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Universidad de Sonora
Departamento de Agricultura y Ganadería
Ingeniero Agrónomo
Tabla de Contenido
Metodología de trabajo
El manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica General para estudiantes de la carrera de
Ingeniero Agrónomo ha sido elaborado tomando en su mayor parte prácticas de los manuales elaborados por
los maestros Q. F. B. Eva Irma Vejar Rivera y M. C Jesús Rubén Gracilazo Pérez, fundadores del
Departamento de Químico-Biológicas. Consta de 11 prácticas que se contempla realizar en 13 sesiones de
laboratorio. Dado que el semestre consta de 16 semanas de actividades, deberán realizarse todas en tiempo y
forma y sobrará tiempo para aplicar una evaluación general y resolver cualquier duda. Si se realiza a conciencia
cada una de ellas demostrarás los principios establecidos en la clase teórica, aumentarás tu capacidad de
observación y adquirirás destrezas manuales con lo que tendrás una base sólida para continuar con materias
como Fisiología Vegetal, Nutrición Animal, Poscosecha de productos hortícolas y en general podrás
comprender el comportamiento de cualquier ser vivo, incluido tu mismo.
Para todas las sesiones de laboratorio los estudiantes deberán leer con anticipación la práctica y elaborar un
diagrama de flujo que incluya principalmente dibujos y evite el uso de textos donde plasmarás el procedimiento
paso por paso, este diagrama será revisado al entrar al laboratorio, si lo haces con cuidado te permitirá distribuir
rápidamente el trabajo entre los integrantes del equipo, realizar el experimento sin demora, y salir a tiempo
para que no te deje el camión.
Al final de cada práctica se revisará tu desempeño mediante la revisión de la siguiente lista de cotejo:
Si No
¿Asististe puntualmente?
El Reporte a elaborar deberá ser escrito en una libreta sin resorte. Esta libreta de laboratorio debe:
Especificar lo qué se hizo
Detallar lo que se observó
Ser comprensible para cualquier persona.
Deberán incluir los siguientes datos:
• Datos personales: Nombre y grupo del alumno *
• Nombre, número y fecha de realización de la práctica. *
• Objetivo *
• Listado de materiales y reactivos *
• Diagrama de flujo c/ fecha de revisado *
• Observaciones y Resultados con el formato incluido en el manual
• Discusiones y Conclusiones donde des una breve, pero crítica evaluación de tus resultados, así como
del éxito o no del experimento.
• Preguntas correctamente contestadas *
• Bibliografía de consulta *
• Comentarios personales
• Tabla de constantes físicas y datos de seguridad de los compuestos químicos utilizados y obtenidos.
Estos deberán incluir entre otros, los daños a la salud y al ambiente, precauciones durante su manejo,
así como la disposición final de los residuos.
*Son aspectos que puedes realizar antes de realizar la práctica para que no se te acumule el trabajo
Te deseo éxito en tus estudios y en todos los aspectos de tu vida. No dudes en acercarte a resolver cualquier
duda sobre la materia. Mi correo electrónico es merenteria@guayacan.uson.mx.
M. C. Ma. Eugenia Rentería Martínez
. Clasificación completa.
Es responsabilidad del alumno el consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de cada
una de las reacciones arriba mencionadas, antes de hacer la práctica. Al final de la práctica, deberá escribir un
breve resumen del fundamento de las reacciones. Y en la hoja de Datos Experimentales Obtenidos deberá
anotar todas sus observaciones y resultados. Esto se hará en todas las sesiones de laboratorio.
MATERIAL NECESARIO:
REACCION DE FEHLING
Con el vaso de precipitados de 600 ml., tripie y tela de asbestos, instale un baño de agua, y prenda su
mechero para calentar el agua hasta ebullición. Utilice agua destilada para que no se incrusten sales en el
vaso de precipitados. El agua no debe rebasar la mitad del vaso de precipitados puesto que ahí va a colocar
los tubos y el agua se derramaría
Para hacer eso utilice una de las pipetas de 5 ml. Tenga junto el vaso de precipitados de 100 ml. con agua
destilada, enjuague la pipeta dos veces después de haber pipeteado los carbohidratos.
3. Utilizando la segunda pipeta de 5 ml. agregue 5.0 ml. del reactivo de Fehling, ya preparado, a cada uno de
los cinco tubos. Enjuague inmediatamente la pipeta.
4. Cuando el agua del baño esté hirviendo, coloque los cinco tubos al mismo tiempo, dentro del vaso, todos al
mismo tiempo y anote el tiempo.
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5. Una vez que aparezca el precipitado característico de color rojo ladrillo, en la mayoría de los tubos (toma de
uno a tres minutos) saque del baño todos los tubos con ayuda de las pinzas y colóquelos en la gradilla. Si
algún tubo no ha dado el precipitado después de cinco minutos quiere decir que la reacción con el
carbohidrato de ese tubo es negativa.
6. Anote sus resultados en la ‘Hoja de Datos’. Los tubos con reacción positiva serán los que contienen
CARBOHIDRATOS REDUCTORES
7. Lave inmediatamente los tubos donde hubo precipitado o las manchas no se podrán quitar.
1. Repita los pasos dos y tres de la reacción anterior. No use los mismos tubos aunque ya estén lavados.
2. Agregue 5.0 ml. del reactivo de Barfoed ya preparado, a cada uno de los cinco tubos.
3. Coloque los cinco tubos al mismo tiempo en el agua hirviendo y anote el tiempo.
DISACARIDOS
5. Como opción para ver la utilidad de esta prueba, coloque una mezcla de Glucosa y Lactosa en un tubo de
ensaye, agregue el reactivo de Barfoed y llévelo al agua hirviendo. En cuanto aparezca el primer
precipitado, saque el tubo y filtre. El filtrado vuélvalo a colocar en agua hirviendo por unos diez minutos más
o hasta que aparezca un nuevo precipitado. De acuerdo a los resultados verá que esta reacción puede
detectar monosacáridos y disacáridos en mezcla.
2. Pipetee 1.0 ml. de Xilosa al tubo 1; 1.0 ml. de Glucosa al tubo 2 y 1.0 ml
de Fructosa al tubo 3. Recuerde que la reacción identifica
CETOHEXOSAS
Sabemos que de las muestras que tenemos para esta práctica solamente una contiene Cetohexosa por lo que
basta probar esa muestra y otras dos como controles negativos.
3. Agregue 5.0 ml. del Reactivo de Seliwanoff, ya preparado a cada uno de los tres tubos.
5. Observe la aparición del color y el tiempo. Aquellos tubos que sean positivos serán los que contienen
Cetohexosas.
REACCIÓN DE BIAL.
3. Agregue 5.0 ml. del reactivo de Bial, ya preparado a cada uno de los tres
tubos.
6. Anote sus resultados en la hoja de datos. Aquella muestra que haya dado la reacción positiva será la que
contenga carbohidrato
PENTOSA
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
Antes de usarse, mezcle las soluciones A y B en partes iguales, de acuerdo con la cantidad que se vaya a usar.
LA MEZCLA ES INESTABLE, pero las soluciones individuales son estables, así que no mezcle más de lo que
va a usar cada día.
EXPERIMENTO 1
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Reacción de Fehling
Reacción de Barfoed
Reacción de Seliwanoff
Reacción de Bial
Escriba brevemente el fundamento de las reacciones practicadas. Si es necesario consulte el libro de texto o
alguna otra bibliografía.
Reacción de Fehling:
Reacción de Barfoed:
Reacción de Seliwanoff:
Reacción de Bial:
CUESTIONARIO
1. Dibuje un modelo de pared celular vegetal donde muestre los polisacáridos que la forman.
2. Establezca las diferencias estructurales y funcionales entre pared celular y membrana celular
3. Investigue cómo cambia la composición de carbohidratos de la pared celular en mango y calabaza a
medida que estos van madurando.
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4. Mencione los carbohidratos que contienen las uvas y los melones y como se cuantifica el contenido de
éstos?
LECTURAS EXPERIMENTO 1
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Las siguientes lecturas están diseñadas para que los alumnos puedan fácilmente consultar todos los datos
necesarios para entender los ejercicios que practiquen en el laboratorio. Por eso también están divididas de
acuerdo a los mismos ejercicios.
Los más sencillos son los Monosacáridos que pueden ser Aldosas o Cetosas según que contengan
la función aldehido o cetona en sus moléculas. Según el número de carbonos serán triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas y heptosas. Correspondientemente habrá Aldotriosas, Aldotetrosa Aldopentosas y
Aldohexosas; o Cetotriosa, Cetotetrosas, Cetopentosas y Cetohexosas.
Si la molécula consta de unos pocos monómenos unidos en Unión Glucosídica, entonces será un
Oligosacárido. Disacárido, trisacárido, tetrasacárido… Si la molécula cuenta con cientos o miles de
monosacáridos unidos en unión glucosídica entonces tendremos a los Polisacáridos. Los Homopolisacáridos
constarán de un solo monómero repetitivo. Los Heteropolisacáridos, constarán de dos o, en contadas
ocasiones, más monómeros distintos en su molécula.
Todos los monosacáridos, aun si existen en forma cíclica, son reductores. Los disacáridos que tengan
el hidroxilo del Carbono Anomérico de alguno de los dos monómeros libre, también serán reductores, aunque
más lentamente, por ejemplo la Maltosa y la Lactosa. Pero aquellos que estén unidos por sus dos carbonos
anoméricos, como la Sacarosa, no serán reductores, a menos que se hidrolice la unión y queden libres los
monómeros. A medida que el número de monómeros aumenta, las características reductoras se van haciendo
más y más leves. De ahí que los polisacáridos, a pesar de tener su último monómero, con carbono anomérico,
potencialmente libre, en la práctica nunca son reductores. Pero si los polisacáridos se hidrolizan, entonces sí
mostrarán las características reductoras de sus monómeros constituyentes.
Reacción de Fehling
El hidróxido cuproso con el calor se convierte a Oxido cuproso que precipita dando un color rojo
ladrillo característico. Esto es lo que identifica a un carbohidrato como reductor.
Reacción de Barfoed
El carbohidrato reductor, al contacto con el reactivo da el característico precipitado de color rojo ladrillo. Los
monosacáridos reductores dan la reacción positiva en poco tiempo (de dos a cinco minutos), mientras que los
disacáridos reductores la dan positiva pero más lentamente (de cinco a diez minutos).
En una mezcla de monosacáridos y disacáridos reductores, bastará filtrar el primer precipitado que aparezca,
que corresponderá al monosacárido, y esperar la formación de un nuevo precipitado, que si existe,
corresponderá al disacárido.
Reacción de Seliwanoff
Esta reacción identifica carbohidratos Cetohexosas. Al reaccionar una cetohexosa , (fructosa es la más
común), con ácido clorhídrico, el carbohidrato pierde moléculas de agua, dando como resultado el 5-
hidroximetilfurfural. Esta molécula reacciona con el Resorcinol dando un complejo rojo intenso, que será
signo de la presencia de la cetohexosa. No es precipitado, sino complejo.
