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FISIOLOGIA DE FUNGOS

Prof. Sidney T.G. Bastos


Dept. de Micologia/CCB/UFPE

Fungos filamentosos são organismos cuja parede celular é constituída por celulose ou quitina.
Constituem um grupo de organismos a parte, Reino Fungi, uma vez que não ingerem alimentos (como os
animais) e nem produzem o seu próprio alimento através de pigmentos fotossintéticos (como as plantas).
Os fungos secretam enzimas sobre seus substratos que atuam sobre moléculas grandes e complexas
quebrando-as em substâncias menores prontamente assimiláveis através da parede celular.
Fisiologicamente os fungos se adaptam a condições mais severas do que a maioria dos
microorganismos:
a. podem crescer em substratos com concentração de açúcar intolerável para as bactérias, uma
vez que não são muito sensíveis as altas pressões osmóticas;
b. podem tolerar e crescer em altas concentrações de ácidos, suportando variações de pH entre 2
e 9, embora o ótimo para a maioria esteja situado em torno de 5,6;
c. podem sobreviver em ambientes bastante secos que inibiriam as bactérias não esporuladas.
Quando ocorre condição adversa de umidade (ambiente seca), os fungos produzem esporos ou entram em
estado de vida latente;
d. podem desenvolver-se em uma ampla faixa de temperatura (0 a 62°C), embora o ótimo esteja
entre 22 a 30°C, para a grande maioria.

NUTRIÇÃO

As necessidades nutricionais por elementos essenciais podem ser divididos em duas grandes
categorias:
a. macronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-3 M, aproximadamente.
b. micronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-6 M ou menos.
Entre os macronutrientes (C, H, O, N, P, K, N, S, Mg e Ca) o carbono é o principal elemento
requerido uma vez que este elemento faz parte de substâncias estruturais dos fungos em combinação,
principalmente, com hidrogênio, oxigênio e nitrogênio.
Os elementos minerais essenciais aos fungos estão resumidos nas tabelas a seguir (Tabelas 1 e
2).
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Tabela 1. Macronutrientes minerais essenciais aos fungos(Griffin, 1994).

elemento forma concentração função


utilizada requerida (M)
K KCl 10-3 atividade enzimática; metabolismo de carboidratos;
K2HPO4 balanço iônico
P KH2PO4 10-3 composição de ácidos nuclêicos; transferência de energia;
metabolismo intermediário
Mg MgCl2 10-3 ativação enzimática; metabolismo de ATP
MgSO4
N NaNO3 10-3 constituinte de aminoácidos, nucleotídeos e vitaminas
NH4Cl
S K2SO4 10-4 constituinte de aminoácidos (metionina, cisteína e cistina)
Ca CaCl2 10-4 a 10-3 ativador enzimático; estrutura de membranas; não
universalmente requerido

Tabela 2. Micronutrientes minerais essenciais aos fungos (Griffin, 1994).

elemento forma concentração função


utilizada requerida (M)
Fe FeCl3 10-6 constituinte de citocromos, pigmentos e apoenzimas
Fe citrato
Cu CuSO4 10-6 a 10-7 ativação enzimática; biossíntese de pigmentos
Mn MnCl2 10-7 ativador de enzimas; atuação no ciclo dos ácidos
tricarboxílicos; atuação na síntese de ácidos nuclêicos
Zn ZnCl2 10-8 ativação enzimática; metabolismo intermediário dos
ácidos orgânicos
Mo Na2MoO4 10-9 ativação enzimática; metabolismo de nitratos

1. NITROGÊNIO E OXIGÊNIO

Nitrogênio na forma de nitrato é a fonte mais utilizada, entretanto, muitos fungos não podem
utilizá-lo.
Uma outra forma utilizável de nitrogênio é a amônia (NH 3). Contudo, quando sais de amônia
(NH4NO3, (NH4)2SO4 ou NH4Cl) são adicionados ao meio de cultura ocorre, geralmente, uma queda
acentuada do pH. Este fato, decorre da utilização preferencial do cátion amônia, o que pode refletir no
crescimento fúngico (redução do crescimento, por exemplo).
A maioria dos fungos são aeróbicos ou microaerófilos e, portanto o seu crescimento é estimulado
pelo fornecimento de oxigênio.

