UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

“CURVA DE RINGBOWN. DETERMINACIÓN
DE LA ZONA DE TRABAJO. DETERMINACIÓN
DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA”

PROFESORA:
Mg. Norma Carlos
Casas
INTEGRANTES:
Aguilar Puente, Antonio Martin
Campos Salazar, Antony Brayan
Cárdenas Toribio, Karen Regina
Chávez Pacheco, Sair Máximo
Colonio García, Katia Stephanie
Martinez Cabrejos, Karen Janet
Pizarro Herrera, Víctor Romario
Quevedo Torres, Sergio
Quinteros Espino, Norah Miryam
Torres Chipana, Melissa
Mercedes

LIMA-PERÚ
2010
OBJETIVOS

Aprender a graficar la curva de Ringbom.

Conocer la concentración óptima de un compuesto para que

cumpla con la Ley de Lambert – Beer a través de la curva de
Ringbom.

Conocer las limitaciones de la ley de Lambert – Beer.

 INTRODUCCIÓN
En la primera práctica aprendimos la constitución, el manejo y el
cuidado del espectrofotómetro UV-vis y la importancia que tenía dicho
instrumento para el reconocimiento de una sustancia.

Para reconocer una sustancia hallamos su curva espectral la cual

después era comparada con la curva espectral de una sustancia patrón,
otra manera es que debe de cumplir con la Ley de Lambert – Beer pero
debemos de saber que esta ley tiene sus limitaciones y que una de las
limitaciones tiene que ver con la concentración del analito.

En esta práctica se aprenderá a hallar la concentración óptima para una

mejor lectura en el espectrofotómetro UV-vis y para que el analito
cumpla con la Ley de Lambert - Beer, esto lo lograremos con el uso de
la Curva de Ringbom.

La curva de Ringbom relaciona la absortancia con la concentración del

analito. Mediremos la absorbancia de diferentes concentraciones de un
analito, hallaremos el porcentaje de transmitancia y con esto la
absortancia, luego la relacionaremos sus concentraciones y de acuerdo
a la curva reconoceremos la concentración óptima en la cual se cumpla
con la Ley de Lambert – Beer.
 FUNDAMENTO TEÓRICO

LEY DE LAMBERT Y BEER

Ocurre cuando en el caso de la radiación monocrómatica, la

absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la
trayectoria a través de un medio y la concentración c de la especie
absorbente. Ésta relación se representa con la siguiente fórmula:

A= abc
a : constante de proporcionalidad llamada absortividad
b : longitud (cm)
c : concentración (g/L)

Cuando la concentración de la ecuación se expresa en moles por litro y

el largo de la celda está en centímetros, la absortividad se llama
absortividad molar, y se representa con el símbolo especial Ɛ. Por tanto,
cuando b está en centímetros y c en moles por litro se tiene:

A = Ɛbc

Se han encontrado pocas excepciones a la generalización de que la

absorbancia está relacionada en forma lineal con la longitud de la
trayectoria. Por otra parte, se ha encontrado desviaciones frecuentes
de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la
concentración cuando b es constante. Para que no ocurran errores
durante nuestro análisis y hacerlo demanera adecuada hacemos uso de
la curva de ringbown.

GRÁFICA DE RINGBOW

Cuando se realiza un análisis espectroscópico se debe trabajar, en lo

posible, se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que
permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva
de calibración que tenga una relación lineal.

Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se

construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica
de absorbancia (100- %T) vs. lg Concentración. Los datos se obtienen
preparando una serie de soluciones patrón del analito, que cubran una
variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de concentración
de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de
onda analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de
Ringbown corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de
esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el
intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y
concentración. En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la
intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para
determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo,
respectivamente.

A partir de esta gráfica podemos obtener otros datos como:

Límite de detección mínimo: Es la cantidad o concentración mínima

de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método
analítico determinado. Intuitivamente sería la concentración mínima
obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito)
que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a
partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito
presente.

Sería la cantidad o concentración más pequeña del analito que produce

una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo
Xb.

