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Manual de Prácticas
I N M U N O L O G Í A
1
Introducción
1 Diluciones 4
2 Sangrado de animales 8
3 Inmunización de animales 11
Reacciones de Precipitación
4 Precipitación capilar 20
5 Imnunodifución doble 24
6 Inmunudifución radial 27
Reacciones de Aglutinación
Aglutinación activa
Aglutinación Pasiva
11 Inhibición de la hemaglutinación 49
12 Inhibición dela aglutinación 51
13 Factor Reumatoide 52
14 Proteína c reactiva 55
15 Antiestreptolisinas 57
2
REGLAMENTO DEL LABORATORIO
Finalidades:
Lograr al máximo el aprovechamiento de los recursos humanos y materiales con los que se
cuentan dentro del laboratorio, para obtener mejores resultados tanto individuales como en
conjunto, fomentando en el educando los hábitos de observación, responsabilidad e
investigación.
Seguridad:
Todos los educandos deben de poner en práctica las reglas de higiene y seguridad dentro del
laboratorio, debiendo dar aviso inmediatamente al maestro de cualquier desperfecto o
accidente que pudiese ocurrir (en fusibles e interruptores eléctricos, conexiones de gas, llaves
de agua), por higiene no debe tirar papeles, dejar muestras en las coladeras de las mesas de
trabajo, no tirar sustancias en el piso.
Disciplina:
1.- La hora de entrada será la que indique su horario, dando una tolerancia de 10 minutos.
2.- El alumno debe recibir y entregar el equipo y material en buen estado al finalizar la
práctica (si nota algún desperfecto en los materiales debe de reportarlo
inmediatamente).
4.- El alumno para poder realizar su objetivo de la práctica debe traer el material o
muestras en ellas se le pidan.
3
Práctica Nº 1
Nombre de la practica......Diluciones
Objetivo
Introducción:
Una de las ramas importantes que apoyan a la inmunología son las matemáticas ya que es
necesario realizar cálculos que son vitales para poder realizar una metodología lo que nos
indica que cualquier error en los cálculos traerá como consecuencia un mal diagnostico del
proceso patológico.
Como algunas metodologias requieren de preparar soluciones es necesario saber que es una
solución esta se puede definir como un sistema homogéneo y estable donde participan
moléculas, átomos o sustancias. Los componentes que participan en una solución son el
soluto y el disolvente el primero siempre se encuentra en menor proporción y el segundo
se encuentra en mayor proporción .
1.- Empíricas .-Estas soluciones se caracterizan por que para su preparación no se requiere
de cálculos matemáticos dentro de este grupo se pueden encontrar:
a.- Insaturadas
b.- Saturadas
c.- Sobresaturadas
2.- Valoradas.- Son soluciones que para poderla preparar se requiere realizar cálculos
matemáticos tomando en cuenta la composición química del soluto aforando a un litro
dentro de éstas se tiene:
4
Práctica Nº 1
V.g. 1 : 2 (1+1=2)
1:3 (1+2=3)
1:4 (1+3=4)
1:5 (1+4=5)
Etc.
Vg.
Realizar una serie de diluciones con factor de dilución de dos y tres
1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 :16, 1 : 32
1 : 3, 1 : 9, 1 : 27, 1 :71, 1 : 213
C.- Cuando se tiene una solución a una concentración determinada y se requiere diluirla.-
para esto se divide la dilución final que se requiere entre la dilución con que se cuenta .
Vg. se tiene una solución 1: 6 y se necesita una que tenga una proporción 1: 54 para esto
se procede a dividir 54 entre 6 y el resultado es 9 lo cual no quiere decir que se tomara un
volumen de la dilución 1:6 y se le agregara ocho del diluyente lo cual no da una solución
1:54 con respecto a la original.
D.- Cuando se requiere un volumen final determinado y preciso diferente al calculado
teóricamente ya que por lo general el volumen que se necesita es menor al teórico para esto
se toma en cuenta el volumen que se requiera y la dilución que se desea.
V.g. se necesita 25 mililitro de una solución 1:250 en teoría se tendría que preparar 1
volumen del soluto mas doscientos cuarenta y nueve del solvente apartar de esta solución se
tomaría veinticinco y se desecharía doscientos veinticinco lo que se puede observar de lo
anterior que se desecharía la gran mayoría de la solución para evitar esto se realiza lo
siguiente:
En primer lugar se haría la relación entre el volumen deseado y el teórico 25/250 lo cual
daría 0.1 este resultado se multiplica por la expresión 1 + 249 donde el siguiente resultado
0.1 + 24.9 = 25 que es el volumen deseado sin alterar la relación 1:250 que es la que se
desea.
Material:
Safranina
Azul de Metileno
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Práctica Nº 1
Tubos de ensaye
Pipetas
Balanza
Espectrofotometro
Agua
Metodología:
2.- Colocar en nueve tubos de ensaye 4.5 ml de agua y marcarlos del uno al nueve.
3.- Tomar 0.5 mililitros con una pipeta del tubo que contiene la safranina/agua y colocarlo
en el tubo uno y homogeneizar
4.- Del tubo uno tomar con una pipeta y depositarlo en el tubo numero dos homogeneizar
5.- Repetir el procedimiento anterior hasta el tubo nueve de este descartar 0.5 mililitros
después de homogeneizar.
