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Cabronio 5.

Medios de Cultivo
y
Pruebas Bioquímicas
Medios
de
Cultivo
INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para


la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los


microorganismos es el Medio de Cultivo y
el crecimiento de los microorganismos es
el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.
Medios de Cultivo
Clasificación de los medios de cultivo basándose en su
composición química

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,


fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros
elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella
abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan


ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,
extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin
saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos
nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con
aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).

Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento
específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población
microbiana mixta.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando


cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como
única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades
diferenciales de crecimiento en dichos medios.

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey


diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento


óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte
rápida de las células.

Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen


ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa
en los medios de mantenimiento.
Agar-Agar
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos
nutritivos.

Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de


alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
Extracto de carne 3.0 destilada. Mezclar y dejar reposar 5
minutos. Calentar suavemente agitando y
Cloruro de sodio 8.0 hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución.
Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
Agar 15.0 minutos.
pH final: 7.3 0.2
Fundamento

Es un medio usado para el cultivo de


microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales. No contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano.

La pluripeptona es la fuente de carbono y


nitrógeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el


enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de
microorganismos exigentes.

Características del medio: ámbar claro


a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris
Base Agar Gelosa Sangre

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos


microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el
aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios
nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como
para la observación de reacciones de hemólisis.

También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.

Fórmula (en gramos por litro)


Infusión de músculo de corazón 375.0
Peptona 10.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento

La infusión de músculo de corazón y la


peptona, otorgan al medio un alto valor
nutritivo, que permite el crecimiento de
una gran variedad de microorganismos,
aún de aquellos nutricionalmente
exigentes.

El cloruro de sodio mantiene el balance


osmótico.

El agregado de sangre al medio de


cultivo, en concentración final de 5-10
%, aporta nutrientes para el crecimiento
bacteriano, y permite detectar Características del medio
hemólisis. Medio preparado: ámbar.

Medio preparado con 5% de sangre


de carnero: rojo cereza.
E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 10.0
Suspender 36 g del polvo en un litro
Lactosa 5.0 de agua destilada. Reposar 5 minutos;
Sacarosa 5.0 mezclar, calentando a ebullición
durante 1 o 2 minutos hasta su
Fosfato dipotásico 2.0
disolución. Esterilizar en autoclave a
Agar 13.5 no más de 121 C durante 15 minutos.
Eosina 0.4 Enfriar a 45 C y distribuir agitando
suavemente.
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 0.2
Fundamento

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos.

La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y


aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas.

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico


brillo metálico.

Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y


transparentes,

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en


C. albicans

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden


dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las
cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello
se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.

En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de


Salmonella y Shigella.
Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Verdosas con brillo metálico y centro negro
Escherichia coli
azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras

Características del medio


Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil


desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias
que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas
las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0
Lactosa 10.0 Suspender 50 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar
Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en autoclave
Agar 13.5 a 121 C durante 15 minutos.
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 0.2
Fundamento

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el


desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en
las colonias, y la precipitación de las sales biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Resultados
Microorganismos Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes
Shigella flexneri Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas
Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura
Estafilococo 110 Agar

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de


estafilococos, en base a la producciónde pigmentos, la fermentación de
manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de levadura 2.5
Tripteína 10.0 Suspender 149 g del medio en un
Gelatina 30.0 litro de agua destilada. Reposar 5
minutos y mezclar calentando a
Lactosa 2.0 ebullición durante 1 o 2 minutos.
D-Manitol 10.0 Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121 C. Verter en placas y
Cloruro de sodio 75.0 mezclar para dispersar el
Fosfato dipotásico 5.0 precipitado.
Agar 15.0
pH final: 7.0 0.2
Fundamento

Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación


alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos
selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio
110.

En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los


nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de
la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono
fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para
inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp.,
lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos
microorganismos.

Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente,
es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación
presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de
manitol e hidrólisis de la gelatina.
Resultados

Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de


identificación de microorganismos.

1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de


bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y
en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el
color desarrollado entre estas dos zonas.