La reacción es muy rápida en cuanto a la formación del complejo. Lo que varía en cuanto a tiempo es
la formación del 5-hidroximetilfurfural. Las cetohexosas lo dan rápidamente, mientras que las aldohexosas lo
dan lenta y débilmente, por lo que esta reacción se considera más bien característica para identificación de
cetohexosas, y en concreto de Fructosa
Reacción de Bial
Identifica carbohidratos Aldopentosas. Al reaccionar una aldopentosa con Acido Clorhídrico, pierde
moléculas de agua y produce la sustancia conocida con el nombre de furfural. El furfural puede reaccionar
en medio ácido con el orcinol. Si en estas condiciones se agrega una pequeña cantidad de cloruro férrico, se
formará un complejo verde.
Las cetopentosas en estas condiciones dan un complejo de color rojo. Las cetohexosas y las
metilpentosas dan un complejo naranja, que al reposar producen un precipitado de color verde oscuro. Las
triosas y los ácidos 5-cetoaldónicos dan positiva la reacción, así como los ácidos urónicos, por lo que hay que
tener cuidado de que en la mezcla de reacción no existan estos compuestos si es que se quiere demostrar la
presencia de las aldopentosas.
Esta reacción se utiliza para identificar a los Acidos Ribonucleicos, puesto que las condiciones ácidas
hidrolizan al ácido nucleico y las ribosas libres darán positiva la reacción.
La presencia de hexosas no interfiere con la reacción, siempre que no haya calentamiento prolongado, en
cuyo caso las hexosas interferirán con la producción de un precipitado rojo.
Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos de cada una de las
manipulaciones que se practicarán aquí. En la hoja de datos deberá mencionar esos fundamentos.
MATERIAL NECESARIO
Además: Cada grupo de trabajo será responsable de traer al laboratorio por su cuenta, lo siguiente:
Una papa de tamaño mediano
Una navaja o pelador de papa
Un rayador de queso
Un pañuelo limpio de tejido no muy cerrado.
PROCEDIMIENTO
1. Pele una papa de tamaño mediano y ráyela con un rayador de queso de manera que la pulpa fina que se
obtenga caiga en el vaso de precipitados de 600 ml. (Esto debe hacerse lo más rápidamente posible para
evitar las reacciones de oscurecimiento).
2. Agregue agua destilada a la pulpa, más o menos el doble de su volumen y agite fuertemente por unos
minutos.
3. Con gaza doble, que puede proporcionar el laboratorio o con un pañuelo de tejido no muy cerrado filtre,
apretando si es necesario, hacia el vaso de precipitados de 250 ml. La parte gruesa que queda en el filtro,
y que es fundamentalmente celulosa, se descarta.
4. Deje unos minutos a que el filtrado se asiente. Una vez asentado descarte el agua sobrenadante y lave el
almidón agregando nuevamente suficiente cantidad de agua destilada y agitando por unos minutos. Se
deja asentar. La operación se puede repetir una vez más para obtener un almidón limpio.
5. Decante finalmente lo más posible de agua y extienda el Almidón en un vidrio de reloj mediano, y llévelo a
la estufa a 60 ° C. Mientras este almidón se seca, proceda a las siguientes manipulaciones, con el almidón
que le proporcione el Instructor del Laboratorio.
6. Una vez seca el almidón pulverícelo lo mejor posible y guárdelo en donde su instructor le indique.
GRANOS DE ALMIDÓN
OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO
1. Con en almidón que le proporcione su Instructor y utilizando su vaso de precipitados de 50 ml. haga una
suspensión de Almidón de aproximadamente el 2 % en agua destilada. (Serían más o menos 0.5 gr. en 25
ml. de agua.
3. Coloque sobre la tela de asbestos su suspensión de almidón para calentarla UN POCO, teniendo cuidado
de que no llegue a ebullición.
4. Con el agitador tome una gota de la suspensión y colóquela en el centro de un portaobjetos y añada una
gota de Lugol.
5. Ponga el cubreobjetos sobre la preparación y presione ligeramente para eliminar el exceso de agua. Seque
los bordes con un poco de papel filtro.
6. Observe la preparación al microscopio con el objetivo seco débil. Si es posible dibuje algunos de los granos
que observe.
TEMPERATURA DE GELATINIZACIÓN
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1. Con el almidón proporcionado por su Instructor haga una suspensión de Almidón al 5 % (1 gramo en 20 ml.
de agua destilada), en su vaso de precipitados de 50 ml.
2. Con su tripie, tela de asbestos y vaso de precipitados de 600 ml. instale un baño de agua, sin llenar
completamente el vaso de precipitados con el agua.
3. Con ayuda de una pinza para tubos de ensaye , cuando el agua del baño esté hirviendo, sostenga su vaso
de precipitados con la solución de almidón, dentro del agua a ebullición.
5. Cuando la suspensión cambie de aspecto, del normal a un aspecto gelatinoso, haga la lectura de la
temperatura.
COMPLEJO YODO-ALMIDÓN
1. Pipetee 5.0 ml. de la solución de Almidón soluble al 1 % (preparada de antemano por el Instructor), a un
tubo de ensaye de 13 x 100.
2. Agregue 3 gotas de solución de Yodo 0.1 N. Si el color del complejo es tenue, agregue una gota más. El
color del complejo debe ser de un morado oscuro.
3. Prenda el mechero. Tome el tubo de ensaye con pinzas y páselo lenta y repetidamente sobre la llama,
teniendo cuidado de que la boca del tubo apunte hacia donde no haya nadie, porque el contenido caliente
del tubo puede en algún momento saltar.
5. Lleve entonces el tubo de ensaye al agua corriente de la llave y anote el tiempo requerido para que
aparezca nuevamente el color.
5. Con una pipeta tome un poco de esa solución y coloque una gota de ella en el pozo número 1 de la placa
excavada y tres gotas en el tubo número 1 de la gradilla. Enjuague su pipeta con agua destilada.
6. Encienda el mechero y coloque el vaso de precipitados con la solución sobre la tela de asbestos para
calentarla hasta que hierva. El hervor debe ser suave. Si es necesario baje de intensidad la llama del
mechero.
7. A la gota que puso en el pozo 1, agréguele una gota de solución de yodo. Se debe observar el color azul
característico de la reacción positiva del yodo con el almidón.
8. Anote el tiempo en que la solución comienza a hervir. En ese momento tome con su pipeta otro poco de la
solución y coloque una gota en el pozo número 2 y tres gotas en el tubo número 2. Enjuague la pipeta.
9. Agregue inmediatamente una gota de solución de yodo al pozo número 2, y observe si la reacción del
complejo yodo-almidón comienza a hacerse débil o negativa.
10. A los dos minutos exactos de haber comenzado a hervir la solución repita la operación tomando un poco y
dejando una gota en el pozo 3 y tres gotas en el tubo 3. Agregue solución de yodo al pozo 3 y enjuague la
pipeta.
11. Esta operación se repite cada dos minutos hasta que la reacción yodo-Almidón sea negativa, es decir que
dé un color café característico del yodo y no el azul de complejo yodo-almidón. En ese momento se termina
el calentamiento de la solución.
12. Agregue 3 mililitros de la solución de Fehling a todos los tubos que recibieron gotas de la solución.
13. Con su vaso de precipitados, y usando agua destilada, prepare un baño de agua hirviendo. Cuando el agua
esté hiriviendo, coloque en él todos los tubos, procurando que no se derrame agua, para lo cual desde el
principio llene el vaso solamente hasta un poco más de la mitad.
14. Espere cinco minutos. Saque todos los tubos y colóquelos en su gradilla de acuerdo a su numeración.
Observe el grado de reducción por la cantidad de precipitado de Oxido Cuproso de color rojo ladrillo en
cada tubo.
PREPARACION DE REACTIVOS.
EXPERIMENTO 2
Observación al Microscopio
Temperatura de Gelatinización
Complejo Iodo-Almidón
1 _________ 1 ________
2 _________ 2 ________
3 _________ 3 ________
4 _________ 4 ________
5 _________ 5 ________
6 _________ 6 ________
7 _________ 7 ________
8 _________ 8 ________
9 _________ 9 ________
10 _________ 10 ________
Escriba brevemente el fundamento científico de cada uno de los procedimientos efectuados en esta práctica. Si
es necesario consulte el libro de texto.
Observación al microscopio:
CUESTIONARIO
1. ¿Se podría determinar la presencia de Glucosa y Almidón que estuviesen mezclados en el mismo tubo de
ensaye? ¿Cómo?
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2. ¿En qué condiciones el almidón daría la prueba de Fehling positiva y en qué condiciones daría la prueba de
Seliwanoff positiva?
3. ¿Para qué se agrega solución de Lugol a la preparación del almidón cuando se va a observar al
microscopio?
4. ¿Qué otras maneras hay de hidrolizar al Almidón? Explique con detalle y con precisión.
5.¿Qué tipo de hidrólisis de almidón llevamos a cabo en el sistema digestivo cuando comemos alimentos con
almidón? Explique detalladamente.
LECTURAS
EXPERIMENTO 2
Los Polisacáridos son polímeros de carbohidratos sencillos unidos entre sí por uniones glucosídicas.
Normalmente contienen un gran número de monómeros, que pueden ser de un tipo, o de dos o más tipos
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distintos unidos siempre en forma alternada. Por lo general la molécula tiene un solo término reductor y
muchos términos no reductores, por lo que en sí la molécula no muestra las características reductoras. Las
uniones glucosídicas pueden hidrolizarse sea con ácido mineral o con enzimas.
Entre los homopolisacáridos importantes existen dos, que pertenecen a los vegetales, la celulosa y el
almidón, y uno que es característico de los animales, el glucógeno.
Los almidones se presentan como reserva de carbohidratos en tubérculos tales como la papa, en los
granos de semillas, en las frutas y en los rizomas de las plantas. El almidón se concentra en unas formaciones
llamadas granos, que pueden ser esféricos u ovalados, en forma de lente o en forma irregular.
El almidón puede estar organizado en capas concéntricas en los granos, lo que es muy común en los
almidones de los cereales, o en capas excéntricas como en el almidón de la papa. En ocasiones es difícil
observar estas capas, pero si los granos de almidón se sujetan a un ligero calentamiento, se facilita un tanto la
observación de estas capas al microscopio.
La forma de los granos es una característica específica de los distintos almidones. El almidón en los
granos contiene de 14 a 19 % de agua, de la cual un 10 % está unida químicamente. Las moléculas de
almidón hidratadas se arreglan en forma de un enrejado cristalino, pero esta estructura se pierde y se hace
amorfa cuando se expele el agua de hidratación, por calentamiento.
El almidón está formado por una mezcla de moléculas de Amilosa y Amilopectina. Ambas fracciones
son mezclas de moléculas de diferentes tamaños. Se han identificado amilosas con pesos moleculares entre
4,000 y 400,000. Estas moléculas de amilosa están formadas exclusivamente por monómeros de glucosa,
unidos en union glucosídica α-1-4, dando una macromolécula linear. La molécula de amilopectina es mucho
mayor de tamaño y presenta ramificaciones. Su peso molecular varía de 50,000 1,000,000. Son también
polímeros formados exclusivamente de Glucosas. Las uniones para la parte linear de la molécula son también
α-1-4, pero las uniones para formar los puntos de ramificación son α-1-6. Se calcula que las moléculas de
amilopectina tienen un 5 % de ramificaciones, o sea que hay una ramificación después de cada más o menos
20 moléculas de glucosa, en forma linear.
