LAPORAN III

FRAKSINASI

EKSTRAK DAUN JAMBU BIJI (Psidium guajava)

DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

1. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi ekstrak tumbuhan dengan

kromatografi kolom.

2. DASAR TEORI

Prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari

jaringan tumbuhan yang kering (galih, biji kering,akar,daun) adalah dengan
mengekstraksi serbuk bahan dengan alat Soxhlet dengan menggunakan sederetan
pelarut secara berganti-ganti, mulai dengan eter, lalu eter minyak bumi,dan kloroform
(memisahkan lipid dan terpenoid). Kemudian digunakan alkohol dan etil asetat
(untuk senyawa yang lebih polar). Metode ini berguna bila kita bekerja dengan skala
gram. Tetapi jarang sekali kita mencapai pemisahan kandungan secara sempurna, dan
senyawa yang mungkin saja terdapat (dalam perbandingan yang berbeda) dalam
beberapa fraksi.
Bila terdapat senyawa tunggal, kristal dapat dimurnikan dengan
mengkristalkan kembali, dengan demikian bahan tersedia untuk analisis lebih lanjut.
Kebanyakan kristal tersebut berupa campuran sehingga perlu dipisahkan dan
dilarutkan kembali dalam pelarut yang sesuai dengan kandungannya yang dipisahkan
dengan cara kromatograrfi. Banyak juga senyawa yang tetap berada dalam cairan
induk, dan inipun harus difraksinasi dengan kromatografi. Sebagai tindakan
pencegahan baku untuk mencegah kehilangan senyawa, ekstrak pekat harus disimpan
dalam lemari es dan ditambahkan toluen untuk mencegah pertumbuhan jamur.
Untuk mendapatkan isolat murni dari ekstrak suatu tumbuhan perlu
dilakukan pemisahan dan pemurnian, karena ekstrak mengandung berbagai
komponen. Pemisahan atau separasi adalah suatu langkah operasional untuk
memisahkan komponen yang dituju dari komponen-komponen lainnya. Ada beberapa
metode separasi yaitu ekstraksi (solvent extraction), destilasi, kristalisasi dan
kromatografi.

1. Ekstraksi
Pemisahan dengan menggunakan dua pelarut yang tidak saling campur.
Prinsip pada pemisahan ini didasarkan pada perbedaan kelarutan komponen yang
akan diambil terhadap dua pelarut tersebut (koefisien distribusi). Pemisahan
dilakukan dengan menggunakan corong pisah, digojog dan didiamkan. Kekuatan dan
lama penggojogan sangat berpengaruh terhadap hasil ekstraksi.
2. Destilasi
Pemisahan dengan cara destilasi dilakukan berdasarkan perbedaan titik didih
dari komponen-komponen yang akan dipisahkan. Campuran komponen yang akan
dipisahkan diletakkan pada sebuah labu destilasi dan dipanaskan hingga menguap.
Dengan adanya pendingin, komponen-komponen akan mengembun dan terpisah dari
campurannya.

3. Kristalisasi
Kristalisasi dilakukan apabila komponen yang kita tuju dapat dikristalkan
sedangkan komponen pengotor lainnya tidak mengkristal. Cara ini cukup sederhana
dilakukan dengan cara melarutkan campuran komponen pada pelarut yang sesuai
kemudian didinginkan hingga terbentuk kristal, lalu kristal dipisahkan dari campuran
tersebut.

4. Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan fisik campuran komponen
dalam suatu sampel (ekstrak), berdasarkan pada perbedaan migrasi komponen
tersebut dari fase diam oleh pengruh fase gerak

