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LABORATÓRIO: ______________________________________________________________ POP - 003/01- B
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
ALFA-AMILASE
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

Índice
Página Revisão
ÁCIDO ÚRICO - Método Enzimático Colorimétrico - UOD-PAP............................................ 03 00
ALBUMINA - Método Colorimétrico Verde de Bromocresol................................................... 07 00
ALFA-AMILASE - Método Cinético Gal G2 – CNP................................................................ 11 00
BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL - Método Colorimétrico Malloy-Evelyn – DMSO………. 16 00
CÁLCIO ASX -Método ARSENAZO III ................................................................................. 20 00
CÁLCIO - Método Colorimétrico (o-CRESOLFTALEÍNA)...................................................... 24 00
CLORO - Método Colorimétrico (Mercúrio – Tiocianato) ...................................................... 28 00
COLESTEROL - Método Enzimático Colorimétrico .............................................................. 32 00
HDL COLESTEROL DIRETO - Método Enzimático Colorimétrico Direto – Sem
precipitação............................................................................................................................. 36 00
HDL COLESTEROL - Método Precipitante – Ácido Fosfotúngstico...................................... 41 00
CREATININA - Método Cinético Colorimétrico...................................................................... 45 00
CREATINO QUINASE (CK-NAC) -Método Cinético – UV..................................................... 50 00
CREATINO QUINASE – MB (CK-MB) - Método Cinético – UV............................................. 54 00
FERRO Ferrozine - Método Colorimétrico............................................................................. 58 00
FERRO CRX - Método Cromazurol B .................................................................................... 62 00
FOSFATASE ALCALINA - Método Cinético Colorimétrico (DGKC – DEA).......................... 66 00
FÓSFORO – UV - Método Molibdato .................................................................................... 70 00
FRUTOSAMINA – Método Cinético Colorimétrico................................................................. 74 00
γ - GLUTAMILTRANSFERASE (GAMA - GT) - Método Cinético Colorimétrico.................... 77 00
GLICOSE - Método Enzimático Colorimétrico ....................................................................... 81 00
MAGNÉSIO MONO - Método colorimétrico - MAGON SULFONADO................................... 85 00
PROTEÍNA TOTAL - Método Colorimétrico .......................................................................... 90 00
PROTEÍNA URINÁRIA - Método Vermelho de Pirgalol......................................................... 94 00
TGO / AST - Método Cinético – UV........................................................................................ 98 00
TGP / ALT - Método Cinético – UV........................................................................................ 102 00
TRIGLICÉRIDES - Método Enzimático Colorimétrico............................................................ 106 00
URÉIA ENZIMÁTICA - Método Enzimático Colorimétrico ..................................................... 110 00
URÉIA UV - Método Cinético Enzimático – UV ..................................................................... 114 00

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

ÁCIDO ÚRICO

Método Enzimático Colorimétrico


UOD-PAP

1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de enfermidades renais, doenças metabólicas genéticas e patologias
como leucemias, linfomas, etc.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Sangue: o ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas, estando elevado em várias situações clínicas além da
gota. Somente 10% dos pacientes com hiperuricemia têm gota. Níveis elevados também são encontrados na insuficiência
renal, etilismo, cetoacidose diabética, psoríase, pré-eclâmpsia, dieta rica em purinas, neoplasias, pós-quimioterapia e
radioterapia, uso de paracetamol, ampicilina, aspirina (doses baixas), didanosina, diuréticos, beta-bloqueadores, dentre
outras drogas. Diminuição dos níveis é encontrada na dieta pobre em purinas, defeitos dos túbulos renais, porfiria, uso de
tetraciclina, alopurinol, aspirina, corticóides, indometacina, metotrexato, metildopa, verapamil, intoxicação por metais
pesados e no aumento do “clearance” renal.
Urina: cerca de 70% do ácido úrico é eliminado pelos rins. Esta dosagem é útil em pacientes com cálculos urinários para
identificação daqueles com excreção urinária de urato aumentada. Álcool causa diminuição do urato urinário. Anti-
inflamatórios, vitamina C, diuréticos e warfarim podem interferir no resultado.
Líquido sinovial: pode ser útil no diagnóstico diferencial de artropatias.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

No presente método, o ácido úrico da amostra sofre a ação da uricase, na presença de oxigênio, produzindo alantoína e
peróxido de hidrogênio, este em presença de um reagente fenólico (TOOS) e da 4-aminoantipirina, sofre a ação da
peroxidase produzindo um complexo violáceo (quinonimina), com máximo de absorção em 500 nm.
uricase
Ácido Úrico + O2 + 2H2O Alantoína + CO2 + H2O2
peroxidase
2H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS Quinonimina + 3H2O

