LEM Laboratorio de Ecología Microbiana

GUÍA DE APOYO PARA EL CURSO PRÁCTICO DE

MICROBIOLOGÍA
INGENIERÍA EN ACUICULTURA Y ECOLOGÍA
MARINA

ELABORACIÓN:
Dr. Carlos Riquelme S
Ing. Milko Jorquera T

(solo para fines de docencia)

Departamento de Acuicultura, Facultad de Recursos del Mar

UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA

SECCIÓN I: INTRODUCCIÓN A LA
MICROBIOLOGÍA
La microbiología es el estudio de los
organismos, denominados microorganismos, los
cuales debido a su pequeño tamaño no pueden
ser percibidos por el ojo humano. Los
microorganismos, tienen una amplia distribución
taxonómica, incluyendo a metazoos, protozoos,
microalgas, hongos, bacterias y virus. En el
estudio de los microorganismos, debe incluirse el
uso de nuevos ambientes acondicionados,
materiales especializados y técnicas avanzadas.
El principal objetivo del curso práctico de
microbiología es proveer al estudiante el
conocimiento básico para el entendimiento de los
microorganismos acuáticos, específicamente
bacterias, y su manejo efectivo y seguro,
entregando al estudiante una profunda
apreciación de las relaciones de los
microorganismos con su hábitat acuático.
Además, de estimular al estudiante al
racionamiento sobre presencia de diversos
microorganismos en el mundo con el cual
estamos diariamente en contacto.
1. I n f r a e s t r u c t u r a y E q u i p a m i e n t o .
El lugar destinado a la mantención y cultivo de
bacterias debe estar lo suficientemente aislado
para evitar la contaminación de los medios de
cultivo, así como, para mantener una
temperatura estable, dependiendo de los
requerimientos de la especie bacteriana.
Generalmente, para el cultivo de bacterias
marinas, se recomienda un rango de temperatura
de 18-26°C. Este rango sirve tanto para el
crecimiento de las células en unidades de cultivo,
como para la mantención de cepas a través del
tiempo. Actualmente, en el mercado existe una
gran variedad de equipos para el control de la
temperatura en ambientes cerrados (aire
acondicionado), sin embargo, la elección de un
equipo va a estar determinado por el tamaño de
la habitación, el número de personas que
trabajará en la habitación, las fuentes de calor
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(mecheros, ampolletas, tubos fluorescentes, etc.)
y el valor del equipo (manual o automático).
El trabajo en laboratorio con bacterias debe
realizarse en un ambiente libre de agentes
contaminantes (polvos, hongos, etc.), por lo cual,
el lugar asignado debe presentar ciertas
características que aseguren una baja
probabilidad de contaminación. Cámaras o
campanas de flujo laminar de aire son utilizadas
para la transferencia y sembrado de bacterias
(Fig. 1). Al interior de esta campana se genera
una corriente de aire, libre de microorganismos y
polvo, sobre el área de trabajo. El aire que
forma la corriente es tomado desde la habitación,
pasando por filtros hacía el interior de la
campana, además este flujo circulante de aire
forma una especie de pared invisible evitando el
ingreso de contaminantes desde la habitación
hacia el interior de la campana.
Figura 1. Campana de flujo de aire laminar,
utilizada en trabajos microbiológicos in vitro.
Como complemento debe ubicarse dentro de
la campana un mechero Bunsen, el cual caliente
el aire en el área de trabajo, provocando una
corriente de aire ascendente, y un tubo de luz de
irradiación ultravioleta (UV), el cual se utiliza para
esterilizar el interior de la campana. Previo a
trabajar en una campana, su interior debe ser
desinfectado cuidadosamente con alcohol 70%
(vol/vol), el cual ayuda a eliminar ciertos
microorganismos no deseados o bio-
1
contaminantes. El flujo de aire y la luz UV, debe
encenderse 15 minutos antes de su uso.
La mantención y cultivo de bacterias,
generalmente se realiza en recipientes de vidrio
de borosilicato (placas de Petri y tubos con tapa
rosca). Estos recipientes, previo a su uso, deben
ser lavados cuidadosamente con un detergente
neutro, enjuagados reiteradamente con agua
potable y agua destilada o des-ionizada, y
finalmente empaquetados y esterilizados. Estos
recipientes conteniendo los cultivos bacterianos
deben disponerse en estantes metálicos o
madera, susceptible a ser limpiados y
desinfectados con facilidad periódicamente. Así
mismo, para el cultivo de bacterias fototróficas y
microalgas, se debe disponer de estantes
iluminados por paneles de tubos fluorescentes.
Generalmente, los tubos fluorescentes que se
utilizan para el cultivo son de luz fría o luz día, ya
que estos simulan mejor el rango de longitudes
de onda (300-700 nm). Es importante tener en
cuenta que los paneles de iluminación producen
calor, por lo cual, se debe considerar este factor
en el control de la temperatura de la habitación.
2. Esterilización y Desinfección.
Como se ha señalado anteriormente, durante
el cultivo de bacterias en laboratorio es necesario
disminuir la presencia de agentes bio-
contaminantes. En este punto se referirá a los
medios físicos y químicos de control de
crecimiento microbiano. En general, puede
ejercerse el control limitando el crecimiento,
desinfección, o bien destruyendo los organismos
por esterilización, que es la muerte o eliminación
de todos los organismos viables de un medio de
cultivo. En la practica, con frecuencia no se
logra la esterilidad y por ello, muchas veces se
intenta simplemente inhibir el crecimiento rápido
de los microorganismos.
2.1. Esterilización.
2 . 1 . 1 . Es t e r i l i z a c i ó n p o r c a l o r .
A medida que la temperatura se eleva por
encima de la temperatura máxima de
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crecimiento, se producen efectos letales sobre la
célula bacteriana.
C a l o r H ú m e d o : este tipo de esterilización se
realiza a través de un autoclave. El autoclave,
es un aparato hermético que permite la
entrada de vapor de agua a presión (Fig. 2).
El uso de calor húmedo facilita la muerte de
todos los microorganismos, incluidas las
endosporas resistentes al calor. Para matar a
las bacterias es preciso calentar a temperatura
por encima del punto de ebullición del agua y
usar el vapor sometido a presión. El
procedimiento usual es calentar a 1,1 Kg/cm 2
de presión de vapor, lo que proporciona una
temperatura de 121°C. A 121°C se considera
el tiempo de permanencia en el autoclave.
Para lograr la esterilización es necesario un
tiempo de permanencia de 10-20 minutos (Fig.
3). Este es el método más ampliamente
utilizado y es aplicable tanto a medios de
cultivo como a los recipientes de cultivo que
soporten un rango de temperatura sobre los
140°C. El uso del autoclave puede, a veces,
causar la precipitación de los medios de
cultivo, preferentemente aquellos preparados
con agua de mar. Esto podría evitarse de
acuerdo a: (1) en vez de esterilizar por
autoclave, esterilizar por filtración, (2) agregar
sales de fosfato, metales trazas y soluciones de
silicato estériles posterior al proceso de
autoclavado, (3) autoclavar el medio en
volúmenes pequeños y (4) disminuir el tiempo
de permanencia a 10 minutos.
C a l o r S e c o : Sólo usado para material de vidrio o
metálico, ya que requiere temperaturas
mayores a las usadas en un autoclave. El
procedimiento usual es calentar el material a
160°C durante 2 horas en un horno.
2.1.2. Esterilización por irradiación.
Un camino efectivo para la esterilización o
reducción de la carga bacteriana en casi
cualquier tipo de material es mediante el uso de
radiaciones electromagnéticas. La radiación UV,
que normalmente se considera entre los 200 y
2
300 nm, posee energía suficiente para causar
daños en el DNA bacteriano, conduciendo la
muerte de este. Por ejemplo, las campanas de
transferencia utilizadas en laboratorios de
microbiología vienen equipadas con luz UV
microbicida para descontaminar las superficies
antes y después de usarlas. La radiación
ultravioleta no puede penetrar en superficies
sólidas opacas que absorben la luz, por ello su
utilidad se limita a la desinfección de las
superficies expuestas.
2.1.3. Esterilización por filtración.
Aunque el calentamiento es el camino más
común y eficaz para la esterilización de líquidos,
esta no puede utilizarse para esterilizar
compuestos sensibles al calor (por ejemplo,
vitaminas) o gases (aire, CO2). Una técnica
especialmente valiosa para esterilizar de tales
materiales es la filtración. Un filtro es un
dispositivo con poros demasiados pequeños para
que los microorganismos puedan pasar por ellos,
pero suficientemente grandes como para permitir
el paso de los líquidos y gases.
Para el caso de esterilizar soluciones de cultivo
o agua de mar, se usan filtros de membrana de
una porosidad de 0,2 µm o menos. Estos deben
ser del tamaño adecuado de acorde a la a
cantidad y al tipo de líquido que se desea filtrar.