El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea

distinguible con certeza del ruido de fondo es que la diferencia entre la
señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos
sea igual a tres veces la desviación estándar de la señal de los blancos,
utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:

En donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima

detectable de analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la
desviación estándar de las lecturas del blanco.
Límite de detección máximo:

Vendría a ser la máxima concentración de un analito que se puede

analizar. Esto se debe a que las soluciones se hacen tan concentradas,
que en el caso de los métodos espectrofotométricos, toda la luz es
atrapada por el analito y tenemos una situación equivalente al ajuste
del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos
soluciones de concentraciones altas.La determinación queda limitada a
concentraciones menores del valor de límite de detección máximo, pero
en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el problema
se soluciona fácilmente mediante una dilución adecuada. En el caso del
límite de detección mínimo, las soluciones deben concentrar la muestra
o usar otra técnica con límite de detección menor.

El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de

la curva de Ringbown.

TRANSICIONES ELECTRÓNICAS EN MOLÉCULAS

ORGÁNICAS

Clasificación:

Las bandas de absorción en las regiones Ultravioleta y Visible que

presentan los compuestos orgánicos se asocian con transiciones
electrónicas en la capa de valencia. Los electrones involucrados en
dichas transiciones corresponden a aquellos mas débilmente atraídos
por el conjunto de núcleos atómicos que componen la molécula y cuyos
estados pueden ser descritos a través de orbitales moleculares que se
expresan como combinaciones lineales de orbitales atómicos de la capa
de valencia. Las transiciones electrónicas a orbitales moleculares más
externos dan lugar a las denominadas transiciones Rydberg presentes
en el Ultravioleta de Vacío. Por otra parte las transiciones electrónicas
que involucran a los electrones de las capas internas son muy
energéticas y se presentan en la región de los rayos X del espectro
electromagnético. Nuestro análisis se reducirá a las transiciones
electrónicas en la capa de valencia. A estos efectos resulta conveniente
recordar la clasificación convencional de los orbitales moleculares en la
capa de valencia de los compuestos orgánicos.

Orbitales σ y σ*. Son orbitales moleculares localizados a lo largo del eje

de unión de los átomos. Los orbitales σ generan una densidad
electrónica elevada en la región internuclear teniendo un carácter
fuertemente enlazante.

Los orbitales σ*, como todos los orbitales antienlazantes, presentan un

plano nodal perpendicular al eje del enlace en la región internuclear y
tienen un acentuado carácter antienlazante.
Orbitales π y π*. Estos orbitales se emplean en la descripción de los
enlaces múltiples. Las regiones de mayor densidad electrónica
correspondiente a los mismos son aquellas colaterales al eje del enlace.
El carácter enlazante o antienlazante de estos orbitales es menos
acentuado que el de los orbitales σ.

Orbitales n. Estos orbitales moleculares tienen un acentuado carácter

local y describen pares electrónicos libres asociados con heteroátomos
(O, S, N, Hal). Energéticamente tienen carácter no-enlazante.

Figura.1 se representan esquemáticamente la distribución energética

de los orbitales moleculares antes tratados.

Las principales transiciones electrónicas que se consideran para

muchas especies moleculares son: σ → σ , n → σ *, π → π *, n → π *.
A continuación se presentan algunas de las transiciones más
importantes en moléculas orgánicas:
a. La transición σ → σ es la que requiere mayor energía para que
se lleve a cabo, este tipo de transiciones generalmente ocurre en
el ultravioleta al vacío en longitudes de onda menores que 150
nm. Entre los enlaces típicos que presentan esta transición se
encuentran C-H con absorción cercana a 125 nm y el enlace C-C
con absorción cercana a 135 nm. Así, compuestos orgánicos
como los hidrocarburos saturados y cadenas saturadas - enlaces
sigma- presentarán absorción solamente en el ultravioleta lejano
y por tanto son transparentes en el UV cercano.

