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para el diagnóstico microscópico

de Parásitos Intestinales y Tisulares


en Honduras

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MICROBIOLOGIA
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Honduras
Estas láminas han sido preparadas por la Dra. Rosa Elena Mejía, Jefe del Laboratorio
Nacional de Parasitología del Departamento de Laboratorios, Secretaría de Salud,
Tegucigalpa, Honduras y Dra. Irina T. Jovel, Profesora Auxiliar de la Escuela de
Microbiología de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras

Agradecimiento:

– Se agradece las gestiones realizadas, revisión y comentarios aportados para la


realización de los Medios Auxiliares por la Dra. María Luisa Matute, Jefe del
Departamento de Laboratorio Nacional de Vigilancia de la Salud, Secretaría de Salud.

– Al Departamento de Laboratorio de la Secretaría de Salud y a la Red Nacional de


Laboratorios por proporcionar muestras a analizar.

– A los Microbiólogos del Laboratorio Nacional de Malaria Dr. Engels Banegas y Jessica
Henríquez por su valiosa colaboración la logística y administración del proyecto.

– Al Laboratorio del Centro de Salud Alonso Suazo en especial a la Jefe del mismo, Dra.
Mitzi Castro y los técnicos que colaboraron con la proporción de muestras, uso de sus
instalaciones y sus valiosas aportaciones.

– A la Escuela de Microbiología de la UNAH por su valiosa colaboración al proporcionar


muestras y láminas preservadas, uso de las instalaciones y las valiosas
colaboraciones de las docentes de la Sección de Parasitología.

– Estos Medios Auxiliares fueron preparados, revisados e impresos a través del


financiamiento de la Agencia Internacional de Cooperación Japonesa JICA.

Autoras:
Dra. Rosa Elena Mejía
Dra. Irina Jovel

Validado por:
• Dra. Nelly Amador, Laboratorio Departamental de Cortes
• Dra. Olga Lidia García, Laboratorio Departamental de Olancho
• Dra. Dilcia Mata, Laboratorio Departamental de Vallle
• Dr. Melvin espinal, Laboratorio Departamental de Choluteca
• Dra. Carla Mejía, Laboratorio Regional de El Paraíso
• Dr. Roberto Valladares, Laboratorio del Seguro Social
• Dra. Mitzi Castro, Laboratorio del centro de Salud, Alonso Suazo
• Dr. Engels Banegas, Laboratorio Nacional de Malaria
• Dra. Jessica Henríquez, Laboratorio Nacional de Malaria
• Dra. Carla Laínez, Laboratorio Nacional de Malaria
• Dra. Lucy Ordoñez, Laboratorio Nacional de la Enfermedad de Chagas
• Dra. Kenia Martínez, Laboratorio Nacional de la Enfermedad de Chagas
• Dra. Doris Quan, Escuela de Microbiología, UNAH
• Dra. Maritza Canales, Escuela de Microbiología, UNAH
• Dra. Raquel Alejandra Roque, Laboratorio Hospital San Felipe
• Dra. Miriam Aguilera, Colegio de Microbiólogos y Químicos Clínicos de Honduras

Fotos de la portada Tomadas por


Dra. Irina Jovel, MQC
Dr. Engels Banegas, MQC
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Introducción
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

SITUACIÓN ACTUAL DE LOS PARÁSITOS INTESTINALES


Y TISULARES EN EL MUNDO.

Las Enfermedades Tropicales Desatendidas (ETDs) son un grupo de mas de 13 enfermedades


contagiosas cronicas que han sido demostradas que afectan y agravan profundamente la salud y que
conlleva a una reduccion en el nivel de educacion y desarrollo economico. Entre las infecciones de
ETDs endemicas en la region estan las enfermedades tropicales clasicas tales como las infecciones
por Geohelmintos, Chagas y Leishmaniasis, con altas tasas de prevalencia e intensidad. Estas
infecciones se sobreponen en zonas en donde existen altas tasas de otras enfermedades
contagiosas (tal como: VIH/SIDA y tuberculosis), desnutricion, anemia y otras causas de mortalidad y
morbilidad materno-infantil. Por ejemplo algunas estimaciones sugieren que globalmente, las ETDs
tienen como resultado 530,000 muertes anualmente (8). Cuando se mide en anos de vida perdidos
ajustados por incapacidad (DALYs), las enfermedades causadas por geohelmintos pueden tener
como resultado hasta 39 millones de DALYs anualmente del total de 56.6 millones de DALYs
causados por todas las ETDs

Las enfermedades parasitarias de localizacion intestinal en particular representan un grave problema


de salud publica especialmente en las zonas pobres y con carencias sanitarias. El impacto producido
por las Geohelmintiasis es inmenso, mundialmente alrededor de 2 billones de personas son
afectadas y unos 300 millones sufren enfermedad severa1. Alrededor de 400 millones de escolares
infectados en el mundo sufren secuelas fisicas e intelectuales como consecuencia de la anemia y
otras deficiencias nutricionales producidas por los parasitos, que se traducen en dificultades de
atencion y aprendizaje, ausentismo y repeticion de anos escolares2. En 2005, se estimo que
alrededor del 38% (215 millones de personas) de la poblacion de America Latina y el Caribe (ALC)
esta infectada con lombrices intestinales3.

La Leishmaniasis es endemica en 88 paises del mundo. Se estima que cada ano hay dos millones de
nuevos casos y el numero de personas afectadas sobrepasa los 12 millones. Puede producir danos
en organos internos, lesiones cutaneas y mutilacion de la nariz y la boca. En ALC, no se dispone de
datos fiables sobre la prevalencia y la incidencia de la Leishmaniasis debido principalmente a que la
transmision de la enfermedad se produce en zonas rurales remotas, numerosos casos no se
diagnostican, existe un gran numero de personas que son asintomaticas, y solo en 33 de los 88
paises endemicos la leishmaniasis es una enfermedad de notificacion obligatoria4.

La Enfermedad de Chagas, producida por el Trypanosoma cruzi, es uno de los mayores problemas de
salubridad en America Latina en la poblacion rural desatendida y postergada, al causar morbi-
mortalidad en aproximadamente 20 millones de personas, con una importante carga de enfermedad
para 21 paises endemicos.

La malaria o el paludismo es una enfermedad endemica en las zonas tropicales y subtropicales del
mundo, es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. En 2006 se
registraron segun las estimaciones unos 247 millones de casos de malaria entre 3300 millones de
personas en riesgo, produciendose como resultado casi un millon de muertes, principalmente de
menores de cinco anos. En 2008 habia 109 paises con malaria endemica, (World Malaria Report
2008). El parasito Plasmodium, que produce esta enfermedad es transmitido a traves de la picadura
de la hembra del mosquito Anopheles. Tambien puede ser transmitida por transfusion sanguinea, via
placentaria o durante el parto. Al igual que otras parasitosis las mujeres embarazadas y los ninos
menores de 5 anos son las poblaciones mas susceptibles a esta enfermedad. Manual POE, 2006).

1. Organización Mundial de la Salud (2003)La lucha contra las helmintiasis en los niños en edad escolar. Guía para los administradores de los programas de
lucha. A. Montresor, D.W.T. Crompton, T.W. Gyorkos and L. Savioli . OMS, Ginebra.
2. WHO 2006 Weekly epidemiological record. No. 16, 81, 145164 http://www.who.int/wer
3. Pan American Health Organization. Addressing Poverty and Exclusion in Latin America and the Caribbean: Prevention, Control and Elimination of the
Disease of Poverty. PAHO/WHO Regional Strategic Plan Framework 2006-2015. Documento en preparación. Octubre 2006.
4. OMS Consejo Ejecutivo EB118/4 118ª reunión 11 de mayo de 2006 Punto 5.1 del orden del día provisional.

