UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE

COAHUILA
ESCUELA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
UNIDAD TORREÓN

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL

ENERO-DICIEMBRE 2011
 PREFACIO

Durante las últimas décadas, las células microbianas han proporcionado un modelo útil para el estudio
de los procesos de la vida, a causa de su diversidad, versatilidad y fácil manejo. Los estudios con
microorganismos han contribuido en gran medida a lo que hoy se sabe de genética, fisiología y metabolismo.
Los microorganismos han sido, además, foco de creciente interés a causa de que pueden contribuir con
soluciones a los principales problemas de la humanidad y en la búsqueda de la producción de sus satisfactores.

Es por eso, que la creciente importancia de la microbiología, como ciencia básica y aplicada, ha
contribuido a aumentar el interés por su estudio por un gran número de estudiantes y profesionistas vinculados
con el conocimiento y aplicación de los microorganismos en procesos de la transformación y en el área de la
salud pública.

Por consiguiente, te ofrezco el presente manual de laboratorio, con el fin de que te introduzcas en el
interesante estudio del mundo de los microorganismos, desde sus principales técnicas de tinción, hasta las
técnicas de cultivo de los microorganismos más utilizadas por el hombre, que nos interesa conocer, estudiar y
aplicar en los procesos que involucren su actividad biológica.

Esperando contar con tu invaluable apoyo para la aplicación de las prácticas y la búsqueda del mejor
resultado, te saluda tu amigo, LIC.BIOL. MANUEL RAMÍREZ PÉREZ, maestro de la materia de
Microbiología General.

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 ÍNDICE

Práctica 1: Esterilización de material de laboratorio ------------------------------------------- 4

Práctica 2: Control de microorganismos por medios físicos y químicos (Método de

vaciado en placa o placa vertida) -------------------- 6

Práctica 3: Uso del microscopio óptico y la lente de inmersión en aceite ------------------- 8

Práctica 4: Tinción simple y tinción diferencial de Gram -------------------------------------- 11

Práctica 5: Tinción ácido-resistente y de la pared bacteriana --------------------------------- 13

Práctica 6: Clasificación de los medios de cultivo en selectivos, enriquecidos, diferenciales

y de enriquecimiento ---------------------------------------------------------------------- 16

Práctica 7: Técnica de siembra por estrías en medio sólido y método de la gota o de Miles
y Misra -------------------------------------------------------------------------- 18

Práctica 8: Siembra de microorganismos en agar profundo, agar inclinado y extensión en

placa ---------------------------------------------------------------------------- 20

Práctica 9: Determinación del número más probable (nmp) ------------------------------------- 22

Práctica 10: Estudio de la morfología de levaduras y hongos, cultivo de hongos ------------- 24

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Práctica 1 Fecha:______/______/______

ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO
El estudiante conocerá el manejo del material que va a esterilizarse antes y después de su uso y
aprenderá el manejo de la autoclave y/o olla de presión como equipo utilizado para la esterilización de
material utilizado en el laboratorio microbiológico.

INTRODUCCIÓN
En algunos casos, como sucede en el trabajo microbiológico, el material con el que se trabaja necesita
de una asepsia que no se consigue con la aplicación de agentes químicos. Es necesario, por consiguiente,
recurrir al proceso de esterilización. Mediante éste, se logra matar cualquier espora o microorganismo, que
pudiera interferir en nuestra labor provocando contaminaciones en los cultivos o infecciones en los
organismos. Este proceso de esterilizar el material debe llevarse a cabo con gran responsabilidad y en forma
meticulosa, sobre todo si se trabaja con seres humanos.
Como métodos principales de esterilización se utilizan el calor seco (mayor temperatura en hornos), el
calor húmedo (menor temperatura en autoclaves), así como diferentes tipos de radiaciones, entre las cuales la
luz ultravioleta que actúa sobre ácidos nucleicos es la más frecuente. En estos casos, lo primero que debe
hacerse es lavar el material, enjuagarlo con agua destilada; una vez seco, se envuelve con papel destrasa
limpio, grueso, flexible, resistente a las temperaturas altas (como el papel manila, revolución o canela) y en
algunos casos a la humedad (hojas de estaño o aluminio).
Esto se hace para que al sacar el material de la esterilización se pueda conservar por un tiempo
ilimitado en condiciones de asepsia. Así solo debe desenvolverse cuando se vaya a usar, cuidar el nivel del
agua en el autoclave.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
Calor húmedo (autoclave)
Calor seco (horno para esterilizar)
Esterilizar
Radiación ultravioleta
Esterilización a la flama
Fenol

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

EXPERIMENTO 1
PREPARACIÓN DEL MATERIAL

1.- Lave el material de laboratorio que se va a esterilizar con una solución jabonosa

2.- Enjuague el material con agua corriente

3.- Enjuague el material con agua destilada perfectamente

4.- Escurra el material a esterilizar

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5.- Envuélvalo en papel para esterilizar según lo indique su instructor

6.- Esterilice el material en el autoclave según se lo indique su instructor

PROCEDIMIENTO PARA LA ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE

1.- Asegúrese que el agua introducida en el autoclave alcance el nivel de la placa metálica perforada o
diafragma.

2.- Verifique el buen funcionamiento de la válvula de seguridad.

3.- Disponga el material a esterilizar sobre la placa metálica o diafragma (conviene que no estén demasiado
juntos con el fin de permitir el libre paso del vapor de agua).

4.- Recubrir los recipientes de papel de embalar que protegerá a los algodones de que se manchen.

5.- Cerrar el autoclave teniendo cuidado de verificar el que la tapadera quede perfectamente acoplada sobre la
junta de goma, una marca permite acoplar la tapadera siempre en la misma posición, en aquellos casos en que
no este sujeta mediante una charnela al cuerpo del aparato.

6.- Ajuste los bulones encontrados sin apretarlos.

7.- Caliente el autoclave manteniendo abierta la válvula de purga, el aire se expulsa.

8.- Purgado el aparato (se manifiesta por la salida de un chorro de vapor de agua continuo) se cierra la válvula.
El manómetro indica el aumento de la presión en el interior del aparato.

9.- La esterilización termina cuando la temperatura deseada se ha mantenido durante un tiempo suficiente (por
ejemplo 15 minutos a 121º C o 15 libras de presión), o la instrucción indicada en la etiqueta del medio de
cultivo utilizado.

10.- Terminado el tiempo de esterilización se interrumpe el calentamiento de la autoclave y se espera hasta

que la presión descienda a cero y solo entonces se restablece el equilibrio procediéndose entonces a levantar la
tapadera de la autoclave para sacar el material esterilizado, cuida de utilizar guantes de asbesto para retirar la
canastilla de la camisa del autoclave.

