Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
DISUSUN OLEH :
KELOMPOK 1 FARMASI 5A
ADE FITHROTINNADHIROH 108102000036
BAYYINAH 108102000026
IRFAN TAUFIK 108102000011
NUR QUROTUL A’YUNI 108102000018
RATU FENI CHAERUNNISA 108102000046
RR ALVIRA WIDJAYA 108102000024
WIDYA DWI ARINI 108102000056
Dengan mengucap rasa syukur yang tak terhingga kepada Allah SWT,
Yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang, Yang Maha Pemberi Ilmu kepada
setiap ummatnya, dan yang telah memberikan rahmat serta Karunia-Nya serta
Nikmat yang tak pernah berujung sehingga kami dapat menyelesaikan laporan
ini.
Kelompok 1 Farmasi 5A
1
Waktu : Kamis, 21 Oktober 2010
Tempat : Laboratorium Biokimia Klinis FKIK
I. TUJUAN
a. UJI OKSIDASE DALAM KENTANG DAN PENGARUH PEMBERIAN
VITAMIN C :
o Memperlihatkan proses oksidasi senyawa fenol oleh polifenol
oksidase (PPO) kentang.
o Memperlihatkan efek antioksidan vitamin C terhadap oksidasi
fenol oleh PPO kentang.
Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau lebih
electron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam
(Suhartono, 2002). Berdasarkan sumber perolehannya ada 2 macam antioksidan,
yaitu antioksidan alami dan antioksidan buatan (sintetik) (Dalimartha dan
Soedibyo, 1999). Tubuh manusia tidak mempunyai cadangan antioksidan dalam
jumlah berlebih, sehingga jika terjadi paparan radikal berlebih maka tubuh
membutuhkan antioksidan eksogen. Adanya kekhawatiran akan kemungkinan
efek samping yang belum diketahui dari antioksidan sintetik menyebabkan
antioksidan alami menjadi alternative yang sangat dibutuhkan (Rohdiana, 2001;
Sunarni, 2005). Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan
yang disebabkan spesies oksigen reaktif, mampu menghambat terjadinya
penyakit degeneratif serta mampu menghambat peroksidae lipid pada makanan.
2
Meningkatnya minat untuk mendapatkan antioksidan alami terjadi beberapa
tahun terakhir ini. Antioksidan alami umumnya mempunyai gugus hidroksi dalam
struktur molekulnya (Sunarni, 2005).
Antioksidan dalam bahan makanan dapat berasal dari kelompok yang terdiri atas
satu atau lebih komponen pangan, substansi yang dibentuk dari reaksi selama
pengolahan atau dari bahan tambahan pangan yang khusus diisolasi dari
sumber-sumber alami dan ditambahkan ke dalam bahan makanan. Adanya
antioksidan alami maupun sintetis dapat menghambat oksidasi lipid, mencegah
kerusakan, perubahan dan degradasi komponen organik dalam bahan makanan
sehingga dapat memperpanjang umur simpan (Rohdiana, 2001).
3
Tubuh manusia menghasilkan senyawa antioksidan, tetapi jumlahnya sering kali
tidak cukup untuk menetralkan radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh (Sofia,
2006; Hernani dan Rahardjo, 2005). Sebagai contoh, tubuh manusia dapat
menghasilkan Glutathione, salah satu antioksi dan yang sangat kuat, hanya tubuh
memerlukan asupan vitamin C sebesar 1.000 mg untuk memicu tubuh
menghasilkan glutathione ini. Kekurangan antioksidan dalam tubuh
membutuhkan asupan dari luar. Bila mulai menerapkan pola hidup sebagai
vegetarian akan sangat membantu dalam mengurangi resiko keracunan akibat
radikal bebas. Keseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas menjadi kunci
utama pencegahan stress oksidatif dan penyakit-penyakit kronis yang dihasilkan
(Sofia, 2006).
4
Antioksidan total, Superoksida Dismutase dan Glutation Peroksidase sekaligus
untuk memeriksa status selenium (Wijaya, 1997).
KARAKTERISTIK FENOL
Fenol atau asam karbolat atau benzenol adalah zat kristal tak berwarna yang
memiliki bau khas. Rumus kimianya adalah C 6H5OH dan strukturnya memiliki
gugus hidroksil (-OH) yang berikatan dengan cincin fenil. Kata fenol juga merujuk
pada beberapa zat yang memiliki cincin aromatik yang berikatan dengan gugus
hidroksil. Fenol memiliki kelarutan terbatas dalam air, yakni 8,3 gram/100 ml.
Fenol memiliki sifat yang cenderung asam, artinya dapat melepaskan ion H + dari
gugus hidroksilnya. Pengeluaran ion tersebut menjadikan anion fenoksida C6H5O
yang dapat dilarutkan dalam air.