2.2. Desinfección.
El crecimiento de los microorganismos también
puede controlarse con desinfectantes, que
corresponden a agentes químicos que matan a
los microorganismos y se utilizan generalmente
sobre objetos inanimados. Estos agentes químicos
bactericidas tienen un amplio uso de situaciones
en las que no resulta practica la esterilización.
Por ejemplo, compuestos clorados son utilizados
Figura 2. Autoclaves automáticos utilizados en la en el control del crecimiento microbiano en
esterilización de medios de cultivo y material de mesones, paredes y pisos del laboratorio.
laboratorio.
Tabla 1. Tipos de desinfectantes. Fuente:
Madigan et al., 1997.
DESINFECTANTES USOS MODO DE ACCION
Dicloruro Mesas, superficie de Se combina con
mercúrico mesones y pisos grupos –SH
Sulfato de cobre Algicida en piscinas Precipita proteínas
Solución de iodo Heridas Ioda residuos de
tirosinas
Gas cloro Depuración de Agente oxidante
suministros de agua
Compuestos Superficies, Agente oxidante
clorados suministros de agua
Compuestos Superficies Denaturaliza proteínas
fenólicos
Figura 3. Ciclo típico de un autoclave. La Detergentes Instrumental Interacciona con
catiónicos fosfolípidos
temperatura del medio de cultivo u objeto se Oxido de etileno Material plástico Agente alquilante
eleva más lentamente que la temperatura del Ozono Agua de bebida Fuerte agente
autoclavado. Fuente: Madigan et al. 1997. oxidante

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2.3. Pasteurización.
Es un proceso que reduce las poblaciones
microbianas en la leche y otros alimentos
sensibles al calor. Su nombre deriva de Louis
Pasteur. La pasteurización no es sinónimo de
esterilización ya que no todos los
microorganismos son muertos. Originalmente
fue utilizada para matar patógenos causantes de
la tuberculosis, la brucelosis, la fiebre Q y la
fiebre tifoidea, entre otras. El procedimiento
consiste en calentar la solución a 71°C por 15
segundos para luego ser enfriadas rápidamente.
2.4. Sanitización.
Es un proceso estrechamente relacionado a la
desinfección. Una rama de la microbiología
acuática ha iniciado el desarrollo de procesos
para proveer de agua segura para la sociedad.
Las aguas de desechos humanos, especialmente
las aguas servidas, han requerido el desarrollo de
procesos de ingeniería a gran escala de
tratamientos de aguas servidas, dentro de los
cuales muchos son microbiológicos. En la
sanitización las poblaciones microbianas son
reducidas a niveles que son considerados seguros
por estándares de salud pública.
SECCIÓN II: MEDIOS DE CULTIVO
Aunque podemos tener una idea de la
apariencia de las bacterias en un hábitat natural,
a través de estudios microscópicos, sus
características se pueden estudiar mejor
obteniéndolos en cultivo puro o axénico. Un
cultivo puro es un cultivo que contiene solo una
clase de bacteria. Para obtener un cultivo puro
debemos ser capaces de hacer crecer las
bacterias bajo condiciones de laboratorio. Esto
requiere que le suministremos los nutrientes
adecuados y las condiciones ambientales que le
permita crecer. Es también esencial evitar el
ingreso de bio-contaminantes en el cultivo.
Existen diversos tipos de medio de cultivo usados
en microbiología que varían de acuerdo a las
necesidades del microorganismo estudiado.
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Los medios de cultivo se pueden preparar para
ser usados en estado líquido o como geles
semisólidos. Un medio líquido puede pasar a
estado semisólido por adición de un agente
solidificante, que normalmente es el agar. Los
medios de cultivo con agar se disponen en placas
circulares de vidrio o poliestireno, con tapaderas,
que se denominan placas de Petri, donde las
células bacterianas pueden crecer y formar masas
visibles denominadas colonias. Los nutrientes que
están presentes en el medio de cultivo
proporcionan a las células los ingredientes
requeridos para que se produzcan más células
como ellas mismas. Además, de una fuente de
energía, que puede ser un compuesto orgánico o
inorgánico, o luz, un medio de cultivo debe tener
una fuente de carbono y nitrógeno junto a otros
nutrientes. En microbiología se usan dos grandes
grupos de medios de cultivo:
1. Medios de cultivo químicamente
definidos.
Provee de los nutrientes requeridos para el
crecimiento del microorganismo, en forma de
compuestos orgánicos e inorgánicos altamente
purificados en concentraciones conocidas y se
preparan añadiendo agua destilada en
cantidades precisas como solvente. El pH del
medio de cultivo debe ser ajustado antes de la
esterilización y usualmente son esterilizados en un
autoclave por 15-30 minutos.
2. Medios de cultivo químicamente
indefinidos.
En muchos casos, el conocimiento exacto de la
composición química no es crítico, por lo cual, se
emplean en su preparación extractos nutritivos de
la naturaleza (por ejemplo, extracto de suelo).
Estos medios contienen todos los nutrientes
necesarios para un microorganismo, pero en
forma cruda. Muchos componentes son ácidos y
enzimas digeridas de plantas, carnes, caseína y
células de levadura los cuales proveen de ricas
fuentes de polipéptidos, aminoácidos, vitaminas y
minerales. Ejemplos de componentes son las
peptonas y triptonas, las cuales son hidrolizados
4
enzimáticos de proteína animal, o extractos de
levadura, ricos en vitaminas con complejo-B.
Algunos carbohidratos usualmente están
presentes, pero generalmente estos medios son
suplementados con azúcar (glucosa).
3. Preparación de medios de cultivo y su
esterilización.
Los más comunes medios de cultivo para el
cultivo de microorganismos contienen extracto de
carnes y triptona. Los mayores constituyentes son
proteínas degradadas, bases orgánicas, vitaminas
y sales minerales. Generalmente, los medios
utilizados en laboratorio se compran a empresas
de suministros microbiológicos (Oxoid, Difco,
Merck, Fluka, Riedel-deHaën, entre otros). Estos
medios vienen deshidratados y deben prepararse
según las indicaciones del fabricante. A con la llama invirtiendo el mechero Bunsen sobre
continuación se presentan algunos ejemplos en la
preparación de medios de cultivo.
3.1. Agar triptona soya (tryptone soya agar)
de Oxoid.
Medio de cultivo general utilizado para el
desarrollo in vitro de una amplia variedad de
microorganismos.
F o r m u l a t í p i c a ( g r a m o / l i t r o ) : triptona (15),
peptona de soya (5), cloruro de sodio (5) y
agar bacteriológico (15). pH 7,3±0,2.
Almacenamiento 10-25°C.
P r e p a r a c i ó n : Añadir 40 gramos a 1 litro de agua
destilada o des-ionizada. Llevar a ebullición
hasta disolver completamente. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos.
3.2. Agar Marino 2216 (marine agar) de
Difco.
Aislamiento, cultivo y enumeración in vitro de
bacterias heterótrofas marinas.
F o r m u l a t í p i c a : contiene todos los nutrientes
esenciales para el cultivo de bacterias
heterótrofas marinas, incluyendo minerales que
duplican la mayor parte de los minerales
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contenidos en el agua de mar. pH 7,6±0,2 a
25°C.
P r e p a r a c i ó n : Suspender 55,1 gramos en 1 litro
de agua destilada o des-ionizada. Llevar a
ebullición hasta disolver completamente.
Esterilizar a 121-124°C por 15 minutos.
4 . Distribución del medio de cultivo y
almacenamiento.
Una vez esterilizado el medio de cultivo en el
autoclave y presentando una temperatura
aproximada de 60°C, este debe ser, en forma
aséptica, cuidadosamente distribuido en placas
de Petri (aproximadamente 15 ml/placa) o tubos
de ensayo con tapa rosca (aproximadamente 15
ml/tubo). Si aparecen burbujas en la superficie
del agar , estas deben ser removidas rápidamente
la superficie del agar. Rotular y secar las placas
por 48 horas a 30°C o 72 horas a temperatura
ambiente. Posteriormente al secado, verificar la
posible contaminación del medio de cultivo, en
caso de placas contaminadas estas deben ser
descartadas inmediatamente. En caso de
contaminación con hongos, las placas no deben
abrirse dentro del laboratorio, para evitar la
diseminación de las esporas y/o posibles futuras
contaminaciones. Por último, almacenar las
placas rotuladas y debidamente empaquetadas, a
4°C hasta su uso.
Cabe destacar que los medios de cultivo semi-
sólidos en placas de Petri, corresponden a caldos
de cultivo a los cuales se les ha agregado 1,5-
2,0% de agar. Por ejemplo, el caldo nutritivo
(nutrient broth) de Oxoid, el cual esta compuesto
de polvo “Lab-Lemco”, extracto de levadura,
peptona y cloruro de sodio; se le agrega agar
(15 gramos/litro), pasa a llamarse agar nutritivo
(nutrient agar), el cual solidifica a temperatura
ambiente.
5
SECCIÓN III: SIEMBRA Y
AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS.
En microbiología básicamente existen dos
clases de acciones: el aislamiento, que consiste
en la separación de un microorganismo en
particular desde una población natural,
conteniendo millones o billones de individuos, y
el cultivo que es crecimiento de poblaciones en
un ambiente artificial (medio de cultivo) bajo
condiciones de laboratorio. Las bacterias no
requieren grandes espacios para su desarrollo,
ambientes artificiales pueden ser creados en
unidades de confinamiento como los tubos,
placas de Petri y matraces. Estos recipientes con
medio de cultivo, inicialmente debe estar
completamente estériles y después de la
introducción de los microorganismos deseados,
deben ser protegidos de una posterior
contaminación externa.
Cuando se desea aislar una bacteria desde
una muestra, es aconsejable llevar a cabo
cultivos preparatorios antes de proceder al
aislamiento. Uno de los más usados es el
denominado es el cultivo de enriquecimiento.
Los factores más importantes al preparar un
cultivo de enriquecimiento son: (1) las
condiciones de cultivo deben favorecer el
crecimiento de las especies deseadas y (2) inhibir
el crecimiento de especies competidoras para
facilitar el posterior aislamiento. El cultivo de
enriquecimiento debe incubarse en condiciones
ambientales adecuadas, acorde con aquellas del
ambiente natural, y debe ser examinado
periódicamente, comenzando aproximadamente
24 horas después de haberse sembrado. El
inóculo es comúnmente introducido a través de
un asa de metal estéril o a través del uso de
micropipetas graduadas (Fig. 3). A continuación
se referirá a las tres técnicas comúnmente
utilizadas en laboratorio para sembrar muestras
de cultivo bacteriano.
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Figura 3. Vista interior de la campana
bacteriológica. Se puede observar bolsas
conteniendo placas de Petri estériles y un set de
micropipetas para la inoculación y sembrado
en medio de cultivo.
1. Siembra en estrías o rayado sobre el
agar.
Cultivos bacterianos pueden realizarse sobre la
superficie del agar en una placa de Petri, a través
del sembrado en estrías con un asa metálica
estéril (Fig. 4). Para esta técnica es necesario
preparar placas con medio de cultivo sólido (1,5-
2,0% agar bacteriológico). El objetivo de las
estrías es producir colonias de bacterias en forma
separada sobre el agar, a través de la
distribución de un inóculo bacteriano proveniente
de una suspensión de células concentradas. Al
comenzar el estriado sobre el agar, las células
quedan dispuestas en forma agrupada, pero al
continuar el estriado las células se van liberando
paulatinamente desde el asa quedando
distribuidas en forma cada vez más separada
sobre el agar. Una buena placa resulta de varios
movimientos continuos del asa sobre el agar. El
inóculo puede ser una pequeñísima cantidad de
células provenientes de una colonia previamente
cultivada, o bien provenir de pequeñas gotas de
cultivo o suspensiones bacterianas (por ejemplo,
gotas de agua de mar, homogenizado de tejido
animal, secreciones, mucosidades, etc.).
6
Finalmente, las placas se sellan y dejan
incubando en forma invertida.
Figura 4. Siembra en estrías sobre medio sólido.
Fuente: Seeley et al. 1991.
2. Siembra en forma extendida.
Esta técnica se utiliza cuando el inóculo a
utilizar es líquido (caldo de cultivo, muestras de
agua servida, orina, etc.). La técnica se basa en
distribuir la muestra sobre la superficie del medio
cultivo sólido en una placa de Petri. Un volumen
de 0,1 ml (100 µl) de muestra se dispone sobre el
medio con la ayuda de una micropipeta y
posteriormente con un asa de vidrio (previamente
sumergida en etanol 90%, flameada y enfriada)
se comienza a distribuir el inóculo sobre el agar,
hasta que este sea absorbido por el agar (Fig. 5).
Finalmente, las placas se rotulan, sellan y dejan
incubando en forma invertida. Para muestras con
alta carga bacteriana, es necesario realizar
diluciones a través de una serie de tubos
conteniendo: (1) solución salina marina SSM
(marine-saline solution, Austin 1988) o (2)
solución de nueve sales SNS (nine-salts solution,
Malmcrona-Friberg et al. 1990). El objetivo de
las diluciones es obtener el desarrollo de colonias
separadas sobre el agar, ya que a través de esta
técnica es posible cuantificar las colonias y de
esta forma estimar la carga bacteriana en la
muestra inicial.
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Figura 5. Siembra en forma extendida sobre
medio sólido. Fuente: Seeley et al. 1991.
Formula típica de SSM (gramo/litro):
MgSO4×7H2O (7), KCl (0,8) y NaCl (24).
Disolver en agua destilada y ajustar el pH 7,0 y
esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
Formula típica de SNS (gramo/litro) : NaCl(17,6),
Na2SO4 (1,47), NaHCO3 (0,008), KCl (0,25),
KBr (0,04), MgCl 2×6H2O (1,87),
CaCl 2×2H2O (0,41), SrCl 2×6H2O (0,001) y
H3BO3 (0,01). Disolver en agua destilada y
esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
3. Siembra en forma vertida.
Al igual que la siembra en placa extendida, se
debe utilizar un inóculo líquido. Para esta técnica
es necesario preparar tubos con 15 ml de medio
de cultivo al cual se le ha adicionado 1,0% de
agar. El tubo es licuado y mantenido en un baño
termoregulado a una temperatura de 45-50°C (a
punto de solidificar). Usando una micropipeta se
transfiere a una placa de Petri estéril (sin medio
de cultivo) 1 ml de la muestra inicial, o bien de
las respectivas diluciones (Fig. 6).
Posteriormente, se vierte sobre la muestra el
medio de cultivo contenido en el tubo, se
homogeniza vigorosamente en forma de cruz y se
espera a que el agar solidifique (Fig. 7). En esta
7
etapa es necesario verificar que el medio de
cultivo presente la menor temperatura posible, ya
que esta puede afectar a las bacterias contenida
en la muestra. Finalmente, las placas con el
medio solidificado se rotulan, sellan y dejan en
forma invertida hasta obtener el desarrollo de
colonias embebidas en el agar. Al igual que la
siembra en forma extendida, con esta técnica es
posible cuantificar las colonias y de esta forma
estimar la carga bacteriana en la muestra inicial.
Figura 6. Siembra en forma vertida, se adiciona 1
ml de la muestra sobre una placa de Petri
estéril.
Figura 7. Siembra en forma vertida, se adiciona
el medio de cultivo, a punto de solidificar,
sobre la muestra bacteriana, posteriormente se
homogeniza y se espera que este solidifique
antes de su incubación.
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4. Siembra en medio de cultivo líquido.
Esta técnica es bastante simple y consiste en
transferir el inóculo (sólido o líquido) a tubos
conteniendo medio de cultivo líquido o caldo de
cultivo. En el caso de inóculos sólidos (por
ejemplo, trozos de tejido infectado por alguna
patología), estos se transfiere con un asa de
metal estéril, la cual es sumergida y agitada
vigorosamente en el caldo de cultivo con el fin de
liberar células bacterianas. Para inóculos
líquidos se adiciona entre 10-20 µl de muestra en
el caldo con la ayuda de una micropipeta. Una
vez inoculado el caldo este es rotulado, sellado,
homogenizado e incubado hasta obtener el
crecimiento bacteriano, evidenciado por un
aumento de la turbidez del caldo mirado a tras
luz.
5. Aislamiento y obtención de cultivos
puros.
Teniendo éxito en el sembrado de las muestras,
reflejado en el crecimiento de diversos
componentes microbianos en el caldo de cultivo
o sobre el agar, el siguiente paso es aislar cada
uno de los componentes microbianos presentes o
asociados a dichas muestras.
5.1. Aislamiento por estrías en agar.
Células bacterianas pueden aislarse fácilmente
por estrías en agar. Esta técnica se basa en la
siembra en forma de estrias y consiste en
disponer una gota de la muestra líquida o una
pequeñísima cantidad de una colonia sobre el
agar a través de un asa metálica estéril. Con el
asa se realiza continuos rayados sobre la
superficie del agar. Posteriormente, las placas se
incuban por 48 horas o más, hasta poder
visualizar las microcolonias bacterianas que se
forman sobre el medio de cultivo (Fig. 8).
Finalmente, las colonias o unidades formadoras
de colonias (UFC) son trasladadas a un medio de
cultivo (líquido o sólido) nuevo.
8

