CARACTERÍSTICAS

FÍSICAS Y QUÍMICAS DE
LOS CARBOHIDRATOS
MONO Y DISACÁRIDOS
SOLUBILIDAD:
•MUY SOLUBLES EN AGUA
•MENOS SOLUBLES EN ETANOL
•ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON AGUA CALIENTE
•INSOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS (EXCEPTO
PIRIDINA)
 IMPORTANCIA DE LA
SOLUBILIDAD DE LOS
CARBOHIDRATOS
INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA
REALIZAR DETERMINACIONES DE
DENSIDAD.

EXISTE RELACIÓN ENTRE SU

DENSIDAD Y SU
CONCENTRACIÓN
ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LOS
CARBOHIDRATOS
MUY ÚTIL PARA DETERMINAR SU
CONCENTRACIÓN.
EXACTO SÓLO PARA
SOLUCIONES DE PURA
SACAROSA.
AMPLIAMENTE USADO PARA
APROXIMAR VALORES PARA
OTRAS SOLUCIONES
AZUCARADAS.
ROTACIÓN ÓPTICA DE LOS
CARBOHIDRATOS
FACILITA AL MÉTODO PARA
MEDIR LA CONCENTRACIÓN DEL
AZÚCAR EN SOLUCIÓN.

MÉTODO BASADO EN
MEDICIONES POLARIMÉTRICAS.

GENERALMENTE UTILIZADO CON

SACAROSA Y ALMIDÓN.
PROPIEDADES REDUCTORAS
DEL GRUPO CETO O ALDEHÍDO
EL GRUPO CETO O ALDEHÍDO
REDUCIRÁN SOLUCIONES ALKALINAS
DE SALES METÁLICAS AL METAL
ÓXIDO O LIBRE.

LA REACCIÓN ENTRE EL AZÚCAR Y EL

SULFATO CÚPRICO NO ES
ESTEQUIOMÉTRICA Y PROPORCIONA
ÓXIDO CUPROSO MUY DEPENDIENTE
DE LAS CONDICIONES DE LA
REACCIÓN.
 REACCIONES DE
CONDENSACIÓN DE LOS
CARBOHIDRATOS
MONOSACÁRIDOS + ÁCIDO FUERTE +
CALOR → SUBSTANCIAS QUE SE
CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G.
FENOL) PARA PROPORCIONAR
COMPLEJOS COLOREADOS.

PÉRDIDA DE AGUA Y FORMACIÓN DE

DERIVATIVOS DEL FURFURAL.
(SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL
ÁCIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD DE
CALENTAMIENTO)
REACCIONES DE SUSTITUCIÓN
DE LOS CARBOHIDRATOS

FORMACIÓN DE ÉTER (E.G. METIL

ÉTERES)

ESTERIFICACIÓN (E.G. ACDETATOS DE

ALDITOL)

IMPORTANTES EN LA PREPARACIÓN
DE DERIVADOS VOLÁTILES PARA LA
CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.
 PROPIEDADES DE LOS
POLISACÁRIDOS
SOLUBILIDAD.- VARÍA
ENORMEMENTE
a) DEXTRINAS (ALMIDONES DE
VARIAS COMPOSICIONES
PARCIALMENTE HIDROLIZADOS)

a) AMILOPECTINA Y GLUCÓGENO.-
SE DISPERSAN PARCIALMENTE
EN AGUA CALIENTE.
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

SUBSTANCIAS PÉCTICAS.-
SOLUBLES EN AGUA CALIENTE A
MENOS QUE CONSTITUYAN UN
COMPLEJO CON Ca.

GOMAS, MUCÍLAGOS,
ARABINOXILANOS, ß-GLUCANOS.-
SOLUBLES EN AGUA
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

CELULOSA, ALGUNOS MANANOS

Y XILANOS, HEMICELULOSA.-
INSOLUBLES EN AGUA.

EN GENERAL LOS
POLISACÁRIDOS SON
INSOLUBLES EN ALCOHOLES
ACUOSOS CON FUERZAS POR
ARRIBA DE 75 A 80% (v/v).
FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE
LOS POLISACÁRIDOS

EL ALMIDÓN FORMA UN COMPLEJO

INSOLUBLE CON EL YODO EN
SOLUCIÓN DE NaCl/KI.

LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DE

LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO
FORMAN COMPLEJOS CON LOS
COMPUESTOS CUATERNARIOS DE
AMONIO
 HIDRÓLISIS DE LOS
POLISACÁRIDOS

LA MAYORÍA DE LOS POLISACÁRIDOS

SON SUJETOS A LA HIDRÓLISIS EN
PRESENCIA DE ÁCIDOS DILUIDOS.