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik
kromatografi tersebut, yaitu :
1. KKt (Kromatografi Kertas)
2. KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
3. KG (Kromatografi Gas)
4. KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat
kelarutan dan keastirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama
bagi kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam
amino, basa asam nukleat, asam organik, dan senyawa fenolat.
KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang
larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana,dan klorofil.
Sebaliknya, teknik ketiga yaitu KGC. Penggunaan utamanya ialah pada pemisahan
senyawa astiri yaitu: asam lemak, mono dan sesquiterpena, hidrokarbon, dan senyawa
belerang. Tetapi, keatsrian kandungan tumbuhan yang bertitik didih tinggi dapat
diperbesar dengan mengubahnya menjadi ester dan atu eter trimetilsilil sehingga
hanya ada sediit saja golongan yang sama sekali tidak cocok dipisahkan dengan cara
KGC.
 Cara lain yaitu KCKT, dapat memisahkan kandungan yang keatsirianya
kecil. KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan keefisienan kolom dan
kecepatan analisis. Disamping itu, perlu dikemukakan bahwa ada tumpang tindih di
atas. Sering gabungan KKt dan KLT, KLT dan KCKT, atau KLT dan KGC mungkin
merupakan pendekatan terbaik untuk memisahkan golongan senyawa tumbuhan
tertentu. Semua teknik tersebut dapat digunakan pada skala mikro maupun makro.
Untuk pekerjaan penyiapan, KLT dilakukan pada lapisan penjerap yang tebal, dan
KKt pada lembaran kertas saring yang tebal. Untuk isolasi pada skala yang lebih
besar dari itu, biasanya digunakan kromatografi kolom yang digabungkan dengan
pengumpul fraksi otomatis. Prosedur ini akn menghasilkan senyawa murni dalam
skala gram.
Suatu teknik lain yang pemakaiannya agak luas dalam fitokimia adalah
elektroforesis. Pada mulanya teknik hanya dapat digunakan untuk senyawa yang
bermuatan, yaitu asam amino, beberapa alkaloid, amina asam organic, dan protein.
Tetapi, selain itu golongan senyawa netral tertentu (gula, fenol) dapat diusahakn
bergerak dalam medan listrik dengan mengubahnya menjadi senyawa kompleks
logam (misalnya dengan mengunakan natrium borat). Sergent (1969) telah menyusun
suatu pengantar teknik elektroforeis yang sederhana. Disamping teknik yang telah
dikemukakan, beberapa teknik lain kadang-kadang digunakan pada penelitian
fitokimia. Pemisahan dengan eksraksi cair-cair sederhana masih tetap bermanfaat
dibidang karotenoid. Alat untuk ekstraksi cair-cair otomatis berupa alat sebar lawan
arus Craig telah ada sejak lama, tetapi ada kecenderungan alat tersebut barudigunakan
sebagai usaha akhir bila teknik lain gagal. Alat yang lebih menyenangkan untuk
ekstraksi cair-cair telah dikembangkan baru-baru ini, yang dinamai kromatografi
lawan-arus tetes (KLAT) yang digunakan pada skala penyiapan. Pengunaannya
terutama untuk memisahkan kandungan yang larut dalam air (Hostetman, 1981).
Pemisahan protein tumbuhan dan asam nukleat sering memerlukan teknik khusus
yang belum disebutkan, seperti penyaringan melalui gel ‘Sephadex’, kromatografi
afinitas, dan ultra-pemusingan diferensial.

a. Kromatografi Kertas (KKt)

Keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaannya pada

pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku
sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Selain itu keterulangan
bilangan Rf yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rf merupakan parameter
yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Memang untuk
senyawa antosianin yang tidak mempunyai ciri fisik lain yang jelas, Rf adalah
sarana terpenting dalam memaparkan dan membedakan pigmen yang satu dengan
 pigmen yang lain (Harborner, 1967). Air murni ialah pengembang kromatografi
yang sungguh-sungguh serba guna dan dapat dinakan untuk memisahkan Purina
dan pirimidin biasa, dan secara umum dapat dipakai juga untu senyawa fenol dan
glikosida tumbuhan. Pada KKt, senyawa biasanya dideteksi sebagai bercak
berwarna atau bercak berfluoresensi-UV setelah direaksikan dengan pereaksi
kromogenik yang digunakan sebagai pereaksi semprot atau pereaksi celup. Untuk
lembaran besar, pencelupan biasnya lebih mudah tetapi susunan pereaksi semprot
harus diubah agar mudah kering, dan dengan demikian mencegah difusi waktu
pencelupan. Selanjutnya kertas dapat dipanaskan untuk menimbulkan warna.
Bilangan Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi,
nisbi terdapat garis depan. Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak antara
titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, jarak ini kemudian dibagi
dengan jaerak antara titik awal dengan garis depan (yaitu jarak yang ditempuh
cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan terletak antara 0,01
dan 0,99.