b. La transición n → σ generalmente requiere menos energía que

la transición s ® s * Estas transiciones generalmente se
 presentan entre 150 y 220 nm. Muchas de estas transiciones se
observan en moléculas orgánicas que contienen un heteroátomo:
N,O,S,Cl,Br,I, como haluros de alquilo, aminas, éteres, tioles, etc.
Por ejemplo el CH3OH presenta una banda n   * en 180 nm
con e = 315 M-1cm-1. Se considera para este tipo de transición
que un electrón que se encuentra en el orbital p del heteroátomo
- u orbital n de la molécula – es excitado al orbital s de la

c. Las transiciones π → π implican que el cromofóro debe poseer

al menos una insaturación para proveer el orbital molecular pi
antienlazante π *, moléculas con dobles o triples enlaces
frecuentemente presentan absorción entre 160 y 220 nm para
cromóforos aislados es decir separados por más de un enlace
sencillo. En el caso de moléculas con grupos cromofóros que
entren en conjugación como dienos, enonas, o con anillos
aromáticos la absorción se encuentra generalmente entre 200 y
360 nm, en el UV cercano y puede presentarse en el visible 360-
700 si el sistema conjugado es grande.Las transiciones π → π *
presentan coeficientes de absortividad e altos que oscilan entre
1000 y 15000 M-1cm-1

Las bandas atribuidas a las transiciones π → π * de sistemas

conjugados como el butadieno polienos, enonas, el benceno o
moléculas aromáticas que poseen sustituyentes que a su vez son
cromóforos (como el estireno, benzaldehido, o acetofenona) se
denominan bandas K (del alemán konjugierte).

Estas transiciones p ® p *, bandas K, se caracterizan por

absortividades molares altas e máx >104 y sufren desplazamiento
batocromico cuando hay aumento en la polaridad del solvente.

d. Las transiciones n → π implican que el cromofóro debe poseer

una insaturación (para proveer el orbital molecular π *) con un
heteroátomo que contenga un par de electrones no compartido,
electrones n, por ejemplo cromóforos como C = O, N = N, NO,
NO2, entre otros, presentan absorción entre 200 y 350nm para
cromóforos aislados. Se considera que uno de los electrones del
orbital molecular no enlazante, n, ( o que uno de los electrones de
un orbital átomico no enlazante del heteroátomo ) es excitado al
orbital antienlazante  * asociado con el doble o triple enlace.

Las transiciones n → π *presentan coeficientes de absortividad e bajos,

que oscilan entre 10 y 102 M-1cm-1, son prohibidas y estos valores
permiten distinguirlas de las transiciones π → π *.

Las transiciones n → π *también son llamadas bandas R (del alemán

radikalartig). Se caracterizan además de sus bajos coeficientes de
absortividad por el efecto hipsocrómico que se observa con el
incremento en la polaridad del solvente.
CÁLCULO DE ERRORES: ERROR ABSOLUTO, ERROR
RELATIVO

Bien sea una medida directa (la que da el aparato) o indirecta

(utilizando una fórmula) existe un tratamiento de los errores de medida.
Podemos distinguir dos tipos de errores que se utilizan en los cálculos:

Error absoluto. Es la diferencia entre el valor de la medida y el valor

tomado como exacta. Puede ser positivo o negativo, según si la medida
es superior al valor real o inferior (la resta sale positiva o negativa).
Tiene unidades, las mismas que las de la medida.

Error relativo. Es el cociente (la división) entre el error absoluto y el

valor exacto. Si se multiplica por 100 se obtiene el tanto por ciento (%)
de error. Al igual que el error absoluto puede ser positivo o negativo
(según lo sea el error absoluto) porque puede ser por exceso o por
defecto. No tiene unidades.

Parte Experimental
 Espectrofotometría: Absorbancia y %T
entre MATERIALES,
una sustancia inorgánica
EQUIPOS y una
Y REACTIVOS
Equipo:
orgánica
UV-2100 Spectrophotometer
Materiales:
Matraz Aforado (100, 50, 25 y 10ml)
Tomaremos a continuación los datos
Pipeta volumétrica leídos en el espectrofotómetro. Lo
(15,10,5,2,1)
que buscamosMatraz
es determinar la longitud
simple (250, 100ml) óptima analítica y comparar la
naturaleza de Tubos
dos sustancias
de ensayodiferentes: Una es orgánica (heliantina) y
Vaso(permanganato
la otra, inorgánica precipitado (250,de 100 ml)
potasio).
Reactivos:
Aseptil Rojo
Las curvas espectrales (Azosulfamida
-Absorbancia vs 5%)
Longitud de onda y %T vs
Permanganato de potasio
Longitud de onda- serán graficadas al final del presente informe.
Anaranjado de metilo
Agua destilada
 Permanganato de potasio (KMnO4) Anaranjado de metilo (Heliantina)