7.- Con ayuda de un espectrofotometro realiza una curva ( selecciona longitud de onda de
acuerdo a l espectro de emisión)
Nota. Realiza el mismo procedimiento para el colorante azul de metileno y registra tus
resultados
Cuestionario:
1.- Prepara una solución 0.2 Molal de ácido sulfúrico a un volumen final de 250 ml.
2.- Prepara una solución 0.2 Molar de ácido sulfúrico a un volumen final de 300 ml
3.- Prepara una solución 0.2 Normal de ácido sulfúrico a un volumen final de 300 ml
4.- Realiza una serie de diez diluciones de una solución con un factor de dilución de 6
5.- Se tiene una dilución 1:6 y se requiere para realizar una metodología una dilución
1:70 realiza los cálculos necesarios para obtener esta dilución.
6
Práctica Nº 2
Objetivo
Introducción:
Material
Metodología:
Sangrado de conejo
Oreja
7
Práctica Nº 2
6.- Retirar la aguja y presionar el sitio de la punción con una torunda impregnada del
alcohol
Corazón
1.- Sujetar el conejo d las cuatro patas colocándolo con el tórax hacia arriba
2.- con el dedo índice y medio localizar en la zona del tórax el corazón por medio del
latido cardiaco
Nota.- cuando se introduce la aguja en cavidad cardiaca se siente por que la jeringa
registra las pulsaciones del corazón si esto no sucede no se esta en región cardiaca. si la
aguja se mueve en el interior del tórax puede haber riesgo de desgarra tejido cardiaco y
pulmonar ocasionando la muerte del animal
Sangrado de cobayo
Sangrado de ratones
1.- Sujetar el conejo colocándolo dentro de una trampa para ratones o sobre la jaula jalar
ligeramente la cola
8
Práctica Nº 2
2.- Introducir una pipeta Pasteur o un capilar sin heparina en la región interna del ojo hasta
encontrar el seno venoso, esto sucede cuando la sangre fluye por capilaridad hasta la luz
de objeto de punción
cuestionario:
9
Práctica Nº 3
Nombre de la practica...Inmunización de animales
Objetivo
Introducción:
Se entiende por inmunización al proceso mediante el cual un individuo competente desarrolla una
respuesta inmunología al entrar en contacto con un antígeno especifico esta respuesta puede ser natural
o artificial
La obtención de anticuerpos por medio de una vía de inmunización es de gran ayuda en la terapéutica
humana y animal en diferentes procesos infecciosos o tóxicos adamas de que estos antisueros son de
gran ayuda para la identificación de bacterias
Producido principalmente por IgM seguida por IgG . si hay un segundo contacto con el inmunogeno la
fase la disminuye considerablemente y alcanza un máximo de diez veces mas la concentración del
anticuerpo que en la respuesta inicial esta respuesta es mediada por IgG .
El antígeno producido por efecto de una respuesta inmunologica va a estar en función de :
La dosis del inmunogeno es importante ya que si se inocula una dosis no adecuada se puede presentar
el fenómeno de tolerancia que es un estado de no respuesta a un antígeno particular.
Para que se puede producir una respuesta inmunologica es necesario tomar en cuenta los siguientes
factores
1.- Antígeno ya que su inmunogenicidad va a estar en función de, complejidad estructural, peso
molecular, conformación y naturaleza química <se ha visto que las proteínas son mas inmunogenicas
que los carbohidratos y lípidos> es importante recordar que un antígeno se comporta de manera
diferente en diferentes especies animales adamas que es importante la edad, el sexo y la genética.
10
Práctica Nº 3
2.- Estado físico del antígeno <soluble o particulado> esto es importante ya que de aquí va a
depender la vía de inmunización que se eligiera :
Antígenos particulados <bacterias, glóbulos rojos células y partículas inertes> de preferencia son
introducidos por vía intravenosa
Antígenos solubles pueden ser introducidos por diferentes vías <intramuscular (IM),intraperitoneal (IP)
subcutánea (SC) intradermica (ID) cuando se utiliza la vía SC e ID se recomienda que se acompañe de
un inmunopotenciador o adyuvante
Un adyuvante es un estimulador de la respuesta inmunologica para que esto suceda debe de reunir los
siguientes requisitos:
a.- Ser capaz de formar un deposito para proteger al antígeno del catabolismo rápido dentro del
organismo
b.- ser capaz de estimular la respuesta inmune no especifica para lograr incrementar las linfocinas
Adyuvantes antigénicos
Adyuvantes no antigénicos
Dentro del las practicas inmunologicas el adyuvente que mas se trabaja es el Freund del cual se
conocen dos tipos:
vg. M. tuberculosis
M. bovis
M. phlei
Estas micobacterias se utilizan a razón de 1-5 mg. de peso seco por cada ml de adyuvante incompleto
Cuando se va a realizar una ruta de inmunización es necesario tomar en cuenta las siguientes
consideraciones
b.- El regulador y los componentes que deben de ser administrados junto con el inmunogeno
c.- La rapidez con la que el inmunogeno es liberado dentro de la circulación linfática y sanguínea
vg. Para un conejo se recomienda de 2-5 ml por vía subcutánea para un ratón 0.3-1ml intraperitoneal
Cuando un inmunogeno se administra por vía intramuscular o intradermica su liberación es lenta, pero
si el intravenosa su liberación es rápida. nunca se debe de aplicar un inmunogeno junto con un
adyuvente por vía intravenosa
Material
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Práctica Nº 3
Metodología
Inmunización de conejos
Vía intravenosa
5.- Proceder a inocular el inmunogeno para esto se recomienda que se inicie la inmunización en el
entramo mas distante a la cabeza procediendo a inyecta hacia abajo.