b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kelebihan KLT dibanding dengan KKt ialah keserbagunaaan, kecepatan,

dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa
disamping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada
pelat kaca atau penyangga lain da digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT
yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan
pada pelat dan merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa labil.
Sedangkan kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputan pelat kaca
dengan penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan adanya penyaput
otomatis. Jenis KLT yang paling baru ialah KLT yang menggunakan pelat
bersaputkan mikropartikel silica yang halus yang biasa digunakan untuk kolom
KCKT. Kromatografi yang demikian disebut Kromatografi Lapis Tipis Kinerja
Tinggi (KLTKT) dan biasanya menghasilkan pemisahan yang lebih efisien dan
lebih cepat dari pada pemisahan pada lapisan silica yang biasa. KLT preparative
dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1mm) sebagai pengganti
lapisan penjerap yang tipis (0,10-0,25 mm).

c. Kromatografi Gas (KG)

KG dinyatakan dengan volume retensi Rv, yaitu volume gas pembawa

yang diperlukan untuk mengelusi suatu komponen dari kolom, atau dinyatakan
dengan waktu retensi Rt, yaitu waktu yang diperlukan untuk mengelusi komponen
dari kolom. Kedua parameter ini hamper selalu dinyatakan nisbi terhadap senyawa
baku (sebagai RRv atau RRt) yang dapat ditambahkan kedalam ekstrak cuplikan
atau dapat berupa pelarut yang digunakan untuk melarutkan cuplikan. Perubahan
utama dalam KG adalah sifat fase diam dalam kolom dan suhu kerja. Keduannya
diubah-ubah menurut kepolaran dan keastirian senyawa yang dipisahkan. Banyak
golongan senyawa dibuat turunnnya secara rutin (terutama menjadi eter
trimetilsilil).
Radas yang diperlukan untuk KG sangat canggih dan mahal dibandingkan
radas untuk KLT atau KKt. Tetapi pada prinsipnya KG tidaklah lebih rumit dari
prosedur kromatografi yang lain.
Radas KG mempunyai empat bagian utama berikut:
1. Kolom
Berupa pipa kecil yang panjang (misalnya 3m x 1mm), biasanya
terbentuk dari logam yang berbentuk gelungan untuk menghemat ruang. Kolom
ini dikemas dengan fase diam (misalnya silikon 5-15%) yang melekat pada
serbuk lembam. Kemasan tersebut bukanlah suatu keharusan karena dapat pula
digunakan cara lain seperti kolom silika terbuka. Disini fase diam disaputkan
film pada permukaan kolom bagian dalam (KG kapiler)
2. Pemanas
Disediakan untuk memanaskan kolom secara meningkat, mulai dari
50-350°C dengan laju baku. Bila perlu suhu dapat dipertahankan pada batas
tertinggi. Suhu di tempat masuk kolom dikendalikan terpisah sehingga cuplikan
dapat diuapkan dengan cepat ketika diteruskan ke kolom. Cuplikan yang
dilarutkan dalam eter atau heksana disuntikkan jarum semprit ke dalam gerbang
masuk melalui septum karet.
3. Aliran Gas
Terdiri atas gas pembawa yang lembam seperti nitrogen dan argon.
Pemisahan senyawa dalam kolom bergantung pada pengaliran gas ini melalui
kolom dengan laju aliran yang terkendali.
4. Gawai Pendeteksi
Diperlukan untuk mengukur senyawa ketika senyawa itu dialirkan
melalui kolom. Sering pendeteksian didasarkan pada pengionan nyala atau
tangkap-elektron. Cara pertama memerlukan tambahan gas hidrogen dalam
campuran gas dan akan terbakar habis dalam pendeteksi yang sebenarnya.
Gawai pendeteksi dihubungkan dengan perekam potensiometri yang
memberikan hasil pemisahan berupa serangkaian puncak yang berbeda-beda
kekuatannya.
 Hasil KG dapat dinyatakan dengan volume retensi Rv, yaitu volume gas
pembawa yang diperlukan untuk mengelusi suatu komponen dari kolom, atau
dinyatakan dengan waktu retensi Rt, yaitu waktu yang diperlukan untuk mengelusi
komponen dari kolom. Kedua parameter ini hampir selalu dinyatakan nisbi
terhadap senyawa baku (Sebagai RRv atau RRt) yang dapat ditambahkan ke dalam
ekstrak cuplikan atau dapat berupa pelarut yang digunakan untuk melarutkan
cuplikan. Perubah utama dalam KG adalah fase diam dalam kolom dan suhu kerja.
Kedua-duanya diubah-ubah menurut kepolaran dan keatsirian senyawa yang
dipisahkan. Banyak golongan senyawa dibuat turunannya secara rutin (terutama
menjadi eter trimetilsilil) sebelum dikromatografi gas, karena dengan demikian
memungkinkan pemisahan pada suhu yang lebih rendah.
Alat KG dapat disusun sedemikian rupa sehingga komponen yang
dipisahkan dapat dianalisis dengan cara spektrometri atau dengan cara lain. Yang
paling sering dilakukan adalah menghubungkan KG dengan spektrometer massa
(SM). Radas gabungan KG-SM ini telah muncul pada tahun-tahun belakangan ini
sebagai cara terpenting dari semua cara analisis fitokimia.

d. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT dapat disamakan dengan KG dalam hal kepekaan dan

kemampuannya menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja
saja. Perbedaannya ialah fase diam yang terikat pada polimer berpori terdapat
dalam kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil, dan fase gerak cair
mengalir akibat tekanan yang besar. Alat KCKT lebih mahal dari pada KG,
terutama karena diperlukan system pompa yang cocok serta semua sambungan
harus disekrup agar menahan tekanan. Fase geraknya adalah campuaran pelarut
yang dapat bercampur. Campuran ini dapat tetap susunannya (pemisahan
isokratik) atau dapat diubah perbandingannya secara sinambung dengan
menambahkan ruang pencampur kepada susunan alat (elusi landaran). Senyawa
dipantau ketika keluar dari kolom dengan menggunakan pendeteksi, biasanya
dengan mengukur spectrum serpan UV. Dapat ditmbahkan pemadu (integrator)
untuk mengolah data yang dihasilkan dengan mikro prosesor.
Perbedan utama antara KCKT dan KG ialah bahwa cara pertama biasanya
dilakukan pada suhu kamar sehingga senyawa tidak mendapat perlakuan yag
memungkinkan terjadinya tata susun ulang termal selama pemisahan. Tetapi,
mungkin saja pengendalian suhu kolom KCKT menguntungkan pada pemisahan
kritis sehingga mungkin diperlukan selubung yang dikendalikan dengan
thermostat. Kolom, yang biasanya dikemas dengan partikel bulat kecil yang
terbuat dari silica yang berlapiskan atau berkaitan dengan fase diam, terutama peka
 terhadap cemaran. Dengan demikian ekstrak tumbuhan perlu dimurnikan dan
disaring sebelum disuntikkan kedalam pangkal kolom.
KCKT digunakan terutama untuk golongan atsiri, misalnya terpenoid
tinggi, segala jenis fenol, alkolid, lipid, dan gula. KCKT berhasil paling baik untuk
senyawa yang dapat dideteksi didaerah spectrum UV atau spectrum sinar tampak.
Untuk gula yang tidak menunjukkan serapan UV dapat digunakan pendeteksi
indeks bias, tetapi kepekaannya lebih rendah. Protein telah dipisahkan dengan
KCKT dengan menggunakan kolom ‘sephadex’ yang dimodifikasi dengan silica
gel atau penukar ion.
Sebagian besar pemisahan dengan KCKT modern mengunakan kolom
siap pakai, dan berbagai jenis kolom ii disediaakan oleh pabrik. Tetapi,
kebanyakan pemisahan dapat dilakukan dengan menggunakan kolom partikel
silica mikropori (untuk senyawa nonpolar) atau kolom fase balik, yaitu fase-ikat
C18 (untuk senyawa polar) Hamilton dan sewell, 1982. satu hal praktis terakhir
yang patut disebutkan yaitu pelarut harus ultramurni. KCKT merupakan cara
kromatografi paling baru yang ditambahkan kedalam perlengkapan fitokimiawan.
Terlepas dari biaya alat dan pelarut, KCKT memberi harapan sebagai alat
terpenting dan serba guna pada analisis kuantitatif tumbuhan. Namun demikian,
KCKT harus dapat membuktikan kegunaannya pada skala preparatif.

3. ALAT :

- Beaker glass
- Gelas ukur
- Labu alas bulat
- Lempeng KLT
- Bak kromatografi
- Erlenmeyer
- Glass wool
- Glass colum
- Vial 5 mL
- Mikropipet
- Lampu UV 254 nm dan 365 nm

4. BAHAN :
 - Ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava)
- Etanol 96 %
- Metanol
- HCl 57%
- Kloroform
- Aseton
- Asam formiat
- Silika gel