Suponiendo el peso molecular de la glucosa de 180 y restando el peso de una molécula de agua por
cada unión glucosídica, será característico de la molécula de amilosa tener entre 25 y 2,500 monómeros de
glucosa, y para la amilopectina de 300 a 6,000 monómeros, lo cual corresponde a unas 15 a 300
ramificaciones.
La papa es un tubérculo que almacena gran cantidad de almidón, por lo que es muy sencillo obtenerlo
de esa fuente. Basta con raspar la papa para hacer una pulpa fina y eliminar por filtración la parte gruesa
insoluble de Celulosa, para obtener una buena suspensión de granos de almidón.
Observación al microscopio
Los granos de almidón son de tamaño microscópico, por lo que hay que hacer una preparación y
llevarla a observación al microscopio. Para observarlos mejor y, si es posible, hacer visibles sus capas
excéntricas se añade un poco de Lugol, que es una mezcla de Yodo con Ioduro de Potasio en agua, lo cual va
a teñir de azul los granos de almidón.
Temperatura de Gelatinización
El material de los granos de almidón es una mezcla de sustancias diferentes con estructuras y
propiedades distintas. Cuando el Almidón se trata con agua hirviendo, el almidón de unas partes del grano se
solubiliza y se sale del grano, quedando otra parte del almidón que permanece insoluble. Esta porción
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insoluble de los granos, absorbe agua y se hincha para formar una esfera elástica, y toda la masa se convierte
en una pasta de almidón. Este proceso de gelatinización sucede siempre a una temperatura definida.
No confundir almidón soluble con amilosa, ni almidón insoluble con amilopectina. Eso no es correcto.
Ambos almidones, el soluble y el insoluble son mezclas de amilosa y amilopectina.
La obtención de una sustancia colorida al reaccionar el yodo con el almidón se cree que se debe a la
formación de un complejo de coordinación entre las micelas de Almidón y el Yodo. Estas micelas están
formadas por cadenas polisacáridas enrolladas en hélice. El yodo puede colocarse centralmente en estas
hélices. El color depende del largo de la sección linear de la molécula del almidón. Por eso la amilosa pura,
que es el polisacárido exclusivamente linear dará con el yodo el color más intenso de un azul profundo.
La amilopectina dará un color azul violeta mientras que el glucógeno que es la molécula más
ramificada dará un color café rojizo. La celulosa no da reacción de color con el yodo. Las dextrinas formadas
por hidrólisis del almidón dan un color que varía de café rojizo a la ausencia de color, dependiendo del tamaño
de la molécula.
El color disminuye cuando la temperatura aumenta, hasta desaparecer por completo, y se intensifica al
bajar nuevamente la temperatura. Esto indica la formación y destrucción de los complejos de coordinación
formados entre el yodo y el almidón. La reacción del yodo con el almidón nos sirve para detectar el grado de
hidrólisis del almidón.
El almidón es la reserva alimenticia de las plantas, pero las células para la obtención de su energía no
pueden metabolizar el almidón como tal, sino que es necesario que lo degraden por hidrólisis hasta sus
constituyentes monosacáridos o glucosas, para que estas puedan metabolizarse en los caminos energéticos.
Las células llevan al cabo la hidrólisis a través de procesos enzimáticos, pero en el laboratorio se puede llevar
al cabo con ácido mineral, obteniendo el mismo resultado.
El curso de la hidrólisis se puede seguir de dos maneras. O por la desaparición de la reacción con el
yodo a medida que avanza la hidrólisis, o por la formación de azúcares reductores. Mientras más hidrolizado
esté el almidón, más azúcares reductores habrá, y menor será la reacción con el yodo hasta hacerse totalmente
negativa.
Revisión de Conceptos
. Lecitinas y Cefalinas
. Colesterol
. Agentes Emulsificantes
. Fracción Insaponificable
. Fracción Saponificable.
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Es responsabilidad de alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de
las distintas manipulaciones de la práctica, antes de hacer la práctica. En la Hoja de Datos, deberá
mencionar esos fundamentos.
La práctica puede llevarse al cabo en dos sesiones, y en la segunda obtener el colesterol y hacer la prueba de
Liebermann-Burchard.
MATERIAL NECESARIO
PROCEDIMIENTO
OBTENCIÓN DE LA LECITINA
1. Rompa el huevo, separe la yema y vacíela en un Erlenmeyer de 250 ml. Hágalo con cuidado, de
preferencia en el lavabo, procurando siempre la limpieza. La clara se descarta.
2. Añada 50 ml. de Alcohol Etílico y 25 ml. de Eter. Tape el Erlenmeyer y agite con cuidado durante unos dos
minutos, destapando de tiempo en tiempo para desalojar cualquier presión que pudiera desarrollarse. Deje
reposar la mezcla por 10 minutos, agitando suavemente de tiempo en tiempo.
3. Filtre sobre papel filtro Whatman 1, humedecido con Etanol y doblado en la forma de “zig-zag” (en inglés
“fluted”). Cheque con el Instructor para saber cómo se dobla ese papel.
4. Pase el residuo que queda en el papel filtro a otro Erlenmeyer y añada 10 ml. de Etanol y 5 ml. de Eter.
Agite suavemente y deje reposar por cinco minutos.
5. Filtre nuevamente esta segunda extracción y combine los filtrados. El residuo se descarta. Disponga de él
en el lugar apropiado.
6. Coloque el Erlenmeyer con la mezcla de filtrados sobre una de las “Planchas Calientes”, del laboratorio,
donde le indique su Instructor.
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7. Esté pendiente a que se la haya evaporado todo el solvente y solo quede una pasta verdoso-amarillenta
que burbujee un poquito. No debe proseguir calentando pues se quemará la preparación y será difícil
seguir con el procedimiento.
9. Prepare un vaso de precipitados de 100 ml, con 30 ml. de Acetona. Lentamente y con agitación suave solo
alrededor del centro del vaso de precipitados vacíe la solución del Erlenmeyer hacia el vaso con Acetona.
Siga agitando con cuidado hasta que las partículas de Lecitina cruda precipiten, se adhieran entre sí y
formen una bolita alrededor del agitador.
En ocasiones la Lecitina precipita pero no se adhiere. No importa.
10. Filtre para separar la Lecitina. Guarde el filtrado para usarlo en la segunda parte de la práctica. Puede
observar la sedosidad de la lecitina obtenida. Después de lo cual se descarta, pues ya no se usará más.
Lo que aprendió en esta parte es que:
La Lecitina es insoluble en Acetona
Donde PRECIPITA
1. Coloque el filtrado de la sección anterior en un vaso de precipitados de 250 ml. y colóque el vaso en la
plancha caliente que le proporcione su Instructor. Deje que se haga una pasta, pero cuidando de que se
llegue a resecar totalmente.
2. Con mucho cuidado agregue 15 ml. de una solución de Potasa Alcohólica al 10 %, agite bien y vuelva a
colocar la preparación en la plancha caliente, hasta que la solución se concentre a sequedad.
3. Deje que se enfríe la preparación. Añada 50 ml. de Eter y agite bien. Filtre por si hay algún precipitado de
jabón.
5. Añada 5 ml. de Alcohol etílico y caliente por unos dos minutos. Transfiera la solución a un tubo de ensaye
7. Transfiera el sobrenadante a otro tubo de ensaye. Ese sobrenadante contiene el Colesterol. Ahora añada
gota a gota agua destilada a la solución. Comenzará a precipitarse el colesterol. Siga añadiendo agua
hasta que ya no aparezca más precipitado.
9. El colesterol cristalino estará en el fondo del tubo de ensaye. Decante para eliminar el líquido, y deje secar
los cristales de Colesterol. Puede utilizarlos para la siguiente parte de la práctica. Lo que en esta parte
aprendió es que:
2. Si obtuvo buenos cristales de colesterol en su sección anterior, agréguelos a uno de los tubos. Al otro
agréguele 10 a 15 miligramos de Colesterol puro que le proporcione su instructor.
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4. Añada 1.0 ml. de Anhidrído Acético a cada uno de los dos tubos.
5. Con mucho cuidado agregue dos o tres gotas de Ácido sulfúrico Concentrado a cada uno de los dos
tubos.
6. Agite suavemente y observe la aparición de color. Deje reposar y observe el color a los dos, cinco y diez
minutos para notar algún cambio de color en la reacción.
7. Anote todos sus resultados en la Hoja de Datos. En esta parte aprendió que la principal reacción para
cuantificar el colesterol es:
La reacción de
Liebermann-Burchard
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
PRIMERA PARTE
Alcohol Etílico……………….. 2 litros
Eter Etílico…………………….1.5 litros
Acetona………………………. 1 litro
SEGUNDA PARTE
Alcohol Etílico………………..300 ml.
Eter Etílico…………………… 1 litro
Cloroformo Anhidro…………..200 ml.
Anhidrido Acético…………….100 ml.
Äcido Sulfúrico Concentrado …50 ml.
Colesterol Puro………………..100 miligramos.
EXPERIMENTO 5
Obtención de la Lecitina
Fundamento del procedimiento hasta la obtención de la Lecitina:
Reacción de Leibermann-Burchard
Fundamento de la reacción
Cuestionario:
2. ¿Qué quiere decir que las Lecitinas puras sean buenos agentes emulsificadores?
5. ¿Por qué en la obtención del colesterol se usa KOH disuelto en alcohol y no disuelto en Agua?
6. Es muy importante que consulte en sus libros y tenga claros los modelos de los Fosfolípidos y
colesterol, para entender sus propiedades de anfotericidad y sus características de orientación
sobre todo en la estructura de las membranas biológicas. Anote las estructuras de estos lípidos.
LECTURAS EXPERIMENTO 3 y 4
Lípidos son aquellas sustancias orgánicas extraíbles de tejidos animales o vegetales, por medio
de solventes orgánicos como Éter, Cloroformo, Tetracloruro de Carbono, Benceno, etc.
Los lípidos, como grupo, son muy insolubles en agua. Bioquímicamente hablando, son sustancias de
suma importancia, en primer lugar porque constituyen formas de almacenamiento de energía, y en segundo
lugar, porque forman parte de estructuras celulares, principalmente de todo tipo de membrana biológica.
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Los lípidos extraídos de material biológico representan una gran variedad de moléculas,
estructuralmente diferentes, pero que comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgánicos, llamados
por eso, solventes de las grasas. Entre los lípidos existen moléculas no polares, como los triacilgliceroles, o
triglicéridos, y moléculas polares como los Fosfoglicéridos, o Fosfolípidos, y los Esfingolípidos, y moléculas
de tipo terpenoide los Esteroides, los Terpenos y algunas Vitaminas.
No existe clasificación de lípidos, aceptada universalmente, pero una de las más comunes es la que los
divide en: Acidos Grasos, Triacilgliceroles, Fosfoglicéridos y Lípidos no fosforilados, siendo esta última una
categoría heterogenea que incluye: Gangliósidos, Cerebrósidos, Sulfolípidos, Proteolípidos, Esteroides,
Terpenos y Eicosanoides o Prostaglandinas. Hay que notar que los nombres genéricos de los grupos de
lípidos pueden variar de acuerdo a diferentes autores.