Vía subcutánea
5.- Introducir la aguja lentamente, aproximadamente una tercera parte del aguja .
Vía intradermica
2.- En este sitio aplicar crema depiladora y dejar actuar durante 5-8 min.
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Práctica Nº 3
4.- Introducir la aguja en la dermis del animal con el bisel hacia arriba una vez dentro de la piel, girar
120º y depositar el inoculo
Inoculación de cobayos
Vía intradermica
4.- Introducir la aguja en la dermis con el bisel hacia arriba y una vez dentro girar 120º y depositar el
inoculo
5.- En el sitio del inoculación se debe de formar una papula
Intraperitoneal
1.- Sujetar el cobayo de las cuatro patas con el tórax hacia arriba
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Práctica Nº 3
Inmunización de ratones
Vía intraperitoneal
Vía intravenosa
1.- Colocar el animal en la jaula para ratones y sujetar la cola en forma horizontal
procurando que la vena caudal quede expuesta
2.- Limpiar la cola con una torunda impregnada de alcohol
3.- Introducir el antígeno usando una aguja de calibre 25 esto sucede cuando se desliza
suavemente el antígeno
Antígenos particulados
Los antígenos bacterianos que se pueden utilizar son cepas Salmonella choleraesuis H y O
15
Práctica Nº 3
sucede se recomienda realizar una quinta inoculación con 3 ml del antígeno después del
cuarto o sexto día del sangrado y volver a sangrar seis días después de la inoculación.
Antígenos solubles
Los antígenos solubles que se que se pueden utilizar son fracciones séricas como la
Albúmina, Gama globulina, Albúmina de Huevo.
16
Práctica Nº 3
Suero Total
Cuestionario
17
Práctica Nº 3
Introducción
Ph
Fuerza ionica
Temperatura
Tiempo
Concentración de antígeno
Concentración de anticuerpo
Las reacciones de precipitación pueden ser cuantificadas además que pueden realizarse en
medios líquidos, sólidos, o semisolidos
Medio liquido
Medio solidó
Medio semisolido
Inmunodifución radial o simple
Inmunodifución doble
Inmunoelectroforesis
Contrainumoelectroforesis
Electroinmunoelectroforesis unidimensional
Inmunoelectroferesis cruzada
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Práctica Nº 4
Objetivo
Introducción
Si se realiza una gráfica donde se graficara cantidad de precipitado formado contra cantidad
de antígeno agregado el resultado seria tres zonas y éstas quedarían de la siguiente manera.
1.- Exceso de anticuerpo
2.- Equivalencia
3.- Exceso de antígeno
Material
Tubos capilares
Tubos de ensaye
Pipetas
Gradilla de plastilina
Solución salina
Solución de albúmina de huevo
Suero anti albúmina de huevo
Metodología
2.- En ocho tubos de ensayo realizar Diluciones al doble de la albúmina con solución
salina usando como volumen final un mililitro.
3.- Se llena un tubo capilar por capilaridad con antisuero hasta la primer marca se limpia
la parte externa del tubo
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Práctica Nº 4
5.- En forma similar se absorbe antígeno sin diluir que llegue hasta la segunda marca
limpiar la parte externa del tubo con papel absorbente
7.- Tapar uno de los extremos con el dedo y dejar que el contenido quede centrado en el
tubo
8.- Repetir los pasos 3 hasta el 7 pero utilizando las Diluciones de la albúmina
9.- Se usan testigos utilizando solución salina mas antisuero sin diluir y solución salina
mas antígeno
10.- Colocar los tubos en una gradilla de plastilina y dejarlos unos minutos a temperatura
ambiente y guardarlos en refrigeración durante 24-48 hrs.
Cuestionario:
5.- Que cantidad de antígeno hay libre en cada capilar después de reaccionar
6.- Que cantidad de anticuerpo hay libre en cada capilar después de reaccionar
20
Práctica Nº 5
Objetivo:
Introducción
Material
Metodología
1.- Preparar una solución de agarosa al 0.1% en solución salina isotónica disolverla por
calentamiento reponer el volumen perdido con agua destilada caliente
2.- Sumergir los porta objetos en la solución de agarosa caliente, escurrir y dejar secar (
barnizado de portaojbetos )
21
Práctica Nº 5
3.- Preparar solución de agarosa al 0.1 % en solución salina isotónica y disolverla por
calentamiento reponiendo el volumen perdido con agua destilada caliente ; adicionar
timerosal hasta obtener una
concentración final de 0.1 %
22
Práctica Nº 5
4.- Colocar los portaobjetos barnizados secos en un puente de tinción y con ayuda de una
pipeta inundarlos con agarosa al 1% caliente
O O
O O
7.- Los posos realizados se llenan con un antígeno al centro y los anticuerpos a los lados
Cuestionario:
23
Práctica Nº 6
Objetivo
Introducción
Este método es de gran ayuda para la cuantificación de antígenos los cuales conforme van
difundiendo va diluyéndose hasta que adquiere una concentración proporcional al
anticuerpo generando un halo de precipitación cuyo diámetro es directamente proporcional
ala concentración de antígeno. El anticuerpo cuando se encuentra en su concentración
inicial es muy alta lo cual favorece la formación de complejos solubles. para que esta
determinación sea confiable se necesita tener muestras estandarizadas de antígeno lo cual
funciona como patrón de referencia .