Figura 8: Aislamiento por estrías en medio sólido,
observe el crecimiento de las UFC individuales.
Fuente: John Durham/Photo Researchers, Inc.
5.2. Aislamiento por dilución.
Esta técnica se utiliza cuando la bacteria que
se desea aislar está en abundancia. El principio
básico es estimar la densidad poblacional de una
muestra y efectuar diluciones necesarias para
reducir la densidad, teóricamente, a una o unas
pocas células. Por ejemplo, se toma 1 ml de
una muestras (dilución 100), a la cual se le estimó
bajo microscopía una concentración de 106
células/ml, y se inócula en un tubo de 9 ml de
SSM estéril (dilución 10-1). Luego se homogeniza
el tubo con la dilución 10-1 y se le extrae 1 ml
para inocular otro tubo con 9 ml de SSM estéril
(dilución 10-2). Esta operación se realiza
sucesivamente hasta obtener la dilución 10-6, la
cual teóricamente contiene una concentración de
1 célula/ml. Posteriormente, se realiza la siembra
en forma extendida de las últimas diluciones (10-
4 que se llama fase de latencia, que puede ser más
, 10-5 y 10-6) sobre medio de cultivo enriquecido.
Estas placas se incuban hasta poder visualizar las
UFC para luego ser traspasadas individualmente
a nuevos recipientes de cultivos.
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SECCIÓN IV: DINAMICA DE UN
CULTIVO BACTERIANO
Durante el cultivo de una especie de
bacteria en particular, se requiere de una
comprensión adecuada de su ciclo de
crecimiento, edad de cultivo y fase de desarrollo
dinámico del cultivo. En microbiología, el
crecimiento se define como un incremento en el
número de células. El crecimiento es un
componente esencial de la función celular, ya
que una célula tiene un periodo de vida
determinado en la naturaleza y la especie se
mantiene como resultado del crecimiento
continuo de la población celular. El crecimiento
de una población de bacterias puede ser medido
como un incremento en la masa microbiana. La
velocidad de crecimiento es el cambio en el
número de células o masa celular, donde todos
los componentes estructurales de las células se
duplican. El tiempo requerido para que a partir
de una célula se formen dos células se denomina
tiempo de generación. Por lo tanto, el tiempo de
generación es el tiempo requerido para
duplicarse el número de células con el de la
masa microbiana. El tiempo de generación varía
ampliamente entre las diferentes especies de
bacterias.
1. Ciclo de crecimiento de poblaciones de
bacterias.
En un recipiente cerrado o batch, una típica
curva de crecimiento es la que se representa en la
figura 9. Esta curva de crecimiento puede
dividirse en varias fases: de latencia, exponencial,
estacionaria y muerte.
1.1. Fase de latencia o fase lag.
Cuando una población bacteriana se inocula
en medio de cultivo fresco, no ocurre crecimiento
inmediatamente, sino después de cierto tiempo
larga o más corta dependiendo de muchos
factores. Si un cultivo en crecimiento exponencial
se inocula exactamente en el mismo medio de
9
cultivo, no se observa esta fase sino que sigue
creciendo exponencialmente. Sin embargo, si un Como n esta expresado en términos de
inoculo se toma a partir de un cultivo viejo, cantidades, se pueden calcular los tiempos de
entonces tiene lugar una fase de adaptación. generación. El tiempo de generación g se
Esto ocurre porque las células, en estas calcula como t/n, donde t son las horas o
condiciones, carecen de determinados minutos de crecimiento exponencial. Por
componentes esenciales y tiene que transcurrir un ejemplo, el tiempo de generación de un cultivo
cierto tiempo para que se proceda su síntesis. que inicio su fase exponencial con una densidad
de 5×106 células/ml y que luego de 4 horas de
1.2 Fase exponencial o fase log. crecimiento exponencial incrementó su densidad
La fase exponencial es la consecuencia de que a 1×108 células/ml.
una célula se divida en dos, éstas en otras dos y
así sucesivamente. La mayoría de las bacterias n= log (1×108) – log (5×106) = 8 – 6,698 = 2,162
Log 4 0,602
crecen exponencialmente, pero las velocidades
de crecimiento exponencial pueden variar g = 4 = 1,85
considerablemente. Tal velocidad es influenciada 2,162
por las condiciones ambientales (temperatura,
composición del medio de cultivo, etc.), así como Entonces, 2,162 generaciones de bacterias
por las características genéticas de la bacteria en tuvieron lugar durante 4 horas de crecimiento
cuestión. Una de las característica del crecimiento exponencial y la población bacteriana se duplicó
en el número de células es lenta inicialmente, cada 1,85 horas. El tiempo de generación g
para después incrementar constantemente en una puede calcularse también de la pendiente en una
auténtica explosión del número de células. gráfica semi-logarítmica de crecimiento
Para muchos propósitos es útil conocer el exponencial. Con el conocimiento de n y t, uno
tiempo de generación de una población puede calcular g para diversos organismos
bacteriana durante el crecimiento exponencial; creciendo exponencialmente bajo diferentes
tal información puede obtenerse de un análisis condiciones de cultivo (Tabla 2). Los tiempos de
matemático de los datos del número células que generación en investigaciones microbiológicas
tiene lugar en un cultivo creciendo son a menudo buenos indicadores del estado de
exponencialmente, es una progresión geométrica salud fisiológico de una población celular.
del número 2. Al dividirse dos (para dar cuatro
células) podemos expresar como 22-23 y así Tabla 2. Tiempo de generación de algunas
sucesivamente. Debido a la progresión bacterias, de acuerdo a su temperatura óptima
geométrica, hay una relación directa entre el de crecimiento y cultivados en medio de cultivo
número de células presente en el momento inicial complejos. Fuente: Stainer et al. 1990.
y el habido en un momento determinado del
crecimiento exponencial, de modo que: ESPECIE TEMPERATURA g (horas)
(°C)
Vibrio natriegens 37 0,16
N1 = N02n Bacillus stearothermophilus 60 0,14
n = (log N2/N1)/log(t2-t1) Escherichia coli 40 0,35
Bacillus subtilis 40 0,43
n = Número de generaciones ocurrido durante el Pseudomonas putida 30 0,75
Vibrio marinus 15 1,35
período de fase exponencial.
Rhodobacter sphaeroides 30 2,2
t1 = Unidad de tiempo inicial. Mycobacterium tuberculosis 37 ~6
t2 = Unidad de tiempo final. Nitrobacter agilis 27 ~20*
N1 = Número de células/ml en el tiempo inicial. *Crecimiento en medio sintético.
N2 = Número de células/ml en el tiempo final.