EXPERIMENTO 2
ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL SUCIO

1.- Esterilice material sucio en la olla de presión (30 minutos de exposición a 121º C o 15 libras de presión)

2.- Elimine el contenido en el vertedero si esta líquido, los medios de cultivo se desechan en la tina de basura,
junto con el material de papel, aluminio u otros materiales que pueden tapar el vertedero.

CUESTIONARIO
1.- Define esterilización.

2.- Investiga dos métodos físicos y dos químicos que puedes utilizar para esterilizar material de laboratorio en
microbiología.

3.- Investiga la acción del fenol como desinfectante.

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Práctica 2 Fecha:______/______/______

CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS FÍSICOS Y QUÍMICOS

OBJETIVO
El estudiante determinará el punto térmico letal de un microorganismo y determinará las propiedades
bactericidas de un detergente comercial.

INTRODUCCIÓN
Las actividades enzimáticas de los microorganismos, determinantes en la existencia de los mismos, son
regulados en parte por la temperatura. Las temperaturas superiores a la máxima inhibe la actividad enzimática
y por ende el desarrollo microbiano, ocasionado por lo general efectos letales, en cambio temperaturas
menores a la mínima ejerce una acción estática, esto es, solo se inhibe su multiplicación sin causarle
necesariamente la muerte.
Existen infinidad de productos químicos comerciales empleados como sustancias germicidas. Su modo
de acción es en unas conocida y desconocida para otros. Generalmente, sin embargo, bien pueden alterar la
permeabilidad celular, la naturaleza coloidal del protoplasma o inhibir la actividad enzimática. La evaluación
de la acción germicida de un producto se determina por lo general en comparación con el coeficiente de fenol.
Uno de los procedimientos de rutina para determinar el contenido bacteriano de muchos materiales diferentes
es la técnica de recuento en placa. Este procedimiento está basado en el supuesto de que cada célula visible
desarrollará una colonia; de aquí que al número de colonias en la placa revelará el número de organismos
contenidos en la muestra que son capaces de crecer bajo las condiciones específicas de incubación.
El espécimen se diluye para que una de las placas finales tenga entre 30 y 300 colonias. El número de
colonias dentro de este rango da la más adecuada aproximación de la población microbiana.
Debido a que la población en el espécimen original no se conoce de antemano, debe ser preparado y
sembrado una serie de diluciones para obtener una placa dentro del rango citado anteriormente.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Temperatura de muerte térmica - Letalidad
- Actividad enzimática - Bactericida
- Bacteriostático - Detergente
- Compuesto de amonio cuaternario - Iodoforo
- Fenol - Desinfección
- Desinfectante - Sanizante

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

EXPERIMENTO 1
CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS FÍSICOS

1.- A una serie de 4 tubos de ensaye de 16 x 150 mm que contengan 10 ml de agua estéril, hacer una
suspensión de microorganismos (Escherichia coli) y colocarla a baño maría a diferentes temperaturas 20º C,
45º C, 80º C y 100º C cada tubo por un término de 15 minutos.

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2.- Después tomar 1 ml de cada tubo y transferirlo a cada caja de petri estéril (una caja por cada tubo
utilizado), y agregar después el medio de cultivo correspondiente (agar nutritivo), preparar cuatro tubos de
ensaye de 16 x 150 con 15 ml de agar nutritivo cada uno de ellos.

3.- Homogenizar las cajas con la muestra y el agar como se lo indique su instructor, dejar solidificar las cajas e
incubar las mismas en forma invertida en una estufa de incubación a 35º C ± 2 por 24 hrs.

4.- Sacar las cajas de la incubación y leer los resultados.

EXPERIMENTO 2
CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS QUÍMICOS

1.- En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm poner 10 ml de solución salina estéril y hacer una suspensión
bacteriana con el microorganismos problema ( Escherichia coli).

2.- Preparar tres tubos de ensaye de 16 x 150 mm con 9 ml de solución salina estéril cada uno.

3.- De una muestra concentrada de detergente a utilizar tomar 1 ml con pipeta de 1 ml estéril (esterilizar
cuando menos 4 pipetas de 1 ml por muestra a probar), poner este mililitro en el primer tubo esta será la
dilución 1: 10, de este dilución tomar 1 ml y ponerlo en el segundo tubo, esta será la dilución 1.100 y de esta
dilución tomar 1 ml y ponerlo en el tubo 3, esta será la dilución 1. 1000.

4.- Para cada dilución se tendrá una caja de petri estéril y un tubo de 16 x 150 ml con 15 ml de agar cuenta
estandar de contenido por cada caja de petri, incluyendo una caja de petri para hacer una prueba con el
detergente concentrado.

5.- De cada dilución de microorganismo realizada se toma un ml de muestra y se coloca en el centro de cada
caja de petri marcada con la dilución correspondiente, se funde el agar de los tubos a baño maría y se baja su
temperatura a 24º C aproximadamente, al tener esta temperatura se vierte cada tubo con agar en cada caja de
petri correspondiente, se homogeniza y se deja solidificar el agar ya homogenizado con la muestra.

6.- Ya solidificadas las muestras se incuban por 24 horas a una temperatura de 35º C ± 2 en forma invertida
para prevenir la evaporación.

7.- Después de este tiempo de incubación, saque las cajas de la incubadora y registre sus resultados.

CUESTIONARIO

1.- ¿Por qué es importante la temperatura de incubación?

2.- ¿Por qué la utilización de los diferentes gradientes de temperatura aplicados a los microorganismos?

3.- ¿Por qué es importante la dilución de los microorganismos en 10-1, 10-2 y 10-3?

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Práctica 3 Fecha:______/______/______

USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y LA LENTE DE INMERSIÓN EN ACEITE

OBJETIVO
El estudiante se familiarizará con el manejo y partes del microscopio óptico. El estudiante aprenderá a
utilizar la lente de inmersión en aceite.

