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Subturma: T3
Professora: Fernanda Badotti
1. Título
2. Introdução
Os meios de cultura podem ser quimicamente definidos, nos quais se conhece a composição
exata e assim, pode-se saber se determinado constituinte é essencial para o crescimento de certo
microrganismo; pode ser complexo, utilizado mais comumente em laboratório, esses meios têm
função de simular, até mesmo melhorar o ambiente natural dos microrganismos que estão sendo
estudados (geralmente, incluem extratos de carne, peptonas, extrato de levedura, sangue, soro,
leite, extrato de solo e fluido de rúmen de bovino); ou podem ser ainda de cultura de células in
vitro, nos quais culturas de células animais e de plantas desenvolvidas são utilizadas para cultivar
vírus in vitro, uma vez que sua replicação ocorre somente dentro de células hospedeiras vivas.
Os meios de cultura podem ser classificados quanto ao estado que se encontram:
O ágar é um polissacarídeo complexo extraído de uma alga marinha. Ele apresenta muitas
propriedades que o tornam um agente solidificante ideal: funde-se em torno do ponto de ebulição
da água (100 ºC), formando uma solução transparente, e então permanece no estado líquido até
em torno de 40 ºC. Como a maioria dos microrganismos não são mortos a 45 ºC, eles podem ser
adicionados a um meio contendo ágar liquefeito antes que o meio seja solidificado em tubos ou
placas de Petri. O meio contendo ágar, após se solidificar e resfriar, permanece solidificado a
temperaturas de incubação e pode ser inoculado com microrganismos.
- Meio seletivo: aquele que permite o crescimento de um tipo particular de microrganismo e/ou
suprimem o crescimento de outro.
- Meio diferencial: possui substâncias que evidenciam uma característica que permite separar um
grupo ou uma espécie de microrganismo.
Quando se prepara meios de cultura é necessário atentar para seu tempo de uso, pois não se
pode deixar uma solução não estéril por mais de uma hora, devido à possibilidade de evaporação
da água e do crescimento microbiano; não podem também ser mantidas em altas temperaturas
antes de serem esterilizadas, uma vez que haverá degradação de vários reagentes do meio.
3. Objetivos
4.1 Reagentes:
• Água;
• Ágar nutriente;
• Caldo Lactosado.
4.2 Materiais
• Placa de Petri;
• Tubos de ensaio com tampa (de rosca e de algodão hidrofóbico);
• Tubo de Durham;
• Erlenmeyer.
4.3 Equipamentos
• Alça de Drigalsky;
• Alça de platina;
• Barbante;
• Papel Kraft;
• Papel alumínio;
• Fita de autoclave;
• Ponteira de plástico;
• Fita crepe;
• Autoclave;
• Bico de Bunsen;
• Balança analítica;
• Contador de colônia;
• Micro-ondas.
28g _______________1L
Y g _______________ 0,78 L logo Y= 21,84g
28g _______________1L
Z g _______________ 0,130L logo Z= 3,64g
6.1 Procedimentos/metodologia
3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado.
5) Esterilizar em autoclave.
7) Preparar as placas de Petri, que devem estar embrulhadas em papel Kraft e esterilizadas em
autoclave.
9) Despejar certo volume do meio de cultura nas placas de Petri (cobrindo o fundo da placa),
abrindo-a ao lado da chama do bico de Bunsen. Ao concluir a distribuição, deve-se recolocar a
tampa na placa rapidamente.
10) Deixar a placa em posição horizontal, até que o meio de cultura se solidifique completamente.
1) Separar os meios que serão utilizados e observar os rótulos quanto à classificação, finalidade
de uso, data de validade, instrução de preparo, constituição.
3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado.
7) Distribuir 10 mL em tubos de ensaio (próximo ao bico de Bunsen, flambar a boca do tubo antes
e depois da distribuição), tampar com rolha de gaze e algodão hidrofóbico.
8) Esterilizar em autoclave.
9) Retirar da autoclave e posicionar o tubo de forma a permanecer inclinado. Esperar que ele
resfrie até estar solidificado.
10) Acondicionar os tubos num recipiente, envolvê-los em papel Kraft e barbante e armazenar no
refrigerador a 4 ºC.
1) Separar os meios que serão utilizados e observar os rótulos quanto à classificação, finalidade
de uso, data de validade, instrução de preparo, constituição.
3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado.