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro, urina e líquido sinovial. Não usar plasma, pois obtem-se resultados falsamente diminuídos.
Soro: obtido da maneira usual. Separar dentro das próximas 2 horas da coleta. Soros ictéricos ou com hemólise
produzem valores falsamente elevados. O fluoreto inibe a Uricase.
Urina: de 24 horas, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0 com hidróxido de sódio a 5% e aquecer 10 minutos a 56°C
para dissolver os cristais de urato e ácido úrico, evitando resultados falsamente diminuídos. Diluir a urina 1:20 com água
destilada ou deionizada e fazer a determinação. Multiplicar o resultado por 20.
Líquido sinovial: a coleta não deve ser feita antes de decorridos 07 dias da última punção, ou antes de 30 dias após a
administração de medicamento intra-articular.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


o o o
Soro: O analito é estável 03 dias entre 2-8 C ou 06 meses a –10 C (10 C negativos). Não utilizar plasma, pois apresenta
resultados falsamente diminuídos.
Urina: Manter refrigerado.
Líquido sinovial: Até 15 dias entre 2-8oC.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Urina: presença de ácido ascórbico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material.

5. COMPONENTES DO KIT

ÁCIDO ÚRICO - UOD-PAP Registro M.S.: 80027310038


Códigos: BT 10.001 – 1 fr com 250mL + 1 fr Padrão – 2,0 mL.

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646


Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tampão Fosfato pH, 7.0 – 50 mmol, Uricase 450 U/L, Peroxidase 2500 U/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L;
TOOS 0,34 mmol/L e conservantes.
Padrão: Solução de Ácido Úrico (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 – 8 º C

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
Se o reagente for mantido de 15 – 25°C, protegido da luz, sua estabilidade será de 2 semanas
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 500 nm (490-510), com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas.e ponteiras
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.


y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Os reagentes devem estar à temperatura ambiente.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Água destilada 20μL - -
Padrão - 20μL -
Amostra - - 20μL
Reagente 1,0mL 1,0mL 1,0mL

3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente (16-25 °C) ou durante 10 minutos a 37°C.
4. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco a 500 nm (490-510nm). A cor é estável durante 30
minutos.
5. Para espectrofotômetros que requeiram volumes de leitura superiores aos indicados, usar 50 μl de amostra ou padrão e
2,0 mL de reagente.
y Os volumes de amostra e de reagentes podem ser modificados proporcionalmente, sem prejuízos para o desempenho
do teste. Os cálculos permanecem inalterados. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volume de amostra menores que 10 μL (10 microlitros = 0,01 mL)
são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela, pois aumentam a imprecisão da medição.

Dosagem na urina:
• Homogeneizar a urina, medir o volume e separar uma amostra de cerca de 20 mL. Ajustar o pH para a faixa entre 7 e 9
com NaOH 5% e aquecer a amostra durante 10 minutos a 56ºC. Este procedimento dissolve cristais de ácido úrico
presentes, evitando resultados falsamente diminuídos.
• Diluir a urina assim tratada 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de água destilada ou deionizada), procedendo à dosagem
como descrito acima para o soro.
• Multiplicar o resultado obtido por 10.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.
y Para soro lipêmico e/ou com bilirrubina superior a 10 mg/dL, misturar 1,0 mL de NaCl 0,9% e 0,02 mL de soro. Ler em
520 nm ou filtro verde, acertando o zero com água. Diminuir a absorbância assim obtida, da absorbância do teste e
calcular a concentração.
y Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciar a
dosagem, para que resultados falsamente diminuídos não sejam obtidos.

11. CÁLCULOS

Abs. Teste x Valor padrão mg/dL = mg/dL ácido úrico


Abs. Padrão

Onde: Abs. Teste → Absorbância do teste


Abs. Padrão → Absorbância do Padrão
Valor padrão mg/dL → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco)

Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:
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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator

Cálculo p/ Urina: Urina (mg/24 h) = mg/dL x volume urinário (em mL)


100

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL ácido úrico x 59,5 = mmol/L ácido úrico

Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma:
y Homens: 2,5 a 7,0 mg/dL = 148 a 416 mmol/L
y Mulheres: 1,5 a 6,0 mg/dL = 89 a 356 mmol/L
Para amostras de Urina:
y 250 a 750 mg/24horas.
Para amostras de Líquido sinovial:
y Valores próximos ao do soro colhido na mesma ocasião.
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 20 mg/dL (1190 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
O ácido ascórbico > 0,3 mmol/L, a hemoglobina > 1g/L e bilirrubina > 15 mg/dL interferem.
A lipemia pode afetar os resultados.
Falsos Valores elevados: acetozolamida, clorotiazida, furosemida, metildopa, fenotiazida, salicilatos, etc.
Falsos Valores baixos: vitamina C (ácido ascórbico), acetohexamida, alopurinol, azatiopina, probemicida, mercaptopurina,
coumarim, estrógenos, sulfinpirazona, etc.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Barham D, Trinder P. Analyst 1972; 27:142-145.


