Estrategias para construir y

secuenciar genotecas genómicas

completas
 DNA genómico

Genoteca de Genoteca de Genoteca de

1kb 5kb 100kb

Cobertura genómica
15x106 plásmidos 7.5x106 plásmidos 2.5x106BACs
6x 3x 1x

Ensamblaje de la secuencia en
hileras de cromosomas
 Secuencia de un genoma
bacteriano por “tiro de escopeta”
• Genoma de Hemophilus influenzae.
• H. influenzae fue la primera bacteria
secuenciada. Su genoma es de solo
1.8Mb de DNA. El genoma se cortó en
fragmentos de DNA de 1kb en promedio,
estos fragmentos se clonaron en un
plásmido y se secuenciaron por el método
de los dideoxinucleótidos (Sanger).
 Cobertura de la secuencia
• Las clonas (33,000) se secuencian y procesan.
Toda la secuencia obtenida se almacena en
computadora y se utilizan programas para
ensamblar las secuencias de DNA superpuestas.
• El ensamble de las secuencias cortas conduce a
un proceso continuo que se denomina “contig”
(contiguo o cóntigo)

• 600b x 33,000= 20 Mb de secuencia génica no

procesada, implica una cobertura de la secuencia
de 10x.
Estrategia en “tiro de escopeta” para el
ensamble de secuencias genómicas
largas
• El paso que limita la obtención de la
secuencia completa de genomas
complejos es el análisis de la
información y no la producción de los
datos. La estrategia en tiro de escopeta se
adaptó para la secuenciación de genomas
de otros animales y del humano.
• El cromosoma humano promedio mide
150MB
• Se construyeron genotecas en plásmidos
con diferente tamaño de inserto (1, 5 y
100kb), se procesa un número de clonas
aproximado de 2 millones.
• 2,000,000 x 600 b ~ 1000,000,000
representado una cobertura de 10 veces
el tamaño de un cromosoma.
 Estrategia de clonación en tiro de
escopeta

Secuencia de un cromosoma completo:

100 máquinas de secuenciación x 384 = 3
semanas
• Se determinan “contigs” (contiguos) para la
secuenciación en tiros de escopeta de
fragmentos cortos de DNA genómico. Se
extienden las secuencias contiguas por medio
de secuencias terminales provenientes de
insertos mas grandes pertenecientes a los
insertos de 5 Kb y 100kb.
• Contiguo: colección de clonas cuyas
secuencias se solapan o se sobreponen
 “Contiguos”
Los tamaños de los “contiguos”
dependen de la cantidad de secuencias
obtenidas. Un contiguo individual típico
mide de 50,000 a 200,000 pb cantidad
menor a la de un cromosoma típico. El
genoma humano tiene en promedio ungen
cada 100 kb. Los contiguos se pueden
ensamblar en andamios más grandes de
1 a 2 Mb de longitud.
Estrategia de obtención de la secuencia completa
de un genoma
Fragmento de DNA
(clona)

Secuenciación

Contiguos (50,000 a 200,000pb)

Andamios (1-2Mb)

Ensamblaje final del

genoma completo Anotación
 Contiguo 1 contiguo 2 contiguo 3
Registro de extremos Registro de extremos
Apareados apareados

Andamio

Contiguo 1 contiguo 2 contiguo 3

Secuenciado secuenciado secuenciado
El valor de bibliotecas de clonas en los proyectos
genómicos
 Una clona de contiguos consiste de una serie linear de clonas de DNA
con insertos superpuestos originados por corte parcial de DNA genómico
durante la construcción de la biblioteca de DNA

Contiguo:21 clonas
contiguos

Clona de contiguos
Generación de fragmentos sobrepuestos por digestión parcial

Construcción de una biblioteca genómica

Caminata de
cromosoma
por hibridación
de clona a
clona
Sondeo de bibliotecas de YACs por PCR
Ensamblaje de contiguos de DNA por mapeo de contenido de STS
Alu-PCR permite la amplificación de secuencias de DNA localizadas entre dos
Repetidos Alu posicionados cercanamente pero orientados en posición
contraria
Diseño de cebadores para PCR
 La importancia de sitios de secuencia etiquetados
(STSs)

Los sitios de secuencia marcados son herramientas de

mapeo muy útiles simplemente porque la presencia de esta
secuencia puede convenientemente ser aislada por PCR.
La mayoría de los STSs no son polimórficos y pueden
ser asignados a una localización cromosómica específica
por el mapeo de un panel de híbridos monocromosómico y
a localizaciones sub-cromosómicas por tipificación de
paneles de híbridos adecuados.
Algunos STSs pueden derivar de clonas más grandes
(clonas de genes) que han sido mapeados físicamente a
una localización sub-cromosómica particular. Además, los
marcadores de microsatélites son un juego de STSs
que son muy polimórficos y pueden ser asignados a una
posición sub-cromosómica determinada como resultado
del análisis de ligamiento.
• En un genoma complejo tal como el genoma humano, la
probabilidad de que se una un cebador de 16
nucleótidos al azar a una secuencia relacionada pero
diferente de la secuencia blanco no es insignificante. La
especificidad de la reacción puede ensayarse
simplemente por fraccionamiento por tamaño de los
productos de amplificación en un gel de agarosa. Si hay
un producto de PCR del tamaño aproximado (141 bp en
el ejemplo de arriba), hay una probabilidad excelente de
que el ensayo sea específico para la secuencia blanco
seleccionada.