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Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Introducción
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

SITUACIÓN ACTUAL DE LOS PARÁSITOS INTESTINALES


Y TISULARES EN HONDURAS.

En Honduras, la prevalencia e incidencia de geohelmintos es variable en las diferentes regiones del


país, y van desde más del 90% en algunas localidades de Gracias a Dios, Colón, Atlántida, Cortés,
etc. a una prevalencia menor del 30% en las regiones del sur (datos del Laboratorio Central,
Secretaria de Salud) que presentan condiciones bioclimáticas más adversas al desarrollo de los
huevos y larvas de estos parásitos en el medio ambiente. La prevalencia de Ascaris lumbricoides en el
país, alcanza a 36%, la de Trichuris trichiura a 51% y la de uncinarias a un 17%. En el municipio de
Santa Rita de Copán la prevalencia de estos geohelmintos es bastante alta, especialmente T. trichiura
con 64% y en Puerto Lempira la prevalencia de uncinarias es de 46%.

La Enfermedad de Chagas se conoce en el país desde los años sesenta, pero es reconocida como un
problema de salud pública solo a fines de los setenta y comienzos de los ochenta, cuando se
realizaron estudios seroepidemiológicos nacionales, que demuestraron la presencia de R. prolixus y
T. dimidiata, su asociación con el tipo de vivienda y la seroprevalencia de T. cruzi en diferentes zonas
de Honduras. En la actualidad, se estima una prevalencia nacional de infección por T. cruzi de 6,2%
en la población general y de 3% en escolares de áreas rurales5, la mayoría de los casos asociados a
transmisión vectorial. Actualmente la prevalencia serológica en donantes es de 1,4%.

En las áreas rurales de Honduras en el mes de abril de 2006, se detectó un total de 1.502 casos
acumulados de Leishmaniasis de los cuales 7 correspondieron a Leishmaniasis visceral. Sin
embargo, se asume que las cifras pueden ser mayores considerando que muchos casos no se
detectan o se reportan, al no ser de notificación obligatoria.

La malaria en el país es de baja transmisión y de forma estacional. Según los datos del Programa
Nacional de Prevención y Control de la Malaria del 2008 el Índice de Parasitemia Anual (IPA) fue de
1.07 por 1000 habitantes por Detección Pasiva de Casos (DPC). De los casos reportados el 92%
fueron producidos por Plasmodium vivax y 8% por Plasmodium falciparum y menos del 1% fueron
infecciones mixtas. Los departamentos que aportaron la mayor cantidad de casos fueron Gracias a
Dios, Olancho, Yoro, Islas de la Bahía, Colón y Atlántida.

Estos medios auxiliares se han elaborado para el fortalecimiento de la estructura de los laboratorios
de parasitología y el mejoramiento de calidad de los técnicos, microbiólogos y otro personal que
trabaja en el diagnóstico de parásitos en los laboratorios de salud pública en Honduras. En el presente
trabajo se ofrecen fotografías de parásitos intestinales y tisulares propios de Honduras, las cuales han
sido tomadas en laboratorios tanto de salud pública como de enseñanza. Además se presentan
algunos de los métodos utilizados para el diagnostico de los parásitos, los cuales servirán como
referencia en los laboratorios. Se espera que sea una ayuda inmediata y sencilla para el personal
técnico y profesional que trabaja en la Red Nacional de Laboratorios. Además puede ser usada como
una herramienta de capacitación

5. Informe de Actividades y Resultados Programa Nacional de Chagas, Asistencia de JICA Y PROMESAS/ACDI 2004. Secretaría de Salud, República de
Honduras. Http://www.paho.org/sapnish/ad/dpc/cd/dch-hon-pnch-2004.pdf

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Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 1 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Entamoeba coli, Entamoeba hartmani

Entamoeba coli. Entamoeba coli.


Trofozoíto en 100x. Tinción de Hematoxilina Trofozoítos en 100x. Examen en Fresco con
férrica. Lugol

Entamoeba coli. Entamoeba coli.


Quiste en 100x. Tinción de Hematoxilina Quiste en 100 x. Examen en Fresco con Lugol
Férrica

Entamoeba hartmani Entamoeba hartmani


Trofozoíto en 100 x. Muestra preservada con Quiste en 100x. Muestra preservada en MIF.
MIF.

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Examen Directo Microscópico: Lamina 1
Fundamento:
Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño
microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos; así como larvas o huevos de helmintos)

Materiales, Reactivos y Equipo.


Porta-objetos, 7.5 X 2.5 cm (3 X 2 pulgadas) limpio y seco.
Cubre-objetos, 22 X 22 mm, N° 1 ó N° 2.
Aplicador de madera sin algodón.
Marcador para vidrio.
Solución Salina.
Solución de lugol o MIF (Merthiolate, Iodo y Formalina).
Aceite de inmersión.
Papel lente.
Microscopio óptico con objetivos 10x, 40x, 100x.

Procedimiento:

1. Colocar en un extremo de la lámina porta objeto una gota de Solución Salina (suero fisiológico) y con ayuda de un
aplicador, agregar 1 a 2 mg de materia fecal, mezclar bien y cubrirla con una laminilla cubre objeto.

2. Colocar en el otro extremo de la lámina porta objeto una gota de lugol o MIF y proceder a la aplicación de la muestra
fecal, como en el párrafo anterior.

3. Con la Solución Salina, los trofozoítos y quistes de los protozoarios se observan en forma natural, y con lugol las
estructuras internas, núcleos y vacuolas.

4. Observar al microscopio con Objetivos de 10x, 40x y 100x. El conteo de huevos de Helmintos se hace con el
objetivo de 10x, y para reportar las estructuras de los protozoos, usar el objetivo de 100x.

5. Recorrer la lámina porta objeto siguiendo un sentido direccional, ejemplo: de derecha a izquierda, o de arriba a
abajo.

Resultado:

Los resultados se deberán reportar en la respectiva boleta y el libro de registro de la siguiente manera:

1. Protozoos: reportar el nombre del parásito y el estadio evolutivo encontrado, solo en el caso de Blastocystis
hominis se reporta mayor o menor de 5 parásitos por campo cuando se observa en 100x.

2. Helmintos: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y Uncinarias, cuantificar el número de huevos encontrados en
2mg de heces. El resto de los helmintos se reporta únicamente la presencia de huevos o larvas.

Fig. 1 Fig. 2
4/7/92

WHO 92611
224
4/7/92
224

WHO 92610

Fig. 4
Fig. 3
WHO 88611
22 9 2
4
/
4/7

WHO 92612
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 2 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Blastocistis hominis

Endolimax nana Endolimax nana

Trofozoíto en 100x. Examen en Fresco con Quiste en 100x. Tinción de Hematoxilina


Lugol Férrica

Iodamoeba buschlii Iodamoeba buschlii


Trofozoíto en 100x. Examen en Fresco con Quiste en 100 x. Muestra preservada con MIF
Lugol

Blastocystis hominis Blastocystis hominis


100 x. Examen en Fresco con Lugol 100x. Muestra preservada en MIF.