LA MAYORÍA DE LOS COMPONENTES

DE LA HIDRÓLISIS SON ESTABLES EN
LOS ÁCIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA
FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA

HIDRÓLISIS ÁCIDA (SE NECESITAN 72%
(p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA)

LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO DE

UN POLISACÁRIDO CONFIEREN
ESTABILIDAD EN EL ENLACE
GLUCOSÍDICO ADYACENTE.
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

LA MAYORÍA DE LOS RESIDUOS

DE ÁCIDO URÓNICO SE LIBERAN
EN COMBINACIÓN CON OTRO
RESIDUO, PRODUCIENDO UN
DISACÁRIDO EXTREMADAMENTE
RESISTENTE A LA HIDRÓLISIS
ÁCIDA.
 DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES LIBRES
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

CUANDO LOS AZÚCARES ESTÁN

EN SOLUCIÓN

GASES DISUELTOS.-
REMUÉVANSE DE LOS
PRODUCTOS CARBONATADOS O
FERMENTADOS MEDIANTE VACÍO
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

PIGMENTOS.- PUEDEN
INTERFERIR CON LAS
REACCIONES. EXISTEN MUCHAS
MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G.
CARBÓN O SALES DE PLOMO)

ACETATO DE PLOMO BÁSICO.-

INTERFERIRÁ CON LOS MÉTODOS
POLARIMÉTRICOS.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

ACETATO DE PLOMO NEUTRO.-

FORMA PREFERENTE DE USO. SE
UTILIZA COMO UNA SOLUCIÓN
ACUOSA SATURADA. SE ELIMINA
EL EXCESO AÑADIENDO YA SEA
OXALATO DE SODIO O POTASIO.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

DESPROTEINIZACIÓN
LAS PROTEÍNAS INTERFIEREN CON LAS
DETERMINACIONES REDUCTORAS Y
COLORIMÉTRICAS. EL USO DE TCA
(ÁCIDO TRICLOROACÉTICO) ES
DEMASIADO FUERTE PARA
DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN
SOLUCIÓN CONTIENE DISACÁRIDOS O
FRUCTOSA.
 DESPROTEINIZACIÓN DE LA
MUESTRA

MÉTODOS ACEPTABLES:

a) AÑÁDASE ETANOL O ACETONA

AL 70% (v/v). LA MAYORÍA DE
LAS PROTEÍNAS COAGULARÁN Y
SE PODRÁN FILTRAR O
CENTRIFUGAR.
 DESPROTEINIZACIÓN DE LA
MUESTRA

b) PRECIPITACIÓN CON METALES

PESADOS BAJO CONDICIONES
ALKALINAS. EJEMPLO: LA
SOLUCIÓN CARREZ PRECIPITA
PROTEÍNAS, ABSORBE ALGUNOS
COLORES, Y ROMPE
EMULSIONES.
 PROCEDIMIENTO
SE AÑADE A LA MUESTRA LÍQUIDA
SOLUCIÓN CARREZ I
(HEXACIANOFERRATO DE POTASIO,
K4[Fe(CN)6]·3H2O),

SE AÑADE A LA MUESTRA SOLUCIÓN

CARREZ II (SULFATO DE ZINC (ZnSO4·7
H2O), Y SOLUCIÓN DE NaOH.

SE ENFRÍA, SE DILUYE A UN VOLUMEN

DETERMINADO Y SE FILTRA.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR
SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE
UN EXTRACTOR SOXHLET

SE AÑADE LA MUESTRA AL
ETANOL AL 80% (v/v,
CONCENTRACIÓN FINAL)
HIRVIENDO. LOS POLISACÁRIDOS
SON INSOLUBLES Y EL CALOR
INACTIVA A LAS ENZIMAS.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR
PUEDE AÑADIRSE CARBONATO DE
CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS
ÁCIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE
ÉSTOS PUEDEN OCASIONAR LA
HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS.