LEM Laboratorio de Ecología Microbiana 10

1.3. Fase estacionaria.
En un cultivo donde no se renueva el medio de
cultivo, el crecimiento exponencial no es
indefinido. Lo que habitualmente sucede es que,
o bien un nutriente esencial del medio de cultivo
se acaba, o algún producto de desecho se
acumula en el medio hasta alcanzar
concentraciones inhibitorias del crecimiento
exponencial. En esta fase no hay crecimiento
neto (o decremento) del número de células. Sin
embargo, aunque en esta fase no tiene lugar
crecimiento, todavía ocurren muchas funciones
celulares, incluyendo el metabolismo energético y
algunos procesos bio-sintéticos. En algunos
microorganismos puede incluso tener lugar un
crecimiento lento durante la fase estacionaría;
algunas células crecen y otras mueren, siendo el
balance total de ausencia de incremento en el
número de células, este fenómeno se conoce
como crecimiento críptico.
1.4. Fase de muerte.
Si la incubación continúa después de que la
población alcance la fase estacionaria, las
células deben permanecer vivas y teñida, o con sistema de fluorescencia cuando se
metabólicamente activas, pero también deben
morir. Si esto último ocurre se dice que las
células entran en su fase de muerte. En algunos
casos la muerte va acompañada de la lisis
celular.
Figura 9. Curva de crecimiento ideal de una
población bacteriana en un cultivo batch.
LEM Laboratorio de Ecología Microbiana
2. Medición de crecimiento microbiano.
El crecimiento de una población microbiana se
mide siguiendo los cambios en el número o el
peso de la biomasa celular. Existen diversos
métodos para contar el número de células o para
estimar la masa celular dependiendo del
microorganismo que se trate.
2.1. Recuento directo de bacterias totales.
El número de células de una población puede
medirse directamente al microscopio, es el
método denominado como recuento directo. Se
puede realizar en muestras secas o líquidas. El
recuento microscópico directo es una manera
rápida de estimar el número de células
microbianas. Sin embargo, tiene una serie de
limitaciones: (1) las células muertas no se
distinguen de las vivas, (2) las células pequeñas
son difíciles de ver al microscopio, (3) se requiere
tiempo y habilidad para conseguir precisión por
este método, (4) se requiere de un microscopio
de contraste de fase cuando la muestra no es
trabaja con tinciones fluorescentes y (5) este
método no es bueno para una suspensión de
células poco densa (<106 células/ml).
2.1.1. Método de Breed.
Este método se basa en distribuir un volumen
conocido de la muestra, que se quiere
cuantificar, en un cuadrado de 1 cm 2 sobre un
portaobjeto. El número de microorganismos en
la muestra es determinado contando diferente
campos bajo el microscopio. Para la realización
de este método es necesario fijar la muestra y
teñir las células con una tinción básica (Fig. 10).
Para entender como la tinción actúa sobre la
célula, primero se debe saber que es una tinción.
Muchas tinciones son sales, de las cuales una
parte es coloreada. Una sal es un compuesto
constituido por un ión con carga positiva y otro
ión con carga negativa. Por ejemplo, el azul de
metileno corresponde a cloruro de azul de
metileno:
11
AMC azul metileno+ + cloruro-

El color se encuentra en la carga positiva. Las

células bacterianas tiene una carga negativa
cuando el pH que las rodea es cercano a 7. La
carga negativa de la célula se combina con la
carga positiva del ión azul de metileno, dando
como resultado la célula teñida. Las tinciones
pueden dividirse en básica y ácida. Si el color se
encuentra en el ión positivo se denomina tinción
básica, por el contrario si el color se encuentra
en el ión negativo se denomina tinción ácida. Figura 10. Bacillus sp. teñido con cristal violeta
para la realización del recuento de Breed.
A continuación se referirá al procedimiento
utilizando para el recuento como tinción básica, 2.2. Recuento de células viables cultivables.
a través del uso de cristal violeta.
En el método anterior se cuentan tanto
Procedimiento:
bacterias vivas como muertas. En muchos casos
- Dibuje un cuadrado de 1 cm 2 sobre un estaremos interesados en contar solo las vivas y
portaobjeto. para ello se han desarrollado métodos recuentos
- Prepare una suspensión bacteriana en un tubo para bacterias activas. Una célula viable
de SSM o SNS y disponga una gota (10-20 µl)
cultivable se define como la que es capaz de
de la suspensión sobre el portaobjeto, o bien,
dividirse y dar lugar a descendencia y la forma
disponga una gota (10-20 µl) de SSM o SNS habitual de llevar a cabo el recuento, es
sobre el portaobjeto y a través de un asa determinar el número de células capaces de
metálica estéril disuelva un pequeño inóculo formar colonias sobre la superficie de un medio
tomado desde una UFC.
de cultivo sólido. El racionamiento que se
- Distribuya la muestra tratando de cubrir el área
sustenta este método es que cada célula viable
del cuadrado.
puede dar lugar a una colonia, por lo cual, esta
- Seque la muestra con la ayuda de la llama del se denomina unidad formadora de colonia o
mechero Bunsen. Cuide no calentar UFC. Hay dos maneras de llevar este contaje en
excesivamente la muestra, ya que puede placa, por siembra en forma extendida o por
producir cambios en la morfología de la
siembra de forma vertida.
célula.
- Tiña con cristal violeta por 30 segundos y lave 2.3. Recuento directo de bacterias viables.
con agua.
Diversos estudios han señalado que los
- Seque la muestra a la llama del mechero.
métodos tradicionales de siembras en medio de
- Observe y cuente las células bajo microscopía
cultivo arrojan recuentos bacterianos que solo
con aceite de inmersión.
representan 0,001% a 0,1% del total de las
- Haga el cálculo para determinar la
bacterias presentes en un ecosistemas marino.
concentración bacteriana de la muestra.
Por lo tanto, existe un alto porcentaje de
bacterias que se encuentran activas pero el
medio de cultivo o las condiciones de cultivo no
facilitan su crecimiento. Para soslayar esta
problemática, se han desarrollados diversos
métodos de recuento directo de bacterias viables