Dibandingkan dengan alkohol alifatik lainnya, fenol bersifat lebih asam. Hal ini
dibuktikan dengan mereaksikan fenol dengan NaOH, di mana fenol dapat
melepaskan H+. Pada keadaan yang sama, alkohol alifatik lainnya tidak dapat
bereaksi seperti itu. Pelepasan ini diakibatkan pelengkapan orbital antara satu-
satunya pasangan oksigen dan sistem aromatik, yang mendelokalisasi beban
negatif melalui cincin tersebut dan menstabilkan anionnya.
5
beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam
pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin) pembasmi rumput liar,
dan lainnya. Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran
kimiawi pada kulit yang terbuka.
Ketertarikan akan fenol murni dalam tubuh hewan dimulai karena adanya
penemuan fenol dalam urin kuda, sapi dan manusia. Retensi fenol dalam
jaringan hewan, paling tidak telah dumulai penelitiannya sebelum tahun 1944
oleh deMeio dan Arnolt. Dengan menggunakan media krebs’ solution dengan pH
= 7.2, phosphate buffer, 0,2 gram glukosa per 100 ml., 0,5 mg fenol dalam 100
ml. Gas phase, oxygen; waktu inkubasi, 2 jam. Volume larutan tiap, 15 ml.
Senyawa Fenol
Senyawa Fenol (C6H3OH) atau hidroksi benzena atau karbonat termasuk asam
lemak (pH 9,9), senyawa organik dengan gugus OH-, sistem cincin benzena atau
aromatik kompleks, sangat peka terhadap oksidasi enzim fenolase. Titik leleh dan
titik didih berturut-turut 41,8 – 42 0C dan 182 – 183 0C. Bersifat mudah larut
dalam air. Terdapat 592 jenis turunan fenol. Semua senyawa fenol berupa
senyawa aromatik sehingga semuanya menunjukkan serapan kuat daerah
spektrum ultra violet. Fenol terdapat pada dinding sel, apabila sel rusak, fenol
akan bereaksi dengan oksigen, lalu membentuk melanoidin berwarna coklat.
Senyawa fenol diduga berasal dari metabolisme asam amino aromatik sehingga
6
termasuk produk sekunder. Kadar fenol dalam tanaman hortikultura sangat
bervariasi tergantung varietas, musim dan lokasi penanaman, umur masak, tahap
pertumbuhan dan cara bercocok tanam, termasuk penyakit. Setelah pelukaan,
terbentuk polifenol oksidase (PPO), kemudian reaksi pencoklatan terbentuk,
karena PPO akan bebas dari fenol dan membentuk o-quinon. Kadar fenol yang
terbentuk ini akan semakin tinggi pada jaringan yang dekat di daerah luka dan
berangsur-angsur berkurang ke bagian dalam. Senyawa polifenol dan fenolat
terbentuk dimulai dari proses fotosintesa melalui terbentuknya karbohidrat yang
melalui jalur asam shikimat terjadi fenilalanin dan tirosin. Dari bentuk fenilalanin
dan tirosin satu bagian jalur akan terbentuk golongan fenilpropanoid. Asam
sinamat merupakan senyawa kunci terbentuknya berbagai fenolat lain.
Enzim polifenol oksidase atau fenolase terdiri dari 2 tipe enzim, yaitu odifenol
dan p-difenol. PPO termasuk dalam golongan enzim oksidoreduktase dengan
kode EC (1.14.18.1). Angka pertama, 1, menunjukkan golongan oksidoreduktase,
angka kedua , 14, berperan pada pasangan donor dengan cara inkorporasi
oksigen ke dalam salah satu donor (hidroksilase), angka ketiga, 18, dengan
oksigen sebagai donor dan angka keempat, 1, dengan NAD dan NADP sebagai
akseptor. PPO adalah enzim oksidatif golongan protein yang mengandung logam
tembaga yang secara merata tersebar luas di dalam tanaman. Lepasnya logam
7
tersebut menyebabkan denaturasi enzim secara reversible bila kondisi kembali
normal. Enzim ini dapat mengkatalis reaksi pencoklatan dan menimbulkan
pengaruh terhadap karakteristik sensory dan nilai gizi pada sebagian besar
produk hasil pertanian, serta memiliki kaitan erat dengan pencoklatan enzimatis
pada beberapa jaringan tanaman. Di dalam Marshall et al. (2000) dinyatakan
bahwa enzim PPO mula-mula ditemukan dalam jamur dan tersebar luas di alam.
Enzim ini memainkan peran fisiologis yang penting dalam mencegah serangga
serta mikroorganisme menyerang tumbuhan serta menjadi bagian dari respon
tumbuhan terhadap serangga, mikroorganisme, dan luka. Senyawa fenol dan
PPO umumnya secara langsung berperan dalam reaksi pencoklatan enzimatis
pada sel buah, atau sayuran yang rusak, selama penanganan dan pengolahan.
Menurut Kegg (1998) PPO membutuhkan kondisi optimum didalam aktivitasnya,
seperti suhu dan pH. Menurut Kusnawijaya (1991) setiap enzim memiliki pH
optimum yaitu pH dimana aktivitas enzim tertinggi dapat tercapai. Pengujian
pengaruh Ph terhadap aktivitas enzim fenolase dilakukan dengan variasi pH 6,0;
6,5; 7,0; 7,5 dan 8,0. Kisaran pH ini didasarkan pada kisaran pH optimum enzim
fenolase yang berasal dari jamur N. crassa yaitu pada kisaran pH netral.