Es muy difícil, si no imposible, el separar cuantitativamente, por extracción con solventes orgánicos, a
todos los lípidos de un tejido, por ejemplo con Etanol-Eter, o con Etanol-Eter-Cloroformo. Unos lípidos son más
solubles en un solvente y otros en otro.
Entre los Fosfolgicéridos más comunes, tenemos a los tres derivados del Acido Fosfatídico, a saber:
Fosfatidil Colina, Fosfatidil Etanolamina y Fosfatidil Serina. A los Fosfatidil Colina se les conoce con el nombre
genérico de Lecitinas. Existen varias lecitinas dependiendo de los dos ácidos grasos que contengan
esterificados en los carbonos alfa y beta del glicerol.
Las Lecitinas son moléculas polares que existen en forma de sales internas o zwiteriones, ya que
contienen la carga negativa del Acido Fosfórico, y la carga positiva del grupo trimetilamino de la colina. El pH
isoeléctrico de una Lecitina pura es generalmente de 6.7 o un poco mayor, lo cual concuerda con su estructura
anfótera.
Las lecitinas puras son sustancias blancas de aspecto grasoso, que cuando se exponen a la luz y al
aire toman una coloración café, debido a la autooxidación y descomposición. Son solubles en los solventes
ordinarios de las grasas, excepto en Acetona. Esta propiedad se emplea para su aislamiento. Son
higroscópicas y se mezclan bien con el agua formando soluciones coloidales nebulosas.
La identificación de la lecitina puede hacerse por saponificación, para separar los Acidos Grasos,
hidrólisis para separar la Colina y después probar para presencia de Colina.
En el reino animal el esteroide más abundante es el Colesterol. El colesterol no se precipita del eter
por la Acetona, y como es insaponificable, puede extraerse con eter, después del tratamiento con hidróxido de
potasio.
El colesterol, generalmente cristaliza como placas rómbicas blancas. No tiene olor ni sabor. Si se
expone a la luz y al aire, se oxida lentamente, formando una mezcla de productos que bajan su punto de fusión
y cambian sus reacciones de solubilidad. Es insoluble en agua, ácidos y álcalis. Es un poco soluble en
soluciones jabonosas y todavía más solubles en soluciones de ácidos biliares. Es muy soluble en Eter,
Benceno, Cloroformo, Eter de Petroleo, Disulfuro de Carbono y Acetona. Sus principales propiedades
químicas se relacionan con su grupo hidroxilo secundario y su doble ligadura.
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A su vez se llamará Fracción saponificable, al conjunto de sustancias que después del tratamiento
de saponificación se vuelven solubles en agua e insolubles en eter. Esta última fracción contiene
principalmente jabones y ésteres de ácidos grasos, mientras que la fracción insaponificable la componen
principalmente alcoholes de alto peso polecular, Esteroides y Terpenos.
En la yema del huevo se encuentran las lecitinas en gran abundancia y además el colesterol en
suificiente cantidad para hacer su aislamiento y detección fácil.
Separada la yema, se extraen los lípidos con solventes orgánicos. Tal vez la mejor mezcla de
solventes es Ethanol-Eter al 2:1. Las lecitinas una vez extraídas por los solventes orgánicos, se precipita
fácilmente agregando Acetona. Una vez precipitadas las lecitinas en soluición queda el colesterol junto con
otras sustancias de menor concentración. Si entonces se hace una saponificación se separa la fracción
saponificable y queda la fracción insaponificable, donde viene el colesterol. El colesterol entonces se precipita
en forma cristalina agregando agua.
Reacción de Liebermann-Burchard
Las reacciones de color de los esteroles se deben a una dehidración preliminar para formar dienos,
principalmente el 3,5-Colestadieno o el 2,3-colestadieno, que se polimerizan a dímeros y trímeros. Entonces el
Colestadieno, y sus polímeros reaccionan con el Acido Sulfúrico para formar Acidos Sulfónicos, que pueden
representar productos intermediarios o finales de la reacción, se deben a los diversos pasos del proceso, por lo
que se requiere de 15 a 20 minutos para que se desarrolle completamente el color típico verde azulado
oscuro característico, que puede incluso cuantificarse. Para esta reacción se requieren condiciones
completamente anhidras.
PRACTICA 5: REACCIONES DE COLOR PARA AMINOÁCIDOS
Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos en que se
basa cada una de las reacciones arriba mencionadas, antes de hacer la práctica. En la Hoja de Datos deberá
mencionar esos fundamentos.
MATERIAL NECESARIO:
Además: Es responsabilidad de cada grupo traer un poco de hielo que se necesitará para la última reacción.
Se pueden juntar dos o tres grupos y entre ellos traer una bolsa de hielo.
PROCEDIMIENTO
1. Con su mechero, tripie, tela de asbestos y el vaso de precipitados de 250 ml. prepare un baño de agua
hirviendo. No llene de agua totalmente el vaso de precipitados sino más o menos a la mitad. Use agua
destilada.
2. Con ‘masking tape’, o con plumón graso, titule sus siete vasos de precipitados de 50 ml. con los
nombres de las muestras que van a contener y que son: Albúmina, Alanina, Tirosina, Triptófano,
Aspártico, Arginina y Gelatina.
3. Con los vasos así titulados vaya a la mesa de reactivos y tome más o menos 15 ml. de cada una de las
muestras. Estas soluciones estarán en su mesa de trabajo para facilitar la práctica. Si al final algo sobrara
se podrá regresar al frasco original, teniendo mucho cuidado de identificar bien las sustancias.
4. Coloque en su gradilla 7 tubos de ensaye e identifíquelos de alguna manera con los nombres de las
sustancias que va a probar (puede usar una hoja aparte para la correcta identificación de las sustancias).
5. Pipetee 3.0 ml. de cada una de las muestras a sus correspondientes tubos. Cuide de no perder la
identificación de las muestras. Las muestras las tiene ya en sus vasos de precipitados en su lugar de
trabajo.
6. Con papel indicador, cheque el pH de las muestras. Si no está neutro, ajústelo con mucho cuidado.
7. Añada 1.5 ml. de la solución de Ninhidrina al 0.1 % a cada uno de los siete tubos.
8. Cuando ya esté hirviendo el agua en el baño que preparó coloque ahí los siete tubos al mismo tiempo y
déjelos unos minutos. Vaya sacando los tubos del baño de agua hirviendo a medida que vayan dando la
reacción positiva. Si algún tubo después de 10 minutos no ha dado la reacción positiva, sáquelo y
considere en ese tubo una reacción negativa.
9. Observe el color desarrollado y anote en su ‘Hoja de Datos’, las características de tiempo y color de la
reacción para cada tubo. La reacción que en esta parte ha practicado es la:
31
Reaccion de la
Ninhidrina.
1. Coloque en su gradilla 4 tubos de ensaye y numérelos o identifíquelos de acuerdo a las muestras que va a
probar, que son: Tirosina, Alanina, Albúmina y Gelatina.
3. Añada 5 gotas del Reactivo de Millon a cada uno de los cuatro tubos.
4. Coloque los tubos en el baño de agua hirviendo y déjelos por cinco minutos.
5. Saque del baño de agua hirviendo los tubos y observe el color desarrollado en algunos de los tubos.
Identifíque las muestras que estaban en los tubos que dieron reacción positiva.
6. En su ‘Hoja de Datos’ anote sus observaciones y resultados. Lo que acaba de realizar es la prueba
llamada:
Reacción de
Millon.
Reacción Xantoprotéica
1. Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye y numérelos o identifíquelos de alguna manera con los
siguientes nombres: Tirosina, Triptófano, Alanina, Albúmina y Gelatina.
3. Con mucho cuidado añada a cada uno de los cinco tubos 1.0 ml. de Acido Nítrico concentrado (incoloro).
4. Lleve los tubos al baño de agua hirviendo y déjelos ahí por cinco minutos.
5. Saque los tubos de ensaye del baño de agua hirviendo y enfríelos en agua corriente.
6. Con sumo cuidado, resbale lentamente con una pipeta, por la pared de cada tubo, 2.0 ml. de Hidróxido de
Amonio Concentrado. NO AGITE.
8. Anote sus observaciones en su ‘Hoja de Datos’. La prueba que acaba de demostrar es la:
Reacción
Xantoprotéica
Reacción de Sakaguchi
1. Prepare un baño de hielo, poniendo hielo picado en su vaso de precipitados de 600 ml.
2. Coloque en ese baño de hielo 3 tubos de ensaye numerados o identificados como: Aspártico, Arginina,
Albúmina.
4. Añada 1.0 ml. de Hidróxido de Sodio al 10 % a cada uno de los tres tubos.
5. Añada 2.0 ml. de solución de Alfa-Naftol al 0.02 % a cada uno de los tres tubos.
6. Añada 1.0 ml. de Hipobromito alcalino a cada uno de los tres tubos.
7. Después de un minuto añada 1.0 ml. de solución de Urea al 40 % (Para destruir el exceso de Hipobromito).
Mezcle bien por inversión del tubo.
9. Anote en la ‘Hoja de Datos’, sus observaciones y resultados. Lo que acaba de practicar es la prueba de la:
Reacción de
Sakaguchi.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Nota: Si alguno de los aminoácidos no se disuelve bien en Agua Destilada, por ejemplo la Tirosina, agregue un
poquito de ácido Clohídrico y calor.
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EXPERIMENTO
Reacción de la Nimhidrina
Reacción de Millon
Reacción Xantoprotéica
Reacción de Sakaguchi
Escriba brevemente el fundamento de las reacciones practicadas. Si es necesario consulte el libro de texto, o
pida a su Instructor le indique donde puede encontrarlos.
Reacción de la Ninhidrina
Reacción de Millon
Reacción Xantoprotéica
Reacción de Sakaguchi
CUESTIONARIO.
3.- En sus cursos de Química Inorgánica, ¿recuerda haber tocado ácido Nítrico? ¿Que pasó y qué
reacción era?
36
LECTURAS EXPERIMENTO 5
La hidrólisis completa de las proteínas da como resultado una mezcla de los 20 aminoácidos
componentes de las proteínas. Con excepción de Prolina, todos los aminoácidos, como su nombre lo indica,
tienen un grupo funcional ácido y un grupo funcional amino, los dos grupos unidos al mismo carbono α de la
molécula. Por eso se dice que los aminoácidos son compuestos α-amino-α-carboxílicos.
Todos los aminoácidos, excepto Glicina, poseen al menos un átomo de carbono asimétrico, y
químicamente pueden existir en la forma D (dextro) o en la forma L (levo), o en mezcla racémica. Se sabe que
la configuración de los grupos asimétricos de los aminoácidos de plantas y animales es la misma que la del L-
Gliceraldehido, por lo que se considera mque todos los aminoácidos que forman parte de las proteínas en
plantas y animales están en configuración L.
Todos los aminoácidos tienen varias reacciones en común. Son aquellas que se llevan al cabo en el
grupo amino, o en el grupo carboxilo o en ambos. Además, aquellos aminoácidos que contienen cadena lateral
con un grupo reactivo, podrán sobrellevar reacciones específicas para ese grupo particular. Tales reacciones
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son de interés, primero porque permiten la detección y estimación de algunos aminoácidos en particular, y
segundo poraue esas reacciones permiten modificar a las proteínas químicamente.