Material
Portaobjetos
Cajas de petri
Pipeta serológica
Pipeta Pasteur
Matraz erlenmeyer
Papel absorbente
Regla graduada en milímetros
Agarosa
Solución salina isotónica
Timerozal al 1%
Antisueros
Solución de antígenos a diferentes concentraciones
Metodología
2.- Preparar solución de agarosa al 1% con solución salina y disolver la agarosa por
calentamiento reemplazando el volumen con agua destilada caliente . dejar enfriar la
24
Práctica Nº 6
agarosa hasta una temperatura de 45¦c y adicionar 1-5% ( v/v ) del antisuero, mezclar
perfectamente y adicionarle timerosal hasta una concentración final de 0.1%.
3.- colocar los portaobjetos barnizados sobre un puente de tinción y con ayuda de un pipeta
inundarlos con la mezcla antisuero-agarosa dejar gelificar a temperatura ambiente y
guardarlos en ambiente húmedo hasta su uso.
4.- sobre una línea horizontal realizar perforaciones de 3 mm de diámetro separadas 0.5 cm
O O O O
5.- Llenar cuatro posos con un volumen determinado de las soluciones de antígeno y un
poso con la solución problema del antígeno
6.- Incubar las placas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24-48 hrs.
Anotar los resultados midiendo los diámetros de inhibición y realizar una gráfica donde se
colocara concentración de antígeno contra el cuadrado del diámetro de inhibición.
interpolar el valor de la solución problema para conocer su concentración.
Cuestionario
25
Práctica Nº 7
Objetivo:
Introducción
Tomando como base las características genéticas, morfológicas y químicas de los glóbulos
rojos se observa un polimorfismo que depende de las características inmunohematológicas
además de que presentan características importantes como ser detectados por su actividad
especifica con el Ab correspondiente que producen aglutininas o lisis, se transmiten por
herencia según las leyes de Mendel aparecen en ciertas etapas de la vida fetal y están
plenamente formados al nacer persistiendo durante toda la vida de ahí que se puedan
clasificar en un gran numero de grupos o sistemas sanguíneos bien definidos dentro de los
cuales se pueden mencionar los siguientes sistemas.
1.- ABO
2.- Rh
3.- MNS
4.- Lewis
5.- Luteran
6.- Duffy
7.- Kidd
8.- Diego
9.- Y
10.- Xg
Etc.
Los que se determinan en forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios son el ABO y el
Rh.
Sistema ABO
26
Práctica Nº 7
Es el que se descubrió en primer lugar por Landstainer y se caracteriza por que es el único
que en el plasma y en el suero contiene siempre aglutininas que reaccionan con factores
sanguíneos presentes en glóbulos rojos de otras personas. Las isoaglutinas que contiene se
dice que son del tipo completo (IgM) de ahí sean altamente aglutinantes y buenos fijadores
del complemento razón por la cual la determinación de los grupos sanguíneo sea de gran
importancia en las transfusiones sanguíneas .
En la superficie de los glóbulos rojos es posible encontrar uno dos o ningún de los dos
antígeno ( A y B ) tomando como base lo anterior se puede decir el sistema ABO se pueden
clasificar de la siguiente manera:
Sistema Rh
Se descubrió como resultado del experimento con animales ( Landsteiner) tomando como
base a levine y Stetson que reportaron el caso de una mujer con severa reacción hemolítica
después de una transfusión con sangre de su esposo. Tomando en cuenta la suposición de
que en los eritrocitos de monos Macacus rhesus podían existir antígenos similares a los de
los humanos se inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de Macacus rhesus y el que
se obtenía aglutinaba los eritrocitos del mono y del 85% de la población blanca aunque
otras investigaciones demostraron que estos antígenos eran diferentes pero se determino
que la mayoría de los eritrocitos humanos tienen el antígeno del mono rhesus y otro
diferente pero que se relaciona de ahí que se conservó la denominación del Rh para el
antígeno humano y asignó el nombre de LW al antígeno común del hombre y del mono esta
denominación esta echa por Levine.
Una vez que se descubrió el sistema Rh se siguió realizando investigaciones resultando dos
clasificaciones para este sistema una la propone Weiner y la otra Fhiser-Race .
27
Práctica Nº 7
el antígeno D se dice que son Rh positivo mientras que los que no lo tiene se les denomina
Rh negativo tomando como base lo anterior se pueden clasificar de la siguiente manera.
