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Producción de pectinasas por Aspergillus niger a partir de cáscaras

de naranja y de toronja como fuente de carbono


Aline M. Beltrán V.*, Carmen Larrondo S.*, Mauricio S. Ramírez B.*,
Aseneth Ruiz C.*, Luis M. Salgado R.*

*Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, Calz. Del Hueso 1100, Col. Villa Quietud,
Del. Coyoacán, México Distrito Federal.

Resumen: Se realizó un estudio comparativo de la producción de pectinasas por


Aspergillus niger a partir de pectina extraída de cáscaras de naranja y toronja utilizada
como fuente de carbono, debido a la importancia que tienen estas enzimas en diversos
campos de la industria. Se cuantificó la producción de proteínas por el método de
Lowry y se determinaron los azucares reductores por el método de Miller;
posteriormente se determinó la actividad enzimática para comparar la producción de
pectinasas en las diferentes fuentes de carbono. De acuerdo con los datos obtenidos
concluimos que la pectina extraída de la cáscara de naranja induce una mayor
producción de pectinasas por Aspergillus niger.

Abstract: We conducted a comparative study for the production of pectinases by


Aspergillus niger from pectin extracted from orange peel and grapefruit used as
carbon source, because of the importance of this enzymes for many industries. We
quantified the production of proteins by the Lowry method and reducing sugars were
determined by the method of Miller, later determined to compare the enzymatic
activity of pectinases production in different carbon sources. According to the data
obtained, we conclude that pectin extracted from orange peel induces higher
production of pectinases by Aspergillus niger.

1. Introducción sustancias pécticas de diferente


composición que contiene como
La palabra pectina viene del nombre componente principal ácido pectínico.
griego pectos que significa solidificado La pectina en forma natural se localiza
o coagulado. En 1790 Vauquelin en la pared celular y puede estar
descubrió la pectina como una entrecruzada con otros polisacáridos
sustancia soluble presente en los estructurales y proteínas para formar
zumos de fruta, pero no fue hasta 1824 protopectina insoluble.1
cuando Braconnot, quien continuó el
trabajo de Vauquelin, llamó a esta El componente más abundante
sustancia ácido péctico, ya que tenía de las pectinas es el ácido
propiedades gelificantes cuando se le galacturónico, que forma el esqueleto
añadía ácido a la solución.1 principal de la molécula consistente en
Actualmente se sabe que la una cadena de residuos de ácido D-
pectina es una mezcla amplia de galacturónico unidos mediante enlaces
α - (1 – 4). Estos residuos pueden estar Tanto la actividad como los
parcialmente metilados, esterificados mecanismos que controlan su síntesis y
en el C-6 con alcohol metílico, siendo el su secreción están bajo la influencia de
grado de metilación variable según el diversos factores ambientales, tales
origen de la pectina. La pectina como el pH del medio, la temperatura
también contiene con frecuencia de incubación y la naturaleza y
residuos de ramnosa, arabinosa y cantidad de la fuente de carbono.4
galactosa. Generalmente la ramnosa
forma parte de la cadena principal, Las pectinasas figuran entre las
mientras que la arabinosa y la enzimas de aplicación industrial más
galactosa se encuentran en las cadenas antiguas; pueden clasificarse en dos
laterales unidas a la cadena principal grandes grupos: ácidas y alcalinas. Las
formando ramificaciones.1 pectinasas ácidas son utilizadas en la
industria de zumos de fruta y en la
Estas pectinas son ingredientes fabricación de vinos. Son
muy importantes en la industria de los mayoritariamente poligalacturonasas
alimentos para hacer gelatinas, de origen fúngico, especialmente de A.
helados, salsas, queso. También se niger. Las pectinasas alcalinas se han
emplean en otras industrias, como la introducido en diversos procesos
farmacéutica, que requieren modificar industriales, como el textil,
la viscosidad de sus productos, y en la principalmente en el enriado de lino y
industria de los plásticos, así como en en el procesado de fibras de plantas.
la fabricación de productos es- Las enzimas que se utilizan en estos
pumantes, como agente de clarificación sectores proceden mayoritariamente
y aglutinante.2 de bacterias, destacando entre ellas las
producidas por Bacillus.1
La degradación de este polímero
requiere la intervención de un sistema El objetivo de este trabajo es
pectinolítico compuesto por varias producir pectinasas por Aspergillus
enzimas distribuidas en tres grupos niger a partir de pectina extraída de
principalmente: pectinesterasas las cáscaras de naranja y toronja utilizada
cuales catalizan la desesterificación de como fuente de carbono.
los grupos metoxilo, pectina
despolimerasas que rompen los enlaces 2. Material y métodos
α – (1 – 4) glucosídicos por hidrólisis
(polimetilgalacturonasas y poligalactu- 2.1 Preparación de la muestra
ronasas) o transeliminación (pectina y
pectato liasas), reacciones que Se pesaron 50 g de albedo de naranja y
catalizan el rompimiento de la 50 g de albedo de toronja. Se realizó
molécula.3 una extracción ácida de pectina a cada
muestra agregando agua destilada en
Las pectinasas actúan de ebullición hasta hidratarla, además de
manera sinérgica y secuencial, son HCl 6N hasta alcanzar un pH de 2 y se
secretadas en grandes cantidades por hirvió durante 15 min. Se filtró y con el
hongos filamentosos, de los que residuo se repitió el proceso 2 veces
destacan los del género Aspergillus. más y por último se lavó con agua a
ebullición. Finalmente se agregó un KH2PO4, 5 g/L de (NH4)2SO4 y 10 g/L
volumen de etanol equivalente al de la fuente de carbono
volumen total de los filtrados correspondiente. Posteriormente se
anteriores, dejando reposar 2h para inoculó con 1 mL de la suspensión de
precipitar la pectina. La pectina esporas cada uno de los matraces y se
resultante se filtró y se secó a 40°C.*5 incubaron a 37°C con agitación de 250
rpm durante 72 h*7, tomando muestras
2.2 Cuantificación de esporas en el de 6 mL de cada cultivo cada 24 h, las
inóculo cuales se centrifugaron a 4500 rpm
durante 10 min y el sobrenadante se
2.2.1 Extracción de las esporas de un guardó en refrigeración para realizar
medio sólido pruebas posteriores.

