Biologia Molecular

e Celular

Endereçamento não clássico

e regulação da expressão da
GAPDH1p de Kluyveromyces
marxianus

Maurício Moreira

Projecto de Prof.ª Dra. Roxana Moreira

08/01/2011
 GAPDH1p

 Isoforma da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase de

K.marxianus.

 Pertence
a uma família multigénica constituída por 3 genes:
GAP1, GAP2 e GAP3.

 Pode ser encontrada na parede celular de K.marxianus.

 GAPDH1p

Via de secreção
 Presente na parede celular.

 Desprovida da sequência N-terminal.

 Apresenta N-glicosilação.

A expressão heteróloga do gene GAP1 induz a floculação

numa estirpe não floculante de S. cerevisiae.
 GAPDH1p

Floculação
 GAPDH1p

Interesse do projecto
 Estudo de uma via de secreção alternativa à clássica.

 Contributo para o melhor conhecimento do papel de uma

enzima glicolítica quando à superfície da célula.

 Investigação da multifuncionalidade da GAPDH1p.

 Análise das condições de regulação da expressão genética.

 GAPDH1p

Objectivos
 Elucidação da via de secreção da GAPDH1p através de vários processos:

 Averiguar o envolvimento do RE na via de secreção da proteína.

 Inferir sobre a passagem da proteína pelo RE em K.marxianus, induzindo a retenção da

GAPDH1p no RE.

 Transferência do construct KmGAPDH1p-HDEL do plasmídeo pYES2 para o

plasmídeo pKYES.

 Seguir o percurso da proteína na célula através de experiências de localização

subcelular recorrendo à expressão da GAPDH1p de K.marxianus.

 Identificar a origem da proteína detectada na superfície celular.

 Caracterizar a actividade enzimática de GAPDH1p e a capacidade de indução da

adesão celular quando presente na parede celular.
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p
Estudo da regulação da expressão do gene
GAP1 e dos determinantes da via de
secreção da GAPDH1p

 Objectivos:

 Identificação de uma possível sequência sinal

alternativa envolvida no endereçamento da proteína.

 Identificação de uma parte ainda desconhecida do

promotor do gene GAP1.
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Resultados obtidos
 GAPDH1p

Perspectivas Futuras
 Estudos de yeast two-hybrid.

 Repetição dos ensaios de Pulse-Chase

contemplando a análise das cpm em células
intactas.
 GAPDH1p

Conclusões
 GAPDH1p acumula-se na parede celular acompanhando o crescimento
celular de forma a responder a temperaturas mais elevadas, conferindo
termotolerância.

 GAPDH1p mantém a sua actividade glicolítica e por conseguinte a sua

actividade catalítica conformacional na parede celular.

 O retículo endoplasmático está envolvido na via de secreção da

kmGAPDH1p como demonstrado através de estudos utilizando mutantes
de SEC61 sensíveis à temperatura e sequências de retenção do retículo
endoplasmático fundidas com GAPDH1p.

 K. marxianus e S. cerevisiae partilham uma via de secreção comum para

kmGAPDH1p.