LEM Laboratorio de Ecología Microbiana 12

o direct viable-cell counting (DVC), basados en
observaciones de frecuencia de división celular
y/o basados en reacciones de actividad
enzimática. Uno de estos métodos generalmente
usados, corresponde al método del ácido
nalidíxico (Fig. 11), este se refiere a la incubación
de una suspensión bacteriana con agentes
antibacterianos (ácido nalidíxico, ácido
piromídico, etc.). El agente antibacteriano actúa
como inhibidor de la síntesis de ADN y previene
la división celular sin afectar la actividad
metabólica de la célula. Como resultado la
célula metaboliza los nutrientes y comienza a
elongarse o engordar, en cambio las células
muertas permanecen con el tamaño original.
Este recuento de células elongadas suele ser más
representativos de las bacterias metabólicamente
activas en las muestra que aquellas obtenidas por
recuentos de viables cultivables en placas.
Figura 11. Método de ácido nalidíxico, donde
se aprecia, bajo técnicas de observación con
fluorescencia, células elongadas (células activas)
después del periodo de incubación.
2.4. Estimación de masa celular.
En algunos casos, es necesario estimar la masa
de células presente en el cultivo más que el
número de células. Sin embargo, debido a que
la masa celular es proporcional al número se
puede utilizar la determinación de un parámetro
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para estimar otro. Se puede medir la masa
celular neta por centrifugación o filtración de un
volumen conocido y simplemente pesar el
precipitado o las células retenidas en el filtro. El
procedimiento habitual es determinar el peso
seco después de secar la muestra durante una
noche a 90-110°C.
2.5. Estimación por absorción de la luz.
Un método más rápido y útil, para obtener una
estimación del número de células o biomasa,
consiste en la utilización de medidas de
dispersión luminosa. Una suspensión celular
aparece turbia por que las células dispersan la
luz que atraviesa la suspensión. Esta turbidez
puede medirse con un fotómetro o
espectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la
luz a través de una suspensión celular y detectan
la cantidad de luz no dispersada. Sin embargo,
previo al uso de esta técnica es necesario realizar
recuentos directos celulares con el objeto de
establecer una curva de cantidad de luz no
dispersada versus concentración bacteriana.
SECCIÓN V: IDENTIFICACIÓN
BACTERIANA
Los hábitats acuáticos raramente contienen una
sola especie de bacteria. Para determinar que
microorganismo vive en un hábitat, cada especie
presente debe ser aislada en un cultivo puro e
identificada. Los microorganismos no tienen una
variedad definida de características anatómicas y
obviamente difieren notablemente de los patrones
utilizados en botánica y zoología. La
identificación bacteriana se basa en una variedad
de características que incluye no solo la
morfología, sino también características
fisiológicas, patógenas, serológicas y,
recientemente, información genética. Para
muchos microbiólogos la forma de las células, la
apariencia de los cultivos en laboratorios,
respecto a la forma de la UFC y su pigmentación,
con herramientas útiles en su identificación (Fig.
12). Otras características importantes en el
reconocimiento de una bacteria pueden ser la
13
habilidad de utilizar o atacar ciertas substancias
(substratos), producir cambios o productos
químicos y causar una enfermedad en particular.
Sin embargo, la tarea de identificación de una
especie bacteriana no sencilla pudiendo ser
simplificada por pruebas acerca de las
características particulares de los
microorganismos: requerimientos nutricionales y
de temperatura, productos metabólicos y otros.
Añadiendo sustancias químicas selectivas a la
formula típica de los medios de cultivo o
imponiendo una condición especial durante el
crecimiento del cultivo se puede reprimir el
crecimiento de ciertos microorganismos no-
deseados y favorecer el crecimiento de
microorganismos deseados para estudiar.

Figura 12. Guía de términos frecuentemente usados en la descripción de UFC. Whole colony: forma de
UFC (puntiforme, circular, rizoidea, irregular, filamentosa, etc.), edge: borde de la UFC (entero,
ondulado, lobulado, rizado, etc.), elevation: elevación de la UFC (plana, elevada, convexa, pulvinada,
umbonada, etc.), Surface, superficie de la UFC (lisa, brillante, rugosa, encarrujada, seca, polvorosa,
etc.). Fuente: Seeley et al. 1991.

crecimiento de gran parte de los grupos

1. Medio de cultivo enriquecido o
selectivo.
El objetivo de este medio es favorecer el
desarrollo de microorganismos dándole ventajas
por sobre sus competidores. Por ejemplo,
ajustando el pH 4 de un medio e incubándolo en
condiciones anaeróbicas se previene el
bacterianos, promoviendo el crecimiento de
bacterias ácido-tolerantes como bacterias del
ácido láctico Lactobacillus. Si el medio es
preparado con lactato de sodio como la única
fuente de energía, de preferencia se producirá el
desarrollo de bacterias que utilizan el lactato
como Propionibacterium o Veillonella. Si se
pretende aislar miembros del género Vibrio,

LEM Laboratorio de Ecología Microbiana 14

habitante común de los ecosistemas acuáticos y
comúnmente asociado a la flora de invertebrados
marinos, el medio utilizado corresponde al
tiopsulfato-citrato-sales biliares-sucrosa o TCBS.
Este medio de cultivo favorece de crecimiento de
vibrionáceas inhibiendo el desarrollo de otros
componentes bacterianos en una muestra.
2. Medio de cultivo diferencial.
Algunos medios de cultivos están sujeto a
muchas (a veces inadvertidas) influencias
selectivas: la composición del medio, temperatura
de incubación, pH, relación de oxigeno y otros.
El aislamiento e identificación bacteriana puede
ser orientada a bacterias que pueden realizar una
reacción en particular. Por ejemplo, si se desea
aislar un microorganismo que puede hidrolizar la
urea, las muestras deben sembrarse en medio
conteniendo urea y un indicador de pH. Durante
el desarrollo de las colonias, aquellas que utilizan
la urea produciendo amonio, deberían ser
reveladas debido al cambio de color del
indicador a su alrededor. Otro ejemplo,
corresponde al medio TCBS, anteriormente
señalado, ya que este medio además de ser
selectivo para Vibrios presenta un indicador de
pH el cual vira de verde a amarillo cuando se
produce el desarrollo de colonias de bacterias
capaces de fermentar la sucrosa, siendo
denominadas sucrosa +.
3. Tinción Diferencial.
Se denominan tinciones diferenciales aquellas
que no tiñen de manera homogénea a todos los
tipos de células. La más importante tinción
diferencial utilizada en microbiología se
denomina tinción de Gram, en honor al
microbiólogo que lo describió.
3.1. Tinción Gram.
Este procedimiento divide a las bacterias en
dos grandes grupos: gram-positiva y gram-
negativa. La diferencia entre los dos tipos de
células es debido a la variación de su pared
celular. La capa responsable de la rigidez en las
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paredes de las gram-positivas y gram-negativas
es muy similar en su composición química. Se le
denomina peptidoglicano (o mureína) y esta
formada por dos derivados de azucares N-
acetilglucosamina y N-acetilmuramico, y un
pequeño grupo de aminoácidos que incluye la L-
alanina, D-alanina, D-glutámico y lisina entre
otros. Estos componentes se unen entre sí para
formar una estructura que se repite a lo largo de
la pared y que se denomina tetrapéptido del
glicano. En bacterias gram-posititvas el
peptidoglicano representa hasta el 90% de la
pared. En bacterias gram negativas el
peptidoglicano constituye sólo alrededor del 10%
de la pared, estando constituido el resto por una
compleja capa de lipopolisacaridos y proteínas.
La tinción Gram requiere de cuatro soluciones:
una tinción básica, un mordiente, un agente
decolorante y una contra-tinción. El mordiente es
una sustancia que incrementa la afinidad entre la
célula y la tinción. Bajo la acción del mordiente
la célula es intensamente teñida y mucho más
dificultosa de lavar después de la aplicación del
mordiente. El agente decolorante, como el
nombre lo señala, es una sustancia que remueve
la tinción desde la célula. Algunas células
teñidas decoloran más fácilmente que otras. La
contra-tinción, es una tinción básica de un color
diferente a la tinción inicial. El propósito de esta
es dar a las células decoloradas un color
diferente al de la tinción inicial. Los
microorganismos que no son fácilmente
decolorados retienen el color inicial de la tinción
básica y aquellos que son fácilmente decolorados
toman el color de la contra-tinción (Fig. 13). A
continuación se referirá al procedimiento gram
utilizando como tinción básica a cristal violeta,
mordiente lugol, decolorante alcohol y contra-
tinción safranina.
Procedimiento:
- Prepare una suspensión bacteriana en SSM o
SNS sobre un portaobjeto y fíjela bajo la llama
del mechero Bunsen.
- Tiña con cristal violeta por 30 segundos y lave
con agua.
- Cubra la muestra con lugol y deje actuar por
30 segundos.
15
- Lave con agua.
- Decolore la muestra con alcohol 95° por 10-
20 segundos y lave con agua.
- Tiña con safranina por 20-30 segundos y lave
con agua.
- Seque la muestra a la llama del mechero.
- Observe bajo microscopía con aceite de
inmersión.
- Haga un esquema en una hoja de reporte.
Figura 13. Tinción de Gram. Observe las células
de color violeta o azul oscuro,
correspondiendo a bacterias gram-positivas.
Fuente: John Durham/Photo Researchers, Inc.
4. Pruebas bioqu ímicas.
Como se ha señalado anteriormente, una
parte importante en la identificación es la
habilidad de utilizar substancias y producir ciertos
productos químicos. Tradicional la identificación,
esta basada en la suposición que se cuenta con
un cultivo bacteriano puro (libre de bio-
contaminantes) y en esquemas de identificación
(Fig. 14) constituidos por una serie de
fermentación de azucares e hidrólisis de
compuestos químicos. Las características
utilizadas para la identificación bacteriana
pueden ser consultadas en el Manual de
Sistemática Bacteriológica de Bergey (Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, Holt et al.
1994). Este manual, de proporciones de
enciclopedia, comprende un sistema taxonómico
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que es seguido por la mayoría de los
microbiólogos. Para ubicar una especie en
particular en la amplia clasificación géneros y
familias, es necesario seguir diversos esquemas
de identificación constituidos por una amplia
gama de pruebas, de las cuales a continuación
se describirán algunas:
Fermentación
Fermentación de Carbohidratos (glucosa, lactosa
y a r a b i n o s a ) : Los productos finales de esta
fermentación son ácido y/o gas. Producto de
esto el medio de cultivo se acidifica
evidenciado por el cambio de color rojo
(alcalino) a amarillo (ácido) utilizando como
indicador rojo fenol. Uso en la diferenciación
de Enterobacteriaceae.
Descarboxilación (lisina, ornitina y arginina): arginina) La
descarboxilación de los aminoácidos libera
CO2 y amina, resultando en la alcalinización
del medio. Esta reacción produce el cambio
de pH pasando de un color amarillo pálido
(ácido) a púrpura (alcalino) utilizando como
indicador el púrpura de bromocresol. Uso en
la diferenciación de grupos dentro de la familia
Enterobacteriaceae.
P r u e b a d e β - g a l a c t o s i d a s a ( O N P G ) : El
ortonitrofenil-βgalactósido es un substrato
artificial para la enzima. Cuando se hidroliza,
se forma el nitrofenol (amarillo). Utilizado en
la identificación de algunas especies de
Shigella y Pseudomonas.
P r o d u c c i ó n d e H22 S : El sulfito de hidrogeno,
liberado por la bacteria capaces de romper los
aminoácidos azufrados o de reducir el
tiosulfato, reacciona con las sales de hierro
presentes en el medio de cultivo formando un
precipitado negro de sulfuro férrico. Utilizado
en la identificación de Salmonella.
F o r m a c i ó n d e i n d o l : La producción de indol
obedece al metabolismo del triptofano por la
enzima triptofanasa que es detectada por el
desarrollo de un color rosa-rojo después de la
adición del reactivo de Kovac (di-
metilaminobenzaldehido). Utilizado en la
identificación de Escherichia y Edwardsiella.
V o g e s - P r o s k a u e r : Acetilmetilcarninol (acetoina) es
un intermediario en la producción de glicol
16
 butileno producto de la fermentación de la O x i d a s a : La oxidasa determina la capacidad de
glucosa. La presencia de acetoína es indicada una bacteria para oxidar ciertas aminas
por el desarrollo de un color rojo producto de aromáticas, por ejemplo, p-
la adición de α-naftol. Utilizado para identificar aminodimetilanilina, produciendo productos
Bacillus y separar Klebsiella-Enterobacter de coloreados. Esta oxidación esta relacionada
Escherichia. con la actividad citocromo oxidasa de algunas
H i d r ó l i s i s d e l a u r e a : La producción de ureasa bacterias. Utilizado en la identificación de
por algunas bacterias, la cual hidroliza la urea Pseudomonas y Aeromonas.
produciendo amonio, es revelada por el C a t a l a s a : La catalasa es una enzima producida
cambio de pH pasando de un color amarillo por una gran variedad de bacterias, esta
(ácido) a un color rojizo-púrpura (básico) enzima descompone el peróxido de hidrogeno
utilizando como indicador el rojo fenol. Uso (agua oxigenada) liberando O2. Utilizado en
para distinguir Klebsiella de Escherichia. la identificación de Bacillus.
U t i l i z a c i ó n d e c i t r a t o : Microorganismos capaces
de utilizar el citrato, en un medio que contiene
a este como única fuente de carbono,
producen la alcalinización del medio, los
cuales son evidenciados utilizando el indicador
azul de bromotimol, el cual con el cambio del
pH en el medio pasa de un color verde (ácido)
a un color azul marino (alcalino). Uso en la
identificación de Klebsiella-Enterobacter y
Salmonella.