2. CARBONO

Os fungos, patogênicos ou saprófitas, utilizam carbono e energia de uma grande variedade de


compostos produzidos por organismos vivos.
A capacidade dos fungos em utilizar estes compostos depende de três processos diferentes:
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a. digestão de materiais oligo e poliméricos,


b. transporte de monômeros através da plasmalema e
c. fosforilação dos carboidratos.
A glicose é a principal fonte de carbono para praticamente todas as espécies fúngicas. Até certo
ponto, isto não surpreende pois muitos açúcares comuns são a base da celulose (glicose beta-1,4), amido
(glicose alfa-1,6 e alfa-1,4) e de outros carboidratos.
Existe uma controvérsia sobre a capacidade de utilização da glicose por Leptomitus lacteus e
Araiospora spp (Ordem Leptomitales).
Os açúcares frutose e manose, após a glicose, são os mais utilizados pelos fungos, seguidos da
galactose. Entretanto, geralmente, existe um período de adaptação antes do crescimento iniciar, mas após
este período o crescimento é, particularmente, tão rápido e extenso quanto com glicose (ver curva de
crescimento fúngico). Isto, pode ser observado durante a fase de adaptação de Allomyces macrogynus. O
crescimento, durante a fase de adaptação, foi retardado com manose e frutose, contudo, uma vez iniciado,
a taxa de crescimento foi aproximadamente igual que com glicose. A adição de uma pequena quantidade
de glicose, a fim de iniciar o crescimento, diminuiu a fase de adaptação permitindo o início do
crescimento e proporcionando material e energia suficientes para a indução de enzimas que assimilam a
manose. Deste modo, ocorre crescimento rápido sem a existência de uma fase de adaptação longa e
irregular observada na ausência de glicose.
A utilização de manose e frutose segue claramente o modelo de formação de enzimas indutivas
(sistema indutivo: enzimas que são sintetizadas somente em resposta a presença de certos substratos). O
sistema enzimático para assimilação da glicose é do tipo constitutivo (sistema constitutivo: enzimas que
estão sempre presentes em quantidades quase constantes em uma célula) e, portanto, não existe um
período de adaptação para o crescimento fúngico iniciar.
Ao iniciar um estudo com um determinado fungo sobre o qual não há nenhuma informação
nutricional, a glicose deve ser escolhida como a fonte mais provável de utilização de carbono pelo fungo.
Os compostos de carbono tem duas funções essenciais no metabolismo fúngico:
a. proporcionar o carbono necessário para a síntese de compostos celulares (proteínas,
aminoácidos, ácidos nuclêicos, substâncias de reserva, etc.) e,
b. proporcionar quantidades apreciáveis de energia através do processo de oxidação dos
compostos de carbono.
Fungos que utilizam dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos para o seu crescimento
requerem a síntese de enzimas indutivas e, portanto, a curva de crescimento mostrará um período de
adaptação antes do crescimento ser iniciado.
Muitas fontes de carbono são estáveis ao calor, contudo, podem ser, significativamente, alteradas
por reações com outras substâncias que entram na composição do meio de cultura e, portanto, devem ser
esterilizadas separadamente. A sacarose pode ser hidrolisada em pH levemente ácido enquanto que a
inulina, um polímero de frutose, é degradada durante a autoclavagem.
Experimentos sobre a utilização de compostos como única fonte de carbono e energia são
geralmente monofatoriais, isto é, os compostos são testados separadamente. Experimentos monofatoriais
não são naturais, os fungos no ambiente vivem sobre uma mistura de substratos potencialmente
fornecedores de carbono e energia.
A habilidade de um fungo utilizar um composto como única fonte de carbono e energia pode di-
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ferir de sua habilidade para usar este mesmo composto quando em conjunto com outro.
Em estudos envolvendo a utilização de uma mistura de compostos foram observados que:
a. a glicose tem efeito repressivo e inibidor sobre a utilização de outras fontes de carbono (a
glicose é utilizada em primeiro lugar sendo que a utilização do segundo composto é retardada até a
glicose ser totalmente consumida).
b. compostos que são pouco utilizados ou não utilizados como única fonte de carbono podem ser
usados quando misturados com outros.
Em um estudo realizado com Sporotrichum termophile sobre a utilização de glicose e de outros
substratos, concluiu-se que:
a. o fungo crescendo em meio com glicose apresenta um baixo nível de atividade celulase;
b. o fungo crescendo em substrato que não celulose ou celobiose, apresentou atividade celulase 2
a 10 vezes maior, sugerindo um certo grau de desrepressão na ausência de glicose;
c. celulose e celobiose, contudo, atuam como verdadeiros indutores resultando em atividade
celulase 100 vezes maior quando presentes como única fonte de carbono;
d. quando o fungo cresce em meio com celobiose, a adição de glicose resulta em uma parada
imediata da utilização de celobiose (o efeito da glicose na repressão da síntese enzimática é geralmente
denominada de repressão catabólica).
Por outro lado, as ligninas parecem ser usadas somente na presença de outros compostos.
Embora, muitos fungos sejam capazes de degradar as ligninas a CO2, são incapazes de utilizá-las como
única fonte de carbono e energia. Entretanto, podem degradar a lignina somente na presença de uma outra
fonte de carboidrato como a celulose, celobiose ou glicose. A habilidade para metabolizar um composto
somente na presença de outro é conhecida como cometabolismo.
Um outro ponto de grande interesse na assimilação de carbono é a eficiência de conversão do
substrato em micélio.
Eficiência sintética é o quociente, expresso em %, entre o peso seco do micélio e o peso da fonte
de carbono consumida. Substrato consumido pode ser convertido em micélio, CO2 e vários produtos
metabólicos de interesse industrial (álcool, ácidos orgânicos, polissacarídeos extracelulares e outros
metabólitos secundários). Eficiência sintética tem grande importância para a indústria de fermentação,
onde o principal interesse está na produção de metabólitos fúngicos de uso comercial.