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de


crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos
permanece sin cambio.

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento


bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de
amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Resultados
Microorganismo Pigmento Fermentación de Hidrólisis de Prueba de la
manitol la gelatina coagulasa

S. aureus + + + +
S. aureus + + + +
S. epidermidis - - + -

Características del medio


Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Sal y Manitol Agar

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y


diferenciación de estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir


de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales
de importancia sanitaria.

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas


de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio
Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de carne 1.0
Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
d-Manitol 10.0 mezclar calentando a ebullición
Cloruro de sodio 75.0 durante 1 o 2 minutos. Distribuir y
esterilizar en autoclave a 118-121 C
Agar 15.0 durante 15 minutos.
Rojo de fenol 0.025
pH final: 7.4 0.2
Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.

Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;


las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.

Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una


zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso
de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente


de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol
es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y
fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no


fermentar el manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan


como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias


rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.
Resultados
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla
Staphylococcus epidermidis ATCC
Bueno Roja
14990
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

Características del medio


Medio preparado: rojo
Salmonella Shigella Agar

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas


especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Pluripeptona 5.0
Extracto de carne 5.0
Suspender 60 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0
agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar.
Citrato de sodio 8.5 Calentar a ebullición durante 2 o 3
minutos. NO ESTERILIZAR EN
Tiosulfato de sodio 8.5 AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y
Citrato férrico 1.0 distribuir unos 20 ml por placa.
Secar la superficie del medio unos
Agar 13.5 minutos en la estufa.
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 0.2
Fundamento

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.


La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp.

Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido


sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,


acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose
colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,


crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Resultados
Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis Transparentes, centro negro
Escherichia coli Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy escaso
Enterococcus faecalis
crecimiento

Características del medio


Medio preparado: rojo naranja.
A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac +
C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2S
E: Pseudomona aeruginosa
Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de


sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangre
para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado
Peptona ácida de caseína 17.5 en un litro de agua destilada. Dejar
embeber de 10 a 15 minutos. Calentar
Almidón 1.5 con agitación frecuente y hervir durante
1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15
minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a
cajas de Petri (o agregar los
Agar 15.0 suplementos que se desee) hasta un
nivel de 4 mm sobre una superficie
horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm
de diámetro).
pH final: 7.3 0.1
Fundamento

El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en


forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido
a una serie de factores :

•presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,

•su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es


bajo,

•la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente

Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Resultados

Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la


metodología apropiada.

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

Chromobacterium violaceum Pseudomona aeruginosa Streptococcus pyogenes


Cerebro Corazón Infusión

Medio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias


aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,
neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo.

Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utiliza


este medio para el cultivo de hongos patógenos.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Infusión de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro de
Infusión corazón vacuno 250.0 agua destilada. Calentar a ebullición
hasta disolver completamente.
Peptona 10.0 Esterilizar en autoclave a 121 C durante
Cloruro de sodio 5.0 15 minutos. Los tubos que no se usen
inmediatamente deberán calentarse en
Glucosa 2.0 un baño hirviendo para la eliminación
del oxígeno retenido. Enfriar
Fosfato disódico 2.5 rápidamente sin agitar.
pH final: 7.4 0.2
Fundamento

Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo


microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y
la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas.

La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene


el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer.

Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya
que en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos excepto
los tiol y piridoxal dependientes.

Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reacciones
en la prueba de la coagulasa.

Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe la


flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos
patógenos.
Resultados

Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea
necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación
bioquímica.

Microorganismos Crecimiento
Neisseria meningitidis Bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae Bueno a excelente
Streptococcus pyogenes Bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae Bueno a excelente

Características del medio


Medio preparado: ámbar claro, sin precipitado.

왼왼
: uninoculated tube

왼왼
: Neisseria meningitidis

왼왼왼
: Strepcococcus pyogenes
Tetrationato Caldo.