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Clave para la identificación de Amebas Comensales Lamina 2

PARÁSITO DESCRIPCIÓN ESQUEMA


Quiste:
10-33 micras
Forma esférica, posee vacuolas de glucógeno,
de 1 a 8 núcleos, cuerpos cromatoidales
astillados en ambos extremos

Entamoeba coli
Trofozoito:
15-50 micras
Con pseudópodos cortos, citoplasma granuloso
con numerosas vacuolas y otras inclusiones ,
núcleo con cromatina nuclear irregular y gruesa,
cariosona grande y excéntrico,
Quiste:
5-10 micras
Forma esférica, con vacuolas de glicógeno
difusas, de 1 a 4 núcleos, cuerpos cromatoidales
numerosos de forma variada.

Entamoeba hartmani
Trofozoíto:
4-12 micras
Citoplasma granulado y vacuolado, con
pseudópodos digitiformes; cromatina nuclear
gruesa y cariosoma grande.

Quiste:
5-14 micras
Ovoides, esféricos, citoplasma refringente con
gránulos finos, con 1 a 4 núcleos sin cromatina
periférica y cariosoma grande.

Endolimax nana
Trofozoíto:
6-15 micras
Citoplasma granuloso fino, membrana nuclear
sin cromatina interna, cariosoma grande central
o excéntrico.

Quiste:
5-20 micras
Irregular, vacuola de contorno definido y se tiñe
frecuentemente con lugol, un núcleo con
membrana nuclear poco definida y cariosoma
grande central o excéntrico.
Iodamoeba butschilii
Trofozoíto:
8-20 micras
Citoplasma vacuolar, membrana nuclear sin
gránulos de cromatina, cariosoma grande central
o excéntrico.

Forma Vacuolar:
Esférica de tamaño variable (5-30 micras).
Cuerpo o vacuola central, anillo de gránulos
Blastocystis hominis
periféricos, de 1-4 núcleos. Se observan en las
heces formadas.
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 3 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmani

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar


Trofozoíto en 100x. Examen Tinción de Quiste en 100x. Tinción de Hematoxilina
Hematoxilina Férrica. Férrica.

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar Entamoeba hartmani


Trofozoíto en 100x. Examen en Fresco con Trofozoíto en 100 x. Muestra preservada con
Lugol. MIF.

Balantidium coli Balantidium coli


40 x. Muestra preservada en MIF. 40x. Muestra preservada en MIF.

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Diferencias entre Entamoeba histolytica Lamina 3
y Entamoeba dispar

En 1993 se publicó una redescripción formal de Entamoeba histolytica distinguiendole de Entamoeba dispar. Esto
sucedió debido a que ambas tienen estadios morfológicamente indistinguibles al microscopio de luz, pero E. histolytica
es capaz de causar enfermedad invasiva intestinal y extraintestinal, ya que es un patógeno de virulencia variable,
mientras que E. dispar se denomina como un patógeno avirulento incapaz de invadir tejidos.

Por mucho tiempo ambas especies venían siendo diagnosticadas como E. histolytica, pero algunos estudios han
demostrado que son dos especies distintas. E. histolytica es capaz de producir enfermedad por mecanismos invasivos
en localizaciones extraintestinales, como absceso hepático e invasión interna de otros órganos y tejidos.

Las infecciones por E. histolytica se producen en todo el mundo, más frecuentemente en regiones tropicales y
subtropicales. En Honduras el hallazgo de quistes en heces se reporta con una frecuencia moderada que oscila entre
el 10 y el 15%; la mayoría de las cuales son infecciones asintomáticas que pudieran ser debidas a cepas virulentas de
E. histolytica o a E. Dispar.

Estas amebas pasan por las siguientes fases en su ciclo vital: trofozoíto, prequiste, quiste, metaquiste y trofozoíto
metaquistico. Pero para fines prácticos solo nos referimos a ellos como trofozoítos, prequistes y quistes.

ESTADIO DESCRIPCIÓN ESQUEMA


Los trofozoítos vivos tienen dimensiones
variables que fluctuan entre 10 y 60 micras, los
trofozoítos evacuados en las heces disentéricas
son por lo general relativamente grandes, y los
trofozoítos presentes en las heces pastosas
normales de personas asintomáticas son más
pequeños.
Trofozoíto Se puede diferenciar un ectoplasma externo
claro y un endosplasma central finamente
granulado en el que se observan a veces
vacuolas digestivas y glóbulos rojos ingeridos.
El núcleo es esférico, la membrana nuclear
interna está rodeada de una masa de cromatina
que se distribuye en pequeños gránulos, y un
cariosoma pequeño y central.

Cuando los trofozoítos están listos para


enquistarse, expulsan de su interior todas las
vacuolas digestivas, se redondean y comienzan
Prequistes a formar la pared quística. En estas formas, el
núcleo se observa más grande con relación al
cuerpo de la ameba, ocupando hasta una cuarta
parte del interior.

Los quistes suelen ser esféricos u ovoides y su


diámetro oscila entre 10 y 20 micras.

Los quistes inmaduros poseen de uno a tres


núcleos, e inclusiones citoplasmáticas como
vacuolas de glicógeno y barras cromatoidales.
Las barras cromatoidales o cuerpos
cromatoidales son estructuras refractarias que
Quistes en E. histolytica tienen forma de bastones con los
extremos redondeados, y que con la coloración
de hematoxilina férrica se tiñen de negro.

Los quistes maduros son los que presentan


cuatro núcleos y ya no poseen inclusiones como
vacuolas o barras cromatoidales.
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 4 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Giardia lamblia, Trichomonas hominis, Chilomastix mesnili

Giardia intestinalis (lamblia) Giardia intestinalis (lamblia)


Trofozoíto en 100x. Muestra Preservada en Trofozoíto en 100x. Muestra Preservada en
MIF. MIF.

Chilomastix mesnili Chilomastix mesnili


Quistes en 100x. Muestra Preservada en MIF. Trofozoíto en 100 x. Muestra Preservada con
MIF

Trichomonas hominis Chilomastix mesnili


Trofozoito en 100x. Muestra preservada en Quiste en 100x. Muestra preservada en MIF.
MIF.

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Clave para la identificación de Flagelados Lamina 4

PARÁSITO DESCRIPCIÓN ESQUEMA


Trofozoíto:
Es redondeado en la porción anterior y afilado en la parte posterior.
Es convexo dorsalmente y en su porción ventral está provisto de una
concavidad superficial y ligeramente ranurada (el disco suctorio),
que ocupa casi toda la mitad anterior del cuerpo del parásito. De
perfil es mucho más delgado que cuando se observa de frente, el
tamaño de los trofozoítos es variable de 9 a 21 micras de largo y de 5
Giardia a 15 micras de ancho. En el cuarto anterior posee dos núcleos, uno a
intestinalis cada lado de la línea media, son ovoides y con un cariosoma central.
(lamblia) También se observan cuatro pares de flagelos.

Quiste:
Es ovoide y mide de 8 a 12 micras de largo por 7 a 10 micras de
ancho. Su citoplasma es granuloso fino y está separado claramente
de su pared quística. Los quistes inmaduros poseen dos núcleos,
los quistes maduros poseen cuatro núcleos. Los demás organelos:
flagelos: flagelos, disco suctorio, axonema, etc., se retraen y se
incluyen en el quiste.