TAMBIÉN SE DEBE USAR

EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN
BUFFER PARA EVITAR LA HIDRÓLISIS
ÁCIDA
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR
EN CASO DE QUE SE NECESITE
ELIMINAR EL ETANOL DEL
EXTRACTO PREVIO AL ANÁLISIS
SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO
MEDIANTE VACÍO. TAMBIÉN SE
PUEDE REALIZAR CALENTANDO
LEVEMENTE EN BAÑO MARÍA
BAJO CAMPANA DE EXTRACCIÓN
O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE
CARBOHIDRATOS

MÉTODOS QUÍMICOS

MÉTODO FLUORIMÉTRICO

MÉTODOS ENZIMÁTICOS

CROMATOGRAFÍA DE GASES

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

MÉTODOS FÍSICOS
 MÉTODOS QUÍMICOS
REACCIONES DEL H2SO4 Y
CARBOHIDRATOS

ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

FUNDAMENTO.- PROVIENE DE
LOS PRODUCTOS DE REACCIÓN Y
DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO Y EL
AZÚCAR.
 ÁCIDO FENOL SULFÚRICO
EL AZÚCAR SE TORNA
PRINCIPALMENTE
HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O
FURFURAL (F) LOS CUALES SON
REALMENTE DETERMINADOS
LEYENDO LA ABSORBANCIA A 490nm
H2SO4

CONC.
FENOL + CARBOHIDRATO → AMARILLO – NARANJA
CALOR
ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

H+ H+
POLISACÁRIDOS → MONOSACÁRIDOS → F + HMF
∆ ∆
VENTAJAS DEL MÉTODO

ES SENCILLO
ES RÁPIDO
SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES
DE AZÚCAR (E.G. 5μg)
ESPECÍFICO PARA
CARBOHIDRATOS.
NO EXISTE INTERFERENCIA CON
PROTEÍNAS
VENTAJAS DEL MÉTODO

A MENUDO NO ES NECESARIA LA
CLARIFICACIÓN DE LA MUESTRA
LOS REACTIVOS SON BARATOS Y
ESTABLES
COLOR ESTABLE
RESULTADOS REPRODUCIBLES
RESULTADOS CONFIABLES
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

LOS CARBOHIDRATOS QUE NO

PROPORCIONAN HMF Y F EN LA
DESCOMPOSICIÓN ÁCIDA
RESULTAN EN UNA AMPLIA GAMA
DE COLORES. POR TANTO EL
MÉTODO NO MIDE TODOS LOS
CARBOHIDRATOS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

MIDE LA MAYORÍA DE LOS

CARBOHIDRATOS PERO LA
INTENSIDAD DEL COLOR VARÍA
AMPLIAMENTE ENTRE LOS
CARBOHIDRATOS, POR LO QUE
SE DEBE SELECCIONAR UNO DE
ELLOS COMO REFERENCIA
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
LA PROPORCIÓN DE H2SO4 ES MUY
IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA
H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA
MUESTRA ACUOSA.

SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIÓN

PROVENIENTE DEL PAPEL FILTRO O
POLVO DE CELULOSA
ANTRONA – ÁCIDO SULFÚRICO
(9,10 DIHIDRO-9-
OXOANTRACENO)
FUNDAMENTO
EL MÉTODO ES BÁSICAMENTE IGUAL
AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE
SE OBTIENE ES AZÚL – VERDE Y SE
LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm.

TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y

DESVENTAJAS QUE EL MÉTODO
ANTERIOR.
 DETERMINACIONES DE
AZÚCARES REDUCTORES

AZÚCAR + ÁLKALI → FRAGMENTOS DE AZÚCAR REDUCTOR

+
Cu(OH)2 ← COMPLEJO DE COBRE DE
TARTRATO Y CITRATO
↓
∆ OH
H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE ÁCIDOS DE
AZÚCAR
 SOLUCIÓN DE FEHLING
FUNDAMENTO

DOS SOLUCIONES :
SOLUCIÓN A: SULFATO DE COBRE
CRISTALINO

SOLUCIÓN B: TARTRATO DE SODIO Y

POTASIO (O CITRATO DE SODIO) +
HIDRÓXIDO DE SODIO (O HIDRÓXIDO
DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)
 SOLUCIÓN DE FEHLING
FUNDAMENTO

EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA

PRECIPITACIÓN DEL HIDRÓXIDO CÚPRICO

EL ÁLKALI ENOLIZA A LOS AZÚCARES Y

PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN
FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN
OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++
(CÚPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IÓN
CUPROSO)
 SOLUCIÓN DE FEHLING

FUNDAMENTO
A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++
SE REDUCEN POR LOS
FRAGMENTOS DE AZÚCAR, LOS
IONES Cu+ SE COMBINAN CON
LOS IONES HIDROXILO PARA
FORMAR HIDRÓXIDO DE COBRE
(DE COLOR AMARILLO, Cu+).
 SOLUCIÓN DE FEHLING

FUNDAMENTO

EL CuOH REDUCIDO PIERDE

H2O EN PRESENCIA DE CALOR
PARA DAR COMO RESULTADO
ÓXIDO CUPROSO INSOLUBLE
(Cu2O)
 SOLUCIÓN DE FEHLING
FUNDAMENTO

LA DETERMINACIÓN DEL COBRE

REDUCIDO SE PUEDE LLEVAR A CABO
POR GRAVIMETRÍA, VOLUMETRÍA, O
POR MÉTODOS ELECTROLÍTICOS.