Perubahan pH pada enzim menunjukkan perubahan konsentrasi H+ dan OH-
disekitar enzim. Perubahan pH akan menyebabkan terjadinya perubahan ionisasi
pada gugus ionik enzim pada sisi aktifnya atau pada sisi lain yang secara tidak
langsung mempengaruhi sisi aktif enzim. pH optimum merupakan pH dimana
enzim dan substrat berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan dimana
konformasi sisi aktif enzim sesuai dengan substrat sehingga dapat terjadi
interaksi antara enzim dengan substrat secara cepat, sehingga diperoleh aktivitas
enzimatik tertinggi. pH lingkungan dapat menyebabkan perubahan keadaan
muatan gugus-gugus fungsinal dari enzim atau substrat. Pada saat pH<7 terjadi
kelebihan ion H+ disekitar enzim dan substrat fenol akan kesulitan untuk
melepas proton (H+) sehingga elektron pada atom O akan sulit untuk berikatan
dengan atom Cu2+ pada sisi aktif enzim. Hal ini mengakibatkan interaksi enzim
dengan substrat akan terhalangi. Pada pH>7, terjadi kelebihan ion OH-
8
dilingkungan sekitar enzim, sehingga gugus Cu2+ pada sisi aktif enzim akan lebih
mudah berikatan dengan ion OH- disekitarnya sehingga akan menghalangi enzim
untuk berinteraksi dengan substrat. Kedua hal tersebut akan mengakibatkan
penurunan aktivitas enzim. Menurut Rodwel (1998) enzim disamping memiliki
pH optimum juga memilki suhu optimum dalam melakukan fungsinya, dimana
pada suhu tersebut didapat aktivitas enzim paling besar. Adanya peningkatan
suhu akan menyebabkan bertambahnya energi kinetik dari enzim maupun
substrat, sehingga akan terjadi peningkatan gerakan enzim dan substrat, hal ini
menyebabkan peningkatan peluang terjadinya tumbukan antar keduanya. Makin
besar frekuensi tumbukan molekul enzim dengan substrat, maka makin besar
peluang terjadinya interaksi antara enzim dengan substrat dan makin besar pula
peluang terbentuknya produk. Pada suhu optimum dicapai aktivitas enzim yang
optimum dan dihasilkan produk optimum. Menurut Rodwel (1998) pada suhu
yang lebih tinggi dari suhu optimum, aktifitas fenolase menurun. Pada suhu yang
terlalu tinggi, enzim dan substrat dapat mengalami perubahan konformasi
sehingga gugus aktif keduanya menjadi tidak bersesuaian, dan mengakibatkan
tidak terjadi interaksi, bahkan bila suhu terus ditingkatkan maka enzim bisa
terdenaturasi, sehingga peluang terbentuknya produk akan menurun.
Fenol yang terdapat dalam kentang akan dioksidasi oleh PPO menjadi katekol,
yang kemudian menjadi kinon. Setelah melalui kondensasi membentuk senyawa
berwarna coklat. PPO juga mengubah pirogalol menjadi purpurogalin yang
berwarna coklat. Penambahan vitamin C dapat menghamabat oksidasi fenol oleh
PPO.
Lipid atau trigliserida merupakan bahan bakar utama hampir semua organisme
disamping karbohidrat. Trigliserida adalah triester yang terbentuk dari gliserol
dan asam-asam lemak.
9
Gambar 1. Struktur Asam Lemak
Asam-asam lemak jenuh ataupun tidak jenuh yang dijumpai pada trigliserida,
umumnya merupakan rantai tidak bercabang dan jumlah atom karbonnya selalu
genap. Ada dua macam trigliserida, yaitu trigliserida sederhana dan trigliserida
campuran. Trigliserida sederhana mengandung asam-asam lemak yang sama
sebagai penyusunnya, sedangkan trigliserida campuran mengandung dua atau
tiga jenis asam lemak yang berbeda. Pada umumnya, trigliserida yang
mengandung asam lemak tidak jenuh bersifat cairan pada suhu kamar, disebut
minyak, sedangkan trigliserida yang mengandung asam lemak jenuh bersifat
padat yang sering disebut lemak.
Trigliserida bersifat tidak larut dalam air, namun mudah larut dalam pelarut
nonpolar seperti kloroform, benzena, atau eter. Trigliserida akan terhidrolisis jika
dididihkan dengan asam atau basa. Hidrolisis trigliserida oleh basa kuat (KOH
atau NaOH) akan menghasilkan suatu campuran sabun K+ atau Na+ dan gliserol.
Hidrolisis trigliserida dengan asam akan menghasilkan gliserol dan asam-asam
lemak penyusunnya.
Trigliserida dengan bagian utama asam lemak tidak jenuh dapat diubah secara
kimia menjadi lemak padat oleh proses hidrogenasi sebagian ikatan gandanya.