En general, los aminoácidos son fácilmente solubles en agua, algo solubles o insolubles en alcohol y
totalmente insolubles en eter. La Tirosina, en particular, es muy poco soluble en agua fría, aunque aumenta su
solubilidad en agua caliente. La Cisteína es difícilmente soluble tanto en agua fría como en caliente. La Prolina
es soluble en alcohol y eter.
Los aminoácidos son solubles en ácidos y bases diluidas, en las que forman sales de aminoácidos.
Pero, como siempre, la Tirosina y la Cisteína tienen características contrarias, o sea en este caso de solubilidad
en ácidos o bases diluidas, la Tirosina es poco soluble y la Cisteína insoluble.
Reacción de la Ninhidrina
Esta reacción es de bastante importancia, pues es universalmente empleada para detectar cualitativa
y cuantitativamente a los aminoácidos. Para los aminoácidos esta es la unica reacción de color,
verdaderamente importante.
La ninhidrina es un agente oxidante poderoso y lleva al cabo la deaminación oxidativa de los grupos α-
amino, liberando amoniaco, bióxido de carbono y el correspondiente aldehido, asi como la forma reducida de la
ninhidrina. El amoniaco entonces, reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninhidrina
reducida para dar una sustancia de color azul violeta, que presenta un máximo de absorción a 570
nanómetros. Como esta absorción es casi una función linear de la cantidad original de los grupos amino, esta
reacciónsirve para estimar cuantitativamente las aminas primarias, y si no hay compuestos que interfieran,
también sirve para determinar cuantitativamente a los aminoácidos.
Es una reacción general dada por aminas primarias cuyo carbón alfa posea un átomo de hidrógeno.
Por eso las proteínas o derivados proteicos pueden dar positiva esta reacción. Por otro lado la evolución de
bióxido de carbono se podría seguir manométricamente como una estimación segura de la cantidad de los
aminoácidos presentes en la muestra. Esto es mucho más difícil y normalmente ya no se hace.
En el caso de los iminoácidos como la Prolina, el producto que se forma tiene color amarillo, con un
máximo de absorción de 440 nanómetros.
Reacción de Millon
Esta reacción, llamada también de Hofmann, es específica para determinar Tirosina. De hecho lo que
se determina son los grupos hidroxifenilos que puedan nitrarse fácilmente. El reactivo es una solución de
Nitrato Mercúrico con Acido Nítrico. El color rosa rojo que se forma al reaccionar la Tirosina con el reactivo,
se cree que se debe a un complejo Mercúrico con los derivados nitrofenol.
Cuando se añade el reactivo a una solución proteica, se forma primero un precipitado blanco, que
corresponde a la proteína coagulada por el calor, pero si la proteína contenía Tirosina, ese coágulo se pondrá
de color rosa rojo al prolongar un poco el calentamiento.
Si la solución que se prueba es alcalina, tendrá que neutralizarse primero con un poco de clorhídrico,
pues de lo contrario se precipitaría el mercurio del reactivo. Los cloruros interfieren con la reacción,
probablemente porque el ácido nítrico forma cloro libre que destruye el compuesto colorido.
Reacción Xantoproteica
La reacción es debida a la nitración del anillo bencénico con el ácido nítrico concentrado, para dar
productos de color amarillo, que se tornan anaranjados al añadir álcali, debido a la formación de sales. En las
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condiciones del experimento solo la Tirosina y el Triptófano darán positiva la prueba. La fenilalanina no por
que es más difícil de nitrar, para lo cual requeriría ácido sulfúrico como catalizador.
Si se prueba una solución de proteína que contenga Tirosina o Triptófano, se formará primero un
precipitado blanco al añadir el nítrico concentrado. Al calentar, ese precipitado se vuelve amarillo, y si la
solución se hace alcalina, el precipitado finalmente se torna anaranjado.
Las manchas amarillas que aparecen en la piel después del contacto con ácido nítrico se deben
precisamente a la reacción xantoproteica del nítrico con los aminoácidos de las proteínas de la piel.
Reacción de Hopkins-Cole
Los derivados Indol, dan productos de condensación cuando se tratan con aldehidos aromáticos en
presencia de ácido sulfúrico o clorhídrico. El aminoácido Triptófano contiene un grupo indol y por eso la
reacción es específica para Triptófano.
Cuando se agrega el reactivo a una solución que contenga Triptófano o una proteína con triptófano, y
lentamente se añade una capa de sulfúrico concentrado, se formará un anillo de color violeta en la interfase
de los líquidos.
Proteínas que no contengan Triptófano, como la gelatina, darán negativa la prueba. Se desconoce la
naturaleza de los productos que se forman. El tirptófano puro no da la reacción a menos que contenga indicios
de iones férricos o cúpricos. Los cloratos, nitratos, nitritos y cloruros en exceso impiden la reacción.
Reacción de Sakaguchi
Es una reacción de los compuestos que contengan grupo Guanido o guanidino. De ahí que sea una
indicación de la presencia de Arginina libre p de proteínas que contengan Arginina. LA prueba consiste en
tratar la muestra con Alfa-Naftol e hipoclorito de sodio o hipobromito de sodio, con lo cual se desarrollará un
color rojo intenso. El desarrollo del color se altera o se previene por completo por la presencia de amino,
histidina o triptófano. La arginina libre da la prueba positiva aun a concentraciones tan bajas como de 4
microgramos por mililitro.
Revisión de Conceptos
El alumno debe tener claras las
. ‘Salting out’ distintas formas que hay de
. Precipitación diferencial precipitar a las proteínas y sus
. Carga de las proteínas usos.
. Punto Isoeléctrico.
. Formación de sales.
. Solventes orgánicos.
Es responsabilidad del alumno el consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de las
diversas formas de precipitar a las proteínas, así como los fundamentos de la reacción del Biuret. En la ‘Hoja
de Datos’ deberá mencionar esos fundamentos.
MATERIAL NECESARIO
PROCEDIMIENTO
1. Rompa un huevo y separe la yema de la clara. Descarte la yema y vacíe la clara en un vaso de
precipitados de 250 ml.
2. Agite suavemente la clara. No agite vigorosamente pues provocaría la producción de espuma, cosa que no
es recomendable. (Toda solución proteica si se agita produce espuma. Si la proteína es enzima se
desnaturaliza):
3. Filtre a través de gaza doble o de un pañuelo limpio de tejido no muy cerrado. Puede filtrar directamente a
una probeta para calcular la cantidad de filtrado que se obtuvo.
4. Mida el volumen de filtrado obtenido y vacíelo a otro vaso de precipitados de 250 ml. Añada un volumen
igual de una solución saturada de Sulfato de Amonio. Agite suavemente y deje reposar por unos 10
minutos.
5. Filtre a través de papel filtro ordinario. El precipitado contiene la ovoglobulina y el filtrado contiene la
ovoalbúmina todavía en solución.
6. Disuelva este precipitado en un vaso de precipitados de 100 ml. añadiendo 50 ml. de Cloruro de Sodio al 1
%
7. Al filtrado, que ya está en solución al 50 % de Sulfato de Amonio, agréguele Sulfato de Amonio sólido para
llevarlo al 100 % de saturación. Se mide la cantidad de filtrado y se calculan los gramos de sulfato de
amonio que hay que añadir sabiendo que por cada 100 ml. de filtrado habrá de añadir 37.5 gramos. Agite
suavemente para que se disuelva bien el sulfato de amonio. Deje reposar unos 10 minutos. Se precipita la
ovoalbúmina.
9. Disuelva este nuevo precipitado en otro vaso de precipitados de 100 ml. añadiendo 50 ml.de Cloruro de
Sodio al 1 %.
10. Conserve estas soluciones para hacer la siguiente reacción. Lo que acaba de hacer es la:
Precipitación de la
Ovoalbúmina y la
Ovoglobulina por
Salación
40
3. Pipetee 2.0 ml. de solución de ovoalbúmina al tubo número 2 y 2.0 ml. de solución de ovoglobulina al tubo
número 3. (Estas son las soluciones que obtuvo en la primera parte).
4. Agregue 2.0 ml. del Reactivo de Biuret ya preparado a cada uno de los tres tubos. Agite bien y deje reposar
por unos 10 minutos.
5. Observe el color desarrollado en los tubos dos y tres que deben ser positivos para la reacción
6. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la:
Detección de Proteinas
Por la reacción del
BIURET.
Nota: El experimento se puede hacer cuantitativo, para lo cual en necesario primero hacer curva patrón con
una serie de tubos de ensaye a los cuales se les pipetean cantidades crecientes de proteína, se hace la
reacción y se mide la densidad óptica de cada uno de los tubos a 550 nanómetros. Se grafican los datos en
papel milimétrico. A esa gráfica se refiere cualquier problema de cantidad de proteína.
2. Pipetee 3.0 ml. de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, dos y tres.
Precipitación de la Ovoalbúmina
con solvente orgánico a distintos
pHs.
41
2. Pipetee 2.0 ml. de Albúmina de huevo al 0.1 %, ya preparada, a los tubos uno, tres y cinco.
3. Pipetee 2.0 ml. de Agua Destilada a los tubos dos, cuatro y seis.
8. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de hacer es la:
Precipitación de
Ovoalbúmina
Por formación de
SALES.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
EXPERIMENTO 6
1 _____________ _____________
2 _____________ _____________
3 _____________ _____________
1 _____________
2 _____________
3 _____________
43
4 _____________
1 _____________
2 _____________
3 _____________
4 _____________
5 _____________
6 _____________
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es, en general, la solubilidad de las proteínas globulares y a qué se debe esta solubilidad?
2. Conociendo lo que es el ‘Salting out’, ¿qué significará el procedimiento del ‘Salting in’?
3. ¿Investigue por qué el Sulfato de Amonio es la sal más empleada en la precipitación de proteínas?
4. ¿Qué proteínas precipitan al 50 % de saturación de Sulfato de Amonio, y que proteínas precipitan al 100 %
de saturación?
44
5. Le conviene investigar qué es una Diálisis, cómo se lleva al cabo y para qué sirve.
LECTURAS EXPERIMENTO 6
Por lo general la solubilidad de las proteínas es variable. La mayoría de las proteínas globulares es
soluble en agua, sea totalmente o coloidalmente soluble, cuando están en su estado nativo. Cuando están
desnaturalizadas las proteínas pierden parte de su solubilidad. Cuando se dice que una proteína es
Coloidalmente soluble se quiere indicar o bien que las moléculas proteicas son de tamaño tan grande que
incluso dispersas en solución tienen el tamaño y superficie que caracteriza a las partículas coloidales, o que hay
alguna fuerza que las hace formar agregados de tamaño coloidal.
De las proteínas globulares, las albúminas son solubles en agua pura, pero también solubles en
soluciones salinas. Las globulinas son insolubles en agua pura, pero se disuelven en soluciones neutras de
sales como el cloruro de sodio, y para permanecer en solución las globulinas necesitan una cierta
concentración de sal, precipitando cuando el contenido de sal disminuye. Las proteínas coaguladas son
insolubles en agua, soluciones salinas, ácidos y álcalis diluidos. Se disuelven en los ácidos minerales y álcalis
fuertes, los que las hidrolizan, desdoblándolas a sus correspondientes aminoácidos.
