Cara Menghitung Jasad Renik/Mikroba

         Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat ditentukan dengan berbagai macam cara
tergantung pada bahan dan jenis mikroba. Dalam analisa mikrobiologi, menghitung jasad renik
mikroorganisme suatu sediaan, harus diperhitungkan sifat-sifat dari bahan yang akan diperiksa,
terutama: - kelarutan
                - kemungkinan adanya zat anti mikroba
                - derajat kontaminasi yang diperkirakan
         Bahan-bahan yang diperiksa perlu diencerkan, dilarutkan/dibuat suspensi dalam cairan
pendispersi yang sesuai. Bila bahan yang yang diperiksa mempunyai daya/sifat anti mikroba,
maka harus dihilangkan dahulu dengan cara diencerkan, netralisasi/dengan cara penyaringan.
         Tingkat kontaminasi dalam pengujian perlu dilakukan pengenceran sehingga diperoleh
konsentrasi kecil dari bahan yang diperiksa. Pengenceran umumnya berkisar 10 -1 s/d 10-4, atau
dalam hal tertentu diencerkan sampai 10-5 s/d 10-6 agar diperoleh perhitungan mikroba yang
benar.
         Jenis populasi mikroba dalam tanah, air, bahan makanan, dll berbeda-beda tergantung pada
susunan bahan tersebut. Pengukuran secara kuantitatif  populasi mikroba dapat dilakukan dengan
beberpa cara, antara lain:
1.Menghitung dengan cawan
2.Metode MPN (Most Probable Number)/jumlah perkiraan terdekat
3.Menghitung langsung secara mikroskopis
4.Menghitung dengan cara kekeruhan
5.Menghitung dengan cara penyaringan

1. Menghitung dengan cawan  

            Prinsip metode ini adalah sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar
padat, maka sel mikroba tersebut akan berkembangbiak dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dengan mata tanpa mikroskop. Sebaiknya jumlah koloni mikroba yang tumbuh
dan dapat dihitung berkisar antara 30-300 koloni. Metode cawan dengan jumlah koloni yang
tinggi (>300) sulit untuk dihitung sehingga kemungkinan kesalahan perhitungan sangat besar.
Pengenceran sampel membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah yang benar, namun
pengenceran yan terlalu tinggi akan mengahasilkan jumlah koloni yang rendah/menghancurkan
koloni. Metode perhitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung
jumlah mikroba.
Keuntungan:
         Hanya sel yang hidup yang dapat dihitung
         Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
         Digunakan untuk isolasi & identifikasi mikroba
Kerugian:
         Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya karena beberapa sel
yang berdekatan membentuk satu koloni
         Media dan kondisi yang berbeda menghasilkan nilai yang berbeda pula
         Mikroba yang tumbuh harus pada media padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas serta
tidak menyebar
         Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni baru
dapat dihitung
Metode cawan ada dua cara:
1. Metode tuang (pour plate)
2. Metode  permukaan (surface plate)

1. Metode tuang
      Hal-hal yang harus diperhatikan adalah pengenceran sampel dan memasukkan hasil
pengenceran tersebut. Pada pembuatan pengenceran, diambil 1 ml larutan uji dan dimasukkan
dalam cawan petri kemudian dimasukkan ke media cair steril dengan suhu kira-kira 50 0C
sebanyak 15 ml (sebaiknya selama penuangan tutup cawan jangan dibuka terlalu lebar untuk
menghindari kontaminasi). Cawan petri digerakkan di atas meja dengan gerakan melingkar
seperti angka 8, gunanya untuk menyebarkan sel mikroba secara merata. Setelah agar memadat,
cawan diinkubasikan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 350C-370C selama 24
jam. Koloni yang terbentuk dihitung dengan Quebec Colony Counter. Larutan pengencer yang
biasa digunakan adalah NaCl 0,9%; larutan buffer fosfat, atau larutan ringger.

2. Metode permukaan
      Caranya: media cair steril dituang terlebih dahulu ke dalam cawan petri, setelah membeku
dituang 0,1 ml sediaan yang telah diencerkan, lalu diratakan dengan alat pengusap di atas
permukaan media, kemudian diinkubasi dalam inkubator. Cara ini dilakukan minimal duplo (2
kali), misalkan yang pertama 60 koloni dan ynag kedua 64 koloni.
Cara menghitung koloni, yaitu:
Misal: setelah diinkubasi diperoleh tiap cawan 60 dan 64 koloni, maka jumlah koloni:

    ml          jumlah koloni         1

                                           x               10-4 (faktor pengenceran)  
    gr                 cawan             10-4

maka:
   60 + 64        1                                                                                         
                 x                62 x 104          6,2 x 105
-4                                                                
        2           10  