Jika terkena udara bebas, trigliserida yang mengandung asam lemak tidak jenuh
cenderung mengalami autooksidasi. Molekul oksigen dalam udara dapat bereaksi
dengan asam lemak, sehingga memutuskan ikatan gandanya menjadi ikatan
tunggal. Hal ini menyebabkan minyak mengalami ketengikan.
10
Kelas lipida yang lain adalah steroid dan terpen. Steroid merupakan molekul
kompleks yang larut di dalam lemak dengan empat cincin yang saling bergabung.
Steroid yang paling banyak adalah sterol yang merupakan steroid alkohol.
Kolesterol adalah sterol utama pada jaringan hewan. Kolesterol dan senyawa
turunan esternya, dengan asam lemaknya yang berantai panjang adalah
komponen penting dari plasma lipoprotein.
Minyak kelapa diperoleh dari buah tanaman kelapa atau Cocos nucifera L., yaitu
pada bagian inti buah kelapa (kernel). Inti buah tanaman kelapa ini memiliki
kandungan minyak kelapa sebanyak 34% dengan kelembaban 6-8%. Kandungan
asam lemak minyak kelapa yang paling banyak adalah asam laurat C12:0 (asam
lemak jenuh).
Zat warna alamiah yang terdapat pada minyak kelapa adalah karoten yang
merupakan hidrokarbon tidak jenuh dan tidak stabil pada suhu tinggi. Pada
pengolahan minyak menggunakan uap panas maka warna kuning yang
disebabkan oleh karoten akan mengalami degradasi. Warna coklat pada minyak
yang mengandung protein dan karbohidrat bukan disebabkan oleh zat warna
alamiah, tetapi oleh reaksi browning. Warna ini merupakan hasil reaksi dari
senyawa karbonil (berasal dari pemecahan peroksida) dengan asam amino dari
protein, dan terjadi terutama pada suhu tinggi. Warna pada minyak kelapa
disebabkan oleh zat warna dan kotoran-kotoran lainnya (Tambun, 2006).
Minyak yang tidak jenuh bila mengalami oksidasi, ikatan rangkapnya dapat
berubah menjadi peroksida lemak yang ditandai dengan terjadinya ketengiakan.
Ikatan rangkap akan mengisi iodium (I2) sehingga ikatan rangkapnya hilang.
Bersamaan dengan itu warna iodium juga akan hilang.
Pemanasan minyak secara berulang-ulang pada suhu tinggi dan waktu yang
cukup lama, akan menghasilkan senyawa polimer yang berbentuk padat dalam
minyak. Minyak yang rusak akibat proses oksidasi dan polimerisasi akan
menghasilkan bahan dengan rupa yang kurang menarik dan cita rasa yang tidak
11
enak, serta kerusakan sebagian vitamin dan asam lemak esensial yang terdapat
dalam minyak. Kerusakan minyak karena pemanasan suhu tinggi, disebabkan
oleh proses oksidasi dan polimerisasi. Kerusakan ini dapat diuji dengan pengujian
bilangan FFA, bilangan peroksida dan uji kejernihan minyak.
1. Inisiasi
Xo+ RH → Ro + XH
Pada tahap ini dengan adanya oksigen bebas akan terjadi pengambilan atom H
dari PolyUnsaturated Fatty Acid (PUFA) yang terdapat pada membran sel
sehingga menyebabkan kerusakan pada sel.
2. Propagasi
Ro+ O2 → ROOo
Hasil dari reaksi ini akan menjadi inisiator baru untuk bereaksi dengan PUFA yang
lain sehingga menghasilkan produk radikal baru.
3. Terminasi
ROOo + Ro → ROOR
Ro + Ro → RR
Tahap ini mengkombinasikan dua radikal menjadi suatu produk non radikal
(Murray dkk., 2000).
12
Metode Evaluasi Nilai Biologis Lemak
Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi nilai biologis lemak, antara lain:
1. Bilangan peroksida
2. Bilangan TBA
3. Bilangan iod
4. Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
5. Profillipid darah(total kolesterol, trigliserida, HDL, LDL)
6. Kadar TBARS menunjukkan tingkat oksidasi lemak
7. Pengujian daya hipokolesterolemik in vitro
8. Pengujian kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol in vitro
9. Kadar asam empedu sekum
Bilangan iod
Bilangan Peroksida
Bilangan TBA
13
Asam 2-tiobarbiturat (TBA) bereaksi dengan malonaldehid membentuk warna
merah. Malonaldehid adalah produk degradasi lipid teroksidasi
Lipid darah meliputi kadar trigliserida(TG), kadar total kolesterol(TK), kadar HDL
dan kadar LDL. Kadar TG, TK dan HDL pada plasma/serum dapat diukur dengan
menggunakan kit reagen komersial. Kit komersial berisi sejumlah enzim-enzim
spesifik yang mengubah substrat menjadi kromofor, sehingga kadarnya dapat
diukur dengan spektrofotometri.