El punto clave para entender la precipitación de las proteínas es que la proteína es una molécula
cargada tanto positiva como negativamente, y que por consiguiente pueden reaccionar se entre sí o con iones
de cargas opuestas o con el agua. Podemos, por tanto, señalar tres tipos de interacciones de una proteína en
solución. A.- proteína-proteína, B) proteína-agua, C) proteína-iones pequeños.
entonces las proteínas tienden a ser solubles. Por consiguiente, cualquier cosa que aumente o favorezca la
interacción proteína.proteína o disminuya la interacción proteína-agua, disminuirá la solubilidad de la proteína,
favoreciendo su precipitación y cualquier cosa que disminuya la interacción proteína.proteína y aumente la
proteína-agua, aumentará la solubilidad de la proteína.
Si disminuye la concentración efectiva del agua, en una solución proteica añadiendo una sal muy
soluble, se aumentará la interacción proteína-proteína, favoreciéndose la precipitación de la proteína. La gran
cantidad de sal estará robándole a la proteína las moléculas de agua que la solubilizan. Como las proteínas
varían en la proporción de cargas superficiales, las distintas proteínas precipitarán a distintas concentraciones
de sal, proporcionando esto un método para lo que se llama la “precipitación diferencial” de las proteínas. El
procedimiento en general se llama en inglés “salting out” En español se llamado de varias formas, siendo el
más empleado el “salado”. La sal más empleada para este efecto es el Sulfato de Amonio. Una solución
saturada de Sulfato de Amonio es aquella que tiene 75 gramos de sulfato de amonio por 100 ml. de agua
Precipitación por Solventes Orgánicos
Al añadir solventes orgánicos como Etanol o Acetona, a una solución acuosa de proteínas, se baja la constante
dieléctrica del agua disminuyendo efectivamente la interacción proteína-agua y aumentando la interacción
proteína-proteína, favoreciendo así la precipitación. Si esto sucede arriba de cero grados, las proteínas se
desnaturalizan, de ahí que este tipo de precipitación cuando se usa para purificar proteínas con actividad
biológica como las enzimas, se tenga que hacer a bajas temperaturas. En este tipo de precipitación sí hay que
tener en cuenta factores como pH, electrolítos, presencia de metales pesados, etc., pues pueden tener efecto
en la precipitación.
Precipitación isoeléctrica
Una manera muy sencilla de precipitar a las proteínas es el ajustar el pH de su solución a su punto
isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado reversible, que se disolverá tanto del lado alcalino como del lado
ácido del punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico de la proteína la carga neta es cero, favoreciéndose
entonces la precipitación por ser ese el punto de menor solubilidad en el agua.
Reacción de Biuret
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El Biuret es un reactivo de sulfato de cobre diluido en álcali fuerte. Es un reactivo muy bueno para
demostrar presencia de proteínas e incluso cuantificarlas. La prueba la dan positiva todos los componentes
que tengan dos o más uniones peptídicas, por lo cual es propia para Proteínas y péptidos.
La intensidad del color de la reacción es proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.
El color azul morado de la reacción positiva se debe a un complejo de coordinación entre el catión divalente
de cobre y cuatro átomos de nitrógeno, dos de cada cadena peptídica. Los dipéptidos y los aminoácidos no
dan positiva la reacción, excepto treonina y serina. Esta reacción requiere relativamente grandes cantidades
de proteína, de 1 a 5 miligramos, para la formación del color.
Para demostrar la precipitación proteica con solventes orgánicos se utiliza el etanol. Aquí se puede ver
la influencia del pH en este tipo de precipitación
La precipitación con metales pesados y con reactivos alcaloidales dará un precipitado más o menos
grueso.
La precipitación por punto isoeléctrico se puede demostrar con una solución de Acetato de caseina 0.1
N. Utilizando la fórmula de Henderson-Hasselbach se podrá calcular el pH de cada uno de los tubos y así
determinar el punto isoeléctrico de la caseina.
Si no se dispone de bolsas de diálisis se puede hacer la prueba del Biuret con la proteína precipitada con
Sulfato de Amonio .La cantidad de sal interfiere un poco con la aparición del color, pero si se trata de una
prueba cualitativa solamente no habrá problema
PRACTICA 7: AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
(DOS SESIONES)
Los procedimientos que se practicarán en esta sesión de Laboratorio son los siguientes:
. Aislamiento de los Acidos Nucléicos a partir de hígado de res.
. Separación de ácidos Deoxiribonucléicos y Ribonucléicos.
. Reacción de Bial para identificación de ácido Ribonucléico.
. Reacción de Dische para identificación de ácido Deoxiribonucléico.
Es responsabilidad del alumno consultar los libros de texto para conocer los fundamentos científicos de cada
uno de los procedimientos arriba mencionados antes de hacer la práctica. En la ‘Hoja de Datos’ deberá
mencionar esos fundamentos.
Se puede convenientemente dividir la práctica en dos sesiones, en la primera se hace el aislamiento de los
ácidos nucléicos a partir del hígado de res, y en la segunda se separan y se identifican.
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MATERIAL NECESARIO
PROCEDIMIENTO
2. Así mismo con su mechero, tripie y tela de asbestos y un vaso de precipitados de 600 ml., prepare un baño
de agua hirviendo. No llene todo el vaso y use agua destilada.
4. Córte el hígado con tijeras, cuchillo o navaja, en fragmentos lo más pequeños posible y viértalos
directamente al vaso de precipitados de 600 ml. que está en el baño de hielo.
5. Añada al vaso de precipitados los 40 ml. de Cloruro de Sodio al 10 % helado. Viértalo todo a la licuadora.
6. Conecte la licuadora y homogenice el hígado por 30 segundos. Vierta el homogenado a una probeta para
medir el volumen obtenido
7. Vierta el homogenado al Erlenmeyer de 250 ml. Tápelo sin apretar y llévelo al baño de agua hirviendo.
Déjelo por 30 minutos.
8. Filtre la suspensión caliente a través de fibra de vidrio hacia una probeta para medir el volumen de filtrado
obtenido. Deje que se enfríe. Lo grueso que queda en la fibra de vidrio se descarta.
48
9. Pase el filtrado a un vaso de precipitados de 100 ml. y añada 2.5 volúmenes de Etanol de 95% (Por
ejemplo si se obtuvieron 20 ml. de filtrado, se añadirán 50 ml. de etanol). Mezcle bien y deje reposar por 10
minutos. Los Acidos Nucléicos se sedimentan.
10. Decante lo más posible de la solución sobrenadante, sin dejar que se vaya ningún sólido y luego filtre. El
precipitado de Acidos Nucléicos queda en el filtro.
11. Lave el precipitado en el mismo papel filtro, primero con 10 ml. de alcohol de 95 % y luego con 10 ml. de
éter etílico agregándolos despacio. Deje secar el precipitado al aire.
12. Transfiera el precipitado a un tubo de ensaye de 15 x 150. Añada 4 ml. de Hidróxido de Sodio 1,0 N.
Suspenda bien el precipitado. Tape el tubo y déjelo reposar toda la noche o hasta la siguiente sesión de
Laboratorio.
13. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. El procedimiento que acaba de terminar es el:
SEGUNDA PARTE
1. Prepare un baño de hielo como en la parte anterior y enfríe en él, por cinco o diez minutos el tubo de
ensaye donde están los ácidos nucleicos tratados con álcali.
2. Sin sacar el tubo de ensaye del baño de hielo, agréguele 4.0 ml. de Acido Tricloroacético al 5%, y 2.0 ml. de
Acido Clorhídrico 6.N
4. Decante cuidadosamente el sobrenadante, que contiene el ARN hidrolizado y consérvelo para terminar de
tratarlo como se indica en el número 7.
5. El precipitado contiene el ADN no hidrolizado. Lave ese precipitado con 3.0 ml. de agua y una gota de
ácido clorhídrico 6.N. Vuelva a centrifugar y descarte el lavado.
6. Disuelva este precipitado en 5.0 ml. de Hidróxido de Sodio 1.0 N. Esta es su fracción de ADN. A esta
fracción se le hará la prueba de Dische. A esta fracción se le hará la prueba de Dische.
7. Del sobrenadante obtenido en el número 4 pase 2.0 ml. a un tubo de ensaye de 13 x 100 y añádale 5.0 ml.
de Etanol de 95 %. Cubra el tubo y mezcle por inversión. (Si la solución se vuelve turbia, enfríela en baño
de hielo por 10 minutos y vuelva a centrifugar. Este tratamiento quita el Glucógeno que pueda haber y que
interferiría con la reacción de Bial)
8. Esta es su fracción de RNA. A esta fracción se le hará la prueba de Bial. Lo que acaba de terminar es la:
Reacción de Bial
Con su mechero, tripie y tela de asbestos y su vaso de precipitados de 250 ml. prepare un baño de agua
hirviendo, de la manera acostumbrada.
49
5. Agregue 5.0 ml. del Reactivo de Bial ya preparado a cada uno de los tres tubos. Mezcle el contenido de
los tubos por agitación y déjelos en el baño de agua hirviendo por 10 minutos.
6. Observe la aparición de un color verde, que significa la reacción positiva. El único tubo que la dará es el que
contiene la ‘fracción de RNA’.
7. Anote sus resultados y observaciones en la ‘Hoja de Datos’. Lo que acaba de demostrar es la:
Reacción de
BIAL
4. Pipetee 5.0 ml. del Reactivo de Dische, ya preparado, a cada uno de los tres tubos. Mezcle bien el
contenido de los tubos y déjelos en el baño de agua hirviendo por 15 minutos.
5. Observe el color azul violaceo que aparece en la reacción positiva. Solamente un tubo debe darla positiva.
Reacción de
DISCHE o de la
difenilamina
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Etanol al 95 % (2 litros)
EXPERIMENTO 7
Reacción de Bial
51
1 ___________ ___________
2 ___________ ___________
4 ___________ ___________
Reacción de Dische
1 ___________ ___________
2 ___________ ___________
3 ___________ ___________
Reacción de Bial
Reacción de Dische.
CUESTIONARIO
52
1. ¿Qué diferencia hay entre la estructura y función del DNA y la estructura y función del RNA?
2. ¿Cuál de los ácidos nucleicos tiene mayor peso molecular y cual menor y por qué?
3. ¿Porqué los primeros pasos que se siguen para aislar ácidos nucleicos hay que hacerlos entre cero y
cuatro grados de temperatura?
4. Le conviene tener clara y precisa la estructura molecular de la Doble Hélice del DNA con todas sus
características. Así mismo la estructura de los Ribosomas y de los RNA de transferencia. Anótelas.
LECTURAS EXPERIMENTO 7
Ácidos Nucleicos es una expresión que designa a todo un conjunto de moléculas con estructura general
de poliribonucleótidos y polideoxiribonucleótidos. Sin embargo no todas estas moléculas se encuentran
en el núcleo de la célula como el nombre lo haría esperar. Sin embargo el término Acidos Nucléicos se sigue
empleando universalmente para designar a todo este conjunto de moléculas, prescindiendo de su localización
particular en las células.
Cada molécula de ADN está formada por dos cadenas sencillas complementarias, unidas entre sí por
puentes de hidrógeno, para formar la doble hélice propuesta por Watson y Crik. Lo que forma la columna
vertebral de cada cadena sencilla de ADN es una cadena polimérica de 2-deoxiribosas unidas entre sí por
uniones fosfodiester, del hidroxilo 3 de un monómero al hidroxilo 5 del siguiente monómero. En la posición 1
de cada deoxiribosa hay una base nitrogenada, que puede ser púrica (adenina o guanina), o pirimidínica
(citosina o timina).
