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ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA 02
ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02
EXAME DE GOTA ESPESSA 03
CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) 04
CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04
CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) 05
MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA 06
HEMATÓCRITO 06
HEMOGLOBINA 07
VCM - HCM - CHCM 07
MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08
RETICULÓCITOS 09
DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS 10
MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11
VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) 12
PESQUISA DE CÉLULAS LE 12
TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) 13
PROVA DO LAÇO (PL) 14
RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) 14
TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) 15
TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16
TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17
PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17
DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18
TEMPO DE TROMBINA (TT) 19
TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19
DOSAGEM DE FATOR V 21
PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA 23
PROVA DE FALCIZAÇÃO 25
TESTE DE ITANO 25
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26
DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27
CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28
DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30
DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31
PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32
PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35
TIPAGEM ABO EM TUBO 36
TIPAGEM Rh EM TUBO 37
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) 38
TESTE DE COOMBS DIRETO 39
ELUATO 40
1
1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS =
- Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA
- Lâminas de vidro de 24x76 mm;
- lâmina espalhadora
B. PROCEDIMENTO =
- colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina
- com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade
até suas bordas laterais
- mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial,
num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm
- deixar secar na horizontal sobre a bancada
- identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente,
e a data.
- Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa
B . PROCEDIMENTO
- colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos
- aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou
buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio
- fazer dois ou mais esfregaços
2
3. EXAME DE GOTA ESPESSA
.
A .MATERIAIS
- amostra de sangue total em EDTA
- lâminas de vidro de 24x76 mm;
- estufa a 37 º c (opcional);
- solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada
B .PROCEDIMENTO
- colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina
- esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC
- corar com Giemsa por 30 min.
- transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min
- deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas
3
4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS
- tubos de ensaio de 9 x 75 mm;
- micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL
- câmaras de Neubauer espelhadas;
- lamínulas de vidro,
- Solução diluente de Gower [ 6 ]
Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) 625 mg
Ácido acético glacial 1,66 mL
Água destilada 10 mL
B) METODOLOGIA
– pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3
vezes na mesma solução (1 : 200)
– agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos
– colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara
– cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos
– ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na
diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2
– calcular segundo a fórmula :
4
4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS
A) MATERIAIS
- tubos de hemólise;
- micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL
- câmara de Neubauer espelhadas
- Solução diluente de Turk
Ácido Acético Glacial PA 150-200 μL
Violeta genciana ou Azul de Metileno 100 μL
Água destilada qsp 10 mL
B) PROCEDIMENTO
- pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição
1:20 )
- misturar por inversão, por 2 minutos; preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL)
- deixar sedimentar por 3 minutos; contar todas as células dos 4 quadrados externos, com objetiva
40 x
- Leucócitos / mm3 = no. x ¼ x 1/ 0,1 x 20 = no. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3
B) PROCEDIMENTO
- Pipetar 1000 µ L, tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l
da amostra; homogenizar; preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL)
- sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com
papel de filtro ou algodão umedecido com AD)
- contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja, todo o quadrado central de 1
mm2), com objetiva 40x
- PLAQ/ mm3 = no. x 1 x 10 x 100 = no. plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3
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5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA
MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto)
- preparo do esfregaço do hemograma normal
- contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias
por mm3 do paciente :
6. MORFOLOGIA DE PLAQUETAS
Morfologia normal =
1 – 3 μm de diâmetro, granulação fina azurófila no citoplasma
VPM (fl) = 6,20 – 11,55 [181]
PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15,3 – 19,5 [181]
Alterações do Tamanho =
1. Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase
Regenerativas :
de 4 – 8 μm de diâmetro, indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da
MO)
2. Plaquetas Gigantes
do tamanho de Hc ou linfócitos, isto é, > 8 – 10 μm
3. Microplaquetas
< que 2 μm, na maioria delas, achado encontrado na rara doença de Wiskott - Aldrich
Alterações da Forma =
1. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas
2 . Satelitismo Plaquetário
6
7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA)
7.1 HEMATÓCRITO
A) Micrométodo
-MATERIAIS :
- tubo capilar para microhematócrito
- sangue total (ST) com EDTA
- lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar
- Centrífuga de microhematócrito
- TÉCNICA :
- encher o capilar com ST até a 1 cm da borda
- fechar a extremidade vazia com calor/massa, sem atingir a coluna de Hemácias
- centrifugar com a extremidade fechada para fora, a 11000 rpm / 5 min.