Se agregó solución salina y perlas de 2.4 Determinación de azúcares


vidrio a la caja de Petri que contenía las reductores
esporas y se agitó suavemente hasta
suspender las esporas. Se tomó 1 mL de Para determinar azúcares reductores
esta suspensión y se llevó a cuenta en las muestras del cultivo de
directa. fermentación se realizó previamente
una curva estándar de azúcares la cual
2.2.2 Técnica de cuenta directa en contempló concentraciones de 0 µg
cámara de Neubauer hasta 1000 µg de glucosa por mL y se le
determinaron azúcares reductores
La muestra se homogenizó por medio utilizando el método de Miller8;
de agitación y se colocó con una jeringa posteriormente se utilizó el mismo
estéril entre la cámara y el método para determinar los azúcares
cubreobjetos por el borde de la cámara reductores presentes en el sobre-
y se observó al microscopio con el nadante de las muestras problema.
objetivo de 10x localizando la zona
cuadriculada y se contaron las esporas 2.5 Determinación de proteínas
presentes en dicha cuadrícula con
ayuda de un cuentacolonias.6 Por La cuantificación de proteínas se tomó
último, ya teniendo la concentración de en cuenta para evaluar la producción
esporas en la solución, se realizó una de enzimas pectinolíticas. Esto se llevo
dilución 2:100 para que el tamaño del a cabo utilizando el método de Lowry9,
inóculo fuera el conveniente (106 para lo cual fue necesario realizar una
esporas/mL). curva estándar de albúmina cuyo rango
de concentración fue desde 0 µg hasta
2.3 Fermentación 100 µg por mL, después se aplicó el
método de Lowry para determinar
Se prepararon 100 mL de medio de proteínas en el sobrenadante de las
cultivo basal para cada muestra de muestras problema.
pectina (pectina comercial, extracto de
albedo de naranja y extracto de albedo
de toronja) cuya composición fue la
siguiente: 2 g/L de K2HPO4, 2 g/L de
2.6 Determinación de la actividad 3.2 Curva estándar de proteínas
enzimática

Se prepararon dos muestras de: blanco


problema (0.5 ml de extracto
enzimático, 0.5 ml de buffer de acetatos
al 0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de
pectina), blanco enzima (0.5 ml de
medio, 0.5 ml de buffer de acetatos al
0.1M y 0.5 ml de solución al 0.9% de
pectina), blanco sustrato (0.5 ml de
extracto enzimático, 0.5 ml de buffer de
acetatos al 0.1M y 0.5 ml de agua); La ecuación obtenida a partir de esta
Posteriormente uno de cada uno de los curva estándar se utilizó para calcular
blancos se incubó durante 30 minutos a la cantidad de proteínas presentes en
45°C y los otros se refrigeraron. las muestras problema.
Después se determinaron los azucares
reductores liberados por el método de 3.3 Pectina
DNS.