Trofozoíto:
Los trofozoítos de T. hominis en preparaciones en fresco son
piriformes, miden de 5-14 micras de longitud y su movimiento es
rápido y sin dirección. Posee 4 flagelos anteriores libres y uno más
que bordea la membrana ondulante que le da un movimiento
Trichomonas rotatorio. El axostilo es visible y semirígido y sobresale en el extremo
hominis posterior. Se observa un citostoma opuesto a la membrana
ondulante y un núcleo localizado en la región anterior.

En los trofozoítos vivos se facilita el diagnóstico al observar el


movimiento de la membrana ondulante, debido a que cuando están
fijos o coloreados difícilmente se observa.

Trofozoíto
Los trofozoítos de Chilomastix mesnilii son asimétricamente
piriformes, aplanándose hacia el extremo posterior, mide de 6 a 20
micras, posee un núcleo esférico situado en la parte anterior; a uno
de los lados del núcleo se ve el citostoma e inmediatamente por
delante del núcleo se encuentran 3 flagelos anteriores libres, 2
cortos y uno largo.

Chilomastix
mesnilii

Quiste
Los quistes tienen forma de pera o de limón, son incoloros y meden
de 7 a 10 micras de ancho con una pared gruesa y resistente: el
citoplasma es densamente granular y por lo general separado de la
pared quística; posee un núcleo, en ocasiones 2, grande vesicular y
a veces se observan las fibrillas a ambos lados del citoplasma.

Trofozoíto
Trichomonas vaginalis es un flagelado cuyo hábitat es la vagina y las
glándulas prostáticas. Solo presenta el estadio de trofozoíto que
mide de 7 a 23 micras; la membrana ondulante es relativamente
Trichomonas corta y el citostoma pequeño. Presenta 4 flagelos libres y un quinto
vaginalis flagelo que bordea la membrana ondulante.

El trofozoíto de T. vaginalis se observa en preparaciones en fresco


de secreción vaginal, descargas uretrales, líquido prostático o
centrifugados de orina.
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 5 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Cryptosporidium spp., Cyclospora spp, Isospora belli

Cryptosporidium spp Cryptosporidium spp


Ooquistes en 100x. Tinción de Ziehl Neelsen Ooquistes en 100x. Examen en Fresco con
Modificada. Lugol.

Cyclospora spp Isospora belli


Ooquistes en 100x. Muestra preservada en Ooquiste en 10 x. Muestra preservada con
MIF. MIF.

Isospora belli Isospora belli


Ooquiste en 100 x. Muestra preservada con Ooquiste en 100 x. Muestra preservada con
MIF. MIF.

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Método de Flotación por Sheather Lamina 5
Fundamento: Se basa en la flotación de quistes, ooquistes y huevos de parásitos en una solución de azúcar que
posee mayor densidad que ellos. Esta técnica es útil para la concentración de quistes y ooquistes de protozoos y
huevos de helmintos y se usa como método preferencial en el diagnóstico de los coccidios: Cryptosporidium,
Cyclospora, Isospora, etc. El hallazgo de Isospora belli requiere informe inmediato al médico.

Materiales, Reactivos y Equipo


Solución concentrada fenolada de azúcar
Vasitos de vidrio para preparar suspensión
Portaobjetos ( 3x1 pulgada o 3x2 pulgadas)
Cubreobjetos (22 x 22 mm)
Marcador
Aplicadores de madera sin algodón
Frasco con desinfectante
Guantes

Preparación de Reactivos:
Solución concentrada fenolada de azúcar
1. Azúcar en cristales 500g
2. Agua destilada 320ml
3. Fenol en cristales 6.5g

Disolver el azúcar en el agua destilada, usando calor sin dejar llegar a ebullición, dejar enfriar. Filtrar por gasa, agregar
el fenol y agitar hasta disolución, guardar en frasco tapado y rotulado.

Procedimiento:
1. Identificar los portaobjetos con la muestra a examinar
2. Agregar la solución concentrada hasta la mitad del vasito de vidrio
3. Hacer una suspensión de una pequeña porción de heces(1gr) con la ayuda de un aplicador
4. Llenar el vasito con la solución azucarada hasta el borde
5. Colocar un portaobjeto o cubreobjeto previamente rotulado sobre el vasito de vidrio y dejar reposar por
6. 30 minutos.
7. Remover el portaobjeto o cubreobjeto cuidadosamente y cubrir con el cubreobjeto o portaobjeto
8. Examinar la muestra en objetivo de 10x

Método de Formol-Eter
Fundamento: Concentrar huevos y larvas de helmintos, ooquistes y quistes de protozoos en las heces. Se recurre a
este método cuando en el examen directo no se observan parásitos.

Materiales, Reactivos y Equipo


Vasitos de plástico o cartón
Tubos cónicos 13x100 mm
Aplicadores de madera sin algodón.
Embudos de 5 cm
Gasa
Parafilm o tapones de hule
Solución de formalina al 10%
Eter o acetato de etilo
Portaobjetos 7.5x2.5 cm
Cubreobjetos
Gradilla para tubos
Pipeta graduada de 5 ml
Solución de lugol
Frasco con desinfectante
Guantes

Preparación De Reactivos:
Formalina al 10%:
1. Formaldehído 10 ml
2. Solución salina 0.85% 90 ml
Mezclar y guardar en frasco tapado

Procedimiento:
1. Rotular frascos, tubos y laminas con la muestra a examinar
2. Transferir 1-2 gr de heces a un vaso de plástico o cartón y agregar 10 ml de formalina.
3. Suspender completamente las heces con ayuda de aplicadores y dejar fijar por 30 minutos
4. Filtrar con gasa a un tubo cónico
5. Centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos
6. Decantar el sobrenadante
7. Agregar más formalina al sedimento agitando este con un aplicador, hasta la mitad del tubo
8. Agregar 2-3 ml de éter
9. Tapar el tubo y agitar vigorosamente por 15 segundos
10. Centrifugar a 1500 rpm por 2 minutos
11. Destapar con cuidado y con un aplicador desprender el tapón de detritus de las paredes del tubo y decantar el
sobrenadante de un solo movimiento
12. Transferir el sedimento a un portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos y examinar toda la preparación con objetivo
de 10x, 40x y 100x.
13. Para colorear quistes, agregar una gota de lugol
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 6 Helmintos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Ascaris lumbricoides

Ascaris lumbricoides Ascaris lumbricoides


Huevo Fértil en 40x Muestra Preservada en Huevo embrionado en 40x Muestra
Formalina. Preservada en Formalina.

Ascaris lumbricoides Ascaris lumbricoides


Huevo Fértil en 40x Muestra Preservada en Huevo Infértil en 40 x Muestra Preservada con
Formalina. MIF.

Ascaris lumbricoides Ascaris lumbricoides


Huevo Fértil en 40x. Kato Katz. Huevo Infértil en 40 x Muestra Preservada en
Formalina.

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
Método de Kato Katz (Frotis fecal grueso en celofán) Lamina 6
Fundamento: Este método es útil para estimar la intensidad de la infección. Se utiliza para la elaboración de encuestas
de helmintos intestinales. Presenta algunas ventajas como el no diluir las heces, utiliza materiales accesibles, una vez
preparado puede transportarse en el campo y puede guardarse por varios meses.