Figura 14. Esquema para la identificación de grupos bacterianos. Fuente: Seeley et al. 1991.

LEM Laboratorio de Ecología Microbiana 17

Fig. 15. Sistema API 20E mostrando el resultado de las pruebas de identificación con Proteus vulgaris
(arriba) y Escherichia coli (abajo). Fuente: Seeley et al. 1991.
4.1. Sistemas miniaturizados de
identificación.
La pruebas descritas anteriormente pueden ser
costosas y/o ocupar demasiado tiempo. La
identificación se ha ido inclinando por el uso de
sistemas miniaturizados de identificación
bacteriana. Estos sistemas emplean multi-
compartimentos que requieren menos medios de
cultivo y provee rápidos resultados que son
adaptados a procesos computacionales. Un
ejemplo de estos sistemas corresponde al Sistema
API 20E (Fig. 15). Este es la versión
estandarizada, miniaturizada de 23 pruebas
bioquímicas convencionales para la identificación
de Enterobacteriacea y otras bacterias gram-
negativa. Este sistema puede ser usado el mismo
día y el periodo de incubación para la
identificación abarca de 18-24 horas para
Enterobacterias y 36-48 para otras bacterias
gram-negativa. El sistema consiste en microtubos
conteniendo substratos deshidratados de
diferentes reactivos para la identificación. Como
otros sistemas de identificación los resultados son
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presuntivos y deben complementarse la
identificación con pruebas inmunológicas
utilizando controles positivos como Salmonella,
Shigella, E. Coli y Vibrio cholerae. Los resultados
de las diferentes pruebas bioquímicas son
reducidos a valores, usando números binarios.
Estos números son sometidos a análisis
computacionales contrastándolos con una base
de datos.
Sin embargo, estos sistemas presentan una
serie de desventajas, tales como: (1) la
sensibilidad de algunas pruebas son
cuestionables, (2) la interpretación de los
resultados puede ser difícil, (3) algunas veces es
necesario desarrollar otros ensayos bioquímicos y
serológicos.
5. Técnicas moleculares de identificación.
En los últimos años, métodos moleculares
basados en análisis comparativos de secuencias
génicas del 16S y 23S ARN ribosomal han
revelado una nueva diversidad de las
comunidades bacterianas en ambientes
18
acuáticos. Numerosas nuevas secuencias
genéticas han sido encontradas, indicando que
una alto porcentaje de especies bacterianas no se
encuentra representada en las colecciones
clásicas de cepas bacterianas de los centros
microbiológicos. Esta información se encuentra
contenida en el ADN y ARN de las células
bacterianas proveyendo las bases del
entendimiento, desarrollo y racionamiento en el
uso de técnicas moleculares para la detección e
identificación bacteriana a nivel individual o
comunitario. Estas técnicas están basadas en la
identificación de porciones de material genético
(cadenas de ácidos nucleicos) específicos de
cada grupo o especie bacteriana. Con esta
secuencia se diseñan sondas o cadenas de
ácidos nucleico perfectamente complementarias
con la secuencia específica de cada grupo
bacteriano. La detección esta basada en la
formación de cadenas dobles, formando un
híbrido ADN-ADN o ARN-ADN, entre la sonda y
el material genético de la muestra a identificar.
Estas pruebas pueden ser usadas con tecnologías
de amplificación para otorgar una mayor
sensibilidad, o bien, pueden ser etiquetadas
usando radio-isotopos o moléculas fluorescentes,
siendo visibles bajo equipos de fluorescencia.
Actualmente, varias técnicas y sondas basadas en
secuencias de ADN o ARN están disponibles
pudiendo ser usadas para la detección de
específicas grupos bacterianos.
5.1. Hibridización fluorescente in situ o
f l u o r e s c e n t i n s i t u h y b r i d i z a t i o n (FISH).
Para la técnica de FISH se utilizan sondas de
oligonucleotidos ARNr que a través de un
procedimiento de hibridización penetra la célula y
se une a su complementaria con el ARNr de las
bacteria. Estas sondas deben presentar afiliación
con cierto grupos bacterianos y deben ser
etiquetadas con una tinción fluorescente para
poder ser cuantificadas en un microscopio
equipado con un sistema de fluorescencia.
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SECCIÓN VI: MÉTODOS DE
MUESTREOS BACTERIOLÓGICOS
EN PECES Y MOLUSCOS.
Durante las últimas décadas se han
desarrollados significativos avances sobre el
estudio de la asociación de microorganismos a
peces y moluscos. Este conocimiento se ha
centrado en interrelaciones patogénicas y
parasitarias de bacterias, hongos, protozoos y
virus. Principalmente la atención se ha enfocado
a microbiología de organismos cultivados,
producto de la importancia de la acuicultura
como contribución económica en muchos países.
Los organismos acuáticos están continuamente
inmersos en suspensiones de microorganismos,
los cuales están en contacto con sus superficies
externas. De igual forma, estos organismos
ingresan porciones de agua y alimento a su
tracto digestivo, conteniendo un amplio rango de
microorganismos patógenos y parásitos. Algunas
bacterias pueden ser atraídas activamente por los
organismos acuáticos a través de procesos
quimiotáctico, mientras que otros solo hacen
contacto en forma accidental.
Las diferentes relaciones existentes entre los
organismos acuáticos y las bacterias, pueden
resumirse de la siguiente forma:
- Algunas bacterias pueden estar estrechamente
asociadas con las superficies externas e
internas, siendo frecuentemente colonizadores.
- Algunas bacterias pueden ser inhibidas por
compuestos antimicrobianos producidos por el
organismos hospedador.
- Algunas bacterias pueden ser atraídas y
acumuladas en zonas dañadas (heridas) del
hospedador.
- Ciertas bacterias pueden ser atrapadas por los
filamentos branquiales, donde luego pueden
ser incorporadas como microflora estable del
organismo.
- Dentro del tracto intestinal, los
microorganismos pueden ser retenidos como
parte de la microflora estable, ser destruidos
por la acción digestiva del hospedador, ser
utilizados como fuente de alimento o pasar a
19
 través del tracto para luego ser eliminadas
como material fecal.
1. Muestreos de peces y moluscos.
El avance de la acuicultura ha llevado a la
necesidad de controlar y reducir los efectos
infecciosos en peces y moluscos cultivados.
Atendiendo al control en cultivos se han
establecidos varias técnicas, las cuales incluyen la
administración de drogas, vacunas y químicos.
Así como métodos profilácticos seguido del
diagnostico clínico de enfermedades. Métodos
bacteriológicos han sido comúnmente utilizados
para el diagnostico enfermedades en peces y
moluscos. Esto se debe a las significativas
perdidas producidas por el ataque de bacterias
patógenas a los centros de cultivo, lo cual
conlleva a cuantiosas perdidas económicas. A
continuación se referirá al procedimiento de
muestreo para el aislamiento de componentes
bacterianos asociados a órganos internos de
invertebrados marinos, en el caso de que estos
estuviesen afectados por alguna patología.
Procedimiento:
- Sitúe un pescado o molusco sobre un mesón
de trabajo con un mechero Bunsen encendido.
- Desinfecte la superficie del mesón con alcohol
70°.
- Proceda a etiquetar el organismo y elabore
una ficha con todos los datos necesarios para
una buena identificación del organismos
(número, fecha, procedencia, peso, longitud,
etc.).
- Realice una observación externa del organismo
verificando la presencia de anormalidades,
tales como: heridas, úlceras, forúnculos,
coloración, inflamación, condición general del
organismo, etc.
- Realice la disecación del organismo con el fin
de permitir examinar los órganos internos
(glándula digestiva, gónadas, riñón, etc.).
Utilice material (pinzas y tijeras) desinfectado
con alcohol 90° y flameado en el mechero.
- Realice una observación de los órganos
internos del organismo verificando la presencia
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de anormalidades, tales como: heridas,
úlceras, forúnculos, coloración, inflamación,
condición general del organismo, etc.
- Corte un trozo de tejido (aproximadamente 1
gramo), deposítelo al interior de una bolsa de
poliestileno estéril y agregue 10 ml de SSM o
SNS.
- Homogenize la muestra durante 3-5 minutos
con la ayuda de un homogenizador
Stomacher®.
- Traspase la muestra homogeneizada a un tubo
de ensayo estéril y diluya para su sembrado.
- Siembre la muestra en estrías y en forma
extendida sobre medios de cultivo general y
selectivo, según el grupo de microorganismos
que se desea aislar.
- Incube la muestra y posteriormente realice el
recuento de UFC en la placa sembrada en
forma extendida y realice aislamientos en
estrías desde la placa sembrada en estrías.
Nota: recuerde que la carga bacteriana debe ser expresada en
UFC por gramo de tejido muestreado.
2. Antibiograma.
Cuando un centro de cultivo es afectado por
una enfermedad bacterianas es necesario tomar
medidas rápidas para su control. En primer lugar
es necesario identificar los síntomas presentes en
los organismos enfermos, de esta forma se
obtiene un acercamiento de cual tipo de
organismos patógeno puede tratarse. Esta
búsqueda de información debe realizarse en
literatura especializada acerca de bacterias que
afectan a organismos marinos. En segundo lugar
deben realizarse aislamiento de los diversos
componentes bacterianos desde los tejidos
externos o internos de los organismos enfermos,
utilizando medios de cultivos selectivos de
acuerdo al agente etiológico que se sospecha
como causante de la patología. Una vez
obtenidos los diferentes aislados se pueden hacer
diferentes pruebas de identificación bioquímicas
para confirmar la presencia del patógeno, o bien,
si se desea tratar la enfermedad a través de
tratamientos con antibiótico es necesario realizar