INTRODUCCIÓN
El microscopio óptico o compuesto es un aparato de precisión que consiste en una serie de lentes
diseñadas y acomodadas para proveer, en condiciones óptimas las máximas amplificaciones posibles que
pueden ser de 1000 a 2000 veces (x) el diámetro del espécimen que se va a observar. Es necesario aclarar que
casi siempre las mayores amplificaciones las obtienen los microscopistas con gran experiencia y con la ayuda
de equipos auxiliares.
La lente de inmersión en aceite se debe usar correctamente para obtener resultados seguros. El aceite
de inmersión que más se utiliza tiene las mismas características ópticas (índice de refracción) que el vidrio. En
consecuencia con este sistema, los rayos de la luz pasar directamente del portaobjetos al lente del objetivo de
100 X o lente de inmersión. Si no se utilizara dicho aceite los rayos de luz se refractarían (desviarían) debido
al aire presente entre el portaobjetos y el objetivo, y entraría menos luz al microscopio. Si se siguen con sumo
cuidado las instrucciones siguientes se debe obtener una buena iluminación y observación del espécimen en
cuestión.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Ocular - Platina - Portaobjetos - Pie
- Condensador - Diafragma o iris - Tornillo Macrométrico
- Tornillo micrométrico - Objetivo seco débil - Objetivo seco fuerte
- Objetivo de inmersión - Tubo del ocular - Ocular - Revolver
- Frotis - Xileno - Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO Y ENFOQUE DEL MICROSCOPIO.

1.- Limpiar todos los lentes con el papel especial para ello

2.- Colocar el objetivo seco débil (10X) en posición debajo del tubo del cuerpo del microscopio. Sentirá un
chasquido cuando haya quedado bien colocado.

3.- Conectar la fuente de luz y encenderla

4.- Poner la preparación del portaobjetos sobre la platina del microscopio y asegurarla con las pinzas o
sujetadores correspondientes o cualquier otro medio adecuado.

5.- Acomodar la posición de la preparación que se va a examinar en la apertura central de la platina.

6.- Bajar el objetivo seco fuerte (40X) con la ayuda del tornillo macrométrico a aproximadamente medio
centímetro por encima del cubreobjetos de la preparación.
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7.- Elevar el condensador al máximo con la ayuda del tornillo de ajuste del condensador.

8.- Observar por el ocular y luego mover la palanca del diafragma del iris de tal modo que éste se abra a su
límite máximo. Tal límite se determina mirando por el ocular y observando los cambios en la intensidad de la
luz al mismo tiempo que se manipula la palanca del iris; si la luz es demasiado brillante hacer los ajustes
necesarios.

9.- A continuación enfocar hacia arriba con el tornillo micrométrico hasta que el espécimen se observe con
toda claridad, cuando el microscopio tiene un tubo de cuerpo en posición fija, la platina se controla con los
tornillos de ajuste respectivos.

10.- Para cambiar de objetivos (pasar de seco débil a seco fuerte) no elevar el tubo del cuerpo del microscopio,
sino simplemente hacer girar el objetivo deseado para colocarlo en su lugar. El microscopio debe permanecer
en foco con cualquier objetivo y si así es en efecto se dice que posee la propiedad de ser par focal.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

EXPERIMENTO 1
ENFOQUE DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIÓN CON OBJETIVOS SECO DÉBIL (10X) Y
SECO FUERTE (40X)

1.- Limpiar el portaobjetos y cubreobjetos, en la forma que indique el instructor y colocar una gota de agua en
el centro del portaobjetos.

2.- A continuación cortar varias letras del periódico y asegurarse que por lo menos una de ellas sea “e”
minúscula.

3.- Colocar la serie de letras en la gota de agua y tapar la preparación con un cubreobjetos. Con el fin de
limitar la cantidad de burbujas de aire en esta preparación, observar las siguientes indicaciones:

a.- Poner el borde del cubreobjetos sobre la gota de agua del portaobjetos de tal manera que el fluido
humedezca por completo el borde.

b.- A continuación colocar la aguja de inoculación bajo el cubreobjetos y hacer descender este sobre el
portaobjetos.

4.- Realizar el examen y hacer un dibujo de la letra (e) aproximadamente con las mismas dimensiones con que
aparece en el portaobjetos.

5.- Examinar la preparación bajo los objetivos seco débil (10x) y seco fuerte (40X).

6.- Dibujar los campos del microscopio observados

EXPERIMENTO 2
OBSERVACIÓN CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN (100X)

1.- Colocar en posición el frotis sanguíneo sobre la platina del microscopio.

2.- Elevar el tubo del cuerpo del microscopio y hacer girar el objetivo seco fuerte hasta colocarlo en posición.

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3.- Bajar el objetivo hasta acercarse al espécimen sin llegar a tocarlo.

4.- A continuación, enfocar hacia arriba con el tornillo micrométrico hasta que el espécimen entre en el campo
de visión.
Nota.- Para localizar rápidamente el espécimen buscar siempre una región que tenga un color o una
intensidad diferente a otras partes del portaobjetos.

5.- Hacer los ajustes de iluminación si es necesario.

6.- hacer girar hacia un lado el objetivo seco fuerte.

7..- Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y desplazar a su posición la lente de
inmersión en aceite. El objetivo debe tocar el aceite.

8.- Observar por el ocular y proceder como se indica en el paso 4.

Nota.- Cuando se trabaja con frotis bacterianos la tendencia general es pasar por alto los pasos 2 al 4 y
emplear directamente la lente de inmersión en aceite. Cuando esto se hace:

a.- El aceite se coloca sobre el portaobjetos y b.- La lente se hace descender hasta el aceite sin llegar a tocar el
portaobjetos. El enfoque se logra como se indica en los pasos 4 y 5. Para localizar bacterias en el portaobjetos
se deben buscar zonas de color o características de intensidad distintas.

9.- Dibujar e identificar un campo representativo del frotis de sangre y frotis bacteriano.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es la amplificación total que se puede obtener con el objetivo seco débil, seco fuerte y de inmersión?

2.- ¿Qué sucedió con la orientación original de la letra “e” cuando se movió el portaobjetos de la preparación.
a.- de lado a lado y b.- de arriba a abajo

3.- Establezca la diferencia entre poder de resolución y par focal.

4.- Desarrolla el procedimiento para preparar un frotis bacteriano.

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Práctica 4 Fecha:______/______/______

TINCIÓN SIMPLE Y TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

OBJETIVO
El estudiante conocerá y aplicará los métodos de tinción simple y diferencial de Gram.

INTRODUCCIÓN
Los tres colorantes más comúnmente usados en las tinciones microbiológicas son la Fuscina Fenicada,
el azul de metileno y el Violeta de genciana o Cristal violeta. Cualquiera de estas soluciones pueden ser
empleadas sola o combinadas con otros colorantes y productos químicos, en cualquiera de los muchos
métodos especiales de tinción.
Los microbiólogos dividen los colorantes en ácidos, básicos y neutros; con el uso de estos colorantes la
mayoría de las células bacterianas intactas se tiñen profundamente y uniformemente como en los núcleos de
las células de vegetales y animales superiores.
En las tinciones simples solamente se usa uno de estos tipos de colorantes para teñir las estructuras
celulares.
El método de coloración diferencial de Christian Gram sirve para dividir las bacterias en dos grupos:

a.- Los llamados organismos Gram positivos, que conservan el color morado del colorante de Cristal Violeta.

b.- Los organismos Gram negativos, que pierden el color morado y se colorean de rojo por contrate con el
colorante de Safranina.