- leitura no gráfico (acompanha as centrífugas)
- Ht = ___ %
MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA
A . MATERIAIS
- tubos de ensaio 75 x 100mm,
- solução de Hb padrão comercial
- reagente de cor (solução de Drabkin)
- espectrofotômetro,
- micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro, de 5 mL
B . METODOLOGIA
- pipetar 2,5 mL da solução de Drabkin em tubo, pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes;
- homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos
- ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo)
- empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco”
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Calculado o Fator, faz-se
Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g %
a) Alterações do tamanho =
- Normocitose - Microcitose - Macrocitose - Anisocitose
8
- Hipercromia
- Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia
c) Alterações da forma =
- Poiquilocitose
- Esferocitose
- Eliptocitose
Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos
- Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo)
- Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells)
- Hemáceas crenadas ou Equinócitos
- Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas
- Drepanócitos ou hemáceas falciformes
- Ovalócitos
- Estomatócitos
- Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos
- Rouleaux
- Aglutinação de hemáceas
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EXPRESSÃO DOS RESULTADOS :
b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente, em mm3
se em 1000 Hc 30 Ret
em 4.150.000 Hc / mm3 y Ret RET = 124.500 / mm3
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- Expressão dos resultados :
“ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro, porque cada tipo
celular é um sistema separado, com suas próprias funções, mecanismos de controle e resposta
a diferentes doenças, não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula”
[2,4,7,62,481]
- em valores absolutos : x células / mm3
- em valores percentuais : x %
- Fórmula Leucocitária =
é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos, podendo ser absoluta (no. /
mm3) ou relativa (%).
Por convenção, anota – se na seguinte seqüência :
1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS =
- Neutrofilia ou Neutrocitose
- Neutropenia ou Neutrocitopenia
- Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado
- Reação Leucemóide
- Reação Leuco-Eritroblástica
- Hiato Leucêmico
- Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita)
- Hipossegmentação Nuclear
- NO necrobióticos
- Hipogranulações Citoplasmáticas
- Granulações Tóxicas
- Vacuolizações
11
- Bastões de Auer
- Corpos de Dohle
2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS
- Eosinofilia
- Eosinopenia ou Anaeosinofilia
- Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas
- Granulações bsofílicas
3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS
- Basofilia
- Basopenia
4 ) LINFÓCITOS
- Linfocitose
- Linfopenia ou Linfocitopenia
- Linfócitos Atípicos
- Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells)
5 ) MONÓCITOS
- Monocitose
- Monocitopenia
- Inclusões Anormais
- Vacuolizações Citoplasmáticas
MATERIAIS =
- ST com EDTA
- Pipetas de Westergreen;
- pera
- Suporte para pipetas Westergreen
METODOLOGIA =
- Homogenizar a amostra e encher, com auxílio da pera, a pipeta de Westergreen, até a marca
superior 0;
12
- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas
12-PESQUISA DE CÉLULAS LE
MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO :
MÉTODOS :
1 . IVY [260]
13
- recomendado pela ICSH, descrito em 1941
- fazer antissepsia com algodão embebido em álcool
- punção na face volar lateral do antebraço., 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo
- o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção
- escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais
- fazer 2 incisões de +- 5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos )
- absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “, sem encostar no coágulo plaquetário
VR = 1 a 7 minutos
2 . DUKE [260]
- descrito em 1912, a punção é feita no lóbulo da orelha, com uma incisão de +- 4 mm de extensão em sua
borda, com cerca de 3 – 4 mm de profundidade
- haveria melhor correlação clínica, embora seja tido como menos sensível
VR = 1 a 4 minutos
3 . DUKE MODIFICADO
- a punção é feita na polpa digital, estando mais sujeito a falsos resultados, pela maior sensibilidade a
vasoconstricção ou vasodilatação (febre, temperatura ambiente , ansiedade ou medo do paciente)
VR = 1 a 3 minutos
MATERIAIS :
- Esfigmomanômetro adulto ou infantil
- Cronômetro
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- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço , abaixo da prega do cotovelo
- inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos
- contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62)
Interpretação =
até 5 = negativo
6 a 10 = duvidoso
10-50 = +
>50, até o dorso da mão = ++
>70, 2 a 4 mm = +++
incontáveis, >5 mm = ++++
MATERIAIS =
- 3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados
- banho-maria a 37 o C
- amostra de sangue total colhido sem anticoagulante
15
- colher 4 – 5 mL de ST, com o menor trauma possível, e colocar 1 mL em cada tubo, pondo o sangue nos
tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual)
- disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao
colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) .