λ (nm) %T A λ (nm) %T A

400 83.9 0.0762

400 42.1 0.3757
410 85.2 0.0695

420 85.5 0.0680 410 37.9 0.4213

430 85.7 0.0670 420 34.8 0.4584

440 85.4 0.0685

430 32.2 0.4921
450 84.9 0.0660

460 83.7 0.0773 440 30.2 0.5199

470 81.7 0.0873 450 28.3 0.5482

480 78.7 0.1040

460 27.9 0.5543
490 75.1 0.1243

500 70.4 0.1524 470 29.3 0.5331

510 68.2 0.1662 480 32.7 0.4854

520 64.1 0.1931

490 38.7 0.4122
530 65.1 0.1864

540 65.9 0.1837 500 47.6 0.3223

550 67.7 0.1694 510 58.2 0.2350

560 75.6 0.1214

520 80.2 0.0958
570 77.4 0.1112

580 85.7 0.0670 530 87.7 0.0570

590 90.2 0.0447 540 87.7 0.0570

600 91.5 0.0385

550 92.4 0.0343
610 92.1 0.0357

620 92.6 0.0333 560 93.3 0.0301

630 92.9 0.0319

640 93.4 0.0296

 Procedimiento
Lectura del espectrofotómetro: Longitud óptima de
la onda y % Transmitancia

Longitud Óptima de
Azosulfamida:
Realizamos dos tipos de análisis: 530 nm
Longitud óptima de
1. Determinación de la longitud Anaranjado de
óptima de onda para poder metilo: 460 nm
graficar las curvas espectrales Longitud óptima de
–Absorbancia vs Longitud de Permanganato:
onda– respectivas del 520 nm
permanganato y la heliantina
(Inorgánica vs Orgánica)
2. Determinación de la Lectura del espectrofotómetro: % Transmitancia
concentración óptima de la
muestra (verificar del mismo
modo la zona de trabajo).
Permite graficar la curva de
Ringbown.

1°Para poder comparar la forma de las curvas

espectrales entre dos sustancias de naturaleza
distinta: Inorgánica vs Orgánica. El procedimiento a
seguir fue el desarrollado en la primera práctica:

La sustancia es colocada, junto a un patrón –Agua–;

en el espectrofotómetro medimos la transmitancia
conforme aumentamos la longitud de onda. El punto
en el cual la transmitancia sea la más baja posible
será nuestra absorbancia más alta, es decir: La
longitud óptima de la onda nos otorga la absorbancia
más alta posible de la sustancia problema.
2° Si deseamos graficar la curva de Ringbown (la
que nos permite formar nuestra curva de
calibración) primero debemos realizar las disolución.
Prepararemos soluciones de una concentración
(C) desde 0.1 ug/ml, 0.2 ug/ml, 1 ug/ml, 2 ug/ml, 5
ug/ml, 10 ug/ml, 15 ug/ml, 20 ug/ml, 30 ug/ml, 200
ug/ml hasta 500 ug/ml a partir de la solución
estándar de aseptil rojo (Azosulfamida 5%).

Con las diluciones ya hechas, procedemos a realizar

las lecturas en el espectrofotómetro. Las lecturas
serán del % Transmitancia, nuestra labor consiste en
determinar la absortancia: Absortancia=100-%T. Para
luego graficar nuestra curva Absortancia vs
Log (C).

Preparamos cada concentración a

partir de la muestra estándar de
aseptil rojo. La forma en cómo se
procedió con las diluciones está
explicada en el presente informe.
Una vez que ya tenemos nuestras diluciones preparadas, podemos comenzar con las
lecturas de la transmitancia. La longitud de onda a utilizar será: La longitud óptima de cada
sustancia, 530nm para la azosulfamida y 460nm para la heliantina. Iremos añadiendo en
las cubetas del espectrofotómetro cada dilución unitariamente. El análisis de la
transmitancia será llevado a cabo en la longitud óptima. Nuestros datos serán acoplados en
las posteriores tablas.