En consecuencia, la coloración diferencial de Gram ayuda para la identificación de bacterias

desconocidas, éste método de coloración da mucha seguridad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
mediadas por bacterias.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Colorante - Grupo cromógeno
- Tinción - Grupo auxocrómico
- Coloración diferencial - Frótis
- Diagnóstico - Fijación de un frótis

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

1.- Los portaobjetos deberán de limpiarse con jabón y agua, enjuagarse bien para liberarlos de residuos de
jabón.

2.- Marque los portaobjetos de la siguiente manera:

A.- Tinción simple
B.- Tinción Gram Positiva
C.- Tinción Gram Negativa

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3.- Coloque una gota de solución salina en el centro del área marcada en el portaobjetos para preparar el frotis
(el área se marca con un marcador permanente de punta fina)

4.- Tome una asada del cultivo de E. coli y colóquelo sobre la gota de solución salina y distribúyala bien en
los portaobjetos A y C.
5.- Tome una asada del cultivo de Staphylococcus aureus y colóquelo sobre la gota de solución salina y
distribúyala bien en el árrea marcada en el portaobjetos B.

6.- Fije los frotis al calor indirectamente a la flama de un mechero, hasta que se observe seca la preparación,
evite que se caliente demasiado.

EXPERIMENTO 1
TINCIÓN SIMPLE
1.- Al portaobjetos marcado con la letra A coloque dos o tres gotas del colorante de azul de metileno por 60 a
90 segundos.

2.- Después de este tiempo, lave perfectamente bien con agua corriente (de la llave) procurando que el agua no
peque de lleno en la preparación del frotis.

3.- Seque la preparación al aire

4.- Enfoque la preparación al microscopio con los objetivos de 10X y 40X y observe la preparación con el
objetivo de 100X o de inmersión.

5.- Dibuje las imágenes vistas al microscopio y describa sus observaciones.

EXPERIMENTO 2
TINCIÓN DIFERENCIAL DE CHRISTIAN GRAM
1.- A los portaobjetos marcados con By C, agregue de 3 a 5 gotas del colorante de cristal violeta de Gram por
un término de 60 segundos.

2.- Lave la coloración con agua corriente procurando que el chorro no peque de lleno sobre la muestra.

3.- Añada a la preparación yodo de Gram por un término de 60 segundos y vuelva a lavar la preparación.

4.- Decolore la muestra con el preparado de alcohol – acetona al 50% (2 o 3 picetazos) y vuelva a lavar la
preparación.

5.- Por último añada el colorante de contraste de Safranina de Gram por un término de 10 a 30 segundos.

6.- Lave y seque la muestra, observe con objetivo de inmersión.

7.- Dibuje las imágenes vistas al microscopio y describa sus observaciones.

CUESTIONARIO
1.- Explique que es un colorante

2.- A que se denomina en un colorante el grupo cromógeno y el grupo auxocrómico

3.- En que consiste la tinción negativa de los microorganismos.

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4.- ¿Qué papel desempeña la pared celular en la tinción de Christian Gram

5.- ¿Pueden las células de levadura, animal y vegetal ser divididas en Gram positivas o Gram negativas?
Práctica 5 Fecha:______/______/______

TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE Y DE LA PARED BACTERIANA

OBJETIVO
El estudiante aprenderá la técnica que se utiliza para teñir los microorganismos que pertenecen al grupo
de los bacilos alcohol-ácido resistentes y de la tinción de la pared bacteriana en el microorganismo
Bacillus subtilis

INTRODUCCIÓN
La tinción ácido resistente se llama así debido a la naturaleza ácida del agente decolorante empleado
(una solución de HCl al 3% en alcohol etílico al 95%). Los organismos ácido resistentes son capaces de
retener el colorante primario a pesar de lo enérgico del procedimiento de decoloración; los organismos ácido
resistentes son capaces de retener el colorante primario debido a que este colorante es más soluble en las
sustancias lipoides presentes en estos organismos, que en la solución decolorante.
Otra característica de la tinción ácida resistente es el empleo de calor como agente intensificador del
colorante primario, de hecho el colorante primario es forzado a penetrar en la célula por medio de la aplicación
de calor hasta que el colorante empiece a vaporizarse, este procedimiento es necesario debido a que los
miembros de este grupo, poseen una concentración elevada de material graso en su citoplasma.
La pared celular bacteriana es una estructura que delimita la célula bacteriana, que está situada sobre
la membrana citoplasmática, la cual, a su ves, recubre el citoplasma. Por su parte externa, la pared está
rodeada por la cápsula, cuado ésta existe o por la capa mucoide pericelular.
Según Knaysi (1951) la existencia de la pared celular fue sospechada hacia 1872 por Cohn, que
atribuyo la resistencia dela célula bacteriana hacia la desintegración por parte de ácidos y álcalis, no la
insolubilidad del citoplasma sino la existencia de una membrana que ejercía una acción protectora.
La primera demostración directa de la pared celular es debida Fischer (1894), el cual se sirvió para tal
final del fenómeno de la plasmolisis, obteniéndose una patente separación de la pared celular del resto del
cuerpo bacteriano.
La propiedad fundamental de la pared celular es la rigidez; si no fuese así, las bacterias, por acción de
las fuerzas de tensión superficial relativamente enormes, estarían obligadas a tomar únicamente la forma que
corresponde a la mínima relación entre la superficie y volumen, esto es, la forma esférica, posee además de la
rigidez, otras importantes cualidades: la ductilidad y la elasticidad.
El espesor de la pared celular presenta amplias diferencias, no solo en relación con la especie
bacteriana, sino también con el método de medida; los valores medios que han sido obtenidos demuestran que
la pared celular ocupa una parte considerable del volumen total del organismo bacteriano.
Sus componentes principales son los hidratos de carbono (celulosa y hemicelulosa), algunas sustancias
nitrogenadas (quitina), proteínas, una fracción lipídica y en los organismos Gram – Positivos ácidos teicoicos,
a excepción del magnesio, no ha sido demostrada la presencia de metales.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Decolorante - Lípidos
- Agente intensificador - Mycobacterium
- Pared celular - Bacteria Gram positiva
- Bacteria Gram negativa

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1
TINCIÓN ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE
1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado marque un área con el marcador permanente.