2. Metode MPN 
      Menggunakan media cair, contoh laktosa broth. Prinsip metode ini adalah menggunakan
media cair di dalam tabung reaksi dan menggunakan tabung durham (untuk melihat gas).
Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu ditumbuhi mikroba setelah
diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dilihat dengan
mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas di dalam tabung durham (tabung kecil
dengan posisi terbalik). Metode MPN biasanya dilakukan untuk pengujian air minum, dengan 3-
 5 seri tabung. Prosedurnya dilakukan dengan beberapa tahap, yaitu:
Tahap 1: Uji praduga/presumtif
 Dimasukkan sampel  ke dalam 3 seri tabung yang telah berisi laktosa broth (media) dan 3 seri
tabung durham, dengan rincian: seri pertama berisi 10 ml, seri kedua berisi 1 ml, dan seri ketiga
berisi 0,1 ml. Diinkubasi pada suhu 35 0C-370C selama 24 jam. Dihitung jumlah tabung yang
positif yaitu terbentuknya gas dan kekeruhan pada tabung durham. Fermentasi laktosa menjadi
asam dan gas (1/10 sebagian tabung durham).
Tahap 2: Uji penegasan (konfirmasi untuk bakteri non fekal dan fekal)
 Untuk bakteri non fekal (contoh: Enterobacter aeroginas), suspensi yang positif dari uji
presumtif ditanam pada media BGLBB (Briliant Green Lactosa Bile Broth), diinkubasi pada
suhu 360C selama 24 jam, sedangkan untuk bakteri fekal (contoh: E. Coli) diinkubasi pada suhu
44,50C selama 24 jam.
Tahap 3: Uji lengkap
 Yaitu dengan menggunakan media spesifik, misalnya dengan media endo agar (untuk
Enterobacter aeroginas) dan eosin metilen blue (untuk E.Coli).

Keuntungan:
     Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum yang berbeda-beda
     Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan
     Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroba yang diinginkan
diantara jenis-jenis lain yang ada di dalam bahan pangan/sampel tersebut

Kerugian:
   Dibutuhkan banyak pengulangan untuk memperoleh hasil yang lebih teliti
   Untuk analisa air digunakan laktosa broth, sedangkan bakteri asam laktat pada susu digunakan
BGLBB (Briliant Green Lactosa Bile Broth)

3. Menghitung langsung secara mikroskopik 

      Cara ini merupakan cara cepat yang langsung menggunakan mikroskop. Pada cara ini sampel
diletakkan di kaca objek khusus yang bergaris membentuk bujur sangkar atau alat lain yan
sejenis, misalnya Hemasitometer.
Caranya:
Hasil pengenceran sampel diteteskan pada kaca objek khusus yang bergaris berbentuk bujur
sangkar. Perhitungan dilihat pada sel-sel mikroba yang terdapat dalam kolom penghitung.
Diketahui dalam ruang hitung terdapat 25 kotak besar, setiap kotak besar terbagi 16 kotak kecil,
tinggi kotak dengan gelas pengukur sama dengan isi tiap kotak kotak 0,02 mm 3 sama dengan
volume tiap kotak = 50 ml, kemudian 1ml = 1 cm3 = 1000 mm3.
Misalnya: Jumlah sel yang dihitung = 12 sel
                 Jumlah pengenceran sampel = 103
                 Jumlah sel (cm3/ml) = 12 x 25 x 50 x 103
                                                  = 1,5.107 sel/ml
Keuntungan: 
   Pelaksanaan cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan
Kerugian:
   Tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dan mati sehingga diperoleh jumlah total yang ada
dalam populasi
   Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil sehingga diperlukan pewarnaan sel
   Kadang-kadang sel bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu, oleh karena itu
perlu ditambahkan bahan-bahan anti gumpal seperti tween 80 sebanyak 0,1%.

4. Menghitung dengan cara kekeruhan

      Cara ini menggunakan spektrofotometer (presentase cahaya). Dasar teknik ini adalah
banyaknya cahaya yang diadsorpsi sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas
tertentu. Untuk bahan-bahan pangan metode ini sukar diterapkan karena medium yang diukur
harus bening sedangkan ekstrak bahan-bahan pangan, misalnya sari buah-buahan mengandung
komponen-komponen yang menyebabkan kekeruhan, sehingga kekeruhan tidak sebanding
dengan jumlah mikroba yang terdapat di dalamnya.

5. Menghitung dengan cara penyaringan  

      Sejumlah sampel 25 s/d 100 ml. Misalnya air / susu, disaring menggunakan kertas saring
yang steril. Penyaring diletakkan di atas cawan petri yang telah berisi endo agar khusus bakteri
E. Coli dan diinkubasi 330C-360C selama 18-24 jam. Jumlah koloni yang bertambah dihitung per
100 ml. Pada endo agar dapat dilihat koloni bakteri yang memfermentasi laktosa/zat. Media ini
mengandung 1% laktosa sebagai sumber karbohidrat. Koloni yang memfermentasi laktosa
adalah bakteri colyfom, membentuk warna merah pada bagian atas koloninya. Bakteri yang tidak
memfermentasi laktosa antara lain salmonella, shigella (memberi koloni yang tidak berwarna).
Dilakukan di tabung reaksi. E.Coli termasuk colyfom.