Factores Rh Tipo Rh
Rho ( D ) rh’ ( C ) rh” ( E ) W F-R Designación
-- -- -- rh cde Rh neg.
-- + -- rh’ Cde Rh neg.
-- -- + rh” cdE Rh neg
-- + + rh’,rh”o rhy CdE Rh neg.
+ -- -- Rho cDe Rh pos.
+ + -- Rh1 CDe Rh pos.
+ -- + Rh2 cDE Rh pos
+ + + Rh1,Rh2 CDE Rh pos.
öRhz
-- Ausente
+ Presente
Material
Centrifuga
Torundas
Pipetas Pasteur
Portaobjetos
Jeringa
Tubos de ensaye
Aplicadores
Suero anti-A
Suero anti- B
Suero anti- AB
Suero anti-D
Suero de Coombs
Albúmina bovina al 22%
Glóbulos rojos Humanos A. B y O al 5%
Solución salina isotónica
Metodología
1.- Tomar una muestra de sangre aproximadamente tres mililitros y dejar coagular a
temperatura ambiente.
28
Práctica Nº 7
4.- Con ayuda de una pipeta Pasteur Tomar eritricitos del fondo del tubo y colocarlos en
cada una de las marcas .
5.- A un lado de cada gota de eritrocitos colocar una gota de antígeno comercial según
corresponda a la marca y en la marca de autotestigo colocar una gota de albúmina al 22%.
6.- Mezcla las gotas con ayuda de un aplicador para cada marca y posteriormente con
movimientos circulares.
Búsqueda de Isoaglutininas
A B O
4.- Mezclar ambas gotas con ayuda de un aplicados y posteriormente con movimientos
circulares.
29
Práctica Nº 7
Reacción de eritrocitos con suero Reacción del suero con antígenos Grupo
comercial conocidos sanguíneo
Anti-A Anti-B Anti-AB A B O
+ -- + -- + - A
-- + + + -- - B
+ + + -- -- -- AB
-- -- -- + + -- O
Sistema Rh
Metodología
3.- A otro tubo adicionarle una gota de albúmina bovina al 22% y agitar suavemente
5.- Buscar la presencia de aglutinación en primer lugar en el tubo que contiene albúmina al
22% y los glóbulos rojos posteriormente en el tubo que contiene el suero comercia anti-D si
solamente se presenta aglutinación en este tubo se reporta con Rh positivo.
6.- Si no hay aglutinación en ningún tubo se incuban los tubos a 37º C durante 30 min. y
posteriormente lavar los eriotrocitos con solución salina ( hasta que el sobrenadante quede
transparente no mas de tres lavados) 3400 r.p.m. durante 2 min.
8.- Resuspender el paquete suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 60 seg. ambos
tubos
9.- Buscar la presencia de aglutinación si el tubo problema presenta aglutinación se dice
que el individuo es de grupo Du Rh Positivo Si no hay aglutinación se dice que el individuo
es Rh negativo. Pero si hay aglutinación en el tubo autotestigo se dice que puede ser debido
a una respuesta autoinmune y para fines de transfusión el individuo se clasifica como Du y
se considera Donador Rh positivo y receptor Rh negativo.
Cuestionario
1.- Define lo que es una hemaglutinina
2.- Define lo que es un hemaglutinógeno
3.- Que es una isoaglutinina
4.- Que es un isoaglutinógeno
5.- Que son las heteroaglutininas
6.- Plasma tu conclusión de la practica.
30
Práctica Nº 8
Objetivo
Introducción
Sirva para demostrar el revestimiento in vivo de los eritrocitos se aplica cuando los
eritrocitario están recubiertos con anticuerpos no aglutinantes en la enfermedad hemolítica
del recién nacido, en la anemia hemolítica autoinmune o en la investigación de reacciones
de reacciones consecutivas a transfusiones de sangres incompatibles.
31
Práctica Nº 8
Sirva para que los anticuerpos IgG reaccionen in vitro con eritrocitos que contengan el
aglutinogeno correspondiente que después de el tratamiento adecuado se le adiciona suero
antiglobulínico y espera la respuesta.
Material
Centrifuga
Baño María
Glóbulos rojos problema al 2%
Glóbulos rojos normales al 2%
Glóbulos rojos al 5%
Solución salina isotónica
Suero de coombs
Suero problema
Suero anti-D diluido a titulo sub aglutinante
Tubos de ensaye
Metodología
Prueba directa
3.- a otro tubo adicionarle dos gotas de globulos rojos normales y dos gotas de suero de
coombs ( testigo negativo)
32
Práctica Nº 8
Prueba indirecta
2.- Al tubo problema adicionarle dos gotas de suero problema y dos gotas de eritrocitos al
5% ORh positivo.
3.- Al tubo T.negativo adicionarle dos gotas de solución salina y dos gotas de eritrocitos
ORh positivo al 5%
4.- Al tubo T.positivo adicinarle dos gotas de suero anti-D diluido y dos gotas de
eritrocitos ORh positivo al 5%
7.- Lavar los eritrocitos con solución salina y resuspender en sol salina remanente.
Cuando los Glóbulos rojos con suero problema aglutinan en la primer ocasión indican la
presencia de anticuerpos aglutinantes.