2.- Prepare un frote con el esputo autoclaveado.

3.- Seque el frote al aire y fíjelo al calor.

4.- Coloque la preparación sobre una tela de asbesto en el tripie de metal.

5.- Cubra la preparación con el colorante de carbol – fucsina de Ziehl – Neelsen.

6.- Caliente la preparación con el mechero a la llama lenta, procurando que se desprendan vapores y no hierva
el colorante, evitando que el colorante se seque, agregue el colorante perdido continuamente.

7.- Continué calentando por 15 minutos, siempre agregando el colorante perdido.

8.- Después de este período de tiempo, lave la preparación con agua corriente hasta que se retire el exceso de
colorante.

9.- Decolore su preparación con el alcohol – ácido hasta que no se desprenda más colorante.

10.- Lave la preparación con agua corriente y después agregue el colorante de contraste (azul de metileno)
dejándolo actuar por 5 minutos.

11.- Lave la preparación con agua corriente, seque al aire y examine con el objetivo de inmersión.

12.- Dibuje las imágenes vistas al microscopio y describa sus observaciones.

EXPERIMENTO 2
TINCIÓN DE LA PARED DEL Bacillus subtilis
1.- Prepare un frote relativamente concentrado de B. Subtillis sobre un portaobjetos limpio
y desengrasado.

2.- Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos, cúbrala

directamente con la solución fosfomolíbdico y déjelo reaccionar cuatro minutos.

3.- Incline completamente el portaobjetos sobre el fregadero para drenar totalmente el ácido
fosfomolíbdico; luego agregue el colorante de verde de metilo directamente sobre el
frote húmedo y déjelo reaccionar durante cinco minutos.

4.- Lave suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se
desprenda del frote; trate de minimizar el desprendimiento, pero al mismo tiempo lave
bien hasta que el agua ya no arrastre colorante.

5.- Seque al aire, después examine con el objetivo de aceite de inmersión.

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6.- Si tiño correctamente, las paredes celulares aparecerán de un verde obscuro ó azul,
mientras que el citoplasma se vera de un verde claro ó bien incoloro.

7.- Con esta tinción es necesario examinar tres campos bien hasta encontrar al más
demostrativo.

8.- Dibuje las imágenes vistas al microscopio y describa sus observaciones.

CUESTIONARIO

1.- Mencione y explique las características que se relacionan con las bacterias ácido – resistentes.

2.- Explique por qué se considera el bacilo de Hansen (M. leprae) un bacilo ácido – resistente.

3.- ¿Qué sustancia o compuesto químico podría utilizar junto con el colorante para suprimir la utilización del
calor en la técnica.

4.- ¿ Cuál es función principal de la pared celular bacteriana?

5.- ¿ Cuál es la formula del ácido fosfomolíbdico?

6.- ¿ Que función desempeña el ácido fosfomolíbdico en la técnica de tinción para paredes celulares?

7.- ¿ Cuales son las principales diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativas y las
Gram positivas?

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Práctica 6 Fecha:______/______/______

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN SELECTIVOS, ENRIQUECIDOS,

DIFERENCIALES Y DE ENRIQUECIMIENTO.

OBJETIVO
El estudiante aprenderá el manejo de los diferentes tipos de medios de cultivo, de acuerdo a su
aplicación, así mismo, aplicará las técnicas correctas de preparación de medios de cultivo y de siembra
microbiológica.

INTRODUCCIÓN
Las distintas mezclas de sustancias nutritivas empleadas en el laboratorio microbiológico para el
cultivo de microbios se denominan medios de cultivo.
Existen muchos tipos de medios de cultivo que van desde los más simples, como el agar nutritivo,
hasta los agares más complejos como los medios enriquecidos y selectivos.
Los medios selectivos y diferenciales son los que utiliza el microbiólogo para el cultivo primario de
alguna muestra, a veces utiliza un medio preparado de modo que ponga de manifiesto las diferencias cuando
se inicia el desarrollo entre aquellos organismos que se quieren estudiar y otros gérmenes que puedan existir
en la muestra; los medios especiales y enriquecidos son los que se preparan enriqueciendo caldo o agar simple
con la adición de carbohidratos, sangre, suero sanguíneo, caseína digerida, extracto de levadura u otras
substancias nutritivas especiales.
Los medios sintéticos se utilizan para estudios precisos de nutrición y metabolismo; la mayoría de los
medios de cultivo utilizados se encuentran en el comercio en forma de polvos secos (deshidratados), los cuales
se transforma fácilmente en medios de cultivo por la adición de agua y su ulterior esterilización.
Los medios líquidos (caldos) se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodón o
tapas especiales, un cultivo líquido puede ser transferido mediante una asa microbiológica, un hisopo, una
pipeta o una pipeta Pasteur; el líquido se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos
los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el
líquido.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Medio selectivo - Medio enriquecido
- Medio de enriquecimiento - Microbio
- Germen - Medio diferecial
- Siembra microbiana - Mezclas

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1.- Lave y seque el material de vidrio y prepare las cajas de petri y tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón
de rosca para esterilizar.

2.- Cada equipo deberá preparar los medios de cultivo que se van a utilizar en la práctica (Agar Eosina-Azul
de Metileno, Agar S-110, Agar Base Sangre, Agar MacConkey, Caldo de Tioglicolato) de acuerdo a las
indicaciones de su instructor.

16
3.- Cada alumno preparará un tubo de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 15 ml de cada medio de cultivo
que se vaya a utilizar y esterilizará solo aquellos que lo requieran (ver indicaciones del empaque de cada
medio)

4.- Después de esterilizar el material de vidrio y medios de cultivo procederá a preparar una caja de petri con
cada agar que se vaya a sembrar por la técnica de estrias. Deje que los agares solidifiquen perfectamente.

5.- El caldo de tioglicolato manténgalo en el tubo con rosca hasta que se enfríe a temperatura ambiente.

6.- Divida la superficie de la caja en tres regiones del mismo tamaño y proceda a inocular la caja en cada área
marcada con el microorganismos que le corresponda:
En la parte A.- Inocular por siembra recta con Salmonella sp.
En la parte B.- Inocular por siembra recta con Escherichia coli
En la parte C.- Inocular por siembra recta con Staphylococcus aureus

7.- En el tubo de ensaye con caldo de tioglicolato inocular con cualquier microorganismo que elija el
estudiante.

8.- Rotula cada caja y tubo de ensaye con el número de equipo, grado y sección.