Materiales, Reactivos y Equipo:


Aplicadores de madera.
Rejilla de acero inoxidable, nylon o plástico.
Plantilla de acero inoxidable, plástico o cartón. La plantilla de 1 mm de espesor con un agujero de 9 mm suministra
50 mg de heces, la de 1.5 mm de espesor con un agujero de 7 mm, 41.7 mg de heces y la de 0.5 mm de espesor con
un agujero de 6.5 mm, 20 mg de heces. Las plantillas deben estar estandarizadas en el país. Siempre se debe
utilizar el mismo tamaño a fin de que los datos de prevalencia e intensidad sean comparables y reproducibles.
Espátula de plástico.
Portaobjeto (75x 25 mm)
Tiras de celofán hidrófilo de 25x30, o 25x35 y 50-50µ de espesor
Tarro de fondo plano con tapa
Pinzas
Papel higiénico o absorbente
Papel de periódico
Solución de glicerina-verde de malaquita o de glicerina-azul de metileno
Guantes

Procedimiento:

1. Deposite una pequeña cantidad de heces sobre un papel de periódico u otro papel ordinario y colóquese encima la
rejilla, haciendo presión para que parte de las heces pase a través y aparezca en la parte superior (fig. 3)

2. Ráspese la superficie de la rejilla con una espátula plana para recoger las heces que han pasado a través de
aquella. (fig. 4)

3. Colóquese la plantilla agujereada en el centro de un portaobjeto y deposítese el material fecal de la espátula en el


agujero hasta llenarlo por completo (fig. 5) Elimínese el material que sobresalga pasando sobre el agujero el borde
de la espátula (tanto ésta como la rejilla, pueden desecharse luego o si se lavan cuidadosamente, volver a
utilizarse)

4. Retírese con cuidado la plantilla, de manera que el material fecal quede sobre el portaobjeto formando un pequeño
cilindro.

5. Cúbrase el material fecal con una tira de celofán humedecida con glicerina (fig. 6). El celofán debe estar muy
húmedo si las heces son secas y no tanto si las heces son blandas (si hay un exceso de solución de glicerina en la
cara superior de la tira, empápese con papel higiénico). En los climas secos el exceso de glicerina retrasa pero no
impide la desecación.

6. Inviértase el portaobjetos y comprímase bien la muestra fecal contra la tira de celofán hidrófilo sobre otro
portaobjeto o alguna otra superficie lisa. El material fecal deberá quedar uniformemente extendido entre el
portaobjeto y la tira de celofán (fig. 7). Una vez aclarado, los caracteres de imprenta de periódico deben ser visibles
a través del frotis. (Fig. 8).

7. Retírese el portaobjeto, deslizándolo con suavidad hacia un lado para que no se desprenda el celofán, o
levantándolo cuidadosamente. Colóquese el portaobjeto sobre la mesa con el celofán hacia arriba. El agua se
evapora mientras la glicerina aclara las heces.

224
4/7/92

Fig. 7 WHO 92622

Fig. 4 WHO 92619

Fig. 1 WHO 92616


L´ARSENAL
PHNOM PENH CHIMIQUE VA
LES KHMERS ÉTRE DÉTRUIT
ROUGES Le dirigeant Homey your
WHO 92617

REVIENNEN Khieu Sampha es revent


Le dirigeant Homey your jeudi a phnorn awre es
Khieu Sampha es revent ponsable s des hebor
jeudi a phnorn awre es Unies et du Camerum en
ponsable s des hebor chef de ndsflewfflf ldd fj
WHO 92620
Unies et du Camerum en jshsjsf sjfsiwoqie djiiueh
chef de ndsflewfflf ldd fj Cambodge (PRONUC) ya
jshsjsf sjfsiwoqie djiiueh sushi Akashi avait exe le 2
Fig. 8 Cambodge (PRONUC) ya lddfh jhdgfhds dsbf bfds f
Fig. 5 sushi Akashi avait exe le 2 whity che de la mission.
WHO 92623

Fig. 2
2
22 4
7/ 9
4/

WHO 92621
Fig. 6

WHO 92618

Fig. 3
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 7 Helmintos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Uncinarias, Strongyloides stercoralis

Trichuris trichiura Trichuris trichiura


Huevo Fértil en 40x Muestra Preservada en Huevo Fértil en 40x Muestra Preservada en
Formalina Formalina

Uncinarias Uncinarias
Huevo Fértil en 40x Muestra Preservada en Huevo Infértil en 40 x Muestra Preservada con
Formalina MIF

Strongyloides stercolaris Enterobius vermicularis


Larva L1R (Larva de Primer estadio Huevo en 40 x Método de Graham o de la Cinta
Rabditoide) 40x Muestra preservada en Adhesiva

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
Estimado de la Intensidad de Infección; Lamina 7
Conteo de Huevos de Nemátodos Transmitidos
por el Suelo

Propósito:

1. Estimar la intensidad de una infección intestinal por Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Uncinarias del
humano en forma práctica, en una cantidad conocida de heces.

2. Evaluar la efectividad de tratamiento terapéutico. Se asume que la producción de huevos estará en relación directa
con el número de hembras fecundas que deponen huevos.

3. Una variable importante para determinar la intensidad puede ser: clínica, epidemiológica, para encuestas,
evaluación terapéutica, etc.

Métodos:
Los más utilizados son:
Método directo, en frotis (2mg) de heces
Método de concentración por Kato- Katz en 41.7 mg de heces
Cuenta directa de gusanos adultos expulsados después del tratamiento
Método de dilución de Stoll, en 1 gr. de heces.

Interpretación de los datos del recuento de Huevos de Geohelmintos:


Estimados de intensidad de infecciones son muy variables y dependerán de la edad, estado nutricional y dieta del
individuo parasitado, duración de la infección, número de gusanos, especie de uncinaria, presencia de otros parásitos,
fibra, grasa, moco, eficiencia técnica del examinador.

Para fines clínicos; cualquier tipo de infección por Ascaris debe tratarse; infecciones por Trichuris y Necator con
cuentas de 5 huevos/2 mg de heces o menos no tienen importancia clínica (leves); una cuenta de 5 huevos/2mg de
heces para Ancylostoma ya podría ser importante clínicamente; cuentas de más de 25 huevos/2 mg de heces o 2500
huevos/gr para Necator y 40 huevos/2mg o 20,000 huevos/gr para Trichuris (severas) producen síntomas clínicos
importantes. La tendencia actual es tratar todas las infecciones.

Interpretación del Recuento de Huevos de Geohelmintos según Métodos de Laboratorio.


Umbrales de intensidad para la clasificación de la infección de nemátodos transmitidos por el suelo (NTS) o
geohelmintos por el método de kato-Katz huevos por gramo de heces.

Cuadro 1

Especie Infección Leve Infección Moderada Infección Severa


A. lumbricoides 1- 4,999 hpg 5,000- 49,999 hpg >50,000 hpg
T. trichiura 1- 999 hpg 1,000- 9,999 hpg >10,000 hpg
Uncinarias* 1- 1,999 hpg 2,000- 3,999 hpg >4,000 hpg
*Depende de la especie de Uncinaria del humano
hpg= Huevos por gramo de heces
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 8 Helmintos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Taenia spp., Hymenolepis nana

Taenia spp Hymenolepis nana


Huevo en 40x Muestra Preservada en Huevo en 40x Muestra Preservada en
Formalina Formalina

Taenia solium Taenia saginata


Proglótide maduro en 4x Tinción de Carmín. Proglótide Maduro en 4x Tinción de Carmín.

Taenia solium Taenia saginata


Escolex en 4x Tinción de Carmín. Escolex en 4x Tinción de Carmín

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
Método de Baermann: Lamina 8
Fundamento: Este es un método para la concentración de larvas rabditoides y filariformes. Es un método muy
conveniente para hacer una buena concentración de larvas; en parasitología médica se utiliza para concentrar larvas
de Strongyloides y Uncinarias.