*La actividad exopectinasas se expresa


como mg de azúcares reductores
liberados/mL de extracto.

3. Resultados y discusión

3.1 Curva estándar de azúcares


reductores.

En las gráficas se observa que en las


primeras 24 horas el microorganismo
Con la curva estándar se obtuvo la produjo enzimas suficientes para
ecuación de la recta, con la cual se degradar el sustrato. Después de 48
determinó la concentración de horas se observa un consumo
azúcares reductores en cada muestra importante de azúcares reductores, por
problema. lo cual el microorganismo produjo
proteínas necesarias para seguir
degradando la pectina.
3.4 Toronja 3.5 Naranja

Como se observa en las gráficas,


Analizando las gráficas, en un principio durante las primeras 24 horas el
el microorganismo produjo las enzimas microorganismo aparentemente utilizó
necesarias para empezar a degradar el azúcares reductores presentes en el
sustrato, por lo que se observa un extracto obtenido que fueron más
aumento en la concentración de accesibles que la pectina; a partir de las
azúcares reductores. 48 horas esta primera fuente de
carbono se agotó y empezó a consumir
A las 48 horas consumió gran parte del la pectina extraída de la naranja, es por
sustrato, por esto, produjo más esto que se observa un incremento en
enzimas en busca de metabolizar otra la producción de proteínas y azúcares
fuente de energía, sin embargo entre reductores.
las 24 y 48 horas es probable que el
sustrato se haya terminado, por lo que 3.6 Actividad enzimática
la producción de proteínas bajó
drásticamente.
Al tomar la pectina como nuestra como fuente de carbono pectina
fuente de carbono de referencia, se extraída de cáscaras de naranja y
observa que el extracto de naranja toronja.
indujo una actividad enzimática
semejante a ésta; mientras que en el  La pectina extraída de la cáscara de
extracto de toronja es menor. naranja induce una mayor actividad
enzimática que la extraída de la
4. Conclusiones cáscara de toronja.

 Es posible que Aspergillus niger


produzca pectinasas utilizando

Referencias

1. Soriano M. 2004. Análisis de sistemas pectinolíticos bacterianos. Aislamiento y


caracterización de las pectinasas. Pela de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de
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Universidad de Barcelona. España. pp. 8-40.

2. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT.


Medellín, Colombia. pp. 22.

3. Trigui-Lahiani H., Gargouri A. 2006. Cloning, genomic organization and mRNA


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Gene Section Functional Genomics. pp.: 54.

4. Arreguín-Rangel L., García-Rivero M., Pérez-Vargas J., Martínez-Trujillo M. y


Aguilar-Osorio G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la
producción de pectinasas y ramnogalacturonasas por dos cepas autóctonas de
Aspergillus. Laboratorio de Catálisis Enzimática. Postgrado de Ingeniería
Bioquímica. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. México. pp.: 1.

5. Devia J. 2003. Proceso para producir pectinas cítricas. Universidad EAFIT.


Medellín, Colombia. pp. 24.

6. Aquiahuatl-Ramos M., Pérez-Chabela M., 2004. Manual de prácticas de


laboratorio de microbiología general. Departamento de biotecnología.
Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. México. pp.67

7. Arreguín-Rangel, L., García-Rivero, M., Pérez-Vargas, J., Martínez-Trujillo, M.A. y


Aguilar-Osorio, G. 2007. Aprovechamiento de residuos de frutas en la producción
de pectinasas y ramnoglacturonasas por 2 cepas autóctonas de Aspergillus.
Laboratorio de catálisis enzimática. Tecnológico de Estudios Superiores de
Ecatepec. México.
8. Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar. Analytical Chemistry 31: 426-428.

9. Lowry OH, Rosebrough NL, Farr AL y Randall RJ (1951). Protein measurement


with the folin phenol reagent. Journal Biological Chemistry 193: 265-273