9.- Incubar las cajas de petri inoculadas en forma investida a 35º C ± 2 por 24 horas, el tubo con caldo de
tioglicolato incubarlo a la misma temperatura y tiempo, evitando que este se agite al observarlo.

10.- Al término de la incubación hacer sus dibujos y observaciones para realizar su reporte.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles de los medios de cultivo empleados son diferenciales. Enriquecidos, de enriquecimiento y
selectivos.

2.- ¿Qué importancia tiene ésta práctica para el estudio microbiológico?

3.- ¿Qué características tienen los microorganismos utilizados en este trabajo?

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Práctica 7 Fecha:______/______/______

TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN MEDIO SÓLIDO Y MÉTODO DE LA GOTA O DE

MILES Y MISRA

OBJETIVO
El estudiante aprenderá las técnicas de siembra por estrías en la superficie del agar para el aislamiento
de colonias microbianas y el método de Miles y Misra.

INTRODUCCIÓN
Los cultivos en agar u otro medio sólido realizados en cajas de petri se llaman cultivos en placa, con
frecuencia cuando aludimos a la caja de petri la llamamos simplemente placa.
La placa por estrías se inicia cuando el medio de agar estéril fundido y enfriado se vierte primero en
una caja de petri estéril y se deja que se solidifique completamente, después se siembra sobre la superficie del
agar sólido, haciendo sobre ella con el asa bacteriológica estrías, en este caso, el crecimiento sólo se producirá
en la superficie de la placa.
Algunas veces se siembra en una placa de agar, haciendo estrías y luego se trasvasa una pequeña
cantidad de agar fundido estéril, para formar una capa delgada sobre la superficie sembrada, este cultivo en
placa vertida y por estrías es muy apropiado para ciertos estreptococos parásitos y otras bacterias
microaerófilas.
El método de Miles y Misra consiste en colocar un número determinado de gotas de la muestra diluida
sobre las placas de agar seco, después de que las gotas son totalmente absorbidas por el agar, se invierten las
placas y se incuban. Después de la incubación se seleccionan las placas que tengan colonias aisladas en el área
en que se colocaron las gotas, de preferencia aquellas que contengan menos de 40 colonias por gota (el ideal
es de 10 a 20)

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Caja de petri - Microorganismo microaerófilo
- Agar – Agar - Medio estéril
- Microorganismos mesofílicos aerobios - Dilución
- Colonia microbiana

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1.- ESTRIADO EN PLACA

1.- Lave y esterilice una caja petri por miembro del equipo, posteriormente agregue 15 ml del agar estéril a
utilizar, el agar fue preparado previamente con las indicaciones de su instructor.

2.- Permita que se enfrié el medio de cultivo hasta unos 42º C antes de verterlo en las cajas de petri.

3.- Cubra la caja de petri con la tapa inmediatamente después de haber agregado el agar, déjela sobre la mesa
de trabajo hasta que solidifique.

4.- Inocule la caja, dibuje con el asa una serie de líneas estriadas sobre la superficie del agar (según se lo
indique su instructor)

5.- Debe tener cuidado de no penetrar la superficie del agar durante el sembrado.
18
6.- etiquete la caja de petri con el nombre de cada integrante del equipo, del grado y sección, incube las caja en
forma investida a 35º C ± 2 durante 24 horas.

7.- Al término de este tiempo saque las cajas de la incubadora, observe el crecimiento de las cajas e identifique
las características de cada colonia que observe.

8.- Haga sus dibujos y observaciones para realizar su reporte.

EXPERIMENTO 2.- MÉTODO DE MILES Y MISRA

1.- Con un marcador dividir la parte externa inferior de las 2 cajas de Perti con agar EMB en seis sectores.

2.- Marcar tres secciones de una caja con la dilución 10-1 y los otros tres con 10-2, tres sectores de la segunda
caja con la dilución 10-3 y los otros tres con la 10-4

3.- Con una de las pipetas Pasteur, tomar una muestra de la dilución 10-4, levantar la tapa de la caja, colocar la
pipeta en posición vertical y a una altura aproximada de 2 cm sobre la superficie del medio de cultivo,
dejar caer una gota en el centro de cada uno de los tres sectores que corresponden a esa dilución.

4.- Con otra pipeta inocular por triplicado la dilución 10-3 en los otros tres sectores, cuidando de colocar la
pipeta en cada ocasión en posición vertical y a la altura indicada.

5.- Inocular la segunda caja con las diluciones 10-2 y 10-1.

6.- Dejar que las gotas se absorban en el medio, invertir las cajas e incubar a la temperatura y durante el
tiempo adecuado para los microorganismos que se desea cuantificar, 35º ± 2 por 24 hrs.

7.- Después de la incubación, seleccionar los sectores que presenten entre 20 y 30 colonias y proceder a la
cuantificación de las mismas.

8.- Calcular el número de bacterias por mililitro o gramo de la muestra con la siguiente fórmula:
N x f
Número de bacterias por ml = ---------------------
V
En donde N = número promedio de colonias
f = inverso del factor de ilución
v = volumen de la gota

CUESTIONARIO
1.- ¿Qué importancia tiene para la microbiología la técnica de aislamiento por estrías?

2.- ¿Qué importancia tiene para la microbiología la técnica de placa vertida?

3.- ¿Qué otro tipo de técnica de aislamiento puede desarrollar usted?

4.- Investigue la importancia que tiene el análisis de Miles y Misra para la microbiología.

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Práctica 8 Fecha:______/______/______

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN AGAR PROFUNDO, AGAR INCLINADO Y

EXTENSIÓN EN PLACA

OBJETIVO
El estudiante aprenderá las técnicas de siembra microbiana en agares preparados en tubo de ensaye y
caja de Petri.

INTRODUCCIÓN
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de
cultivo y condiciones de laboratorio controladas; para ello los medios de cultivo se pueden preparar en caja de
petri o tubos de ensayo.
Los medios semisólidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja (asa recta) o con pipeta; en este
último caso es necesario calentar el medio (baño maría) y cuando se encuentra en estado líquido y a una
temperatura de 42º C se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para
estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con
diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos se preparan en tubos, después de esterilizarlos, estos se inclinan sobre una hilera de
pipetas de 5 ml para desarrollar el pico de flauta o inclinación del agar, la siembra se realiza con el asa
bacteriológica rayando la superficie del agar y con suavidad, tratando de que las colonias se desarrollen en
forma aislada.
Para la extensión en superficie se emplean placas con el medio sólido adecuado, sobre estas se coloca
un pequeño volumen de la muestra, el que se mide con una asa calibrada o con una microjeringa y se extiende
sobre la superficie con el asa de Drigalski.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Siembra microbiana - Inóculo
- Colonia microbiana - Agar semisólido
- Agar inclinado

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A.- SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN PLACA DE AGAR
1.- Preparar tres cajas de Petri con agar nutritivo, dejar solidificar el medio.