Cuando aglutinan los Gr. con suero problema y suero de coombs nos indica la presencia de
anticuerpos no aglutinantes en el suero problema.
La aglutinación del testigo positivo no indica que el suero de coombs esta funcionado.
Cuestionario:
33
Práctica Nº 10
Objetivo
Introducción
En forma rutinaria las reacciones se realizan en solución salina al 0.85 % donde solo
aglutinan principalmente los anticuerpos de la clase IgM
Cuando se utiliza enzimas como papaina, ficina, o la bromelina nos ayudan a potenciar la
actividad de algunos anticuerpos, como los dirigidos contra el sistema Rh, Lewis, kidd, vel
e i . también modifica y destruye los antígeno tales como : Mns, Duffy, por, Xga, Yta, Csa,
Cha, esta propiedad se utiliza para identificar los correspondientes anticuerpos.
Antes de realizar una prueba cruzada es necesario conocer los datos clínicos del donador y
receptor para poder elegir los análisis adecuados pero si no se conocen estos datos es
necesario realizar los siguientes estudios.
--Paciente que nunca ha sido transfundido o que no haya tenido embarazos. esto es con el
fin de que pueden existir anticuerpos contra antígenos de los sistemas menores adquiridos
en forma natural
34
Práctica Nº 10
--Paciente politransfundido, que haya tenido varios embarazos o que no se desconozcan sus
antecedentes . además de los anticuerpos contra antígenos menores y los adquiridos en
forma natural pueden existir otros inducidos por transfusiones previas por el producto
hacia la madre por medio de eritrocitos.
Salina rápida
Albúmina rápida
Ficina o papaina rápida
Salina a 37º / coombs
Albúmina a 37º/ coombs
Ficina o papaina a 37º/ coombs
Material
Centrifuga
Jeringas
Tubos de ensayo
Pipeta Pasteur
Albúmina bovina al 25 %
Solución salina al 0.85%
Ficina ( 1mg/ml) o papaina ( 10 mg/ml)
Metodología
1.- Tomar una muestra sanguínea de 5 ml y colocar 0.2 ml en un tubo de ensayo que
contenga 5 ml de solución salina (gr. al 5%) el resto de sangre depositarla en un tubo de
ensayo sin anticoagulante para obtener suero
a.- marcar un tubo de ensayo como PM (prueba mayor ) y adiciona dos gotas de gr. del
donador y dos gotas de suero del receptor.
b.- A otro tubo de ensayo marcarlo como PM (prueba menor ) y colocarle dos gotas de gr.
del receptor y dos gotas de suero del donador
35
Práctica Nº 10
E.- En caso de no observar aglutinación en los dos tubos de la solución salina rápida
agregar a ambos tubos solución de albúmina al 25%
I.- Si no ha observado aglutinación en los tubos lavar los eritrocitos con solución salina a
3400 r.p.m. durante 2 min. cuantas veces sea necesario
J.- Después del ultimo lavado eliminar el sobrenadante y adicionar al paquete dos gotas de
suero de coombs y mezclar
Preparar ficina
Disolver 1 g. de ficina y disolverla en 100 ml de solución salina de fosfatos a Ph 7.3 (
guardarla en refrigeración a menos 20 ¦c y para su uso diluirla 1:10 con regulador de
fosfatos 0.1 m Ph 7.3
Preparación de papaina
Disolver 0.5 g. de papaina en 190 ml de amortiguador de fosfatos Ph 5.5 y agregar 10 ml
de L-cisteina al 0.6 % en agua destilada incubar a 37 ¦c durante una hora y centrifugar
recuperar el sobrenadante y almacenar a -20¦c
36
Práctica Nº 10
Preparación de Gr.
Lavar Gr. en solución salina y el paquete celular con un volumen igual de papaina o ficina
mezclar e incubar a 37¦c durante 15 min. .lavar los gr. con solución salina y ajustar a una
concentración al 2%
Metodología
4.- Centrifugar a 100 r.p.m. durante 60 seg. y resuspender suavemente par la búsqueda de
aglutinación
1.- Tomar una muestra de 5 ml de sangre sin anticoagulante del donador y colocar 0.1 ml
de esta sangre en un tubo que contenga 5 ml de solución salina el resto de la sangre se
deposita en un tubo de ensayo para que se coagule
A B C D E F G
PM 1 -- -- 1 -- -- --
pm -- 1 1 -- -- -- --
Auto -- -- 1 1 -- -- --
PM 1 -- -- 1 2 -- --
pm -- 1 1 -- 2 -- --
Auto -- -- 1 1 2 -- --
PM 1 -- -- 1 -- 1 --
pm -- 1 1 -- -- 1 --
Auto -- -- 1 1 -- 1 --
PM 1 -- -- 1 -- -- 1
pm - 1 1 -- -- -- 1
Auto -- -- 1 1 -- -- 1
A.- Gr. al 2% de donador B.- Suero del donador C.- Gr. al 2% del receptor
D.- Suero del receptor E.- Albúmina al 25% F.- Papaina G.- Ficina
Nota.- los números de los cuadros indican gotas
37
Práctica Nº 10
8.- Lavar el paquete celular de cada tubo con solución salina ( 2500 R.P.M. durante 5 min. )
dos veces
9.- Agregar una gota de suero de coombs al paquete celular de cada tubo
Para saber si la determinación esta bien realizada es necesario introducir un testigo positivo
y un negativo
Testigo positivo
1.- Adicionarle dos gotas de anti-D diluido 1:32 y dos gotas de gr. al 2% de un individuo o
Rh positivo
Testigo negativo
1.- A un tubo adicionarle dos gotas de anti-D diluido 1:32 y dos gotas de gr. al 2% de un
individuo o Rh negativo
38
Práctica Nº 10
Objetivo
Introducción
A S. paratyphi A
S. typhimurium
S.paratyphi B
B S. derby
S. san diego
S. paratyphi C
C S. cholerasuis
S. newport
S. montevideo
S. typhi
S. enteritidis
D S. dublin
S. gallinarum
S. pullorum
S. anatum
S. meleagridis
E S. give
S. newington
S. illinois
S. senftenberg
39
Práctica Nº 10
Cuando se requiere diagnosticar los titulos de salmonella se debe de tomar en cuenta que
estos se elevan al final de la cuarta semana de la infección.