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella


spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 5.0
Suspender 46 g del polvo en 1 litro de
Sales biliares 1.0 agua destilada. Mezclar vigorosamente y
Carbonato de calcio 10.0 llevar a ebullición. Enfriar a 45 C o
menos. Agregar 20 ml de solución
Tiosulfato de sodio 30.0
iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por
pH final: 8.4 0.2 tubo, en tubos estériles. No debe
Solución iodo iodurada calentarse luego de agregar la solución
iodada. El medio base puede mantenerse
Iodo 6.0 a 4 C , dura varios meses, pero una vez
Ioduro de potasio 5.0 agregada la solución iodada debe usarse
en el mismo día.
Agua 20.0
Fundamento

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe
metabolitos tóxicos.

La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato


(generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales
biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la
flora acompañante.

Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar


40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada
Resultados

Microorganismos Crecimiento
Salmonella typhi Escaso
Salmonella typhimurium Bueno-excelente
Salmonella enteritidis Bueno-excelente
Escherichia coli Escaso

Características del medio


Medio preparado: suspensión blanco lechosa.
Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras


clínicas aptas para exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la
viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difícil desarrollo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro de
Glicerofosfato de sodio 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos.
Calentar a ebullición hasta disolución
Cloruro de calcio 0.1 total. Distribuir en tubos con cierre a
Azul de metileno 0.002 rosca (para evitar oxidación)
llenándolos hasta 2/3 del tubo.
Agar 3.0 Esterilizar 15 minutos a 121ºC.
Dejar solidificar en posición vertical.
pH final: 7.4 0.2
Fundamento

Medio semisólido, no nutritivo.

Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil


para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de
metileno, que es el indicador de oxido reducción.

De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su


envío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados con
carbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenos
entéricos y respiratorios.
Resultados

Los tubos con medio de transporte


se subcultivan en medios sólidos
apropiados según la muestra y el
microorganismo que se quiera
aislar. Luego de la incubación, debe
haber escasa o nula reducción de la
viabilidad de los microorganismos.

Características del medio


Medio preparado: ligeramente
opalescente con tonalidad azul
dependiendo del grado de
oxidación.
Pruebas
Bioquímicas
INTRODUCCIÓN

Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de


manera detallada su actividad bioquímica, porque otras características no
son suficientemente distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la
caracterización bioquímica de una especie.

Además de los productos finales de los procesos metabólicos, también


se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como
ocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimas
intervienen, cuales son los productos intermediarios además de que se
deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas que
tienen lugar dentro de la célula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una


sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del
cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

Enterotube II
Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos


para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación
de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona de carne 13.0
Cloruro de sodio 5.0
Suspender 54.8 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar
Tripteina 10.0 con agitación frecuente, hervir 1 o 2
minutos hasta disolución total. Llenar
Glucosa 1.0
hasta la tercera parte de los tubos de
Citrato de hierro y amonio 0.5 ensayo. Esterilizar a 121 C por 15
Tiosulfato de sodio 0.3 minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento

•En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los


nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

•La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

•El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de


ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro
de hierro, de color negro.

•El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el


balance osmótico. El agar es el agente solidificante.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio ácido.

•El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que


reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.

2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo


fermenta glucosa, y lactosa.

3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no


fermentador de azúcares.

4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el


microorganismo produce gas.

5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido


sulfhídrico.
Características del
medio

Medio preparado: rojo


TSI Agar

Medio universalmente empleado para la diferenciación de


enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa,
lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de carne 3.0
Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro
Lactosa 10.0 de agua destilada. Mezclar bien y
calentar con agitación frecuente,
Sacarosa 10.0 hervir 1 o 2 minutos hasta disolución
Glucosa 1.0 total. Llenar hasta la tercera parte de
los tubos de ensayo. Esterilizar a
Sulfato de hierro y amonio 0.2 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico
Tiosulfato de sodio 0.2 de flauta profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,


aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono


fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de


ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene


el balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan


por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en
medio ácido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que


reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro
de hierro de color negro.
Características del medio
Medio preparado: rojo
Resultados
Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente


Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y
en la producción de ácido sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona de gelatina 5.0
Suspender 35 g del medio
Extracto de levadura 3.0 deshidratado en un litro de agua
Glucosa 1.0 destilada. Dejar embeber unos 15
minutos. Calentar cuidadosamente,
Lisina 10.0 agitando con frecuencia y hervir
Citrato de hierro y amonio 0.5 durante un minuto hasta la disolución
completa. Distribuir y esterilizar a
Tiosulfato de sodio 0.04 121 C durante 15 minutos. Enfriar en
Púrpura de bromocresol 0.02 pico de flauta dejando un fondo
vertical apto para la punción.
Agar 15.0
pH final: 6.7 0.2
Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los


nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la


producción de ácido sulfhídrico.

El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a


pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza


el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.

La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es


necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.

La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del


medio debido a la formación de sulfuro de hierro.

Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de


Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el
cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo
en la superficie del medio.
Resultados

1- Decarboxilación de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género
Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:


-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el
límite del pico y fondo)

Características del medio


Medio preparado: color violeta.
Color en el pico de flauta Ennegrecimiento
Microorganismos Color en la base del tubo
del medio
Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo
Salmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo
Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo
Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Púrpura Púrpura Negativo
Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo
MIO Medio

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,


actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Dextrosa 1.0
Extracto de levadura 3.0
Suspender 31 g del polvo en un
Peptona 10.0
litro de agua destilada. Calentar
Tripteína 10.0 a ebullición hasta completa
disolución. Distribuir en tubos y
Clorhidrato de L-ornitina 5.0
esterilizar 15 minutos a 121 C.
Agar 2.0
Púrpura de bromocresol 0.02
pH final: 6.5 0.2
Fundamento

Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de


extracto de levadura, peptona y tripteína.

Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la


enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.

La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato


para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura
y en medio ácido es amarillo.

Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:


movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento
que difunde mas allá de la línea de inoculación.

La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.
Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol
vire al amarillo.

La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la


enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del


indicador hacia el color púrpura.

El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que


contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de
agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado
positivo.
Resultados
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la
línea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color púrpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color
violáceo en la superficie del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y
la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-
amarillento.

Características del medio


Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.
SIM Medio

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol


y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros
de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua


Peptona 6.1 destilada. Mezclar hasta disolver; calentar
agitando y hervir durante un minuto. Distribuir
Sulfato de hierro y amonio 0.2
unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar
Tiosulfato de sodio 0.2 en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Agar 3.5 Solidificar en posición vertical.

pH final: 7.3 0.2


Fundamento

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y


particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de


Erlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado
negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas
allá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea


de siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de


siembra o en todo el medio.

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el


reactivo de Kovac s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.


Características del medio
Medio preparado: ámbar.
Urea

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la


actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp.
de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Urea 20.0
Suspender 3, 87 g del medio
Fosfato monopotásico 9.1
deshidratado por cada 100 ml de
agua destilada. Disolver sin calentar
Fosfato disódico 9.5
y esterilizar por filtración. Distribuir
Extracto de levadura 0.1 en tubos pequeños estériles, entre
0,5 y 2 ml.
Rojo fenol 0.01

pH final: 6.8 ± 0.2


Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo


contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y


cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el
indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno


proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de
carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el
indicador rojo fenol del amarillo al rojo.
Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.
Características del medio
Medio preparado: anaranjado.
Urea-
1 Uninoculated Control,
2 Proteus Vulgaris,
3 E. coli
Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la


capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones


Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de agua destilada.
Fosfato dipotásico 1.0
Dejar reposar 5 minutos y mezclar
Fosfato monoamónico 1.0 calentando a ebullición durante 1 o 2
Sulfato de magnesio 0.2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar
en autoclave a 121 C durante 15
Azul de bromotimol 0.08 minutos. Enfriar en posición inclinada.
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2
Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y


el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de


utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única
fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento
del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en
presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción
de citrato permeasa.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.


-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae Positivo Azul

S. typhimurium Positivo Azul

E. coli Negativo Verde

S. flexneri Negativo Verde


Características del medio
Medio preparado: verde.
Gracias!

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