MDA terbentuk dari peroksidasi lipid (lipid peroxidation) pada membran sel yaitu
reaksi radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid
(PUFA). Reaksi tersebut terjadi secara berantai, akibat akhir dari reaksi rantai
tersebut akan terbentuk hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida tersebut dapat
menyebabkan dekomposisi beberapa produk aldehid yang bersifat toksik
terhadap sel dan berbeda panjang rantainya, antara lain MDA, yang merupakan
salah satu aldehid utama yang terbentuk (Edyson, 2003) (Gambar 2). Pengukuran
kinetika peroksidasi lipid secara in vitro dapat dilakukan dengan mengukur
berapa banyak oksigen yang dibutuhkan. Ada beberapa metode yang dapat
digunakan, salah satunya TBA (Thiobarbituric Acid) reactivity test, yang dapat
dilakukan baik secara in vivo maupun in vitro. Tes ini didasarkan pada reaksi
kondensasi antara satu molekul MDA dengan dua molekul TBA pada kondisi
asam. Hasilnya adalah pigmen berwarna merah yang dapat diukur pada panjang
gelombang 532 nm (Gambar 3). Jumlah MDA yang terdeteksi menggambarkan
banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi (Josephy, 1997).
14
MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan
sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres
oksidatif.
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron yang
tidak berpasangan di orbit luarnya (unpaired electron). Zat ini sangat reaktif, dan
struktur yang demikian membuat radikal bebas cenderung “mencuri” atau
mengekstraksi satu elektron dari molekul lain di dekatnya untuk melengkapi dan
selanjutnya mencetuskan reaksi berantai yang dapat mengakibatkan cedera sel.
Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi
peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid
(MDA). MDA akan membentuk senyawa berwarna merah muda bila direaksikan
dengan asam tiobarbiturat (TBA). Jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui
15
berdasarkan kemampuan penyerapan cahaya pada A532 nm. Jumlah MDA yang
terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.
Pengukuran kadar MDA serum dapat dilakukan melalui beberapa cara, yaitu
sebagai berikut :
16
b. Pengukuran MDA-TBA dengan HPLC (High Performance Liqiud
Chromatography)
Merupakan metode pengukuran kadar MDA serum yang paling sensitif dan
spesifik. MDA bukan produk yang spesifik dari proses peroksidasi lipid sehingga
dapat menimbulkan positif palsu yang berakibat nilai duga positif yang rendah,
dan telah dilaporkan dapat meningkatkan spesifisitas pada pemeriksaan kadar
MDA serum
17
III. ALAT DAN BAHAN
- Ekstrak kentang
- Larutan fenol 1%
- Larutan pirogalol 1%
- Larutan vitamin c
- Minyak kelapa
- Minyak kelapa yang telah dipanaskan berulang
- Kalium iodide
- Hemolisat darah
- Larutan asam trikloroasetat (tca) 10%
- Larutan tba 0,67%
18
Uji Ketengikan Lemak
19
V. HASIL PENGAMATAN
A. UJI OKSIDASE DALAM KENTANG DAN PENGARUH PEMBERIAN VITAMIN C
Dengan tablet Vitamin C
TABUNG
BAHAN
1 2 3 4
Ekstrak kentang 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
- Gue gak - Gue gak
Tablet. Vitamin C
tau vir :D tau vir :D
Lar. Fenol 10% 10 tetes 10 tetes - -
Lar. Pirogalol 1% - - 10 tetes 10 tetes
Merah orange Coklat tua Coklat
HASIL
kecoklatan muda
TABUNG
BAHAN
1 2 3 4
Ekstrak kentang 5 5 5 5
Lar. Vitamin C - 10 tetes - 10 tetes
Lar. Fenol 10% 10 tetes 10 tetes - -
Lar. Pirogalol 1% - - 10 tetes 10 tetes
Orange Orange Coklat tua Coklat tua
kecoklatan kecoklatan pekat tidak pekat
HASIL
(pekat) (tidak
pekat)
20
Uji oksidase dalam kentang dengan penambahan tablet vitamin C
21
Uji oksidase dalam kentang dengan penambahan vitamin C cair
22
B. UJI KETENGIKAN LEMAK
23
C. UJI PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS
24
asam askorbat, tirosin, enzim polifenol oksidase dan oksigen yang tersedia.
Reaksi pencoklatan dapat terjadi melalui dua proses yaitu proses pencoklatan
enzimatik, disebabkan adanya enzim PPO dan tirosin yang berperan sebagai
substrat sedangkan proses non enzimatis disebabkan karena reaksi Meillard,
karamelisasi atau oksidasi asam askorbat. Proses pencoklatan yang terjadi akan
mengurangi kualitas produk dan menurunkan minat konsumen. Proses
pencoklatan sebenarnya dimulai dari kentang yang dikupas, dipotong-potong,
oksidasi asam askorbat, senyawa phenol seperti senyawa tirosin sebagai
substrat, akan dikatalisis enzim PPO menjadi quinon dan berpolimerisasi
membentuk o quinon, sehingga menghasilkan warna kecoklatan. Penentuan
asam askorbat dalam varietas kentang digunakan untuk proses penghambatan
pencoklatan kentang atau proses browning (inhibitor) dan metoda Murshell Soil
Colour Chart digunakan untuk menentukan asam askorbat, aktivitas enzim PPO
dan perubahan warna kentang.