EL PESO DEL Cu2O SÓLO ES

APLICABLE A MUESTRAS
RELATIVAMENTE PURAS.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE FEHLING

LA REDUCCIÓN DEL COBRE Y LA

OXIDACIÓN DE LOS AZÚCARES NO ES
ESTQUIOMÉTRICA .

LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO CUPROSO

VARÍA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO
ÁLKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE
CALENTAMIENTO Y LA
CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES EN
LA MUESTRA
DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE FEHLING

LOS AZÚCARES DIFIEREN EN SU

HABILIDAD PARA REDUCIR LA
SOLUCIÓN CÚPRICA, POR TANTO, LA
TITULACIÓN (O PESO O ABSORBANCIA)
DEBEN SER CONVERTIDOS EN (mg DE
COBRE) Y POSTERIORMENTE SE
RECURRIRÁ A TABLAS PARA
DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE
AZÚCAR PRESENTE EN LA MUESTRA
MÉTODO DE MUNSON WALKER

FUNDAMENTO

NaOH + Cu++ + AZÚCAR REDUCTOR → CU+ + AZÚCAR

∆ (Cu2O) OXIDADO

LA DETERMINACIÓN DEL Cu2O PUEDE SER

GRAVIMÉTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR
TITULAR EL ÓXIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE
REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS SIGUIENTES
MÉTODOS (SE LLEVAN MUCHO TIEMPO):
 TITULACIÓN DEL
PERMANGANATO DE POTASIO

EL Cu2O REACCIONA CON EL IÓN

FÉRRICO (Cu+++) EL CUAL ES
REDUCIDO AL IÓN FERROSO (Cu+
+). POSTERIORMENTE EL IÓN

FERROSO ES TITULADO (+2 →+3)

CON PERMANGANATO (+3, ROSA
→ +2, INCOLORO)

1) Cu2O + Fe2(SO4)3 → 2FeSO4 + CuSO4 + CuO

 TITULACIÓN DEL
PERMANGANATO DE POTASIO

2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 →

5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO
SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON
ÁCIDO NÍTRICO.
POSTERIORMENTE SE HIERVE LA
MUESTRA PARA ELIMINAR EL
EXCESO DE HNO3

HNO3
Cu2O → Cu(NO3)2
∆
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO

SE AÑADE UNA CANTIDAD

CONOCIDA DE SOLUCIÓN DE KI

2I- + 2Cu++ → 2Cu+ + I2

 TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO
SE TITULA EL I2 LIBERADO CON
UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE
TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3)

S2O3-2
I2 + I- → I3- → S4O6-2 + 3 I-
(TRIIODURO)

SE USA ALMIDÓN COMO INDICADOR: AZÚL → INCOLORO

DESVENTAJAS DEL MÉTODO

NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE

LOS DIFERENTES AZÚCARES
REDUCTORES.

SE REQUIEREN MUESTRAS
RELATIVAMENTE GRANDES (100 A
200mg DE GLUCOSA POR
DETERMINACIÓN.
MÉTODO SOMOGY I-NELSON

AZÚCAR REDUCTOR + Cu++ → Cu+ + AZÚCAR

REDUCTOR
MÉTODO SOMOGY I-NELSON

PROCEDIMIENTO:
Muestra
Reactivo de Somogyi
(Azúcar reductor +) Cu+2

Calor

Azúcar Oxidante + CU+ (Cu2O)

CU+1(red) AsMo (ox)

CU+1(oxi) AsMo (red) Es de un fuerte color azul

Se leé la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estándar

Reactivos para el Método de Somogy i y
Nelson para azúcares reductores

Reactivo de Somogy i
NaCO3 - Carbonato de sodio
NaHCO3 – Bicarbonato de Sodio
KaNaC4H4O6 – Tartrato de Sodio Potasio
CuSO4·5H2O –Sulfato de Cobre
Reactivo de Nelson
(NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio
Na2HAsO7·H2O – Arsenato de Sodio
H2SO4 – Ácido Sulfúrico
MÉTODO FLUORIMÉTRICO