A partir de la transmitancia leída estaremos en la facultad de poder graficar la Curva de

Ringbown (Absortancia vs Log [C]).

Curva de Ringbown: Absortancia vs

Concentración ~ Azosulfamida y
Azosulfamida
Heliantina
[μgml] %T Absortancia

0.1 parte
En esta 98.6 1.4
desarrollaremos la curva de Ringbown, la cual nos
permite encontrar la zona de trabajo y lo más importante: La
0.2
concentración97.8 2.2
óptima de la muestra. Anaranjado de metilo
0.4 96.7 3.3
*Cabe resaltar que nuestro grupo[μgml] %T las Absortancia
trabajó con diluciones de
la azosulfamida
0.6 96.0 4.0 0.2 74.4 25.6
0.8 94.4 5.6 0.3 95.7 4.3
1.0 93.0 7.0 0.6 69.7 30.3
1.5 84.7 15.3 0.8 69.7 30.3
2.0 85.1 14.9 1.5 90.8 9.2
2.5 84.2 15.8 3.0 35.4 64.6
3.0 78.8 21.2 3.5 30.7 60.3
3.5 75.1 24.6 4 12.2 87.8
4.0 75.6 24.4 5 5.5 94.5
5.0 71.9 28.1 6 3.1 96.9
6.0 66.1 33.9 10 0.0 100
8.0 57.7 42.3 15 0 100
 Azosulfamida: Sustancia estudiada
1. Tabla completa: Absortancia, Log C y % Transmitancia.

Azosulfamida
µg/mL mg/mL log C %T Absortancia
0.1 100 2 98.6 1.4
0.2 200 2.30103 97.8 2.2
0.1 100 2 96.7 3.3
0.6 600 2.7781513 96 4
0.8 800 2.90309 94.4 5.6
1 1000 3 93 7
1.5 1500 3.1760913 88.3 11.7
2 2000 3.30103 85.1 14.9
2.5 2500 3.39794 84.2 15.8
 3.5 3500 3.544068 75.5 24.5
4 4000 3.60206 75.6 24.4
5 5000 3.69897 71.9 28.1
6 6000 3.7781513 66.1 33.9
8 8000 3.90309 57.7 42.3
10 10000 4 50.7 49.3
15 15000 4.1760913 38.7 61.3
20 20000 4.30103 27.5 72.5
30 30000 4.4771213 11.5 88.5
40 40000 4.60206 6.4 93.6
60 60000 4.7781513 0.001 99.999

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

CURVA DE RINGBOWN: AZOSULFAMIDA

Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el

menor error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que
consiste en construir una gráfica de absortancia (100%-T) vs la
concentración.

La zona lineal corresponde al intervalo de concentraciones de mínimo

error, ∆ C/C, por lectura y el punto de inflexión corresponde al valor de:

100%-%T= 49.3; T=50.7; que corresponde al valor de mínimo error.

Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una

curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el
intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una
relación lineal entre absorbancia y concentración.
En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte
baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los
límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.

En la curva de Ringboom para la azosulfamida resulto como

concentración optima el valor de 6.4565 µg/mL así como la
concentración mínima cuantificada a 3.715 µg/mL y la concentración
máxima cuantificada a 11.2 µg/mL.

CURVA DE RINGBOWN: ANARANJADO DE METILO

La curva de Ringbom del Anaranjado de Metilo presenta una zona de trabajo

de concentraciones 1 a 5 ug/ml con las absortancias respectivas de 26.8 y
94.5 respectivamente. Además la concentración óptima es de 2.2 ug/ml. No
pudiendo comparar estos datos debido a que no encontramos información
bibliográfica sobre el tema.
BIBLIOGRAFIA

• Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición.

2007

• Química analítica instrumental I Precisión en

espectrofotometría. 2007. URL:
http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Documento_de_A
poyo:_Precision_en_espectrofotometria_2598.pdf

• Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un

método
espectrofotométrico.URL:http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/
ciencias/2001184/lecciones/Cap10/01_01_01.htm