pruebas de sensibilidad en disco de los aislados
20
microbianos sospechosos, como se describe a
continuación.
Filtros de papel impregnados con varios
antibióticos son utilizados para determinar in vitro
la susceptibilidad de los aislados a los
antibióticos. Estos filtros son ubicados sobre la
superficie de una placa de medio donde
previamente fue sembrado en forma extendida
con el microorganismo a ser examinado (Fig.
16). El crecimiento microbiano durante la
incubación se desarrolla alrededor de los discos
conteniendo el antibiótico. Zonas sin crecimiento
o halos de inhibición son encontradas alrededor
de antibióticos que inhiben el crecimiento del
microorganismo examinado. El diámetro del
halo causada por la difusión del agente
antibacteriano sobre el agar está directamente
relacionado con el grado de susceptibilidad de la
bacteria (Fig. 17).
Figura 16. Antibiograma o técnica de Kirby-
Baeur. Disposición de discos con diversos
antibióticos sobre un medio de cultivo de
cultivo previamente sembrado con el
microorganismo a ensayar. Fuente: Seeley et
al. 1991.
SECCIÓN VII: ANALISIS DE
CALIDAD DE AGUA Y DE
PRODUCTOS HIDROBIOLÓGICOS
Microorganismos son generalmente usados
como indicadores de posibles contaminaciones y
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como un índice de calidad de agua. Gran
relevancia se les ha atribuido a grupos bacteriano
denominados coliformes, para determinar los
niveles seguros del agua potable, así mismo
coliformes y otros organismos son también
asociados a consecuencias adversas para la
salud humana en aguas recreacionales y
productos provenientes de la acuicultura y
pesquerías. Gastroenteritis es la principal
aflicción asociada a patógenos en agua. La
presencia de Enterobacteriaceae en agua
potable, aguas recreacionales y productos
hidrobiológicos (pescados, moluscos, crustáceos,
cefalópodos, equinodermos, algas y otros
provenientes de la pesca o acuicultura en
cualquier estado de preparación, frescos,
enfriado, congelados o ahumados) son de
extremada importancia para determinar calidad
microbiológica de estas.
Figura 17. Formación y medición de halos de
inhibición alrededor de discos conteniendo
antibióticos, a los cuales la bacteria ensayada
es susceptible. Fuente: Seeley et al. 1991.
La Familia Enterobacteriaceae, son bacterias
colonizadoras normales del tracto intestinal del
hombre y animales de sangre caliente. Son
bacilos gram-negativos aerobios-anaerobios
facultativos, fermentan la glucosa con o sin
21
producción de gas, reducen los nitratos a nitritos,
son oxidasa negativo y catalasa positivo.
Métodos de cultivo son generalmente utilizados
para la detección de bacterias. Sin embargo,
miles de diferentes microorganismos asociados a
brotes epidémicos no crecen en medio de cultivo
debido a la continua acción estresante de los
desinfectantes usados en el tratamiento de agua
potable. Como resultado, análisis de bacterias
patógenos en agua es extremadamente
complicado y no asegura una completa
seguridad para el consumidor. A continuación se
referirá a grupos de organismos y técnicas que
son usadas para determinar la calidad
microbiológica de agua y productos
hidrobiológicos.
1. Microorganismos indicadores.
1.1. Coliformes totales.
La tradicional definición de este grupo de
bacterias se refiere a bacilo curvado que
fermenta la lactosa con producción de gas y
ácido en 24 a 48 h a 35°C. Este grupo
pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
incluyendo a Escherichia coli así como a varios
miembros del genero Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter cuando son aplicados criterios de
análisis microbiológicos de calidad de agua.
Estas bacterias son clásicamente usadas como
indicador de contaminación fecal de aguas o de
polución.
1.2. Coliformes fecales (coliformes termo -
tolerantes).
Este grupo constituye el indicador de
contaminación homeoterma fecal. Estas
bacterias pueden crecer y fermentar lactosa con
formación de gas y ácido a las 48 horas de
incubación a una temperatura de 44,5ºC. Este
grupo se encuentra presente en el intestino del
hombre y otros animales de sangre caliente.
Estas bacterias corresponden principalmente a los
géneros Escherichia y Klebsiella. El grupo de
coliformes fecales se utiliza como indicador de la
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presencia aguas servidas o de manipulación
inadecuada de la higiene de los alimentos.
E. coli no solo satisface el criterio de coliformes
totales y fecales, sino que ha demostrado ser el
mas específico indicador de la presencia de
contaminación fecal.
1 . 3 . S t r e p t o c o c c i y E n terococci fecales.
Estos microorganismos gram-negativos son
usados como indicadores microbiológicos de
agua. Como el grupo de coliformes, han sido
persistente patrones patógenicidad en aguas.
Particularmente enterococci como Streptococcus
faecalis y S. Faecium son específicos del intestino
humano.
2. Métodos generales de Análisis.
2.1. Técnica del número más probables
NMP.
Este método esta basado en la fermentación de
lactosa por parte de Enterobactericeae. El modo
de operación de la técnica consiste en inocular
una muestra de agua (en diluciones seriadas) en
caldo de cultivo para observar la fermentación de
lactosa. Posterior a la inoculación, el aspecto del
caldo de cultivo es modificado por la acción de
las coliformes fecales, con lo cual su presencia es
confirmada. La estimación de la densidad
bacteriana se basa en la comparación con tablas
pre-establecidas, el número de microorganismos
coliformes que se encuentran en una muestra (de
agua, tejido o alimento), la cual se puede como
indicador microbiológico de calidad o como
criterio microbiológico para aceptar o rechazar
un alimento muestreado. La precisión de cada
test depende del número de tubos usados.
2.1.1. Procedimiento.
2.1.1.1. Coliformes Presuntivas o Fase
Presuntiva.
Inoculación de tres tubos de caldo lauril sulfato
triptona (LST) “doble-concentración” con un
volumen de 10 ml de la muestra de ensayo si el
producto es líquido, o con un volumen de 10 ml
22
de un homogenizado en el caso de que muestra
sea sólida, por ejemplo, tejido de moluscos.
Inoculación de tres tubos de caldo LST “simple-
concentración” con un volumen de 1 ml de la
muestra de ensayo, o con un volumen de 1 ml de
un homogenizado en el caso de que la muestra
sea sólida. Luego, bajo las mismas condiciones,
inoculación de tres tubos de caldo LST “simple-
concentración” con la dilución 10-1 de la muestra
de ensayo o de la suspensión inicial. Todos los
tubos presentan en su interior una campana de
fermentación Durham. Se puede preparar
diluciones mayores si se sospecha una alta carga
bacteriana en la muestra (por ejemplo, aguas
servidas) y cada muestra analizada es sembrada
en duplicado, para obtener una confianza mayor
en los resultados finales de recuento de
coliformes fecales.
Todos los tubos son puestos en
incubadora a una temperatura constante de
35±0,5ºC durante 48 horas. Los resultados
positivos de esta etapa se expresan como tubos
con producción de gas, el cual queda atrapado
en el interior de la campana de Durham, entre
los tubos de una misma dilución. Los resultados
se expresan, a modo de ejemplo, de la siguiente
manera:
Dilución Tubos con gas
10-1 3
10-2 3
10-3 2 Para determinar coliformes fecales los tubos
Con estos resultados se procede estimar la
densidad bacteriana desde la tabla 3 usando el
número de tubos positivos (con producción de
gas) en las diluciones múltiples. En nuestro
ejemplo los tubos con reacción positiva son 3
(para la dilución 10-1), 3 (para la dilución 10-2) y
2 (dilución 10-3); en consecuencia, según la tabla
3, nuestro NMP de coliformes presuntivas es de
24/100 ml de muestra.
Tabla 3. Extracto de la tabla para el cálculo de
NMP por 100 ml con series de cinco tubos con
dilución de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. Fuente:
Proyecto de Norma en consulta publica
NCh2635.c2001.
N° de tubos NMP N° de tubos NMP N° de tubos NMP
positivos positivos positivos
3.3.0 17 4.3.0 27 5.3.0 79
3.3.1 21 4.3.1 33 5.3.1 110
3.3.2 24 4.3.2 39 5.3.2 140
3.3.3 28 4.3.3 45 5.3.3 180
3.3.4 31 4.3.4 52 5.3.4 210
3.3.5 35 4.3.5 59 5.3.5 250
2.1.1.2. Coliformes Confirmativas o Fase
Confirmativa.
Esta etapa tiene por finalidad conocer el
número de coliformes fecales presentes en la
muestra. De los tubos de cada dilución que
presentaron formación de gas en la etapa
anterior, se debe agitar los tubos presuntivos
positivos y transferir con asa metálica el inóculo a
tubos con caldo lactosa verde bilis brillante 2%
(LBVB) para confirmar coliformes totales y a caldo
EC para confirmar coliformes fecales.
Cada tubo con LBVB es cuidadosamente
identificado con la dilución de la cual fue extraída
la alícuota. Todos los tubos son puestos en
incubadora a una temperatura constante de
35±0,5ºC durante 24 horas. Como control
positivo se usa Enterobacter aerogenes y como
control negativo se usa Staphylococcus aureus.
Pasado el tiempo de incubación se procede a
contabilizar los tubos con producción de gas
(reacción positiva) en cada dilución.
con caldo EC deben ser incubados a 44,5±0,2
°C en un baño termorregulado por 24±2 horas.
Como control positivo se usa Escherichia coli y
como control negativo se usa Enterobacter
aerogenes. Luego de la incubación se observa
la formación de gas en las campanas Durham y
se registra el número de tubos positivos,
cualquiera que sea la cantidad de gas producida
en el tubo.
Luego, con el número de tubos con reacción
positiva obtenido para coliformes totales y
coliformes fecales se procede a ir a la tabla 4,
anteriormente usada. La forma de obtener el
NMP es idéntica a la descrita en la primera
etapa, pero esta vez el resultado se expresa como