5. CARA KERJA :

a. Preparasi ekstrak

Sampel 0,3 gram

↓
Ditambah 25 mL metanol dan 0,7 mL HCl 57% v/v

↓
Hidrolisis selama 30 menit pada suhu 700C (menggunakan refluks)

b. Pemilihan eluen untuk fraksinasi

Standar kuersetin dan ekstrak daun Psidium guajava

↓
Cuci kemudian larutkan dalam etanol 96 %
↓
Totolkan 2-5 mikro Liter
↓
Lempeng KLT
↓
Eluasi dengan eluen kloroform : aseton : asam formiat = 150 : 33 : 17
↓
Eluasi sampai tanda batas
↓
Amati lempeng
↓
 Lampu UV 254 nm dan 365 nm

c. Fraksinasi dengan kromatografi kolom

Silica gel 100 kali bobot ekstrak daun Psidium guajava

↓
Masukkan Erlenmeyer
Tambahkan ± 2 cm
↓
diatas permukaan silica gel
Eluen
↓ Kocok pelan merata, lalu masukkan
Kolom kromatografi
↓ Diamkan selama 1 hari
Tambahkan eluen sampai 0,5 cm diatas permukaan silica gel
↓ Tambahkan
Ekstrak daun Psidium guajava (1% bobot silica)
↓ Alirkan dan tampung ± 50 mL
Erlenmeyer
↓ Sisihkan
Buka kran kembali (1 tetes/detik) dan tampung
↓
Vial 20 mL
↓ Tiap vial diuji dengan KLT
Noda yang sama digabungkan dalam satu vial

6. HASIL PENGAMATAN

a. Preparasi Ekstrak
Beaker glass + ekstrak = 34,1341 gram
Beaker glass = 33,7822 gram
Berat ekstrak = 0,3519 gram

b. Pembuatan Eluen
Eluen dibuat 100 mL dengan perbandingan kloroform : aseton : asam format =
150 : 33 : 17

c. Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom

Penampungan sampel 10 vial masing-masing berisi 20 mL.
Sampel vial no.1 – 3 : kolom masih baik
Sampel vial no.4 – 10 : kolom sudah pecah