- incubar a 37 o C
- de minuto a minuto, observar o 1º tubo , por inversão lenta, até que o sangue coagule (marcar o tempo)
- passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos, e após a coagulação deste, o 3 º tubo
- anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética
16
alça de metal, para detectar a formação do coágulo
VR =
Medida do tempo de coagulação em segundos = 11,5 A 13,5 SEGUNDOS
Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP
Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1,25
Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1,00 a 1,40
ISI ISI
RNI = R = TAP paciente
TAP normal
TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve
estar entre 11,5 – 13,5 segundos
17
METODOLOGIA =
2. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril, no volume indicado no frasco. Deixar
dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea, agitar o frasco antes do uso
3. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos
4. se não realizar imediatamente, deixar o PPP a 4oC até a realização do teste
5. preparar a solução de CaCl2 para uso (0,025 M), diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10.
Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso
6. em tubo de hemólise em BM, colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina ; incubar por 3 minutos
7. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0,025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro
VR = 26 a 35 segundos
Relação = TTPA paciente de 0,9 a 1,25
TTPA normal(teste)
TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve estar entre
30 – 40 segundos
1. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1,25, fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia
(alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal)
2. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP)
3. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2)
Obs.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1, mas aumentam com a mistura M2
MATERIAIS=
- amostra de ST em tubo citratado
- centrífuga de soro, BM a 37o C, cronômetro
- reagentes :
1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL);
18
2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia, segundo o fabricante)
- plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit
METODOLOGIA =
- centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas
(PPP)
- reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante); deixar à temperatura ambiente de
20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).
- Homogenizar suavemente antes de usar.
- diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos
- misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no
cronômetro.
- calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit, onde o resultado em segundos será
convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K, pré - determinado pelo
fabricante, sendo que a concentração de FIB. será = K x n, onde n é a diluição do PPP usada (10).
Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido)
19
7 . cronômetro
20
9. anotar o tempo de lise total do coágulo; a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do
coágulo de euglobulina
VR = 90 – 180 minutos
Obs.:
- as variações fisiológicas são acentuadas, segundo atividade, alimentação, cuidados na coleta. Só levar em
consideração os grandes encurtamentos.
- Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 - 30 minutos
- O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do
precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado
[93])
- A heparina não precipita na fração euglobulínica
- A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio
- misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5,9 – 6,0 (PASSO
FUNDAMENTAL)
- misturar e incubar 30 min. / 4o C
- centrifugar 2000 rpm / 5 min.
- descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo
- dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml; incubar 37o C / 10 min.
- adicionar 500 l da solução de trombina e, após a formação do coágulo, disparar o cronômetro
- checar a lise do coágulo a cada 15 minutos
VR = 70 – 300 minutos
25 . DOSAGEM DE FATOR V
21
AD 100 mL
METODOLOGIA :
Construir curva de diluição com PPP normal, na mesma técnica para dosagem de fator VIII
ao trabalhar com a amostra-teste,
22
26. ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA
Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8,6
23
MATERIAIS =
1. cubas de eletroforese, fonte geradora de voltagem
2. tiras de acetato de celulose
3. papel de filtro ou Perfex, aplicador, estufa a 60 – 70o C
4. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 %
REAGENTES =
1. Solução tampão tris-EDTA-borato 0,025 pH = 8,6
tris-hidroxi-metilamina 10,2 g + EDTA 0,6 g + Ácido bórico 3,2 g + AD qsp 1000 mL
3. Solução Descorante
Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL
4. Solução Transparentizadora
Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL
5. SF 0,9 %
24
- existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas
para outros exames com a mesma amostra
- se usadas Hc não lavadas, as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais
- se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4, é tecnicamente mais demorado, e
eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas
- se usado KCN, não deve ser feita coloração nas tiras
- uso de AD é o método mais puro, e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis
- pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas, em congelador (controles, por
exemplo).
- Ao usar hemolisados congelados, recentrifugar antes de usar.