Materiales Reactivos y Equipo:


Agua de la llave
Lugol
Vaso de precipitados de 100 ml
Tubos de centrifuga de 13x100 mm
Porta-objetos, 7.5 X 2.5 cm (3 X 2 pulgadas) limpio y seco
Cubre-objetos, 22 X 22 mm, N° 1 ó N° 2
Embudo de vidrio o polietileno de 7.5 cm de diámetro
Termómetro graduado de 0 °C a 100 °C
Microscopio óptico
Centrifugas
Mechero
Pinzas de mohr
Gasa cortada en cuadros de 12 cm de lado
Baja lenguas

Procedimiento:

1. Se arma el dispositivo

2. Se llena el embudo con agua, que previamente se calentó a 50° C de tal manera que la malla y la gasa Se mojen.

3. Se coloca la materia fecal sobre la malla y la gasa.

4. Se deja reposar durante 2 horas para que las larvas pasen al agua del embudo.

5. Pasadas las dos horas, se abre la pinza, dejando salir el agua y se recibe en el vaso de precipitados.

6. Con una pipeta Pasteur, se toma una gota del agua y se coloca entre porta y cubre y se examina con el
microscopio.

7. Si la muestra está positiva, el agua que se encuentra en el vaso de precipitados se centrifuga durante 5 minutos a
1500 rpm y se toman los sedimentos y se buscan las larvas. De encontrarse son muy móviles, por lo que se
recomienda agregar una gota de lugol para facilitar la observación.

Gasa con Heces


Nivel
de agua

Agua

Vaso de
sedimentación
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 9 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Leishmania

Leishmania spp Leishmania spp


Promastigotes de cultivo en 40x. Tinción de Amastigotes de Raspado de Piel en 100x.
Wright Tinción de Wright

Leishmania spp Leishmania spp


Amastigotes de Raspado de Piel en 100x. Amastigotes de Raspado de Piel en 100x.
Tinción de Wright Tinción de Wright

Leishmania spp Leishmania spp


Amastigotes de Biopsia de Tejido en 100x. Amastigotes de Biopsia de Tejido en 100x.
Tinción de Wright Tinción de Wright

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
En Honduras ocurren las tres formas clínicas de Lamina 9
leishmaniasis: cutánea, mucocutánea y visceral.
1. Leishmaniasis cutánea ulcerada:

Se presenta con lesiones únicas o múltiples con diferentes manifestaciones clínicas (lesiones ulcerosas, nodulares,
costrosas, verrucosas). Las lesiones pueden ser pequeñas o de gran extensión. Es una enfermedad estigmatizante
por las cicatrices que quedan una vez tratada. El promedio anual de casos es de 1500 notificados, aún cuando existe
un sub-registro. Los primeros casos fueron reportados en 1928 en la Costa Atlántica. Es causada por Leishmania
braziliensis y Leishmania panamensis y posiblemente por Leishmania mexicana. Las zonas endémicas más
importantes comprenden municipios de los departamentos de Olancho, Yoro, El Paraíso, Santa Bárbara, Cortés,
Atlántida, Colón y Gracias a Dios.

2. Leishmaniasis mucocutánea:

Generalmente es una consecuencia a una leishmaniasis cutánea ulcerada reciente o padecida mucho tiempo atrás.
Causa una severa destrucción, particularmente de la mucosa orofaringea y/o nasal. Los pacientes requieren atención
especializada y muchas veces necesitan cirugía reconstructiva Es causada por Leishmania braziliensis, y Leishmania
panamensis. En Honduras ocurre en las mismas áreas endémicas de leishmaniasis cutánea ulcerada y se observa
con más frecuencia y severidad en varios municipios de los departamentos de Yoro, Olancho y El Paraíso.

3. Leishmaniasis Visceral:

Es la forma más grave, afecta particularmente a niños menores de 5 años, la mayoría menores de 2 años en los que se
desarrolla un cuadro febril con una hiperplasia reticuloendotelial, los parásitos invaden el bazo, hígado y médula ósea
dando lugar a una esplenomegalia, hepatomegalia y pancitopenia (anemia, leucopenia y trombocitopenia). De no ser
diagnosticada oportunamente y tratada adecuadamente, tiene una mortalidad mayor al 90.0 %. En Honduras se
conoce desde 1974, y hasta la fecha se han registrado aproximadamente 300 casos y es causada por Leishmania
chagasi. Las zonas endémicas comprenden municipios de los departamentos de Choluteca, Valle El Paraíso,
Francisco Morazán, La Paz, Intibucá y Lempira.

4. Leishmaniasis Cutánea no Ulcerada:

Relacionada con la forma visceral, también se presenta en el país una forma cutánea no ulcerada conocida desde
1991. Es una enfermedad de evolución clínica muy lenta con lesiones no ulceradas en forma de pequeños nódulos o en
algunos casos de placas extensas, que afecta principalmente población de 6 a 15 años y que también se conoce en
otros países de América Central y del Mediterráneo. (Lancet 337: 67-70. 1991). Desde que se describió en el país se
tiene un registro de aproximadamente 6000 casos. Es causada por Leishmania chagasi y ocurre en las mismas áreas
endémicas de leishmaniasis visceral.

Distribución de las diferentes formas de


Leishmaniasis,
República de Honduras

N
Leishmaniasis Cutanea
W E ulcerada y Mucocutánea

Leishmaniasis Cutanea no
S ulcerada y visceral
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 10 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Trypanosoma cruzi

Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi


Tripomastigote Sanguíneo en 100x. Tinción de Tripomastigote Sanguíneo en 100x. Tinción de
Wright Wright

Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi


Tripomastigote Sanguíneo en 100x. Tinción de Epimastigote de cultivo en 100x. Tinción de
Wright Wright

Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi


Amastigotes en Nido Chagásico en 100x. Amastigotes en Nido Chagásico en 100x.
Tinción de Wright Tinción de Wright

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
Coloración de Wright: Lamina 10
Solución de Wright:
Wright en polvo (certificado) 3 g
Alcohol metílico absoluto 970 mL
Glicerina 30 mL

En un mortero colocar el Wright agregar la glicerina poco a poco; macerar hasta obtener una pasta homogénea suave.
Transferir a un frasco color ámbar diluyendo con alcohol metílico hasta eliminar todo el colorante del mortero. Agitar el
frasco ámbar para lograr una mezcla completa, dejar madurar por una semana (se logra una mejor maduración si se
incuba a 37o C). Mezclar por lo menos dos veces al día durante la maduración. Filtrar antes de su uso y almacenar de
manera fraccionada en frascos ámbar, bien identificados y enumerados. La solución que está en uso se debe colocar
en un frasco gotero. Para colorear utilizar solución amortiguadora de pH 6.8.

Coloración del extendido fino (Wright):

1. Cuando el extendido fino se colorea con coloración de Wright, no es necesario fijarlo con metanol puesto que la
solución de Wright contiene suficiente cantidad de metanol para fijar y colorear la muestra simultáneamente.

2. Agregue el número de gotas de colorante que sean necesarias para cubrir la muestra. Coloree por 1-3 minutos (el
tiempo óptimo de coloración variará con cada botella de colorante).

3. Agregue un número igual de gotas de solución amortiguadora pH 6.8 sobre la muestra, asegurándose que el
colorante y la solución se mezclan (puede ayudar soplando sobre la superficie). Colorear durante 4-8 minutos

4. Lavar con agua corriente del grifo o con una pizeta. Dejar secar y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión.