FUNDAMENTO

ESTE MÉTODO ES POSIBLE

CUANDO LOS COMPUESTOS
ABSORBEN RADIACIÓN A
LONGITUD DE ONDA CORTA Y
LUEGO EMITEN RADIACIÓN A UNA
LONGITUD DE ONDA MÁS LARGA.
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
POR EL MÉTODO
FLUORIMÉTRICO
EXTRACCIÓN CON ISO-BUTIL
METIL CETONA.
REACCIÓN CON HIDRACIDA DE
ÁCIDO p-HIDROXIBENZOICO
ADICIÓN DE REACTIVO Y
LECTURA A UNA EMSIÓN DE
470nm
EXCITACIÓN A 454nm
MÉTODOS ENZIMÁTICOS

INFORMACIÓN GENERAL

REQUIEREN DE UN EXTRACTO
NEUTRO O ÁCIDO LIBRE DE
ALCOHOLES Y METALES
PESADOS (NO SE PUEDEN USAR
SALES DE PLOMO PARA
CLARIFICAR LOS EXTRACTOS)
APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS
ENZIMÁTICOS
SON POSIBLES PARA UN GRAN
NÚMERO DE CARBOHIDRATOS O
COMPUESTOS RELACIONADOS:
MONOSACÁRIDOS
DISACÁRIDOS
POLISACÁRIDOS
ALOCHOLES Y POLIOLES
ÁCIDOS
 FUNDAMENTO
GLUCOSA

EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS

SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA:
BUFFER,
o – DIANISIDINA · 2HCl (CROMÓGENO
REDUCIDO)
CATALASA
GLUCOSA OXIDASA
 REACCIONES

GLUCOSA
OXIDASA
H2O + O2 + GLUCOSA → LACTONA DE ÁCIDO
D-GLUCÓNICO + H2O

CATALASA

H2O2 → H2O + ½ O2

O2 + CROMÓGENO INCOLORO, REDUCIDO →

CROMÓGENO AZÚL OXIDADO
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA
DE SACAROSA/GLUCOSA

LA CONCENTRACIÓN DE
GLUCOSA ES DETERMINADA
ANTES Y DESPUÉS DE LA
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
 DETERMINACIÓN DE LA
GLUCOSA ANTES DE LA
INVERSIÓN
A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA
HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA
FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA
MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO.
EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6-
FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH)
LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES
ESPECÍFICAMENTE OXIDADA POR EL
NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON
LA FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO.
 REACCIONES
HK
GLUCOSA + ATP → G6P + ADP
G6P-DH
G6P + NADP+ → GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+

EL NADPH FORMADO EN ESTA

REACCIÓN ES ESTEQUIOMÉTRICO
CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE
MIDE MEDIANTE EL AUMJENTO EN
ABOSROBANCIA A 334, 340 Ó 365 nm.
INVERSIÓN ENZIMÁTICA.
A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES
HIDROLIZADA POR LA ENZIMA ß-
FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A
GLUCOSA Y FRUCTOSA:

ß-FRUCTOSIDASA
SACAROSA + H2O → GLUCOSA + FRUCTOSA

EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO

DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES
DE GLUCOSA ANTES Y DESPUÉS DE LA
INVERSIÓN ENZIMÁTICA
CROMATOGRAFÍA DE GASES

FUNDAMENTO
LOS AZÚCARES SON
COMPUESTOS POLIHIDROXI
UNIDOS FUERTEMENTE POR
HIDRÓGENO YA SEA A AGUA O A
ELLOS MISMOS EN CRISTALES.
POR TANTO, TIENEN PUNTOS DE
FUSIÓN MUY ALTOS (200-300°C)
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
FUNDAMENTO

LOS AZÚCARES SE PUEDEN

CONVERTIR EN DERIVADOS
VOLÁTILES POR MÉTODOS DE UN
PASO ANTES DE SER SUJETOS A
ANÁLISIS POR CG. LOS MÁS
CONVENIENTES PARECEN SER:
ACETATOS DE ALDITOL, METIL
ÉTERES, Y TRIMETISILIL ÉTERES.
CROMATOGRAFÍA DE GASES
FUNDAMENTO
LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR
LA DEGRADACIÓN TÉRMICA DE LOS
AZÚCARES, PARTICULARMENTE LA PÉRDIDA
DE AGUA PARA FORMAR DERIVADOS
ANHIDRO.