3. VITAMINAS E FATORES DE CRESCIMENTO

Compostos orgânicos que são requeridos em quantidades diminutas para o crescimento fúngico
podem ser denominados de vitaminas ou fatores de crescimento.
Alguns autores fazem distinção entre estas duas categorias. As vitaminas (Tabela 3) são
geralmente requeridas em concentrações micromolares a nanomolares e atuam como coenzimas enquanto
que, fatores de crescimento são requeridos em concentrações mais altas, acima de 100 µ M e atuam como
elementos estruturais (aminoácidos, bases púricas e pirimídicas).
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Tabela 3. Algumas vitaminas requeridas por fungos (Griffin, 1994).

vitaminas concentração função forma ativa


requerida (M)
tiamina (B1) 10-9 a 10-6 cocarboxilase tiamina pirofosfato
piridoxina (B6) 10-9 a 10-7 coenzima para piridoxal e piridoxamina fosfato
transaminações
riboflavina (B2) 10-7 a 10-5 coenzima para flavina mononucleotídeo (FMN) e
dehidrogenases flavina adenina dinucleotídeo
(FAD)
ácido nicotínico (B3), 10-8 a 10-7 coenzima para nicotinamida adenina dinucleotídeo
nicotinamida e niacina dehidrogenases (NAD) e NAD fosfato (NADP)
ácido p-amino benzóico 10-8 a 10-6 coenzima na ácido tetrahidrofólico
(PABA) transferência de 1 C
ácido pantotênico (B5) 10-7 coenzima na coenzima A
transferência de 2 C
cianocobalamina (B12) 10-12 a 10-6 coenzima na vários derivados da cobalamina
transferência de CH3

Um fungo é chamado de auxotrófico quando requer uma determinada substância para o seu
crescimento e de prototrófico quando o próprio fungo pode sintetizar a substância necessária para o seu
crescimento.
Alguns fungos apresentam um requerimento absoluto por uma determinada vitamina sob
condições específicas:
a. Myrothecium sp requer biotina para germinação do esporo, mas o micélio é prototrófico.
b. Histoplasma sp requer tiamina e biotina na fase leveduriforme, mas na fase micelial é
prototrófico.
c. Mucor rouxii requer tiamina e ácido nicotínico sob condições anaeróbicas, mas é prototrófico
sob condições aeróbicas.
d. Pythium sp torna-se auxotrófico para tiamina quando a concentração de sal alcança um certo
nível no meio de cultura.
A temperatura, geralmente, afeta o requerimento por vitamina. Alguns mutantes de Neurospora
crassa quando cultivados em temperaturas inferiores à 25°C são prototróficos, contudo, quando
cultivados em temperaturas superiores a 28°C requerem riboflavina.