Limpieza y almacenamiento de las láminas portaobjetos.

Las láminas portaobjetos son suministradas en cajas de 50 o 72 unidades. Aunque en la caja se describan como
“lavadas” o “pre-limpiadas”, las láminas deben ser lavadas adecuadamente, secadas y envueltas. No es posible hacer
gotas gruesas o extendidos finos de buena calidad sobre láminas sucias. Las muestras que se preparan sobre láminas
sucias o grasosas, se desprenderán fácilmente durante la coloración. Por lo tanto, no se deben utilizar láminas que
tengan una sombra iridiscente o que aparecen opacas, que no estén limpias o que estén viejas, con rayones en su
superficie o bordes astillados. Para limpiar las láminas portaobjetos se necesita:
1) Un recipiente grande de material plástico,
2) gasa,
3) detergente de buena calidad en polvo o líquido,
4) dos a cuatro retazos de tela de algodón seca, limpia y que no forme pelusa, y
5) agua limpia.

Láminas nuevas: Todas las láminas nuevas deben lavarse con detergente y agua limpia. Después de ser puestas en
remojo por un período de 30-60 minutos, las láminas deben ser lavadas bajo agua corriente o en varios cambios de
agua limpia. Cada lámina debe ser secada y pulida individualmente con un retazo de tela seca, limpia y que no forme
pelusa. Las láminas limpias solamente deben manejarse tocándolas de los bordes para evitar que se deposite sucio o
grasa en su superficie.

Láminas usadas: Para lavarlas se deben sumergir por uno o dos días en agua con detergente. Cuando sea posible se
debe utilizar agua caliente. Después deben limpiarse uno por uno con la gasa. Se deben remover todos los restos de
muestra, colorante y aceite de inmersión. No se deben dejar las láminas en detergente por más del tiempo indicado. Si
el agua se evapora, el detergente se deposita en la superficie de las láminas y es casi imposible removerlo. Después de
limpiadas, las láminas deben colocarse en una solución nueva de Agua y detergente y después de una hora ser
lavadas bajo agua corriente o varios cambios de agua limpia.

Cada lámina debe ser secada y pulida individualmente como descrito arriba. Las láminas que se clasifiquen
inapropiadas (rayadas, opacas, bordes astillados), deben descartarse.

Almacenamiento de las Láminas:


Para almacenar correctamente las láminas se necesita:
1) Hojas de papel limpio y delgados de aproximadamente 11 x 15 cm
2) Cajas de papel limpio y delgado de láminas vacías
3) Bandas elásticas o cinta adhesiva-

Las láminas limpias deben empacarse en paquetes de 10 láminas envueltas en papel. Cada paquete puede
Asegurarse con bandas elásticas o cinta adhesiva. Los paquetes pueden colocarse en las cajas de láminas para ser
enviados al campo. Las láminas deben almacenarse en lugares secos. Si se almacenan en lugares calientes y
húmedos, las láminas se pegaran entre ellas después de unas semanas y solo será posible separarlas si se lavan
nuevamente y son secadas. No deben secarse al fogón
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 11 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Plasmodium vivax

Plasmodium vivax Plasmodium vivax


Trofozoitos en Anillo en Extendido Fino. Trofozoitos en Anillo en Gota Gruesa.
Coloración de Giemsa. 100x Coloración de Giemsa. 100x

Plasmodium vivax Plasmodium vivax


Gametocitos. Extendido Fino. Coloración de Gametocito en Extendido fino. Coloración de
Giemsa. 100x Giemsa. 100x

Plasmodium vivax Plasmodium vivax


Esquizonte en Extendido Fino. Coloración de Esquizonte en Gota Gruesa. Coloración de
Giemsa. 100x Giemsa. 100x

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MICROBIOLOGIA
U N A H
Honduras
Coloración de Giemsa: Lamina 11
Preparación de colorantes y soluciones: Giemsa y Solución Amortiguadora

1. Solución de Giemsa (1000 mL)


Giemsa en polvo (certificado) 6.0 g
Glicerina pura 500.0 mL
Alcohol metílico absoluto (libre de acetona) 500.0 mL

Mezclar el Giemsa en polvo poco a poco con la glicerina en un mortero. Recoger en un frasco resistente al calor
(erlenmeyer o beaker) que contenga unas 50 perlas de vidrio y disolver a baño maría a una temperatura de 55 a 60 o C
por dos horas; agitar suavemente a intervalos de 30 minutos. Con una parte del alcohol metílico se lava los restos de
reactivo que quedaron en el mortero y se recogen en una botella obscura que contenga perlas de vidrio y que pueda
cerrarse herméticamente. Esperar que la mezcla del baño maría se enfríe para agregarle el resto del alcohol. Mezclar
bien y agregarlo a la botella obscura, continuar agitando. Almacenar durante al menos 2 semanas antes de usarlo.
Mantenerse siempre bien cerrado y filtrar la solución antes de usarla (papel Whatman No. 1). Cuando se prepara una
mayor cantidad, se recomienda fraccionar el colorante en varias botellas de 500 mL bien rotuladas y enumeradas. En
el Cuadro No. 1 se señalan las proporciones para preparar diferente volumen del colorante.

Proporción de reactivos para la preparación de colorante Giemsa

Giemsa en polvo Metanol (mL) Glicerina (mL) Volumen total


(gramos) (mL)
0.6 50 50 100
6 500 500 1000
12 1000 1000 2000
24 2000 2000 4000

2. Soluciones amortiguadoras

Solución amortiguadora A
NaH2PO4 (H2O) (Solución ácida) 9.2 g
Agua destilada 1000 mL

Disolver la sal (fosfato sódico monobásico) en una pequeña cantidad de agua destilada. Una vez disuelta agregar
agua hasta completar 1000 mL. Mezclar bien e identificar. Esta sal se puede sustituir por fosfato potásico (KH2PO4).

Solución amortiguadora B
Na2HPO4 (Solución básica o alcalina) 9.5 g
Agua destilada 1000 mL

Disolver la sal (fosfato sódico dibásico) en una pequeña cantidad de agua destilada. Una vez disuelta agregar agua
hasta completar 1000 mL. Mezclar bien y guardar en frasco rotulado.

La solución amortiguadora para la coloración con Giemsa se prepara a partir de estas dos soluciones mezcladas en
proporciones que producen un pH en el rango de 7.0 a 7.2. En el Cuadro No. 2 se señalan las proporciones.

Proporciones de reactivos para la preparación de solución amortiguadora.

pH Solución Alcalina Solución Acida Agua destilada (mL)


Na2HPO4 (mL) NaH2PO4 (mL)
6.8 49.6 50.4 900

7.0 61.0 39.0 900

7.2 72.0 28.0 900

Ejemplo: para preparar 100 mL de solución amortiguadora pH 7.0, las proporciones son: 6.1 mL de solución alcalina y
3.9 mL de solución ácida y completar a 100 mL con agua destilada.
Medios Auxiliares para el Diagnostico de
Lamina 12 Protozoos
Parásitos Intestinales y Tisulares en Honduras

Plasmodium falciparum

Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum


Trofozoitos en Anillo en Extendido Fino. Trofozoitos en Anillo en Gota Gruesa.
Coloración de Giemsa. 100x Coloración de Giemsa. 100x

Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum


Trofozoítos en Anillo. Extendido Fino. Gametocito en Gota Gruesa. Coloración de
Coloración de Giemsa. 100x Giemsa. 100x

Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum


Gametocito en Extendido Fino. Coloración de Gametocitos en Gota Gruesa. Coloración de
Giemsa. 100x Giemsa. 100x

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MICROBIOLOGIA
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Honduras
Preparación y coloración de la gota gruesa y Lamina 12
el extendido fino
Preparación de la gota gruesa: Tener todos los materiales listos. Es importante que las láminas portaobjetos se
encuentren limpias, libres de grasa que pueda interferir con la adhesión de la sangre al portaobjetos o con el
deslizamiento de la misma en el caso del extendido.