Otro microorganismo que puede producir elevación de temperatura son la Brucella las
especies que los hacen son B abortus , B. suis . B. mellitensis las cules responden de la
misma manera cuando se requiere demostrar las aglutininas su diagnostico es relativamente
sencillo cuando se encuentra en la fase aguda ( apartir de la segunda semana de la
enfermedad alcanzando su maximo en la tercer y sexta semana si reporta un titulo 1:320 es
indicativo) de la enfermedad pero cuando se hace cronica se dificulta su diagnostico.
Reacción deWeil-Felix
Especie Enfermedad OX-19 OX-2 OX-K
R.prowasekii Tifus epidémico +++ + 0
R. mooseri Tifus murino +++ + 0
R. reckettsi Fiebre maculatosa de +++ + 0
la montaña
R. conori Fiebre mediterranea + +++ 0
R.siberica Tifus siberiano + +++ 0
R. austarlis Tifus de Queensland + +++ 0
R. akari Viruela rickettsial 0 0 0
R. tsutsugamushi Fiebre fluvial 0 0 +++
Japonesa
R. quintana Fiebre de Tricheras 0 0 0
R. burnet Fiebre Q 0 0 0
Material
40
Práctica Nº 10
Salmonella paratyphi A
Salmonella paratyphi B
Brucella abortus
Proteus ox-19
Metodología
Cualitativo
5.- Al lado del suero colocar una gota de cada uno de los antígenos
9.- Si hay aglutinación en alguna de las marcas realizar una determinación cuantitativa por
cada marca que resulte positiva
Método cuantitativo
41
Práctica Nº 10
1 2 3
4 5 6
3.- A cada marca agregar una gota de antígeno que corresponda este va a ser el que resulto
positivo
7.- el titulo se reporta como la reciproca de la dilución mas alta donde todavía se observa
aglutinación
Cuestionario
42
Práctica Nº 11
Objetivo
Material
Metodología
Inhibición de la hemaglutinación
Fundamento
2.- Abrir un tubo que contenga Gr. recubiertos de GCH y anti GCH
6.- Depositar el tubo el lugar donde se encuentre libre de vibraciones y del calor de tal
forma que se puede observar de abajo hacia arriba
43
Práctica Nº 12
Fundamento
La reacción se basa en una aglutinación directa con partículas de látex las cuales están
recubiertas de anti-GCH para cuando se pone en contacto con la muestra problema y esta
presente la GCH en cantidades detectables reaccionan para formar un agregado Ag-Ab lo
cual se demuestra por medio de una aglutinación visible
Metodología
44
Práctica Nº 13
Objetivo
Introducción
En el suero de personas con ciertos padecimientos inflamatorios como puede ser artritis y
fiebre reumática aparecen anticuerpos dirigidos contra las inmunoglobulinas del individuo a
estos anticuerpos se les denomina Factor Reumatoide. la especificidad de esta reacción es
variable y se puede ver tres formas características
El factor reumatiode por lo general es un anticuerpo de la clase IgM que puede reaccionar
con uno o mas antígenos específicos
La producción del factor Reumatoide es resultado de respuesta del individuo hacia uno o
mas determinantes antigénicos específicos presentes en sus propias gamaglobulinas. el
factor Reumatoide reacciona con complejos Ag-Ab, en casi todos los casos el factor
Reumatoide forma complejos solubles con IgG in vivo los cuales pueden ser eliminados de
la circulación sin causar ninguna alteración por el sistema retículo endotelial. en raros casos
el complejo factor reumatoide-inmunoglobulinas son solubles a temperatura corporal, pero
en frío se pueden precipitar en el suero por el frío ( crioglobulinas ) los individuos que
presentan crioglubulinas son mas predispuestos a sufrir lesiones secundarias . los niveles
sericos de FR guardan relación con la aparición de nódulos subcutáneos. por lo general el
factor Reumatoide esta constituido por inmunoglobulinas con especificidad par los
fragmentos FC de la IgG la mayoría de los métodos de laboratorio detectan el Factor
Reumatoide IgM 19s pero también hay reacción en las inmunoglobulinas de la clase IgM ,
IgG 7s y de la IgA . el Factor Reumatoide esta presente en los siguientes padecimientos
artritis, Lupus eritematoso, esclerosis, Mononuclosis infecciosa y algunos casos de
poliomielitis la determinación del factor Reumatoide no es muy especifica pero si es muy
sensible lo cual puede dar positiva en los siguientes padecimientos
hipergamaglubulinemia, hepatopatias, sífilis padecimientos infecciosos crónicos como son
lepra y tuberculosis pero se hacen negativas cuando el individuo mejora. En investigaciones
se a visto que un reducido numero de personas sanas dan positiva la prueba y personas
enfermas con artritis dan negativa la prueba . el principio de la prueba se basa en la
reacción del látex sensibilizado con gama globulina humana y el factor Reumatoide.