LOS TRIMEISILIL ÉTERES TIENEN LA VENTAJA

DE LA COMBINACIÓN DE ESTABILIDAD Y
VOLATILIDAD QUE PERMITEN LA
DETERMINACIÓN POR CG DE
OLIGOSACÁRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS
CROMATOGRAFÍA DE GASES
PROCEDIMIENTO

SE PREPARAN DERIVADOS VOLÁTILES

DE CARBOHIDRATOS

SE INYECTAN EN LA COLUMNA
CALIENTE DEL CG

LOS DERIVADOS VOLÁTILES PSAN A

DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVÉS
DE LA COLUMNA CON UNA CORRIENTE
LEVE DE GAS ACARREADOR
CROMATOGRAFÍA DE GASES
PROCEDIMIENTO

LOS COMPONENTES SEPARADOS

ALCANZAN EL FINAL DE LA COLUMNA
Y EL DETECTOR.

LA SEÑAL GENERADA POR EL

DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA
DE LA CARTA REGISTRADORA A
OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A
LA CONCENTRACIÓN DE LA
SUBSTANCIA.
 MÉTODOS FÍSICOS
DENSIMETRÍA

FUNDAMENTO

LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE UNA

SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA FUNCIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO A UNA
TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE
OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA
GRAVEDAD ESPECÍFICA DE LA SOLUCIÓN,
PERO ESTE MÉTODO PROPORCIONA UNA
APROXIMACIÓN A LA CANTIDA DE AZÚCAR
PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZÚCAR
RELATIVAMENTE PURA
 DETERMINACIÓN POR
DENSITOMETRÍA

EL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN ES UN
HIGRÓMETRO (TAMBIÉN UTILIZADO
PARA MEDIR SÓLIDOS SOLUBLES
TOTALES).

SE HA DISEÑADO UN HIGRÓMETRO
ESPECIAL PARA LEER EL % DE
AZÚCAR DIRECTAMENTE A 20°C
(GRADOS BRIX).
 ÍNDICE DE REFRACCIÓN
FUNDAMENTO
EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE UNA
SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA
MEDIDA DE SU CONCENTRACIÓN.

LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES

AZÚCARES DE IGUAL
CONCENTRACIÓN TIENEN
APROXIMADAMENTE EL MISMO ÍNDICE
DE REFRACCIÓN
 ÍNDICE DE REFRACCIÓN
PROCEDIMIENTO
SE DETERMINA EL ÍNDICE DE
REFRACCIÓN DE LA SOLUCIÓN
AZUCARADA A 20°C MEDIANTE UN
REFRACTÓMETRO ABBÉ O UN
REFRACTÓMETRO MANUAL.

SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA

EL % DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
(COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE
ÍNDICES DE REFRACCIÓN A % DE
SACAROSA COMO FACTORES DE
CORRECCIÓN.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO
LA RADIACIÓN SE COMPORTA COMO SI
TUVIERA UN COMPONENTE ELÉCTRICO Y
UNO MAGNÉTICO. ACTÚAN COMO SI
ESTUVIERAN DISPUESTOS EN ÁNGULOS
RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO.

HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN

DE LA FUENTE LUMINOSA.

LA DIRECCIÓN DE LOS COMPONENTES

ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS ES PURAMENTE
ALEATORIA, ASÍ QUE SE TIENE RADIACIÓN
NO POLARIZADA.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO
SI SE PUEDE HACER QUE TODOS
LOS RAYOS TENGAN
ORIENTADOS SUS
COMPONENTES ELÉCTRICOS Y
MAGNÉTICOS EN LA MISMA
DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN SERÁ
POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE
PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL
USO DE UN FILTRO
POLARIZADOR.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO
CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA
EN UNA MOLÉCULA ASIMÉTRICA (UN
COMPUESTO QUE NO PUEDE
PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO).
LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES
LLAMADO “COMPUESTO ÓPTICAMENTE
ACTIVO” (e.g. GLUCOSA).

SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA

LUZ POLARIZADA NO SERÁ AFECTADA.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO
EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO
MANUALMENTE PARA COMPAGINAR
VISUALMENTE LAS SOMBRAS DE UN
COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ
POLARIZADA DE REGRESO A SU
POSICIÓN ORIGINAL.

SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN

REQUERIDO.
 MAGNITUD DE LA
ROTACIÓN
DEPENDIENTE DE:

LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ

UTILIZADA.
LONGITUD DE LA CELDA
NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA
ACTIVA Y SU CONCENTRACIÓN
TEMPERATURA
 POLARÍMETROS vs
SACARÍMETROS
POLARÍMETRO: USA LUZ
MONOCROMÁTICA Y LEE EN
GRADOS ANGULARES (SE DEBE
RELACIONAR CON LA
CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR).

SACARÍMETRO: USA LUZ BLANCA

Y LEE LA CONCENTRACIÓN DE
AZÚCAR DIRECTA.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
MÉTODOS
SE UTILIZAN ESTOS MÉTODOS
PARA LA PRODUCCIÓN DE
ALIMENTOS O INGREDIENTES DE
LOS MISMOS.

PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

DE UN ALIMENTO PARA
POSTERIOR ESTUDIO EN EL
LABORATORIO.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
FUNDAMENTO GENERAL
LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE
PROTEÍNAS EXPLOTAN LAS
DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS EN LA
SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU
TAMAÑO, CARGA, CARACTERÍSTICAS
DE ADSORCIÓN, AFINIDAD BIOLÓGICA
POR OTRAS MOLÉCULAS.

LAS TÉCNICAS SE UTILIZAN PARA

PURIFICAR PROTEÍNAS INDIVIDUALES
A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.
 CONSIDERACIONES
GENERALES

ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA

DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS PARA
SU PURIFICACIÓN SE DEBE CONOCER:
SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO
ISOELÉCTRICO, SUS PROPIEDADES DE
SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE
DESNATURALIZACIÓN, ALGUNA
CARACTERÍSTICA QUE LA DISTINGA DE
LAS DEMÁS PROTEÍNAS.
MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS
LOS MÁS COMÚNES SON:

PRECIPITACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
DE TAMAÑO
 SEPARACIÓN POR
CARACTERÍSTICAS DE
SOLUBILIDAD DIFERENCIAL
FUNDAMENTO
LA SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN
EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS
EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS
EN SOLUCIÓN.

LAS PROTEÍNAS SON

POLIELECTROLITOS Y SUS
CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD
ESTÁN DETERMINADAS POR EL TIPO Y
CARGA DE AMINO ÁCIDOS EN LA
MOLÉCULA.
PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL
DE LAS PROTEÍNAS

CAMBIANDO EL pH DEL BUFFER

FUERZA IÓNICA
CONSTANTE DIELÉCTRICA
TEMPERATURA
 PROCEDIMIENTOS
SALADO (SALTING OUT)
LAS PROTEÍNAS TIENEN PERFILES DE
SOLUBILIDAD ÚNICOS EN SOLUCIONES
DE SAL NEUTRAS.

LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE

SALES NEUTRAS AUMENTAN LA
SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.
 SALADO (SALTING OUT)
FUNDAMENTO
SI SE AUMENTA LA FUERZA
IÓNICA DE LA SOLUCIÓN LAS
PROTEÍNAS SE PRECIPITAN.

ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS

PASOS DE SEPARACIÓN DE
PROTEÍNAS. ÉSTAS SE PUEDEN
SEPARAR DE UNA MEZCLA MUY
COMPLEJA CON ESTE MÉTODO.
 SALADO (SALTING OUT)
REACTIVOS

SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4].

SE USA COMÚNMENTE DEBIDO A
QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE.

TAMBIÉN SE PUEDEN USAR: NaCl,

O KCl.
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
FUNDAMENTO

PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). DEFINIDO

COMO EL pH AL QUE UNA PROTEÍNA
NO TIENE CRGA NETA EN SOLUCIÓN.

LAS PROTEÍNAS SE AGREGAN Y

PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE
NO EXISTE REPULSIÓN
ELECTROSTÁTICA ENTRE MOLÉCULAS.
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
FUNDAMENTO
LAS PROTEÍNAS TIENEN DIFERENTES
pI’S, POR TANTO, PUEDEN SER
SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA
SOLUCIÓN.

CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA

SOLUCIÓN AL pI DE UNA PROTEÍNA
ÉSTA PRECIPITA. SI LAS DEMÁS
PROTEÍNAS TIENEN OTROS pI’S ÉSTAS
PERMANECERÁN EN SOLUCIÓN
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
POR TAMAÑO
FUNDAMENTO
LOS PESOS MOLECULARES DE LAS
PROTEÍNAS SON DE 10 000 A MÁS DE 1 000
000. POR TANTO, EL TAMAÑO ES UN
PARÁMETRO A EXPLOTAR PARA SU
SEPARACIÓN.