1. Frotar enérgicamente la yema del dedo del paciente (se prefiere el tercer dedo de la mano izquierda, talón en caso
de niños pequeños ó lóbulo de la oreja) con algodón humedecido con alcohol al 70%. Secar con algodón seco. El
dedo se sostiene enérgicamente (importante en caso de niños) y se pincha en forma rápida. La primera gota de
sangre se seca con el algodón seco.
2. Se utilizan dos láminas portaobjetos. En el centro de una de ellas se deposita la gota de sangre que se obtiene por
presión leve en el dedo. Sobre la superficie de trabajo y usando la esquina de la segunda lámina se extiende la
sangre de manera que forme un rectángulo de grosor uniforme, con dimensiones de 1.0 x 1.5 cm.
3. Dejar secar la muestra y si es posible, intensificar el proceso de secado agregando calor moderado.

Coloración de la gota gruesa


1. Solución de trabajo: 1 gota de sol. de Giemsa por cada mililitro de sol. amortiguadora pH 7.0-7.2 ó 1 ml de sol. de
Giemsa en 20 ml de sol. amortiguadora pH 7.0-7.2 (Sol. Giemsa 5%) para colorear unas 10 láminas portaobjetos
(aprox. 2 mL/lámina). No es posible colorear una gota gruesa con coloración de Wright.
2. Colocar la lámina portaobjetos en un recipiente de coloración o con la muestra hacia la concavidad de la bandeja
de coloración. Deslizar la solución de trabajo recién preparada por debajo de la lámina hasta que se llene el
espacio, eliminando las burbujas. Colorear durante 20 minutos.
3. Para una coloración rápida, se debe incrementar la solución de Giemsa de 5% a 10%, así: 2 gotas de sol. de
Giemsa por cada mililitro de sol. amortiguadora pH 7.0-7.2 ó 1 ml de sol. de Giemsa en 10 ml de sol. amortiguadora
pH 7.0-7.2. Colorear durante 8 minutos. Este es un procedimiento satisfactorio pero implica un mayor gasto de
colorante.
4. El exceso de colorante se lava sumergiendo con delicadeza la lámina portaobjetos en un recipiente con agua
corriente. Sí el agua corriente no es de buena calidad, utilizar agua purificada o destilada.
5. La muestra se puede secar con aire o calor moderado. Observar al microscopio con aceite de inmersión.

Preparación del extendido fino:


1. Observar pasos 1 y 2 de la preparación de la gota gruesa. Después de preparar la gota gruesa, se puede realizar un
extendido fino en la otra mitad de la misma lámina portaobjetos o utilizar una lámina portaobjetos nueva. Cuando el
extendido fino se seca, se puede utilizar su extremo grueso para identificar la muestra con un lápiz carbón o de
grafito.
2. Se utilizan dos láminas portaobjetos. Al colocar la gota de sangre en una de ellas, el borde de la segunda lámina
portaobjetos se coloca en un ángulo de 30 grados, se mueve hacia atrás hasta que toca la gota de sangre y
entonces se desliza hacia adelante para que la sangre que está atrás se extienda. La gota de sangre debe ser
pequeña de tal manera que sea totalmente extendida antes de llegar al final de la lámina. Este extremo del
extendido fino debe tener el grosor de una sola capa de glóbulos rojos.

Coloración del extendido fino (Giemsa)


1. Utilizar la solución de trabajo descrita en el paso 1 de coloración de gota gruesa.
2. El extendido fino seco se fija cubriéndolo con 2-3 gotas de alcohol metílico, dejándolo secar nuevamente. Cuando
se prepare la gota gruesa y el extendido fino en una misma lámina portaobjetos, una vez que ambos ya están
secos, proceder a fijar el extendido fino. Para ello, colocar la lámina portaobjetos en posición vertical en el bloque
para secar con la gota gruesa hacia arriba y el extendido fino hacia abajo y con ayuda de una pipeta Pasteur, verter
algunas gotas de alcohol metílico puro sobre el extendido fino.
3. Colorear la lámina en plato cóncavo, como en el paso 2 de coloración de gota gruesa.
4. Lavar el exceso de colorante como en el paso.
5. La muestra se puede secar con aire o calor moderado. Observar con aceite de inmersión.

Esquema 1: Gota Gruesa Esquema 2: Gota Gruesa y Etendido Fino


(patrón para ColVol) (patrón Unidades de Diagnosticos)

1.5 1.5
cm cm
1.5cm 1.5cm
1.0
cm A 1.0
cm A
1.0 1.0
cm cm

01
B 01
080137
B
2.0cm

01 No. de muestras correlativo al paciente


080137 Clave de identificación
Esquema de un patrón para la preparación de las muestras de sangre
BIBLIOGRAFÍA
• Alger J, Matute ML, Mejía RE. Manual de Procedimientos Operativos Estándar para el
Diagnóstico Microscópico de la Malaria. Secretaría de Salud, Tegucigalpa, 2006.
• Canales M, Jovel I, Espinoza E, Quan D, Espinoza V. Manual de Laboratorio de Helmintología.
Sección de Parasitología, Escuela de Microbiología, UNAH. 2009.
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th
• Leventhal R, Cheadle RF. Medical Parasitology a Self-Instructional Text 5 edition, 2002
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Crompton, T.W. Gyorkos and L. Savioli. OMS, Ginebra.
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Caribbean: Prevention, Control and Elimination of the Disease of Poverty. PAHO/WHO Regional
Strategic Plan Framework 2006-2015. Documento en preparación. Octubre 2006.
• WHO. World Malaria Report 2008
• WHO 2006 Weekly epidemiological record. No. 16, 81, 145164 http://www.who.int/wer

Elaborado por:
Dra. Rosa Elena Mejía
Dra. Irina Jovel

Fotos tomadas por:


Dra. Irina Jovel,
Dra. Rosa Elena Mejía,
Dr. Engels Banegas,
Dra. Jessica Henriquez,
Dr.Andres Murillo

Diseño:
Josue Rodriguez

Impreso en:
Publigraficas S. de R.L.
Tel.: (504) 234-8225

Tegucigalpa, M.D.C.
Honduras C. A.
Es un organismo cooperante en nuestro país que en
el área de control de parásitos ha contribuido en el
fortalecimiento de la Red Nacional de
Laboratorios, a través de la Sección de
Parasitología, del Laboratorio Nacional de
Vigilancia de la Salud, de la Secretaría de Salud,
por medio de capacitaciones y financiamiento para
la realización de manuales, material educativo,
capacitaciones y evaluación externa del
desempeño mediante su programa de
seguimiento. En esta oportunidad y en
colaboración con la Escuela de Microbiología de la
UNAH hemos elaborado los medios auxiliares que
serán una herramienta que vendrá a fortalecer el
diagnostico microscópico de parásitos intestinales
y tisulares en nuestro país.

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M
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MICROBIOLOGIA
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Honduras

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