45
Práctica Nº 13
La granulocidad del látex puede confundir con una prueba positiva, sueros lipémicos
pueden dar resultados falsos positivos.
Material
Látex sensibilizado
Solución amortiguadora
Aplicadores
Placa de aglutinación
Tubos de ensayo
Metodología
Cualitativa
1.- Tomar una muestra sanguínea y dejar que se retraiga el coagulo separa el suero
2.- Preparar una dilución 1:20 del suero problema con la solución amortiguadora
6.- Adicionar 1 gota de reactivo de látex a cada uno de los controles y del problema
7.- Con ayuda de un aplicador mezclar las gotas y con movimientos circulares
homogeneizar
8.- Al cabo de dos minutos ver la reacción de los testigos y el problema (buscar presencia
de aglutinación )
46
Práctica Nº 13
Cuantitativa
1.- Prepara una serie de Diluciones con factor de 2 partiendo del suero diluido hasta una
dilución final de 1:640
6.- El titulo de factor Reumatoide se expresa como la reciproca de la dilución mas alta
donde se presente aglutinación
47
Práctica Nº 14
Objetivo
Al termino de la practica el alumno adquirirá la habilidad para identificar por medio de una
reacción la
presencia de la proteína c reactiva en el suero de un paciente con una infección bacterina de
tipo agudo
Introducción
El nombre de proteína C reactiva deriva de que en personas que padecían neumonía lobular
se extraía suero y el extracto era un carbohidrato que se le denomino c y al proteína humana
capas de precipitarlo se le denomino PC reactiva
Material
48
Práctica Nº 14
Metodología
1.- Tomar una muestra sanguínea sin anticoagulante y esperar que se retraiga el coagulo
3.- Con el suero realizar una dilución 1:20 con la solución amortiguadora
7.- Agregar una gota de partículas de látex sensibilizado a cada gota adicionada ( problema,
positivo, negativo )
8.- Con ayuda de un aplicador mezclar las gotas (utilizar aplicador diferente para cada
mezcla)
10.-Esperar dos minutos y verificar los controles por medio de aglutinación en el control
positivo y no aglutinación en el control negativo reportar el suero problema de acuerdo a
su comportamiento con los controles
49
Práctica Nº 15
Objetivo
Introducción
Las infecciones estreptococicas son frecuentes en niños en edad escolar de ahí que sea
posible detectar los anticuerpos en respectivos tal es el caso de la antiestrptolisina-O
(ASO) esta es una hemolisina labil al oxígeno, pero es activa a eritrocitos humanos y a los
de conejo. La estreptolisina es producida por la mayoría de las cepas Lancefield de
estreptococos del grupo A aunque algunas cepas del grupo C y G también la producen .
Los estreptococos no solamente producen reacción Ag-Ab por antiestreptolisinas sino que
también producen otro tipo de enzimas tal es el caso de:
Suero problema
Tubos de ensaye
Glóbulos rojos o Rh positivo
Solución salina amortiguada
cloruro de sodio 7.40 g
fosfato ácido de potasio 3.70 g.
fosfato ácido disodico 1.81 g.
agua destilada 1000.00 ml
Estreptolisina
50
Práctica Nº 15
Metodología
2.- Por cada 5 ml de agua se utiliza un tubo capilar que contenga hidrosulfito de sodio
4.- Prepara una solución al 5 % de glóbulos rojos con solución salina amortiguada
( antes de preparar la suspención de Gr. se lavan con solución salina)
5.- Prepara las siguientes Diluciones del suero problema con solución salina amortiguada
dilución 1: 10
dilución 1:100
dilución 1:500
...La dilución 1:10 se puede preparar agregando una parte de suero y nueve partes de
solución salina amortiguada
...La dilución 1:100 se prepara agregando una parte de la dilución 1:10 mas nueve partes de
la solución salina amortiguada
...La dilución 1:500 se prepara agrando dos partes de la dilución 1:10 mas ocho partes de
solución salina amortiguada
6.- Rotular 14 tubos de ensayo de la siguiente manera
51
Práctica Nº 15
8.- El titulo se reporta en unidades TODD que es la reciproca de la dilución mas alta donde
se neutraliza completamente la estreptolisina
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Práctica Nº 15
Bibliografia
6.- Hematología Clínica Byrd S. Leavell, Oscar A Thorup Editorial Interamericana Cuarta
edición
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