26/10/2010

Vivek N Bobade

The Line Probe Assay (LIPA)
y Initially developed at Innogenetics
y Easy and fast 
y Determination of multiple genetic variations
y Detection and Quantification of Polymorphism
y This assays have recently been developed for 
y HLA class I A, B, and C typing
y HIV reverse transcriptase drug resistance 
y Determination of HPV polymorphism
y Determination of HBV genotypes and pre‐core mutants

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Preparation of probes for LiPA
1. Employs the distinction of polymorphisms 
specific for the different genotypes of an 
organism 
1. Probes of 15 ‐ 20 nucleotides were tailed with a 
poly(T)‐tail by terminal deoxynucleotidyl
transferase
2. Attached to nitrocellulose membrane 

T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T
T (T)n T

Isolation of DNA or RNA and PCR
y The biotin group can be incorporated by addition of
y Biotinylated dUTP
y 5’‐biotinylated primer during PCR
y Biotinylated amplicons can be readily transferred to the LiPA
procedure. 

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Biotin labeled PCR products are reversely 
hybridized to the probes on the strip 

BCIP / NBT / Alkaline phosphate system for 
detection of reverse hybridization 
y Combination of following compounds yield an 
Co b at o o o o g co pou ds y e d a
intense, insoluble black‐purple precipitate when 
reacted with Alkaline Phosphatase
y BCIP (5‐Bromo‐4‐Chloro‐3'‐Indolyphosphate p‐
Toluidine Salt) 
y NBT (Nitro‐Blue Tetrazolium Chloride) 

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BCIP / NBT / Alkaline phosphate system for 
detection of reverse hybridization 
y BCIP is hydrolyzed by alkaline phosphatase to 
form an intermediate that undergoes dimerization
to produce an indigo dye 

BCIP / NBT / Alkaline phosphate system for 
detection of reverse hybridization 
y The NBT is reduced to the NBT
The NBT is reduced to the NBT‐formazan
formazan by the 
two reducing equivalents generated by the 
dimerization.

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Overview of reaction 

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Accurate identification of single and 
multiple HPV genotypes in clinical samples