Pada pratikum uji oksidase dalam kentang ini bertujuan untuk mengetahui
proses oksidasi senyawa fenol oleh polifenol olsidase (PPO) dan juga untuk
memperlihatkan efek antioksidan vitamin C terhadap oksidasi fenol oleh PPO
kentang. Bahan yang digunakan untuk praktik ini adalah tablet vitamin C dan
sediaan vitamin C dalam bentuk cair.
Pada uji oksidase yang pertama menggunakan tablet vitamin C. Pada tabung 1
(ekstrak kentang+fenol) terjadi perubahan warna pada ekstrak kentang menjadi
merah kecoklatan. Hal ini menunjukkan adanya reaksi oksidasi senyawa fenol
oleh enzim yang dimiliki kentang yaitu Polifenol Oksidase (PPO). Fenol diubah
menjadi katekol oleh PPO, kemudian menjadi kinon. Terbentuknya warna coklat
pada reaksi tersebut dikarenakan proses kondensasi pada reaksi tersebut. Pada
tabung 2 (ekstrak kentang+vit.C+fenol), terjadi perubahan warna pada ekstrak
kentang menjadi warna orange. Warna coklat yang seharusnya terbentuk pada
penambahan fenol dihambat oleh adanya vitamin C. Pada tabung 3 (ekstrak
kentang + larutan pirogalol 1%) terjadi perubahan warna pada ekstrak kentang
25
menjadi warna coklat tua. Hal ini membuktikan bahwa enzim PPO pada kentang
mengubah pirogalol menjadi purpurogalin. Dan Pada tabung 4 (ekstrak kentang +
vit.C + pirogalol) terjadi perubahan warna menjadi warna coklat muda.
Purpurogalin tidak terbentuk karena dihambat oleh vitamin C.
Pada uji oksidasi yang kedua menggunakan sediaan vitamin C dalam bentuk cair.
Pada tabung 1 (ekstrak kentang+fenol) terjadi perubahan warna pada ekstrak
kentang menjadi orange-coklat pekat. Hal ini menunjukkan adanya reaksi
oksidasi senyawa fenol oleh enzim yang dimiliki kentang yaitu Polifenol Oksidase
(PPO). Fenol diubah menjadi katekol oleh PPO, kemudian menjadi kinon.
Terbentuknya warna coklat pada reaksi tersebut dikarenakan proses kondensasi
pada reaksi tersebut. Pada tabung 2 (ekstrak kentang + vit.C + fenol), terjadi
perubahan warna pada ekstrak kentang menjadi warna orange-kecoklatan tidak
pekat. Warna coklat yang seharusnya terbentuk pada penambahan fenol
dihambat oleh adanya vitamin C. Pada tabung 3 (ekstrak kentang + larutan
pirogalol 1%) terjadi perubahan warna pada ekstrak kentang menjadi warna
coklat tua pekat. Hal ini membuktikan bahwa enzim PPO pada kentang
mengubah pirogalol menjadi purpurogalin. Dan Pada tabung 4 (ekstrak kentang +
vit.C + pirogalol) terjadi perubahan warna menjadi warna coklat tua tidak pekat.
Purpurogalin tidak terbentuk karena dihambat oleh vitamin C.
26
terbrntuk yaitu warna coklat muda, sementara pada uji yang menggunakan
vitamin C sediaan cair warna yang terbentuk yaitu coklat tua tidak pekat.
27
kerusakn ini diakibatkan oleh reaksi oksidasi yang menghasilkan peroksida, asam
lemak, aldehid dan keton.
Kerusakan lemak atau minyak yang utama adalah timbulnya bau tengik yang
disebut proses ketengikan. Ketengikan pada kebanyakan lemak atau minyak
menunjukkan bahwa kebanyakan golongan trigliserida tersebut telah teroksidasi
oleh oksigen dalam udara bebas. Asam-asam lemak bebas dapat dihasilkan dari
proses oksidasi lemak atau minyak. Pemanasan akan mengakibatkan adanya
proses oksidasi antara lemak atau minyak dengan oksigen, selanjutnya proses
oksidasi akan membentuk peroksida-peroksida dan terurainya asam-asam lemak
yang disertai dengan konversi hidroperoksida menjadi aldehid dan keton serta
asam-asam lemak bebas.
Proses oksidasi dapat terjadi bila ada kontak antara minyak atau lemak dengan
oksigen. Oksidasi ini terjadi pada ikatan tidak jenuh dalam asam lemak. Pada
suhu kamar sampai suhu 100°C, setiap 1 ikatan tidak jenuh dapat mengabsorbsi
2 atom oksigen, sehingga terbentuk persenyawaan peroksida yang bersifat labil.