2.- De la dilución 10-1 tomar 0.1 ml de ella con una pipeta y dejarla en el centro de la caja marcada con la
dilución 10-1, hacer lo mismo con las diluciones 10-2 y 10-3, colocarlas en el centro de sus cajas
correspondientes.

3. A continuación con el asa de Drigalski extender cada una de las muestras sobre la superficie del medio,
hacerlo de tal manera que se este seguro de una homogenización en el medio.

4.- Esperar un momento hasta que se haya absorbido la muestra extendida en el medio.

5.- Invertir las cajas e incubar a 35º ± 2 por 24 hrs.

6.- Después de este tiempo contar el número de colonias desarrolladas en la superficie y calcular el número de
20
 microorganismos por mililitro de la muestra.

B.- SIEMBRA POR PICADURA (AGAR PROFUNDO)

1.- Siga las instrucciones anteriores (siembra en medio líquido), coloque en un tubo con agar semisólido e
inocúlelo con el asa recta.

C.- SIEMBRA EN UN MEDIO INCLINADO (AGAR EN PICO DE FLAUTA)

1.- Siga las instrucciones anteriores y en los tubos que contienen el agar inclinado, inocule el microorganismo
problema con el asa bacteriológica, siembre por estrías (siga las instrucciones de su instructor para el
sembrado)

12.- Al finalizar las técnicas A, B y C los tubos inoculados se incuban a 35º C ± 2 en forma vertical,
realizando sus observaciones a las 24 horas.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué ventajas y desventajas presentan las técnicas empleadas en esta práctica.

21
Práctica 9 Fecha:______/______/______

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

OBJETIVO
El estudiante aprenderá la técnica de determinación de número más probable (NMP) para la
identificación de organismos coliformes en cualquier muestra problema en la que se desee conocer la carga
microbiana de estas bacterias

INTRODUCCIÓN
En la técnica del NMP (también denominada prueba de fermentación por tubos múltiples), las
bacterias coliformes pueden aislarse y enumerarse usando medios selectivos y técnicas de dilución standard y
placa. La identificación de bacterias coliformes específicas en los alimentos y muestras de agua, por lo
general, no se requiere, sino que normalmente se enumeran como coliformes totales y posiblemente como
coliformes fecales, en medios de cultivos líquidos, usando la técnica del NMP.
Esta técnica requiere de diluciones decimales previas, y siendo un método de probabilidad estadística,
no es una enumeración de la población como tal, sino que es una estimación del número de microorganismos,
nos dan el resultado observado en una prueba de fermentación por tubo múltiple de la muestra.
Puesto que el NMP es una estimación basada en la probabilidad estadística, el grado de seguridad o
confiabilidad de la estimación, aumenta con el número de réplicas de los tubos inoculados, de cada dislución.
Las tablas del NMP en un conjunto de tubos que resulten positivos, da un límite de confiabilidad del
95%. La selección de la serie de 3, 4 ó 5 tubos, generalmente se determina por los propósitos y la muestra a
analizar.
La U. S. Public Health Service, requiere de un mínimo de una serie de 5 tubos por dilución, para el
examen bacteriológico de la calidad de agua potable. Por otro lado, a veces, se acepta una serie de 3 tubos,
como mínimo, para otros exámenes de agua o alimentos.
Generalmente las inoculaciones son de 10, 1.0 y 0.1 gramos o mililitros de la muestra por tubo, en una
serie, no obstante se pueden utilizar diluciones decimales, usándose el factor de dilución o conversión
apropiado.
Al seleccionar cuidadosamente el medio de cultivo y el resultado específico, el cual es una indicación
de que el microorganismo está presente en la muestra, se puede realizar el análisis de NMP, aunque existan
otros microorganismos.
Por ejemplo, los coliformes se pueden estimar por el crecimiento y la producción de gas durante la
fermentación de caldo lactosado, después de incubarse a 35º C ± 2 durante 24 horas.

CONCEPTOS ANTECEDENTES
- Caldo lactosado - Coliformes
- Fermentación de lactosa - Agua residual

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A.- PPRUEBA PRESUNTIVA.- SIEMBRA EN UN MEDIO LÍQUIDO (CALDO LACTOSADO) EN
TUBOS DE 18 X 150 mm CON TUBO DE FERMENTACIÓN DE DURHAN

1.- En una gradilla prepare tres series de 3 tubos de ensaye de 18 x 150mm con tapón de rosca que contengan
10 ml de caldo lactosado y un tubo de fermentación de durhan invertido. La primer serie de 3 tubos deberán
estar preparados a una doble concentración de caldo lactosado.

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Nota.- Poner atención a las indicaciones del instructor para preparar estos tubos con su campana de
fermentación.

2.- De la muestra problema homogenizada, con una pipeta de 10 ml estéril, transferir 10 ml de ella a cada tubo
de la primera serie preparada a doble concentración de caldo lactosado.

3.- Con la misma pipeta, trasfiera 1 ml de la muestra a cada tubo de la segunda serie de tubos preparados con
caldo lactosado a concentración sencilla.

4.- Con una pipeta de 1 ml estéril, transfiera 0.1 ml de la muestra a cada uno de los tubos de la tercera serie
preparados con caldo lactosado a concentración sencilla.

5.- Incube los tubos durante 24 a 48 horas a 35º C ± 2, la presencia de gas en el tubo de durhan (campana de
fermentación) en cualquier cantidad de tubos dentro de las 48 horas siguientes hace la prueba positiva.

B.- PRUEBA CONFIRMATORIA PARA GRUPO COLIFORME

1.- Sub cultive todos los tubos positivos de caldo lactosado que muestren gas dentro de las 48 horas en caldo
bilis verde brillante por medio de 2 o 3 asadas.

2.- Incube todos los tubos de caldo bilis verde brillante a 35º C ± 2 por 48 horas.

3.- Registre todos los tubos de caldo bilis verde brillante que muestren gas y refiera a las tablas NMP. Reporte
los resultados como NMP confirmado de bacterias coliformes por gramo o mililitro de muestra.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué ventajas y desventajas presentan la técnica empleada en esta práctica?