4. ÁGUA

Os fungos, de modo semelhante a todos os organismos, requerem água em alta quantidade,


contudo, o requerimento por água não é nutricional. A água é utilizada como solvente (as enzimas não
apresentam atividade na ausência de água, por exemplo).
O movimento da água dentro e fora da hifa ocorre por difusão, em resposta a gradientes físico-
químicos, através da plasmalema que é semipermeável. Este processo é denominado de osmose.
Vários pesquisadores têm utilizado uma série de termos para descrever as forças que estão
envolvidas no movimento da água (pressão osmótica, potencial osmótico e atividade de água).
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A umidade relativa e a atividade de água estão relacionadas com a pressão de vapor da água em
solução e água pura através das fórmulas:
UR = 100 P/Po,
onde UR é a umidade relativa da atmosfera em equilíbrio com a solução, P é a pressão de vapor
da água em solução e Po é a pressão de vapor da água pura.
Aw = P/Po,
onde Aw é a atividade de água (water activity).
Agregando-se as duas fórmulas temos:
UR = 100 Aw ou Aw = UR/100.
Fungos que tem a capacidade de crescer em Aw (Tabela 4) baixo são denominados de
xerotolerantes. Estes fungos são extremamente importantes na indústria de alimentos como agentes de
deterioração.

Tabela 4. Valores de Aw para crescimento de alguns microorganismos.

Aw bactérias leveduras fungos filamentosos


1,0 Caulobacter, - Mastigomycota
Spirillum
0,90 Lactobacillus, Ascomycetes Fusarium
Bacillus
0,80 - Debaryomyces Penicillium
0,75 bactérias halofílicas - Aspergillus
0,60 - Saccharomyces rouxii, Xeromyces bisporus -
0,55 abaixo deste valor ocorre desnaturação do DNA

5. HIDROGÊNIO

Não há muito o que comentar sobre os efeitos do íon hidrogênio sobre o crescimento de fungos
devido aos experimentos serem realizados de forma inadequada. Em vários experimentos o pH é ajustado
inicialmente e o pH final é ou não relatado, portanto, os resultados são freqüentemente analisados com
base em um único ponto durante o período de incubação. Por outro lado, os fungos alteram o pH do meio
de cultura de forma drástica durante o seu crescimento, tornando difícil o controle do pH.
Estas alterações de pH podem ser causadas pela assimilação diferencial de cátions e ânions do
meio de cultura ou mesmo através da produção de ácidos orgânicos que são liberados para o meio de
cultura. Por exemplo, o íon NH4+ é assimilado como NH3 liberando H+ para o meio de cultura tornando-o
ácido ou, ânions de sais orgânicos são assimilados como ácidos livres tomando um próton da água e
liberando um OH- para o meio, tornando-o básico.
O uso de tampões para controlar o pH é geralmente dificultado devido à limitada efetividade do
tampão, normalmente pK = ± 0,5 pH.
A despeito destas limitações, os fungos crescem adequadamente quando o pH inicial é ajustado
para uma faixa de 4 a 7.
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AMBIENTE FÍSICO E CRESCIMENTO

Além do conhecimento sobre os nutrientes apropriados para os fungos, há necessidade de se


conhecer em que condições físicas ambientais ocorre o crescimento fúngico mais adequado.
Assim como os fungos variam amplamente quanto às exigências nutricionais, também
demonstram os mais diferentes tipos de respostas às condições físicas do ambiente. Em outras palavras, o
êxito no processo de crescimento de uma cultura fúngica requer uma combinação adequada de nutrientes
e fatores físicos.
Fatores físicos ambientais que afetam o crescimento fúngico são temperatura, luz e outras formas
de radiação, gravidade, pressão hidrostática e viscosidade. Existem pouquíssimos estudos sobre os três
últimos fatores.
O fator mais importante em determinadas condições, o mais estudado ao longo dos anos e o que
tem maior quantidade de dados é a temperatura.
A luz tem mais efeito sobre a reprodução dos fungos do que sobre o crescimento. Outras formas
de radiação tem a sua utilização em condições específicas e o interesse maior reside nas radiações
mutagênicas (raios gama, X e ultravioleta).

