enzimática

üSe puede perder proteína lentamente

ü Se pueden obtener membranas
con
enzimas inmovilizadas Gel de poliacrilamida
Polímeros conductores
üDe aplicación general
 Métodos de Inmovilización

Atrapamiento por microencapsulación

Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-100 µm diámetro) dentro de

membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de
sustratos y productos pero no de la proteína.

üSe requieren elevadas

concentraciones de proteína
en disolución acuosa (10 mg/L)

Membrana polimérica obtenida

en un proceso de polimerización
en la interfase disolución orgánica-
acuosa
 Métodos de Inmovilización

Inmovilización
Retención física
química

Atrapamiento o Entrecruzamient
Adsorción Unión covalente
inclusión o
 Métodos de Inmovilización

Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente

Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte
pero no entre las moléculas de enzima.
El tipo de soporte determina la química de la inmovilización

Activación para obtener grupos funcionales reactivos

Grupo funcional Soporte Unión a través de las cadenas laterales
-CONH2 Poliacrilamida de los aminoácidos de la secuencia
polipeptidica de la proteína
-COOH Carboxymetilcelulosa
-NH2 Lisina -SH Cisteina
-NH2 Poliestireno, nylon
-OH-Ph Tirosina -OH Serina
-OH Celulosa, agarosa, sephadex -COOH Aspartato -Nimidazol Histidina
-Si(OH)3 Vidrio poroso Glutamato

Asegurar que el centro activo de la enzima no se ve afectado por los reactivos

empleados en el proceso de inmovilización.
Se puede proteger el centro activo con un análogo del sustrato o un inhibidor
competitivo durante el proceso de inmovilización.
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

1. Método de la acyl-azida para unión a soporte con grupos ácido

Activación de soporte para obtener un grupo acil-azida

CH3OH NH2NH2
OCH2COOH OCH2COOCH3 OCH2CONHNH2
HCl

NaNO2
OCH2CONHNH2 OCH2CON3
HCl

Ataque nucleófilo a la acil-azida para dar lugar a un enlace amida

OCH2CON3 + NH2-ENZIMA OCH2CONH-ENZIMA

Son más reactivas las aminas primarias (lisina), aunque también

reaccionan residuos de cisteina, serina y tirosina.
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

2. Método de la carbodiimida para unión a soporte con grupos ácido

R´ R
N NH
Activación del soporte para dar
C
COOH + COOC un derivado acilisourea por reacción
N NH
con carbodiimida
R R

Reacción con la enzima

R
NH NHR
COOC + NH2-ENZIMA CONH-ENZIMA + O C + H
NH NHR
R

Reaccionan lisina, tirosina, cisteina, serina y metionina

La selectividad de la reacción mejora si se añade un derivado de

N-hidroxisuccinimida durante la etapa de activación del soporte.
Se forma un ester de N-hidroxisuccinimida que forma selectivamente
enlace amida con residuos de Lisina
 Métodos de Inmovilización – Unión Covalente

3. Unión a través de enlace azo

Activación del soporte para obtener una sal de diazonio

NaNO2
R NH2 R N2 Cl
HCl

Unión a la enzima a través de un residuo de tirosina

HO
R N2 Cl + HO Enzima R N N
Enzima

ü Inmovilización covalente selectiva a través de residuos de tirosina

ü Evita entrecruzamiento enzima-enzima
 Métodos de Inmovilización

Inmovilización
Retención física
química

Atrapamiento o Entrecruzamient
Adsorción Unión covalente
inclusión o
 Métodos de Inmovilización

Entrecruzamiento
Formación de enlaces covalentes intermoleculares
(entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte
ü Cantidades altas de proteína inmovilizada resistentes a condiciones
extremas de pH y temperatura

üLas redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el

acceso del sustrato al centro activo  Pérdidas de actividad tras
la inmovilización altas

Reactivos bifuncionales más utilizados

CHO O O
H H
(CH2)3 N2 N2 ICH2 C N (CH2)6 N C CH2I

CHO
Glutaraldehido Diazobenzidina Hexametileno-bis(iodoacetamida)
O O O
O
N O C (CH2)2 S S (CH2)2 C O N

O O
Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
 Métodos de Inmovilización- Entrecruzamiento

Ejemplo- Entrecruzamiento con glutaraldehido

N- Enzima
NH2-ENZIMA CHO CH
+ (CH2)3 (CH2)3
NH2-ENZIMA
CHO CH
N-Enzima

ü Método simple y sencillo

ü Se verifica en condiciones de pH neutro

ü Para minimizar las pérdidas de actividad enzimática

se puede optar por un método de co-reticulado:
entrecruzamiento de la enzima con una proteína sin actividad
enzimática y rica en lisina, ej. albúmina bovina.
Propiedades de las Enzimas
Inmovilizadas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren
de las de las enzimas en disolución debido a efectos del
material soporte y a cambios conformacionales de la enzima

Inmovilización Efectos sobre la estabilidad

Efectos en las propiedades cinéticas

1. Efectos en la Estabilidad
üEstabilización conformacional de la enzima
por uniones multipuntuales enzima-soporte

Mayor resistencia a
desactivación térmica o química

üAlteración del microentorno de la enzima

Por ejemplo mayor estabilidad en medios

orgánicos sobre soportes hidrofílicos
 Propiedades de las Enzimas
Inmovilizadas
2. Efectos de la inmovilización sobre las propiedades cinéticas

[S]superficie < [S]disolución

1 v′max [ S]
v=
[S2]
K′M + [ S]
[S]
[S1]
[S]dis. Los valores de KM y vmax para las enzimas
inmovilizadas son aparentes (K’M y v’max )

Capa de difusión Disolución

K´M suele ser mayor que KM
0 Distancia a la
Superficie del soporte
Propiedades de las Enzimas
Inmovilizadas
Efectos de microentorno  Cambio del pH óptimo de la
enzima

Quimotripsina/
portador catiónico Quimotripsina en disolución
100
%
Actividad Quimotripsina/
relativa portador aniónico

4 6 8 10
pH

Sobre soportes catiónicos: Sobre soportes aniónicos:

[OH-]superficie >[OH-]disolución [H+]superficie >[H+]disolución
pHsuperficie > pHdisolución pHsuperficie < pHdisolución
Enzimas inmovilizadas
Estrategias para la unión covalente
de un enzima a un soporte
ACTIVACIÓN ACOPLAMIENTO
Enzima

Soporte x
Lavado x
x

x
Lavado
Lavado
x
Conjugado
x
Inmovilizado
Enzima

Soporte
Ejemplos de enzimas
inmovilizadas
Principales características de los métodos de
inmovilización:

Características Adsorción Enlace Inclusión en Retención por

covalente matrices Membranas
Preparación Simples dificil dificil Simples

Costo bajo elevado moderado elevado

Fuerza de ligación variable fuerte flaca fuerte

Liberación de si no si no
enzima
Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia

Problemas en la elevados bajos elevados elevados

utilización
Efectos de la si si si no
matriz
Restricciones no no si si
difucionales
Protección no no si si
microbiana
REACTORES

Tanque en agitación
REACTORES
Tanque de alimentación y
agitación
continua (CSTR)
REACTORES
 REACTORES

Lecho
compacto
REACTORES
 REACTORES

Láminas
REACTORES
 REACTORES

Lecho
Fluido
 REACTORES

Lecho
Fluido
Tanque en agitación Tanque de alimentación y
agitación
continua (CSTR)

Lecho Láminas
compacto
REACTORES