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coliformes totales y coliformes fecales por cada E m p l e o e i n t erpretación: sembrar las placas en
100 ml de muestra. estría o placa extendida, por agotamiento.
Incubación 24 horas a 37.5°C.
2.2. Recuento de coliformes totales y fecales
en placa. COLONIAS ESPECIE
Rojas Lactosa-positivos
2.2.1. Recuento en Agar ENDO - C de Merck Rojas con brillo metálico Escherichia coli
Medio de cultivo selectivo para la estable
demostración y aislamiento de E. coli fecal y Rojas hasta rojizas Enterobacter aerogenes
Esféricas, mucosas Klebsiella y otros
Coliformes en los más diversos materiales (agua, Incoloras, claras Lactosa-negativos
alimentos, etc.).
2.2.2. Recuento en agar McConkey de Merck
Formula típica (gramo/litro): peptona (10) fosfato Agar selectivo para el aislamiento de
di-potásico (2,5), lactosa (10) , sulfito sódico Salmonellas, Shigellas y bacterias coliformes, a
(2,5) fucsina (0,3)* y agar bacteriológico partir de heces, orina, alimentos, aguas
(12,5). PH 7,4±0,2. Almacenamiento a 15- residuales etc.
25°C.
P r e p a r a c i ó n : Disolver 39 gramos en 1 litro de Formula típica (gramo/litro): peptona de caseína
agua destilada o des-ionizada, esterilizar en (17), peptona de carne (3), cloruro de sódio
autoclave por 15 minutos a 121°C y verter en (5), lactosa (10), mezcla de sales biliares (1,5),
las placas. Las placas con medio de cultivo son rojo neutro (0,03), cristal violeta (0,001)
claras y casi incoloras. Si una placa con medio y agar bacteriológico (13,5).
de cultivo muestra, tras la solidificación, un P r e p a r a c i ó n : Disolver 50 gramos en un litro de
tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse agua destilada o des-ionizada, esterilizar en
dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas autoclave (15 min. a 121°C) y verter las
(hasta 1ml/litro, como máximo) de una placas. Los medios de cultivo son claros y de
solución recién preparada al 10% de sulfito color rojo parduzco.
sódico anhidro e hirviendo el conjunto a F o r m a d e a c t u a c i ó n : las sales biliares y el cristal
continuación. Por la acción del oxígeno violeta inhiben considerablemente la flora
atmosférico y debido a la consiguiente gram-positiva. La lactosa, junto con el
oxidación del sulfito, el medio de cultivo vertido indicador de pH rojo neutro, sirven para la
en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por comprobación de la degradación de dicho
lo tanto, inservible. Incluso conservando en la azúcar.
oscuridad y a la temperatura de nevera, sólo es Empleo e interpretación: sembrar las placas por
utilizable durante pocos días. el procedimiento de estría o placa extendida.
M o d o d e a c c i ó n : El sulfito sódico y la fucsina Incubación 18-24 horas a 37,5°C. Las
inhiben a las bacterias gram-positivas. E. coli y colonias lactosa-negativas son incoloras y las
Coliformes consumen la lactosa formando lactosas-positivas son rojas con un halo turbio
aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído debido al descenso del pH provocado por los
libera fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la ácidos biliares.
coloración roja de las colonias. En el caso de
E. coli, esta reacción es tan intensa que la COLONIAS ESPECIE
fucsina llega a cristalizar y por este motivo, Incoloras y transparentes Salmonella, Shigella y otros
Grandes, rojas, halo turbio Escherichia coli
confiere a dichas colonias un brillo metálico
Grandes, rosadas, mucosas Enterobacter, Klebsiella
estable, de reflejo verde (típico de la fucsina Diminutas, de crecimiento Enterococos, Estafilococos y otros
cristalizada) aislado, opacas

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2.2.3. Recuento Medio Cromogénico (CM956B)
de Oxoid.
El medio cromogénico es un medio diferencial
para la identificación tanto de E. coli como
coliformes totales a partir de un solo medio, para
muestras de alimentos y aguas. El medio
cromogénico está constituido por un agar base,
más dos sustratos (agentes cromogénicos) que
son capaces de identificar una enzima que es
altamente específica tanto para E.coli (â-
glucoronidasa) como para los coliformes totales
(â-galactosidasa). De esta manera las colonias
de E. coli se observan de un color púrpura y las
de coliformes totales de un color rosado.
Formula típica (gramo/litro): mix cromogénico
(20,3), extracto de Levadura (3), peptona (5),
lactosa (2,5), cloruro de sodio (5), di-sodio
hidrógeno fosfato (3,5), potasio-dihidrógeno
fosfato (1,5), rojo Neutro (0,03) y agar
bacteriológico (15).
P r e p a r a c i ó n : suspender 55,8 gramo en 1 litro
de agua destilada o des-ionizada. Esterilizar en
autoclave a 121°C por 15 minutos y verter en
placas.
E m p l e o : Preparar las diluciones adecuadas (10-1,
10-2, 10-3) con agua peptonada tamponada.
Sembrar en placa extendida e incubar por 18-24
horas a 37.5°C

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LITERATURA CITADA
AUSTIN B (1988) Marine Microbiology. Cambridge University Press. 221 pp.

AUSTIN B & DA Austin (1989) Methods for the Microbiological Examination of Fish and Shellfish.
Ellis Horwood Ltd. 317 pp.

EATON, Clesceri & Greenberg (1995) Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater

GERHARDT P, RGE Murray, WA Wood & NR Krieg (1994) Methods for General and Molecular
Bacteriology. American Society for Microbiology. 791 pp.

HOLT JG, NR Krieg, PHA Sneath, JT Staley & ST Williams (1994) Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology, Ninth edition. Williams & Wilkins. 787 pp.

HURST CJ, GR Knudsen, MJ McInerney, LD Stetzenbach & MV Walter (1997) Manual of

Environmental Microbiology. American Society ofr Microbiology. 893 pp.

MADIGAN MT, JM Martinko & J Parker (1997) Brock Biology of Microorganisms. Eighth edition.
Prentice Hall Inc. 987 pp.

SEELEY HW, PJ Vandemark & JJ Lee (1991) Microbes in Action. A laboratory manual of microbiology.
Fourth edition. WH Freeman and Company. 450 pp.

STAINER RY, JL Ingraham, ML Wheelis & PR Painter (1990) General Microbiology. Fifth edition.
Macmillan Education Ltd. 689 pp.

BUSQUEDA DE INFORMACIÓN VIA INTERNET

Editoriales Científicas.
- American Society for Microbiology http://www.journals.asm.org/
- FEMS The Federation of European Microbiological Societies http://www.fems-microbiology.org/
- Society for General Microbiology http://www.sgmjournals.org
- Asociación Chilena de Microbiología http://158.170.16.193/ACHM/

Otros sitios de interés en Internet.

- Colección de especies bacterianas -American Type Culture Collection http://www.atcc.org/
- Biblioteca online –
Microbe Library of American Society for Microbiology http://www.microbelibrary.org/

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