1. TEMPERATURA

Geralmente são utilizados três parâmetros para descrever a influência da temperatura sobre o
crescimento dos fungos: mínimo, ótimo e máximo.
Existem muitos estudos sobre o ótimo de temperatura para o crescimento fúngico e pouco
interesse para as condições extremas de temperatura (mínima e máxima)
Os fungos podem ser classificados de acordo com a temperatura para o seu crescimento em:
a. psicrófilos: não crescem acima de 20°C, têm um mínimo abaixo de 0°C e um ótimo entre 0 e
17°C.
b. mesófilos: têm um mínimo acima de 0°C, máximo abaixo de 50°C e um ótimo entre 15 e
40°C.
c. termófilos: têm um mínimo de ou acima de 20°C e um máximo de ou acima de 50°C.
Alguns fungos podem situar-se entre uma classe e outra de acordo com suas exigências em
termos de temperatura. Por exemplo, Aspergillus fumigatus que cresce numa faixa de 12 a 52°C é
classificado como mesófilo termotolerante.
A maioria dos fungos crescem numa ampla faixa de temperatura, de 0 a 62°C, com um ótimo
variando entre 22 e 30°C.

2. CRESCIMENTO FÚNGICO

A curva hipotética de crescimento dos fungos pode ser vista na figura abaixo (Figura 1).
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Figura 1. Curva típica de crescimento fúngico.

peso
seco
(mg) fase
log
fase de fase
declínio estacionária
fase
lag fase de morte
(autólise)

tempo (h)

2.1. FASE LAG (fase de adaptação – lag phase)

Quando o inóculo (esporos ou fragmentos de hifas) é transferido para um novo meio de cultura e
incubado em condições favoráveis, o crescimento não ocorre imediatamente. Existe, geralmente, um
período denominado de fase lag, que varia com as espécies fúngicas, com a natureza do inóculo e com as
condições nutricionais do meio de cultura. Nesta fase, não ocorre crescimento visível.
Quando o inóculo consiste de esporos, esta fase é o período necessário para ocorrer a germinação
dos esporos. Quando são utilizados fragmentos de hifas como inóculo, por estarem, geralmente, danifica-
das, há necessidade de um período de tempo para que o crescimento possa iniciar.
Os fatores nutricionais podem afetar a duração da fase lag. Em Allomyces sp a concentração
baixa de ácido glutâmico no meio de cultura, apesar de estimular o crescimento tem como efeito principal
a redução do comprimento da fase lag. Por outro lado, Giberella sp não apresenta a fase lag, contudo, a
utilização de acetato de amônia como fonte de nitrogênio ou alta concentração de glicose provoca o
aparecimento da fase lag.
Entre os fatores físicos, a temperatura também pode atuar na duração da fase lag. Temperatura
abaixo do ótimo aumenta o período de duração da fase lag.

2.2. FASE LOG (fase exponencial ou logarítmica – exponential or logarithmic phase)

Esta fase é marcada por uma taxa de crescimento acelerado na qual o logaritmo do peso seco
fornece uma reta com o tempo de incubação.
A fase log é fortemente afetada pelo suprimento de nutrientes. Outros fatores podem também
afetar a taxa de crescimento nesta fase (culturas fúngicas agitadas em agitador crescem significativamente
mais rápido que culturas estacionárias).
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2.3. FASE DE DECLÍNIO (decline phase)

A fase de declínio é provocada pela exaustão de alguns nutrientes que se tornam limitantes ou,
ainda, pelo acúmulo de substâncias tóxicas produzidas pelo fungo durante a fase log.
Em Giberella fujikuroi foi observado que a exaustão de nitrogênio marcou o fim da fase log e,
que o aumento de peso seco foi devido, principalmente, ao acúmulo de carboidratos e lipídeos.

2.4. FASE ESTACIONÁRIA E DE MORTE (stationary and death phase)

Nesta fase cessa o aumento de peso seco, embora continue ocorrendo utilização de glicose pelo
fungo. A paralisação completa da utilização de glicose resulta em autólise e, consequentemente, morte da
cultura.

LITERATURA RECOMENDADA

BLACK, J.G. Microbiologia – Fundamentos e Perspectivas. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. 2002.
GRIFFIN, D.H. Fungal Physiology. New York, John Wiley & Sons. 1994. 458 p
LEHNINGER, A.L. Biochemistry. New York, Worth Publishers. 1976. 1104 p.
ROBINSON, P.M. Practical Fungal Physiology. New York, John Wiley & Sons. 1978. 123 p