El acido Ribonucleico o ARN (RNA en ingles), tiene dos diferencias básicas con el ADN. El
carbohidrato es Ribosa en vez de deoxiribosa, y Uracilo sustituye a Timina como una de las bases pirimidínicas.
Sin embargo Uracilo también puede unirse a Adenina.
La molécula de ARN actúa en el proceso de traducción del mensaje genético a estructura proteica, y
así, es indispensable para la síntesis de todas las proteínas celulares. Este proceso es muy complicado y
requiere de tres distintos tipos de ácidos ribonucleicos: el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosomal (ARNr) y
los ARNs de transferencia (ARNt). Cada uno de estos tres tiene su composición, estructura y función particular.
53
El ADN es de muy alto peso molecular, y es una doble hélice de estructura más o menos rígida. Esto
tiene como consecuencia que las soluciones de ADN sean extremadamente viscosas y que baste calentar las
soluciones para que disminuya esa viscosidad, debido al rompimiento de los puentes de hidrógeno que unen a
las dos cadenas.
El ARN tiene pesos moleculares menores y por lo general es de cadena sencilla, lo cual hace que las
soluciones de ARN sean mucho menos viscosas.
Para aislar a los Acidos Nucleicos, libres de otros componentes tisulares, se siguen normalmente los
siguientes pasos: a) rotura de las membranas celulares por Homogenización, b) Desnaturalización y
remoción de las proteínas y c) precipitación de los ácidos nucleicos.
Todos los pasos hasta antes de la desnaturalización de las proteínas, deben llevarse al cabo a cero
grados centígrados, para evitar la acción de las enzimas nucleasas, que romperían las cadenas y evitarían el
aislamiento de los ácidos nucleicos como tales.
El ADN es estable a la acción del Hidróxido de Sodio 1.0 N mientras que el ARN se hidroliza fácilmente,
debido a la rpesenbcia del hidroxilo en el carbono dos de la ribosa. Esto da la posibilidad de separar a ambos
cuando están en mezcla.
Para extraer a los ácidos nucléicos de los tejidos se puede usar las soluciones de sales neutras o los
álcalis, o con fenol. Una vez extraidos se pueden precipitar con alcohol o ácido. La identificación se hace por
reacciones de color.
Reacción de Bial
Esta reacción se describe en el experimento uno, y con fruto se puede ir nuevamente a consultar las
lecturas de ese ejercicio, para estar seguro de que se conocen los fundamentos de la reacción. La intensidad
del color verde de la reacción se puede usar para mediciones cuantitativas, a un máximo de absorción de 620
nanómetros.
Toda sustancia que dé un compuesto aldehídico como intermediario, dará positiva la reacción. La
fructosa que por la acción del ácido da Hidroximetilfurfural, produce un color verde con este reactivo
La intensidad del color azul de la reacción positiva se puede usar para mediciones cuantitativas. El
máximo de absorción es de 595 nanómetros.
Los reactivos de Bial y Dische se pueden aplicar directamente a las soluciones de ARN y ADN, porque
los ácidos fuertes que se emplean en estos reactivos hidrolizan a los nucleótidos, y los azúcares liberados
reaccionan con los reactivos cromogénicos, para dar el color.
Los azúcares unidos a las bases en los nucleotidos NO dan positiva la reacción.
54
Para hacer las reacciones cuantitativas se deben tener los patrones puros para poder comparar las
intensidades de color. Para ARN se puede usar como patrón a la Ribosa pura, mientras que para el ADN se
tiene que usar un patrón de ADN purificado.
Hay que tener cuidado con las reacciones cruzadas. La deoxiribosa reacciona ligera pero
mediblemente con el reactivo de Bial, así que el cálculo colorimétrico de ARN en presencia de ADN debe tener
en cuenta la absorbancia contribuida por el ADN.
En cambio la reacción de Dische para el ADN en presencia de ARN no tienen ninguna interferencia.
Para preparar los estándares basta hacer soluciones de 50 a 250 microgramos por mililitro.
Para hacer un análisis verdaderamente cuantitativo hay que sacar la proporción del fósforo y de las
bases para obtener el verdadero porcentaje de ribosa y deoxiribosa.
Revisión de conceptos
Hidrólisis de lípidos
Pancreatina
El alumno debe revisar cómo se lleva al cabo la hidrólisis de los lípidos, cuáles son sus productos y sus
condiciones.
Este es un ejercicio muy sencillo con el cual se demostrará la acción enzimática de la lipasa Pancreática. Se
deducirá la hidrólisis de los lípidos y la existencia de los productos, en forma titrimética.
MATERIAL NECESARIO
5 tubos de ensaye de 15 x 150 1 gradilla
5 vasos de precipitados de 250 ml. 1 bureta para titulación.
Cada grupo se responsabilizará de traer a la práctica la leche homogenizada. Como cada grupo va a requerir
solamente 50 ml. se puede poner de acuerdo todo el grupo para ver quien la trae para todo el grupo.
PROCEDIMIENTO
55
1. Coloque en su gradilla 5 tubos de ensaye de 15 x 150 y numérelos de alguna manera para su identificación.
2. Añada 10 ml. de leche homogenizada a cada uno de los cinco tubos.
3. Añada 3.0 ml. de Pancreatina al 1 % a cada uno de los cinco tubos, y agítelos
4. Inmediatamente vacíe el contenido del tubo 1 a un vaso de precipitados de
250 ml. que ya contenga 25 ml. de alcohol etílico de 95 grados.
5. Lleve los demás tubos a un baño de agua a 37°C anotando la hora exacta.
6. Agite bien el contenido del primer vaso de precipitados. Añádale 0.5 ml. de fenoftaleina y titúlelo con KOH al
0.05 N hasta un color rosa permanente.
7. A los 10 minutos saque el tubo 2 del baño, vacíe su contenido a otro vaso de precipitados con 25 ml. de
alcohol etílico. Añádale 0.5 ml. de Fenoftaleina y titúlelo de la misma manera que en el caso anterior.
8. A los 20 minutos saque el tubo número 3, a los 30 minutos el tubo número
4 y a los 40 minutos el tubo número 5. Deles el mismo tratamiento que el tubo número 1.
9. El tubo número 1 es el testigo, por lo tanto para obtener los valores que va a reportar tiene que restarle a
todos los tubos, el valor obtenido en el tubo 1.
10. Calcule los ml. de KOH consumidos en cada tubo.
En este ejercicio se demostró en forma titrimética, la Acción Enzimática de La Lipasa Pancreática.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
EXPERIMENTO 8
Tubo ml. de KOH consumidos en la titulación ml. de KOH después de restar el testigo.
1 _____________________________ _____________________________
2 _____________________________ _____________________________
3 _____________________________ _____________________________
56
4 _____________________________ _____________________________
5 _____________________________ _____________________________
FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN
CUESTIONARIO
2. ¿Por qué el KOH consumido en la titulación, aumenta en cantidad a medida que el tiempo de incubación es
mayor?
LECTURAS PRÁCTICA 8
Entre las clases de enzimas que catalizan la hidrólisis de diversos ésteres hay diferencias entre las lipasas y las
esterasas. Esta diferencia se basa en su especificidad preferencial selectiva. Los sustractos naturales de las
lipasas son aceites o grasas, o sea triacilgliceroles de ácidos grasos de cadena larga, mientras que los
sustractos naturales de las Esterasas, son los ésteres de dos de bajo peso molecular. Las dos clases de
enzimas son sumamente específicas en cuanto a la naturaleza del ácido graso o del alcohol, que tienen efecto
no en la especificidad sino en la velocidad de la reacción.
La hidrólisis de los triacilgliceroles que consumen los animales superiores se lleva al cabo principalmente en el
intestino delgado, por medio de enzimas lipolíticas elaboradas en el Páncreas. Las lipasas pancreáticas existen
en dos tipos: las específicas para romper la unión éster en posición alfa a prima de los triglicéridos, y las
específicas para las uniones beta. La hidrólisis completa de los triacilgliceroles procede entonces por pasos. ro
se hidrolizan rápidamente las uniones alfa y alfa prima, y luego lentamente se rompen las uniones beta.
Estas reacciones se aceleran con las sales biliares como Taurocolato o glucocolato de sodio, que emulsifican y
solubilizan a los lípidos. Las sales se producen en el hígado, se almacenan en la vesícula biliar y al momento de
las comidas se vierten al intestino delgado inducidas por la hormona Colecistocinina, que se sintetiza en el
mismo intestino delgado.
La lipasa (E.C. 3.1.1.3.) tiene el nombre técnico de Triacil Glicerol acilhidrolasa. Antiguamente se llamaba
Esteapsina. Se extrae de diferentes fuentes biológicas. Contiene siempre diversas fracciones proteicas de muy
diversas masas moleculares, que van desde 39,000 hasta 200,000 faltones, todas ellas con actividad lipolítica.
Estas esterasas hidrolizan sustractos hemulsificados y no atacan a sustractos en veraddera solución. Se cree
que esto se debe a que la enzima se adsorbe a su sustracto emulsificado, y la velocidad inicial de reacción está
en función del número de moléculas de enzima adsorbidas en la interfase.
Se le llama Pancreatina a un extracto de pandreas con fuerte actividad lipolítica. La actividad enzimática se
mide por titulación de la cantidad de ácidos grasos liberados de los ésteres. Es necesario trabajar con
emulsiones de los sustractos. Uno de los emulsificantes más comúnmente empleados es el Alcohol Polivinílico
57
(PVA), pero se pueden usar otros emulsificantes como bentonita, goma arábiga, Oleato de sodio etc.
El uso de la leche liomogenizada es fácil y da excelentes resultados para mostrar la actividad de las lipasas,
puesto que en la leche homogenizada ya están las grasas emulsificadas y vienen en glóbulos finamente
divididos. Consiguientemente en este caso no habrá necesidad de una emulsificación.
Revisión de conceptos:
- Hidrólisis enzimática de las proteínas.
- Productos de la hidrólisis
- Método para medirlos
El alumno debe recordar bien lo que es una hidrólisis enzimática. Así mismo debe recordar la composición de la
Gelatina.
En este ejercicio se demostrará la acción enzimática de una enzima que hidroliza a las proteínas, la tripsina. El
ejercicio es parecido a los anteriores pero en este caso se trata de una Proteasa.
MATERIAL NECESARIO.
2 Pipetas de 10 ml
Gotero
Agitador
Mechero
El alumno deberá traer una hoja de papel milimétrico para graficar los resultados.
PROCEDIMIENTO
58
1. Mida en su probeta 50 ml. de Gelatina al 5 % (conservada en estado líquido en baño maría), y vacíelos aun
vaso de precipitados de 250 ml.
2. Añada 10 ml de solución de Tripsina al 0.2 % y agite por dos segundos.
3. Lleve INMEDIATAMENTE, la mezcla a un baño maría de 37°C y anote la hora exacta
4. Tome inmediatamente 10 ml. en un erlenmeyer de 250 ml. y llévelo a fuego directo por dos minutos. (Con
mucho cuidado para que no vaya a saltar la mezcla y se desperdicie. Si es necesario use pinzas de tubo de
ensaye para sostener al erlenmeyer.) Enfríe con agua de la llave y añada 15 ml. de solución de formol
neutralizado y 5 gotas de fenoftaleína. Esta será la muestra de cero tiempo.