27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO
MATERIAIS =
25
1. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL, preparar
antes de fazer o esfregaço
2. amostra de ST colhido com EDTA
1. lâminas e lamínulas de vidro
2. esmalte de unhas ou Entellan
3. placa de Petri, algodão e AD
METODOLOGIA =
(método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948)
26
MATERIAIS =
1. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8,0 – 9,0
2. espectrofotômetro
3. tesoura
METODOLOGIA =
1. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio
4. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2,5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4,5 – 5,5
cm de largura
5. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos, observando visualmente a separação da Hb A2 das
demais; terminada a corrida eletroforética, cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1, sem coloração,
colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD
6. deixar eluir por 2 horas, agitando os tubos a cada 15 minutos
7. ler, em absorbância de 415 nm, acertando o zero com AD
8. calcular
Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100
5 x DO Hb A1 + DO Hb A2
VR = 2,0 – 3,7 %
27
MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey)
MATERIAIS :
1. Solução NaOH 0,083 N(N/12) NaOH 332 mg
AD 100 ml
2. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml
(solução de uso) AD 800 ml
HCl 10 N 4 ml
3. Hidróxido de Amônio 0,04% NH4(OH)2 4 ml
AD 1000 ml
4. espectrofotômetro
5. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 - 500 µ L
6. cronômetro, papel de filtro Whatmann ou similar
7. tubos de hemólise 13 x 100 mm, funis pequenos (3-4 cm de diâmetro)
METODOLOGIA :
1. Colocar 4 tubos em fila (A,B,C,D)
2. Pipetar inicialmente 3,2 ml de NaOH 0,083 N no tubo A
3. Separar o tubo B para o filtrado
4. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C
5. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D
6. Pipetar 0,2 ml do hemolisado no tubo A, misturar bem; após exatamente 1 minuto acrescentar 6,8 ml de
SAS 50%; misturar e deixar em repouso por 20 minutos
7. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo
8. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C, misturar e transferir 50 μl para o tubo D
9. Ler a absorbância em 415 nm, acertando o zero do aparelho com água destilada
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MATERIAIS =
1. solução fisiológica, AD;
2. Espectrofotômetro, tubos de ensaio
3. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue)
METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie, 1960)=
1 10 0,0 1,00 0
2 8,5 1,5 0,85 0
3 7,5 2,5 0,75 0
4 6,5 3,5 0,65 0
5 6,0 4,0 0,60 0
6 5,5 4,5 0,55 0
7 5,0 5,0 0,50 0a5
8 4,5 5,5 0,45 5 a 45
9 4,0 6,0 0,40 50 a 90
10 3,5 6,5 0,35 90 a 99
11 3,0 7,0 0,30 97 a 100
12 2,0 8,0 0,20 100
13 1,0 9,0 0,10 100
14 0,0 10,0 0,00 100
3. transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados, e trabalhar com a metade da
diluição (2,5 mL em cada tubo = para o controle e o teste)
4. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo , homogenizar por inversão
5. deixar em repouso por 30 minutos em TA
6. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279]
(transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo, sem ressuspender o depósito, e pingar 2 gotas de
NH4OH 1%, misturando-se por inversão [279])
7. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm
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8. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise)
9. o tubo 14 representa o 100% de hemólise
10. calcular
VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0,45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0,30 % de NaCl)
OBS.:
1. no teste com incubação por 24 horas, incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas, sendo que a
esterilidade é fundamental. Neste, não pode ser usado o EDTA, porque provoca alterações morfológicas nas
Hc. A sequência técnica é a mesma como descrito acima, porém usando 17 tubos, com a inclusão de
concentrações de 0,9 – 0,8 – 0,7 % de NaCl
VR = % de NaCl % de hemólise
17 0,10 100
16 0,20 91 – 100
15 0,25 90 - 100
14 0,30 80 - 100
13 0,35 75 - 100
12 0,40 65 - 100
11 0,45 55 - 95
10 0,50 36 - 88
09 0,55 15 - 70
08 0,60 0 - 40
07 0,65 0 - 19
06 0,70 0–9
05 0,75 0
04 0,80 0
03 0,85 0
02 0,90 0
01 1,00 0
2. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado, com as porcentagens de
hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa
3. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil)
30
MATERIAIS =
1. espectrofotômetro; tubos de ensaio 17 x 100 mm
2. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L
3. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6,8 (solução de estoque)
Na2HPO4.12H2O 9g
KH2PO4 5,7 g
AD qsp 1000 mL
4. solução tampão fosfato M/60 pH = 6,8 (solução de trabalho)
solução 3 (ESTOQUE) 250 mL
AD qsp 1000 mL
5. amostra de ST normal para controle
OBS.:
- É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes
- Outros métodos podem ser usados, como :
a) eletroforese de Hb pH 8,6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas
congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +)
b) pesquisa de corpos de Heinz
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(G6PD)
MATERIAIS =
1. Solução de Glicose 0,28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL
2. Solução de Nitrito de Sódio 0,18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL
Obs.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de
AD qsp 100 mL, nas mesmas dosagens
METODOLOGIA QUALITATIVA =
1. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC, estável por 72 horas)
2. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST
B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2
C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3
3. homogenizar os tubos sem agitar, invertendo – os delicadamente, por 15 minutos
4. incubar em BM a 37ºC por 3 horas, exatamente, homogenizando de 15 / 15 minutos
5. diluir todos os tubos na proporção de 0,1 mL para 10 mL de AD, misturar e fazer a leitura
6. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B, entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras
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MATERIAIS =
1. idem para contagem de reticulócitos
2. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil 1g
citrato de sódio 0,4 g
NaCl 0,8 g
AD qsp 100 mL
3. usar amostra controle normal
METODOLOGIA =
1. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %, em BM, por 1 a 2 horas
2. ler em lâmina de imersão , procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul –
pálidas, tipo bolas de golfe
VR = negativo
OBS.:
1. No Portador Silencioso de α - talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 –
1 / 2000 Hc
2. No Traço α - talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc
3. Na Doença da Hb H, + em todos os campos observados
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GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM
MUNOHEMATOLOGIA
A leitura das reações de aglutinação / hemólise, em Imunohematologia, podem ser lidas
macroscopicamente, contra fonte de luz ou superfície iluminada, ou microscopicamente, colocando-se 1 gota
da suspensão entre lâmina e lamínula.