5) Introduzir nos tubos de ensaio um tubo Durham, que tem como função verificar a produção de
gás da cultura a ser inoculada.
O armazenamento dos meios, após preparação, deve ser em geladeira (após resfriamento à
temperatura ambiente) e dentro de sacos plásticos para evitar maior desidratação. Os tubos e
placas devem estar identificados claramente com data de preparação, data de vencimento,
preparador e conteúdo.
1) Com uma alça esterilizada, retirar uma porção de uma cultura em crescimento em meio sólido.
2) Espalhar a cultura em uma placa com meio sólido estéril, fazendo estrias de modo a dividir a
placa em 4 setores, preferencialmente, sempre indo de uma extremidade à outra no setor
esgotado.
• Transferência de uma cultura de microorganismos de maio sólido para tubo com meio
líquido
2) Esterilizar a alça de transferência na chama do bico de Bunsen até que ela fique vermelha e
esfrie-a num canto da placa com inóculo.
3) Remover uma colônia bacteriana com a alça de uma cultura em crescimento em meio sólido.
4) Remover a tampa de um tubo com meio líquido estéril, flambar a boca e introduzir a alça no
meio.
5) Agitar a alça para que as bactérias se desprendam e fiquem em suspensão no meio líquido.
6) Flambar a boca do tubo novamente e recolocar a rolha de gaze com algodão hidrofóbico.
1) A partir da mesma cultura em ágar nutriente e utilizando uma alça de platina previamente
flambada inocular toda a superfície do meio de cultura Agar nutriente no tubo inclinado, em
forma de estria.
1) Identificar as placas com o meio de cultura Agar nutriente de acordo com as diluições
adequadas.
2) Transferir 1,0 mL das diluições selecionadas para a superfície do meio de cultura Agar
nutriente.
3) Verter sobre o inóculo certo volume do ágar nutriente (cobrindo o fundo da placa) fundido e
resfriado a cerca de 55 ºC, e homogeneizar o conteúdo com movimentos rotatórios suaves sem
erguer a placa.
Todos os tubos, ao serem agitados, apresentaram turvação mostrando, assim, que houve
crescimento da Enterobacter. Não houve fermentação em nenhum tubo.
• Espalhamento
Número de Número de
Amostra Diluição
colônias morfologias
Água da Lagoa da 10-1 22 11
Pampulha 10-2 14 6
10-3 21 6
Cosmético 10-1 ~359 4
10-2 35 3
10-3 10 4
10-1 Incontáveis 2
Leite 10-2 Incontáveis 2
10-3 Incontáveis 2
Terra 10-1 Incontáveis Aparentemente 1
10-2 Incontáveis 3
10-3 Incontáveis 3
Como esperado, a diluição 10-1 apresentou um grande número de colônias com grande variedade
de morfologias. Isso se deve a pequena fração da diluição da amostra, ou seja, foi espalhado um
número maior de bactérias com morfologias variadas pela grande concentração em 1 mL de
amostra.
Na diluição 10-2 houve um menor número de colônias com, também, menor número de morfologias
comparando com a diluição 10-1. Isso era esperado já que a concentração da amostra diminuiu.
Já a diluição 10-3 apresentou uma maior contaminação que a diluição 10-2. Isso pode ser explicado
pelo fato de, por descuido, a placa ter sido aberta num raio maior que 10 cm da chama do bico de
Bunsen; já que as colônias observadas são diferentes das presentes nas diluições anteriores,
provavelmente, são provenientes do ar.
- Cosmético:
Como esperado, a diluição 10-1 apresentou um grande número de colônias, sendo que uma das
quatro morfologias foi predominante. Essa placa também possuiu um número de colônias maior
de 300, dificultando a contagem.
Essa mesma morfologia foi a predominante nas outras diluições, mostrando ser a bactéria
presente em maior quantidade na amostra.
- Leite:
Em todas as diluições não foi possível fazer a contagem das colônias, uma vez que quase não
havia nenhuma isolada. A explicação para isso se deve ao fato de que o leite utilizado na prática,
ficou exposto 24 horas na própria bancada do laboratório, o que provocou contaminação de
microorganismos do ar. Estes microorganismos possuíam uma morfologia branca.
- Terra:
Na diluição 10-1 parece existir um fungo filamentoso, pela morfologia que parece algodão. Foi
apenas constatada essa morfologia, que ocupou toda a placa. O não aparecimento aparente de
bactérias pode ter ocorrido pela produção de enzimas desse fungo.