5. A los diez minutos de que la mezcla de reacción esté en el baño a 37°C tome otra muestra de 10 ml. y
proceda con el mismo tratamiento que a la muestra de cero tiempo.
6. A los 20 minutos saque otros 10 ml. A los 30 minutos, otros diez, y los últimos l0 ml. a los 40 minutos. A todas
las muestras se les da el mismo tratamiento que a la muestra de cero tiempo.
7. Titule las cinco muestras con hidróxido de sodio al 0.02 % hasta que aparezca un color rosa permanente.
Tenga mucho cuidado para que el color sea igual en las cinco titulaciones.
En este ejercicio se aprendió a detectar en forma titrimétrica la: Hidrólisis enzimática de las Proteínas.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Gelatina al 5 % (1 litro)
Gelatina …………………………………………. 50 gramos
Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4 …….. 800 ml.
Agua Destilada hasta aforar a …………………….1 litro.
Esta gelatina se debe mantener líquida en baño de agua caliente hasta el momento de hacer la práctica.
En una hoja de papel milimétrico aparte trace una gráfica poniendo en las ordenadas el volumen de álcali
gastado y en las abscisas el tiempo de la reacción. En la misma gráfica trace otra curva de tiempo contra
nitrógeno de aminoácidos tomando en cuenta que 1 ml de solución de hidróxido de sodio 0.1 N es equivalente a
1 .4 miligramos de nitrógeno amínico.
10 min. _______________
20 min. _______________
30 min. _______________
40 min. _______________
60
FUNDAMENTO DE LA REACCION
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la gelatina, utilizada como sustracto en este ejercicio?
LECTURAS PRACTICA 9
La Tripsina (E.C. 3.4.21.4.) forma parte de un grupo de enzimas “serina proteasas”. Se llaman así por tener una
Serina en el sitio activo, serina que es esencial para la actividad de la enzima.
En este grupo de enzimas, además de la Tripsina, se consideran entre otras, la Quimotripsina (EC. 3.4.21.1.), la
Ulastasa (E.C. 3.4.21.11.), la Trombina (E.C. 3.4.21.5.), la Subtilisina (E.C. 3.4.21.14.), así como enzimas que
no son propiamente proteolíticas, como la fosforilasa (E.C. 2.4.1.1,) y la Fosfatasa Alcalina (liC. 3.1.3.1.).
La Tripsina hidroliza péptidos, amidas, ésteres, etc., en las uniones que involucran al grupo carboxilo de L-
Arginina o L-Lisina. Es una proteasa de las más específicas. En los animales superiores se sintetiza en
Páncreas en forma de Tripsinógeno, que es la forma inactiva o precursor de la Tripsina misma.
El Tripsinógeno es una proteína de masa molecular de 24,000 daltons, que cuando pierde sus seis primeros
aminoácidos del término amino, por la acción de la Enterocinasa, o por otra molécula de Tripsina ya activada,
se convierte a Tripsina activa, proteína de masa molecular 23,281 daltons. Actualmente se conoce
perfectamente su secuencia de aminoácidos, su estructura terciaria y su mecanismo de acción.
La actividad enzirnática de la tripsina se puede inhibir por ciertas a sustancias como la p-aminobenzidina, la
acetamida, la fenilacetamida, la
etilamina, la butilamina, etc. El calor también inhibe a la enzima, pero la inhibición por calor, o desnaturalización
es irreversible. Por otro lado los compuestos organofosforados como el dietilo de paranitrofenilfosfato (DPF), la
inhiben específica y totalmente como a todas las esterasas. Estos compuestos inhiben a la tripsina de la misma
manera que lo hacen con la enzima colinesterasa y acetilcolinesterasa.
El colágeno es la proteína estructural del tejido conjuntivo. Es el principal componente de los tendones, huesos
y ligamentos. En la piel se encuentra en la dermis, mientras que la queratina está en las capas de la epidermis.
La queratina puede solubilizarse por reducción de sus puentes disulfhídricos, separándose así las cisteínas
unidas que estaban unidas entre si.
El colágeno se hace entonces soluble. Si el colágeno se calienta por largo tiempo con agua, se solubiliza y se
convierte en la proteína conocida como Gelatina. Esta conversión parece que encierra la hidrólisis de algunas
uniones peptídicas débiles.
61
La gelatina tiene una masa molecular promedio de 60,000 daltons. Las soluciones de gelatina son muy viscosas
y forman geles duros a temperatura
ambiente, cuando están en concentraciones de más del 2 %. La formación de estos geles depende del pH y de
la fuerza iónica de la solución. La gelación se atribuye a la formación de uniones de hidrógeno entre pares de
uniones peptídicas.
Entre glicina (26.1 %), Prolina (13 %), Hidroxiprolina (13.6 %), y ácido glutámico (11%), está el 63 % de los
aminoácidos del colágeno y de la gelatina. Pero no existe triptófano. El contenido de arginina es de 8.3 % y el
de Lisina es de 3.6 %.
La tripsina al romper las uniones peptídicas de la gelatina va dejando grupos carboxilo libres. Mientras más
tiempo actúa la enzima, más grupos
1carboxilo titulables habrá en la solución. El formol neutralizado se añade para que se una con los grupos
amino libres no cargados, y hacer más exacta la titulación de los grupos carboxilo.
Como desde el principio del experimento, aun sin actuar la enzima puede haber grupos carboxilo titulables, se
necesita tener una muestra de cero tiempos, para restar el valor inicial de cero tiempo a todos los demás
valores que se obtengan de la acción de la enzima.
OBJETIVO
Identificación cualitativa del ácido cítrico y tartárico en tomate.
INTRODUCCION. En las plantas superiores actúan simultáneamente el ciclo de los ácidos tricarboxilicos como
el del glioxilato; el primero para proporcionar energía mediante la fosforilación oxidativa y el segundo para
proporcionar succinato destinado a la formación de un nuevo glúcido procedente de las grasas.
Las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en las plantas superiores se hallan localizadas en las
mitocondrias. La actividad del complejo deL piruvato deshidrogenasa, que aporta la porción principal de! acetil
CoA que se incorpora al ciclo, resulta disminuida por la fosforilación del ATP dependiente del componente
deshidrogenásico, y es activado por la fosforilación del fosfoenzima. La condensación del acetil CoA con el
oxaloacetato para rendir citrato es el punto de control primario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en la
mayoría de los tejidos vegetales de origen tropical. Por otro lado, estrechamente relacionado con el mecanismo
y la regulación de la biosíntesis de hexosa en las plantas fotosintéticas se halla el fenómeno de la
fotorrespiración. Las células de las plantas verdes contienen rnitocondrias, además de cloroplastos; tales
células exhiben una respiración mitocondrial y una fosforilación oxidativa en la oscuridad, a expensas de los
sustratos producidos por la fotosíntesis durante períodos previos de iluminación. Surge entonces el problema de
si las células de las plantas verdes respiran también cuando están iluminadas y durante su fotosíntesis, o si la
respiración se ve entonces interrumpida. Se ha demostrado que las plantas respiran realmente bajo la acción
de la luz, al tiempo que efectúan la fotosíntesis.
Sin embargo, el tipo de respiración que tiene efecto a la luz no es mitocondrial. Esta respiración “lumínica”
llamada fotorrespiración desvía al poder reductor fotoinducido de la biosíntesis de la glucosa, hacia la reducción
del oxigeno. La fotorrespiración es muy activa en plantas de zonas templadas pero se encuentra en plantas de
origen tropical.
Por lo tanto varios ácidos orgánicos se encuentran en los tejidos de las plantas, como producto de
almacenamiento de las plantas o como intermediarios de los procesos metabólicos.
Estos ácidos pueden ser cuantificados al determinar su capacidad amortiguadora. Los ácidos orgánicos en
62
particular pueden ser determinados mediante reacciones químicas específicas o por métodos enzimáticos.
MATERIAL Y EQUIPO
Baño maría Agitador
Pipeta de 5 ml
Embudo de separación
Determinador de pH, Peachímetro ó
Potenciómetro
Cuchillo
Probeta de 20 ml
SUSTANCIAS
Resorcinol al 2%
PROCEDIMIENTO
• 1. Quitar la cáscara a un tomate, cortarla en pequeñas fracciones, descongelarlas a temperatura ambiente y
exprimirlos.
2. Acidificar hasta pH 1, utilizandoH2SO4 0.01 N.
3. Utilizando un embudo de separación, extraer tres veces con pequeñas porciones de éter.
4. Evaporar el éter en baño maría.
1 5. Disolver el residuo en 15 ml de H2O, filtrar y efectuar las siguientes reacciones utilizando el filtrado.
CUESTIONARIO
Haz una lista de los ácidos orgánicos que se encuentran en las plantas y su función en el metabolismo de las
mismas
OBJETIVO
Demostración de la producción de almidón durante la fotosíntesis, empleando una hoja de planta verde y
solución de iodo.
INTRODUCCIÓN. Durante la segunda fase de la fotosíntesis no se requiere de luz y se le conoce como fase
63
oscura en la cual hay fijación de CO2, y se fabrican carbohidratos utilizando como fuente de energía al ATP y
NADPH, producidas en la fase luminosa.
El producto final de la fotosíntesis depende de la especie de planta que se trate, aunque la mayoría de las hojas
almacenan almidón, la luz es indispensable para que se realice el proceso fotosintético ya que en su ausencia
no ocurre la síntesis del almidón.
MATERIALES Y EQUIPOS
Papel aluminio
Perforador de corcho
2 Caja de petri
2 Pipetas de 5 ml
1 Tripié
1 Mechero
Baño maría
Parrilla eléctrica
SUSTANCIAS
PROCEDIMIENTO
1. Cubra la mitad de la hoja de la planta con papel aluminio y exponerla a la luz emitida por un foco de
100 watts a una distancia de 60 a 90 cm, durante 24 horas. Al día siguiente descubra la hoja y usando
un perforador de corcho corte discos de 1 a 2 cm de diámetro de las dos partes de
la hoja.
2. Colocar los discos en agua caliente hasta ablandar las paredes lunares, y luego extraer la clorofila con
alcohol caliente sobre la parilla eléctrica. (! CUIDADO¡ Puede provocar incendio) cambiar el etanol en
caso de ser necesario, hasta que se haya extraído la clorofila y transferir el disco a una caja de petri
que contenga solución diluida de jodo.
3. Comparar la forma en que se han coloreado los discos provenientes de cada una de las dos partes de
la hoja.
4. CUESTIONARIO
1. Realizar con dibujos todas las observaciones indicando con color las áreas de cada una de las partes
de la hoja.
2. Escribir la reacción que se verifica entre la molécula de almidón y la solución de yodo.
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4. Escriba y explique qué ocurre durante la primera fase de la fotosíntesis y cómo repercute durante
la fase obscura de la hoja empleada en su experimento.
5. Escriba qué experimento realizó Calvin para llegar a proponer el ciclo de la biosíntesis de la glucosa
a partir de CO2