Oksidasi dimulai dengan pembentukan peroksida dan hidroperoksida dengan
peningkatan oksigen pada ikatan rangkap pada asam lemak tidak jenuh.
Kenaikan bilangan peroksida merupakan salah satu indikator dan peringatan
bahwa produk sebentar lagi akan berbau tengik dan mengalami kerusakan. Pada
saat produk yang mengandung minyak atau lemak berbau tengik, bilangan
peroksida turun karena akan terurai . Pembentukkan peroksida juga mempunyai
korelasi dengan tipe dan jumlah radikal bebas dalam lemak serta kecepatan
proses oksidasinya tergandung dari tipe lemak dan kondisi penyimpanan.
Kandungan gula yang tinggi dapat berperan untuk menghambat porses
timbulnya reaksi oksidasi dan ketengikan. Proses ketengikan sangat dipengaruhi
oleh adanya prooksidan dan antioksidan. Prooksidan akan mempercepat
terjadinya oksidasi sedangkan antioksidan akan menghambatnya.
28
yang telah dipanaskan berulang - ulang ( telah digunakan ). Masing - masing 0.5
ml minyak kelapa dan 0.5 ml minyak kelapa yang telah digunakan, ditetesi kalium
Iodida. Masing - masing tetesan dihitung, hingga terbentuk warna coklat yang
menetap. Ketika ditetesi pertama, ternyata minyak kelapa menghabiskan 40
tetes KI hingga terbentuk warna coklat menetap yang kedua minyak kelapa
menghabiskan 41 tetes KI hingga terbentuk warna coklat menetap. Sedangkan
untuk minyak yang digunakan berulang pertama menghabiskan 35 tetes KI
hingga terbentuk warna coklat menetap dan pada percobaan yang kedua minyak
yang digunakan berulang menghabiskan 35 tetes KI hingga terbentuk warna
coklat menetap. Hal ini dipengaruhi oleh Ikatan rangkap yang mengalami oksida.
Dapat dikatakan bahwa minyak kelapa memiliki ikatan rangkap yang lebih
banyak. Ikatan rangkap yang teroksidasi akan mengadisi Iodium (I2) sehingga
ikatan rangkapnya hilang (kondisi jenuh). Iodium merupakan salah satu senyawa
yang memiliki keelektronegatifitas tinggi. Kondisi ini menjadi dasar bahwa iodine
mudah bereaksi dengan asam lemak, yaitu asam lemak tidak jenuh. Iodin dapat
menyebabkan adanya reaksi adisi pada ikatan rangkap lemak. Sementara,
minyak yang telah digunakan berkali kali telah mengalami penjenuhan.
Kerusakan minyak karena pemanasan berulang-ulang disebabkan oleh proses
oksidasi dan polimerisasi. Akibatnya, ikatan rangkapnya banyak berkurang
(putus/hilang) sehingga ketika dioksidasi lagi, jumlah tetesan KI yang digunakan
lebih sedikit untuk membentuk warna coklat yang menetap. Tengiknya suatu
larutan karena golongan trigliserida banyak teroksidasi oleh oksigen dalam udara
bebas
29
Aldehid dapat menimbulkan bau yang tidak enak pada lemak atau lipid seperti
bau tengik. Salah satu cara untuk mengetahui adanya aldehid adalah dengan
mereaksikan lemak atau lipid dengan TBA. Sedangkan pada penentuan angka
peroksida berdasarkan lipid yang teroksidasi akan membentuk senyawa
hidroperoksida, yang kadarnya bisa dilihat dari bilangan peroksida.
Pada percobaan ini, cairan biologis yang digunakan adalah hemolisat Darah, yaitu
3ml darah yang baru diambil kemudian dilisiskan dengan penambahan air
sebanyak 1ml. Pada hemolisat darah ini terdapat Asam Lemak tak jenuh jamak
(PUFA). Apabila PUFA mengalami peroksidasi maka akan terbentuk peroksida
Lipid. kemudian mengalami proses Dekomposisi menjadi Malonaldehid (MDA ).
Kami melakukan percobaan dengan membuat uji 1, uji 2 dan blanko. Untuk uji 1
dan uji 2 masing-masing diambil 1 ml hemolisat darah kemudian ditambahkan 2
ml TCA 10% (pastikan kondisi TCA dalam keadaan dingin) dan kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Penggunaan TCA disini yaitu untuk proses
pengendapan protein pada darah agar terpisah sempurna dari supernatannya.
Campuran tersebut kemudian divortex 2000rpm selama 1 menit untuk
menghomogenkan darah dan larutan TCA, setelah itu di sentrifugasi 4000rpm.