Nas diluições 10-2 e 10-3 foram muitas colônias de bactérias, sendo impossível conta-las. Os
microrganismos predominantes nessas placas são diferentes dos demais microrganismos das
outras amostras. Alguns são iguais tendo a hipótese de ter sido contaminado com o ar devido a
manipulação inadequada.
• “Pour Plate”
Número de Número de
Amostra Diluição
colônias morfologias
Água da Lagoa da 10-1 incontáveis 3 morfologias ou mais
Pampulha 10-2 4 3
10-3 10 6
Cosmético 10-1 - -
10-2 - -
10-3 - -
Leite 10-1 Incontáveis 3
10-2 Incontáveis 3
10-3 Incontáveis 1
Terra 10-1 Erro na diluição Erro na diluição
10-2 Incontáveis Várias
10-3 Incontáveis 3
10-4 Incontáveis 3
A diluição 10-1 apresentou uma contaminação muito grande, com um número incontável de
colônias. Esse resultado obtido apresenta grande diferença se comparado às colônias observadas
nas outras diluições, tanto para o espalhamento, quanto para o “pour plate”. Esse microrganismo
pode ser um fungo ou, mais provavelmente, várias colônias de bactérias juntas que apresentam
um tipo distinto de crescimento das encontradas anteriormente. (como chegou a essa conclusão)
Já na diluição 10-2 houve quatro colônias com três morfologias diferentes, porém as mesmas
encontradas nos espalhamentos e diluição 10-3 no "pour plate". Podemos explicar o fato de
observarmos um menor número de colônias e morfologias na diluição 10-2 “pour plate” se
comparada com a diluição 10-2 no espalhamento, devido ao número de bactérias anaeróbias
tolerantes ou ainda, pelo fato de as bactérias (não serem uniformemente distribuídas em água,
logo, a alíquota retirada para utilizar no espalhamento pode possuir um maior número de bactérias
que aquela utilizada para o “pour plate”.)
Na diluição 10-3 houve um maior número de colônias e morfologias que na diluição 10 -2. Isso pode
ser explicado por uma manipulação inadequada, erro na diluição ou, como em 10-2, a alíquota
retirada poderia conter um maior número de bactérias que as outras.
- Cosmético:
- Leite:
Na diluição 10 -1 houve predominância de um tipo de colônia, branca. Foi possível perceber outras
três morfologias diferentes, que podemos considerar que provavelmente são oriundas do ar.
(porq)
-2
Na diluição 10 manteve-se a predominância de uma morfologia branca, mas houve colônias
menores e mais dissipadas tornando possível a observação das morfologias. Houve ainda a
presença de 2 ou 3 colônias diferentes, de cor amarela.
-3
Na diluição 10 foi impossível contar as colônias, pois estava presente inúmeras colônias
pequenas, além das de tamanho maior. Não foi identificados microorganismos com outra
morfologia a não ser a branca predominante das outras duas diluições.
- Terra:
-1
Na diluição 10 houve erro de diluição, provocando pouco crescimento dos microrganismos. Na
-2
diluição 10 foram, aparentemente, várias morfologias, já que foi impossível contá-las. (Nas
diluições 10 e 10-4 houveram 3 tipos de morfologia, aparentemente, já que também foi muito
-3
Esses resultados podem indicar que na amostra de terra analisada existem vários microrganismos
anaeróbicos tolerantes.
O ágar não utilizado (se descartado sólido), será tratado como lixo hospitalar, já o descartado na
forma líquida terá o mesmo tratamento que o esgoto. Os produtos que as bactérias geram ao
degradar o meio e metabolizá-lo não recebem tratamento específico, porém, podem ser resíduos
tóxicos.
Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e
adubos. Para a produção dos alimentos e adubos seria necessário o tratamento dos produtos
gerados pela degradação do meio e pelo metabolismo das bactérias. Porém, não foram
encontradas pesquisas nessa área. O tratamento existente consiste na combustão dos meios, o
que gera muita poluição por gás carbônico e resíduos sólidos não identificados.
6.1.4 Conclusão
Concluímos que são necessárias pesquisas aprofundadas na área de tratamento dos meios.
Aprendemos as técnicas apresentadas e compreendemos sua importância.
6.1.5 Bibliografia
- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologia: Conceitos e
Aplicações - vol. 1. 2ª Ed.