Uji dengan KLT : vial no.6 mengandung Kuersetin

7. PEMBAHASAN

Fraksinasi adalah pemisahan suatu golongan senyawa dalam suatu simplisia

menjadi senyawa yang lebih sederhana. Sebelum dilakukan fraksinasi, maka ekstrak
harus dipreparasi dulu. Ekstrak sebanyak 0,3 gram dicampurkan dengan 25 mL
metanol dan 0,7 mL HCl 57% v/v dalam labu alas bulat. Lalu dihidrolisis selama 30
menit pada suhu 70 0C menggunakan refluks. Kuersetin di dalam tumbuhan
berbentuk glikosida, dimana glikonnya adalah glukosa sedangkan aglikonnya adalah
kuersetin. Glikon dan aglikon ini diikat oleh ikatan glikosidik. Untuk keperluan
identifikasi, maka ikatan glikosidik ini harus diputus. Hidrolisis dengan
menggunakan refluks berfungsi intuk memutuskan ikatan glikosidik antara glikon
dan aglikon.
Prinsip kerja refluks ialah mendidihkan ekstrak hingga menjadi uap
kemudian uap ekstrak tersebut bergerak naik menuju ke kondensor dan diembunkan
kembali oleh kondensor. Dengan adanya pemanasan tinggi, maka diharapkan ikatan
glikosidik kuersetin akan terputus. Hasil hidrolisis ekstrak disaring dengan kertas
saring lalu disimpan dalam cawan bertutup.
Setelah itu, dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom. Mula-mula
silika gel sebanyak 100 kali bobot ekstrak dimasukkan dalam erlenmeyer dan
ditambahkan eluen 2 mL di atas permukaan silika gel tersebut. Campuran dikocok
perlahan dan dimasukkan hati-hati ke dalam kolom kromatografi yang bagian
bawahnya sudah diberi glass wool. Penuangan campuran silika gel dan eluen ke
dalam kolom kromatografi tidak boleh terlalu cepat ataupun terlalu lambat, tetapi
sebaiknya konstan (tetap). Karena jika ada udara yang terperangkap dalam kolom
dapat menyebabkan kolom tersebut retak/pecah. Kolom dibiarkan selama satu hari
untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan. Jika kolom tidak retak,
maka ditambahkan eluen 0,5 cm di atas permukaan silika gel. Lalu ekstrak yang telah
dicampur dengan 1% bobot silika dimasukkan dalam kolom tersebut. Setelah itu
eluen dialirkan dan ditampung 50 mL dalam erlenmeyer. Eluen ini belum membawa
zat kimia tanaman sehingga dapat dibuang. Selanjutnya, kran dibuka dan diatur
penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam 10 vial yang berkapasitas 20 mL.
Selama proses pemisahan dengan kromatografi kolom berlangsung, eluen harus tetap
ditambahkan dan dijaga agar selalu berada di atas permukaan sampel ekstrak. Jika
eluen dibiarkan habis hingga berada di bawah permukaan sampel ekstrak, hal tersebut
dapat menyebabkan kolom pecah/retak. Hal ini disebabkan karena dengan
berkurangnya eluen sampai di bawah permukaan sampel ekstrak, maka kemungkinan
terperangkapnya udara di dalam kolom menjadi semakin besar. Akibatnya, kolom
menjadi retak. Silika gel berfungsi sebagai fase diam sedangkan eluen (kloroform,
aseton dan asam formiat) berfungsi sebagai fase gerak. Golongan senyawa yang lebih
mudah terikat pada fase gerak akan keluar terlebih dahulu dari kolom kromatografi,
sebaliknya golongan senyawa yang lebih mudah terikat pada fase diam akan keluar
pada saat-saat terakhir.
Untuk praktikum ini, kelompok kami menampung 10 vial eluen dengan
kapasitas masing-masing 20 mL. Tetapi pada saat menampung eluen untuk vial ke-4,
kolom kromatografi sudah retak/pecah. Jadi, selama menampung vial ke-4 sampai ke-
10, kolom kromatografi dapat dikatakan sudah tidak layak lagi untuk memisahkan
golongan senyawa dalam tumbuhan. Pecahnya kolom disebabkan karena praktikan
tidak menambahkan eluen secara terus-menerus ke atas permukaan sampel ekstrak,
sehingga kemungkinan terperangkapnya udara dalam kolom semakin besar dan
menyebabkan kolom pecah.
Setiap vial diuji dengan KLT untuk melihat noda yang dihasilkan. Jika
menghasilkan noda yang sama vial-vial tersebut digabung. Dalam praktikum ini, 10
vial dan standar kuersetin masing-masing ditotolkan pada lempeng KLT. Lalu
dikeringkan dan dilihat nodanya pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.
Digunakan panjang gelombang 254 nm karena lempeng KLT yang digunakan dapat
berpendar pada panjang gelombang tersebut, sehingga noda akan tampak gelap.
Sedangkan pada panjang gelombang 365 nm, yang tampak berpendar adalah
nodanya, sedangkan lempeng KLT tampak gelap. Setelah dilihat pada panjang
gelombang tersebut, ternyata hanya vial ke-6 yang positif menunjukkan adanya
kuersetin (noda berwarna coklat), sedangkan vial-vial yang lain tidak menampilkan
noda apapun. Padahal saat menampung vial ke-6, kolom sudah pecah dan seharusnya
tidak layak lagi untuk melakukan pemisahan. Fenomena ini mungkin bisa disebabkan
oleh beberapa hal yaitu :
1. untuk vial ke-6, mungkin terlalu banyak massa yang ditotolkan sehingga
noda dapat tampak meskipun kolom pecah,
2. untuk vial-vial yang tidak menampilkan noda, mungkin massa yang
ditotolkan terlalu sedikit sehingga noda tidak tampak.
8. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum dan pembahasan yang dilakukan maka dapat

ditarik kesimpulan sebagai berikut :
a. Fraksinasi adalah pemisahan suatu golongan senyawa dalam suatu simplisia
menjadi senyawa yang lebih sederhana.
b. Kolom kromatografi menggunakan fase diam serbuk silica dan fase gerak berupa
campuran pelarut pengembang kloroform : aseton : asam formiat dengan
perbandingan 150 : 33 : 17.
c. Kolom kromatografi masih dalam kondisi baik saat menampung vial ke-1 hingga
vial ke-3
d. Kolom kromatografi retak/pecah saat menampung vial ke-4 hingga vial ke-10
e. Dari 10 vial, hanya eluen pada vial ke-6 yang menampakkan noda positif sebagai
kuersetin
f. Eluen yang ditampung pada vial-vial lain kecuali vial ke-6 sama sekali tidak
menampakkan noda
 DAFTAR PUSTAKA

Harborne. J. B. 1996. Metode Fitokimia Terbitan Kedua. Bandung : ITB Bandung, Jawa
Barat

Anonim. 1998. Materia Medika Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik

Indonesia
Eluen terus-menerus ditambahkan ke atas permukaan sampel ekstrak

Kolom kromatografi sudah pecah/retak