LA SEPARACIÓN REAL OCURRE BASADA EN

EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES
EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTEÍNA EN
SOLUCIÓN Y ES DETERMINADO POR LA
CONFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA.
 PROCEDIMIENTOS
DIÁLISIS
FUNDAMENTO

SE UTILIZA PARA SEPARAR

MOLÉCULAS EN SOLUCIÓN
MEDIANTE EL USO DE
MEMBRANAS SEMIPERMEABLES
QUE PERMITEN EL PASO DE
PEQUEÑAS MOLÉCULAS PERO
NO DE LAS GRANDES.
 DIÁLISIS
PROCEDIMIENTO

LA SOLUCIÓ PROTÉICA ES COLOCADA EN UN

TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS QUE SE AMARRA
O SUJETA POR UN EXTREMO.

EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA

UNA VEZ QUE SE HA COLOCADO LA
MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O BOLSA
EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER
(GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MÁS
GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN
EL TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS.
 DIÁLISIS
FUNDAMENTO

LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR

DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DIÁLISIS.

EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA

ADENTRO DEL TUBO.

LA SOLUCIÓN PROTÉICA DE ADENTRO DEL

TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA
DIÁLISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA
OSMÓTICA ENTRE LA SOLUCIÓN Y EL AGUA
O BUFFER DE LA DIÁLISIS
APLICACIONES DEL MÉTODO DE
DIÁLISIS
SE PUEDE UTILIZAR ESTE MÉTODO
PARA CONCENTRAR PROTEÍNA
ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DIÁLISIS
CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL
ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA
SOLUCIÓN DENTRO DE LA BOLSA DE
DIÁLISIS.

EL EQUILIBRIO DE LA DIÁLISIS SE
PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA
ESTEQUIOMETRÍA DE LA UNIÓN
PROTEÍNA-LIGANDO.
 GELIFICACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS

CASO DE LA CASEÍNA DE LA LECHE

FUNDAMENTO

EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA
LECHE, BÁSICAMENTE UN GEL DE
CASEÍNA .
FORMACIÓN DE LA CUAJADA
SE BASA EN LA ACIDIFICACIÓN DE LA
LECHE MEDIANTE ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS.

LAS ENZIMAS ACTÚAN EN UN RANGO

ÓPTIMO DE 36-39ºC.

SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE

QUIMOSINA Y PEPSINA DE CERDO CON
UNA ENZIMA COAGULADORA
OBTENIDA DE UN HONGO.
FORMACIÓN DE LA CUAJADA
LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN
LA CONVERSIÓN DE LAS MICELAS DE
FOSFOCASEINATO DE CALCIO
DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN
EL QUESO.

LAS MICELAS DE CASEÍNA EN LA

LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE
POR LA ENZIMA QUIMOSINA. ÉSTA ES
EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS
GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.
 EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO
LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA
PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIÓN DE LA
LECHE.

CAUSA LA DIVISIÓN DE UN ENLACE

ESPECÍFICO, EL ENLACE PEPTÍDICO DE
FENIL-ALANINA-METIONINA.

ROMPE LA PORCIÓN ÁCIDA RICA EN

CARBOHIDRATOS DE LA MOLÉCULA DEL
RESTO HIDROFÓBICO PRIMARIO O para-k-
CASEÍNA.
EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO
CON LA PÉRDIDA DE LA PORCIÓN
ÁCIDA DE LA MOLÉCULA, EL
RESTO DE LA k-CASEÍNA YA NO
ESTABILIZA LAS MICELAS. ÉSTAS
SE APROXIMAN UNAS A OTRAS Y
SE UNEN, PROBABLEMENTE POR
ENLACES HIDROFÓBICOS Y
FORMAN UNA RED
TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA
FASE ACUOSA DE LA LECHE.
EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO

LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL
CALCIO DE LA MICELA. EL
COAGULO DE LA LECHE
FORMADO POR LA ACCIÓN DEL
CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO
DE CALCIO.

EL GEL FORMADO POR EL CUAJO

ES FIRME, ELÁSTICO.
 TEMPERATURA ÓPTIMA DE
FORMACIÓN DE LA CUAJADA
39-40ºC

LA LECHE NO DEBE
SOBRECALENTARSE ANTES DE
AÑADIR EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE
FORMA GEL ÉSTE SERÁ DÉBIL DEBIDO,
EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO
POR EL CALOR ENTRE LA
β-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASEÍNA.
ÉSTA ÚLTIMA SE HACE RESISTENTE AL
EFECTO DE LA QUIMOSINA.