A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre
diferentes laboratórios.
.......
.......
.......
. . . . .
. . . . . .
. . . . .
.
0 ausência de aglutinação; fundo bastante róseo com hemáceas em
suspensão
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Quantificação das reações de aglutinação :
Método do escore numérico = segundo Race e Sanger, modificado por Marsh [Marsh W.L., Scoring of
Hemaglutination. Transfusion 1972;12:352 – 353] , faz-se a conversão da intensidade de aglutinação, de
cada diluição em valores individuais, depois somados (medida semi - quantitativa da reatividade do
anticorpo)
++++ 12
+++ 10
++ 8
+ 5
fraco 2
negativo 0
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35. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS :
As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%, em tubo.
Essas suspensões são usadas para Tipagem, PAI, e TCD
METODOLOGIA :
1. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm
2. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise
3. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda
4. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm
5. esvaziar o tubo por inversão
6. homogenizar o botão de hemáceas
7. repetir os procedimentos 3 a 6, por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical)
8. após a última lavagem, retirar completamente o sobrenadante
OBS. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia, porém como o rigor em
laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor, fazemos diluição
simples sem lavar as hemácias
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36. TIPAGEM ABO EM TUBO
MATERIAIS :
1. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco, APENAS se fôr feita a Fase Reversa)
2. antissoros anti-A, anti-B e anti-A,B
3. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa)
4. tubos de hemólise, centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl
METODOLOGIA :
Fase Direta =
1. prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)
2. rotular tubos em A, B e AB
3. colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste
4. homogenizar
5. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada)
6. ressuspender o botão
7. ler
Fase Reversa =
1. rotular tubos A e B
2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B)
3. homogenizar
4. centrifugar
5. ressuspender
6. ler
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37. TIPAGEM Rh EM TUBO
MATERIAIS :
1. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)
2. soro anti-Rh (D) e Controle Rh
3. Soro de Coombs monoespecífico
4. tubos de hemólise, centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl
METODOLOGIA :
1. identificar 2 tubos D e CRh
2. colocar no tubo D, 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste
3. colocar no tubo CRh, 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste
4. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos
5. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo
6. se aglutinação negativa, pesquisar D fraco = repetir passos 1,2 e 3, e incubar em
BM 37o C / 15-30 minutos
7. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos
8. ressuspender e ler; se positivo = D fraco positivo = Rh positivo
9. se aglutinação negativa, lavar cada tubo 3 vezes em salina
10. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo
11. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos
12. ressuspender o botão e ler; se + = D fraco positivo = Rh positivo e
se D fraco negativo, = D negativo (Rh negativo)
Causas de Falso-positivos =
1. uso de antissoro errado
2. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação)
3. poliaglutinação, autoaglutinação, proteínas anormais no soro-teste
4. contaminação dos reagentes com bactérias, substâncias estranhas
Causas de Falso-negativos =
1. uso de antissoro errado
2. falta de adicionar antissoro ao tubo teste
3. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro, tempo ou velocidade de centrifugação)
4. agitação forte na ressuspensão das células, dispersando aglutinações fracas
Obs.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D, mas sem
o anticorpo. Como testemunho negativo, deve ser da mesma procedência que o anti-D. Se não for
possível, usar controle Rh de outro fabricante, mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente).
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38. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE
DE COOMBS INDIRETO
MATERIAIS :
METODOLOGIA :
PAI EM SALINA =
1. idem 1 – 2 acima
2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI, incubar em BM 37o C / 15 minutos
3. lavar 3 vezes em salina
4. acrescentar 50 μl de SAH
5. centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos, ressuspender e ler
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39. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD)
MATERIAIS :
METODOLOGIA :
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40 .TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO)
MATERIAIS:
METODOLOGIA
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