Kemudian supernatannya diambil lalu ditambahkan TBA 0.67% sebanyak 3 ml
(untuk penentuan bilangan TBA). Fungsi larutan TBA yaitu untuk mendeteksi
MDA bebas dan mengukurnya dalam system lipid peroksida. MDA bila
direaksikan dengan larutan TBA juga mengakibatkan terbentuknya warna merah
muda karena persyaratan Analisis menggunakan UV-Vis Spektrofotometer yaitu
harus mempunyai gugus kromofor. Akan tetapi, bila Bahan tidak mempunyai
gugus kromofor dan tidak berwarna, maka perlu ditambahkan pereaksi
perwarna. Pada prakteknya warna yang terbentuk seharusnya merah muda,
tetapi ternyata supernatant berwarna kuning. Setelah ditambahkan larutan TBA
0,67% kemudian campuran tersebut dididihkan selama 10 menit. Hal ini
dilakukan untuk mempercepat proses degradasi peroksida lipid menjadi MDA.
Sehingga MDA bebas yang berada dalam system lipid peroksidasi mudah
terdeteksi. Kemudian didinginkan, dan dilakukan pembacaan serapan pada λ532
30
nm dengan Spektrofotometri UV-Vis tipe Single Beam(penentuan angka
peroksida yang diketahui dari jumlah MDA yang mempunyai kemampuan
penyerapan cahaya pada λ532 nm).
Nilai absorban yang dihasilkan pada sampel uji 1 adalah 0,044 dan kadar MDA-
nya yaitu 2,9 x 10-7 M-1 cm-1, untuk sampel uji 1 diperoleh absorban 0,025 dan
kadar MDA-nya yaitu 1,6 x 10-7 M-1 cm-1, dan pada blanko diperoleh absorban
0,032 dan kadar MDA-nya yaitu 2,1 x 10-7 M-1 cm-1. Pada sampel uji 2 kadar
MDA yang diperoleh lebih kecil dari nilai kadar MDA pada blanko. Hal ini
disebabkan pada prakteknya kuvet yang digunakan hanya 2, sedangkan
perhitungan kadar yang dilakukan 3x. Sehingga ada kemungkinan pada
perhitungan kadar sampel uji 2 kuvet yang digunakan kurang bersih karena
sebelumnya kuvet tersebut digunakan untuk perhitungan kadar uji 1 yang
mempengaruhi pada pembacaan serapan cahaya.
31
VII. KESIMPULAN
Suatu proses Oksidasi ditandai dengan terjadinya perubahan warna menjadi
coklat pada kentang dan lipid. Pada Lipid reaksi oksidasi juga ditandai
adanya bau tengik karena Hidroperoksida memiliki sifat dapat terurai
menjadi senyawa yang lebih kecil, seperti aldehid. Aldehid dapat
menimbulkan bau yang tidak enak pada lemak atau lipid seperti bau tengik.
Proses oksidasi dapat dicegah atau dihambat dengan pemberian Anti
Oksidan, seperti penambahan vitamin C.
Vitamin C tablet lebih efektif daripada vitamin C dalam bentuk cair dalam
menghambat proses oksidasi pada ekstrak kentang.
Iodine mudah bereaksi dengan tidak jenuh karena iodium memiliki
keelektronegatifitas tinggi. Iodin dapat menyebabkan adanya reaksi adisi
pada ikatan rangkap lemak.
Minyak kelapa membutuhkan KI yang lebih banyak untuk menimbulkan
warna yang coklat karena minyak kelapa memiliki ikatan rangkap yang lebih
banyak. Ikatan rangkap yang teroksidasi akan mengaddisi Iodium (I2)
sehingga ikatan rangkapnya hilang ( kondisi jenuh ).
Minyak yang telah digunakan berkali-kali, telah mengalami penjenuhan.
Akibatnya, ikatan rangkapnya banyak berkurang ( putus/hilang). Sehingga,
ketika dioksidasi lagi, jumlah tetesan KI yang digunakan lebih sedikit untuk
membentuk warna coklat yang menetap.
Pada percobaan ini mengkombinasikan uji kuantitatif dalam penentuan
kadar lipid yang dilakukan dengan cara, yaitu dengan penentuan bilangan
TBA dan penentuan angka peroksida.
Kadar serapan yang terbentuk pada sampel uji 1 diperoleh kadar MDA yaitu
2,9 x 10-7 M-1 cm -1, pada sampel uji 1 diperoleh kadar MDA yaitu 1,6 x 10-
7 M-1 cm -1, dan pada blanko diperoleh kadar MDA yaitu 2,1 x 10-7 M-1 cm
-1.
Jumlah kadar MDA yang terbentuk menggambarkan proses peroksidasi lipid
32
VIII. DAFTAR PUSTAKA
http://digilib.unnes.ac.id/gsdl/collect/skripsi/archives/HASH015d.dir/doc.pdf
http://www.chem-is-
try.org/artikel_kimia/berita/antioksidan_dan_radikal_bebas/
http://www.scribd.com/doc/24002965/LAPORAN-STABILITAS-MINYAK
www.rismaka.net/2009/06/uji-lipid.html
http://xa.yimg.com/kq/groups/20875559/932235840/name/modul12.pdf
http://etd.eprints.ums.ac.id/6090/1/K100050059.pdf
http://eprints.undip.ac.id/18343/1/Nahwa_Arkhaesi.pdf
33