23
Práctica 10 Fecha_____/_____/_____

ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA DE LEVADURAS Y HONGOS, CULTIVO DE HONGOS

OBJETIVO
Observar la morfología general de la levadura Sacharomyces cerevisiae y las estructuras anatómicas
básicas de los hongos imperfectos, así como su cultivo.

INTRODUCCIÓN
Entre mohos y levaduras no hay una distinción patente, se han definido las levaduras como hongos
cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular. Las células de levadura son esféricas, elípticas
y cilíndricas, su tamaño varia notablemente. El protoplasma de la célula de levadura está incluido en una pared
celular y por una membrana citoplasmática, y contiene un núcleo, una gran vacuola y numerosos gránulos y
glóbulos de grasa; no se encuentran flagelos u otros órganos de locomoción.
La pared celular está compuesta por una membrana externa densa, y una capa menos densa; la parte
interna de la pared a su vez se subdivide en tres capas. El núcleo es menor de una milimicra de diámetro;
prácticamente no se conoce su estructura interna; el protoplasma de las células jóvenes en crecimiento
prácticamente carece de gránulos y glóbulos de sustancias de reserva, pero ulteriormente, al terminar el
crecimiento se acumulan gran número de ellos, en el protoplasma de la levadura se han observado gránulos de
proteínas. La gran vacuola paranuclear contiene una solución o suspensión de volutina, que también se
encuentra en hongos superiores y en bacterias; la volutina puede faltar en cultivos muy recientes, abunda en
los cultivos antiguos y desaparece durante la formación de esporas.
Las levaduras se dividen naturalmente en dos grupos, según sus métodos de reproducción; un grupo de
divide o reproduce por germinación y formación de esporas y el otro por gemación; el primero pertenece a los
Ascomicetos y los segundos a los Hongos imperfectos Las levaduras tienen gran importancia Industrial,
suelen utilizarse en la preparación de bebidas alcohólicas (Saccharomyces cerevisiae), en la preparación de
leches fermentadas y en la producción de algunos quesos, entre otros usos.
Las talofitas suelen dividirse en tres grupos: 1)algas, 2)hongos y 3)líquenes. Los hongos muchas veces
son filamentosos, por lo menos en estructura microscópica, a veces unicelulares; hay cinco clases principales
de ellos: Myxomycetes, Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes u hongos
imperfectos; los términos mohos y levaduras no tienen significación taxonómica. Son denominaciones
corrientes para formas que no pueden definirse netamente. Suelen describirse los mohos como hongos
filamentosos multicelulares en que los filamentos, hifas, se ramifican y a veces se unen para formar una masa
enmarañada; cualquier parte grande de la misma se conoce como micelio; suelen distinguirse dos tipos de
hifas fecundas.
Muchas hifas de mohos están divididas por tabiques transversales o septa en células independientes, y
cada una de ellas contienen uno o más núcleos, las hifas de otos mohos son poco tabicadas y son
esencialmente tubos largos que contienen protoplasma con numerosos núcleos dispersos, donde se pueden
observar corrientes protoplasmáticas activas, son las hifas cenocíticas. Las células de mohos individuales
poseen paredes rígidas que rodean al citoplasma; el protoplasma está incluido en una membrana citoplásmica
semipermeable y contiene uno o más núcleos pequeños, además de vacuolas, gránulos y gotitas. Las células
del moho suelen ser cilíndricas y su tamaño es variable, no se ha observado fácilmente el núcleo de los mohos;
se necesita emplear para ello métodos especiales de coloración. El crecimiento de los mohos de inicia por
germinación de una espora o aumento de tamaño de cualquier fragmento de hifa que llega a un substrato
adecuado que tengo circunstancias apropiadas de temperatura, humedad y aire. El crecimiento es rápido en un
medio favorable, algunas especies crecen más lentamente y necesitan una o dos semanas para producir
colonias.

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 Algunos mohos crecen abundantemente y producen un micelio algodonoso que llena cualquier
recipiente que lo contenga. El crecimiento del micelio, de los mohos continua indefinidamente en medio
favorable; las hifas antiguas mueren y se desintegran y aparecen nuevas.
|
CONCEPTOS ANTECEDENTES

-Hongos -Hifa
-Conidio -Micelio
-Moho -Septo
-Fermentación -Levadura

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PARTE 1

1.- Prepare un frote de regular densidad con las células de levadura en aguas destilada seque al aire.

2.- Fije a la flama muy suavemente.

3.- Bañe la preparación durante un minuto con la solución de etanol al 40%. Lave con agua corriente.

4.- Bañe el frote con solución de KOH 0.1M y déjelo reaccionar por una hora; sí sé empieza a deshidratar,
agregue más KOH, lave con agua corriente.

5.- Aplique a la preparación el azul de toluidina por dos minutos.

6.- Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire.

7. - Prepare un segundo portaobjetos como el anterior pero preceda únicamente hasta él tercer paso.

8.- Aplique el azul de toluidina por dos minutos y continúe como en el primer frote.

9.- Compare ambas preparaciones.

10.- Examine las preparaciones con el objetivo de inmersión y dibújelas.

11.- Los núcleos se tiñen de azul oscuro ó rosa y el citoplasma de un rosa mucho más claro.

12.- Prepare un montaje húmedo usando Yodo de Gram. en vez de agua.

13.- Trate de detectar los gránulos y las estructuras internas tales como grandes vacuolas.

14.- Observe con el objetivo de alto poder en seco y con el de inmersión.

PARTE 2

1.- Vierta el medio de cultivo Agar Sabouraud y Agar Patata Dextrosa (PDA) en las cajas
Petri estériles

2.- Déjelos que solidifiquen

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3. - Inocule las placas de agar con la muestra contaminada de los hongos que se va a
estudiar (se recomienda de algún alimento)

4.- Incubar las cajas inoculadas a 35º C durante 48 hrs.

5.- Prepare montajes húmedos con los hongos que hayan crecido en las placas de agar

6.- Use KOH al 10% y colorante de Azul Algodón Lactofenol

7.- Observe al microscopio en objetivo seco fuerte y de inmersión

8.- Dibuje sus resultados en lo referente al tipo de hifas y cuerpos reproductivos, así como
las características del crecimiento en la placa, forma y coloración.

CUESTIONARIO
1.- ¿ En que radica la importancia del estudio de las levaduras?

2.- Investigue algunos de los usos comerciales de las levaduras

3.- Investiga las formas de reproducción de las levaduras.

4.- ¿Qué importancia tiene el estudio de la presencia de hongos en un alimento?

5.- ¿Cuáles son las estructuras principales de los hongos?

6.- ¿Cree usted que existen hongos en el aire? Explique

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