y Fossati P, Prencipe L, Bert G. Clin Chem 1980; 26:227-231.
y Pagana K.D. : Mosby’s diagnostic and laboratory test reference 1992, 754-758.
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5ªedição.
y Ácido Úrico – Bula do Kit – Biotécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

ALBUMINA
Método Colorimétrico
Verde de Bromocresol
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação do estado nutricional, de enfermidades hepáticas avançadas, enfermidades renais e
casos de desidratação grave.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A albumina é uma proteína globular produzida pelo fígado que é o principal componente protéico de um soro humano
normal. Tem diversas funções importantes:
y Transporte de moléculas hidrofóbicas como a bilirrubina e os ácidos graxos. Isto é possível devido a zona
hidrofóbica que existe em sua estrutura. Esta característica é utilizada para dosar a albumina.
y Nutrição;
y Manutenção da pressão osmótica sangüínea;
y Variações nos níveis séricos de albumina não são específicos já que podem ser devido a um grande número de
alterações, no entanto é útil para monitorar o estado do paciente.
Havendo lesão hepática ou renal teremos distúrbios que podem ser resumidos em:
y Hipoalbuminemia: que ocorre nas doenças hepáticas crônicas, na síndrome nefrótica e casos de desnutrição grave.
Essa redução está relacionada a diminuição da síntese hepática ou perda excessiva renal, levando a uma diminuição
da pressão coloidosmótica do plasma provocando um aumento de reabsorção de sódio e água e conseqüentemente
causando edema, icterícia e anemia dilucional.
y Hiperalbuminemia: é observada em casos de desidratação grave e queimaduras externas, onde teremos a perda
excessiva de água causando uma hemoconcentração.
Em algumas situações clínicas, o conhecimento dos níveis de albumina é suficiente e até pode oferecer algumas vantagens
em relação à proteína.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A albumina presente na amostra reage com o verde de bromocresol em meio ácido, formando um complexo colorido que é
quantificado espectrofotometricamente.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente:
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã

Amostras:
Soro, líquido pleural ou líquido ascítico.
Soro: obtido da maneira usual.
Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro: O analito é estável 3 dias entre 2 – 8°C e 7 dias a – 10oC (10°C negativos.)

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de lipemia intensa.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material.

5. COMPONENTES DO KIT

ALBUMINA Registro M.S.: 80027310032


Códigos: BT 10.002 - 1 fr de 250 mL + 1 fr de Padrão - 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tampão Succinato 0,88 mmol – pH 4,2 , verde de bromocresol 0,17 mmol/L, azida sódica 9mmol.
Padrão: Solução de Albumina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.


y Conservar a temperatura ambiente

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes a temperatura ambiente.


Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 630 nm (620-640), com cubetas
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas.e ponteiras
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
y O reagente contém azida sódica que é tóxica, portanto, tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. No descarte do reagente,
usar bastante água, pois a azida pode formar compostos explosivos com tubulações de cobre e chumbo.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão Albumina - 5 μL -
Amostra - - 5 μL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bem e deixar nos tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente.


3. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco a 630 nm. A cor é estável durante 30 minutos.
4. Para espectrofotômetros que requeiram volumes de leitura superiores aos indicados, usar 0,05 ml de amostra ou padrão
e 2 mL de reagente.
y Os volumes de amostra e de reagentes podem ser modificados proporcionalmente, sem prejuízos para o desempenho
do teste. Os cálculos permanecem inalterados. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volume de amostra menores que 10 μL (10 microlitros = 0,01 mL)
são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela, pois aumentam a imprecisão da medição.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas de segurança estabelecidas. Fazer
referência ao Manual ou POP de Segurança.

11. CÁLCULOS

Abs. Amostra x conc. Padrão = g/dL Albumina


Abs. Padrão

Onde Abs. Amostra → Absorbância da Amostra


Abs. Padrão → Absorbância do Padrão
Conc. Padrão → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco)

Devido a grande reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Albumina (g/dL) = Absorbância do Teste x Fator

Globulina = Proteína Total – Albumina


Relação A/G = Albumina / Globulina

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada : g/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): µmol/L = g/dL x 144,9
g/L = g/dL x 10

Valores de referência
Os valores são normais entre 3,5 e 4,8 g/dL.
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 6 g/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
A bilirrubina > 25 mg/dL e a hemoglobina > 1 g/L interferem no método.
Falsos Valores elevados: o uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca um aumento no valor.
Falsos Valores baixos: plasmas obtidos com heparina, lítio e oxalato de potássio combinando com fluoreto de sódio,
fornecem resultados falsamente diminuídos.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Doumas B. T: Watson, WA & Biggs H.G. – Clin. Chim. Acta. 1971;31:1:87.


y Henry, R; Sobel, C. & Berkman, S. – Anal. Chem. 29/10:1491 (1957).
y Jacobs DS, Kasten Jr. BL. – Laboratory Test Handbook, Hudson. Lexi-Comp Inc., 1996, 66.
y Albumina – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

ALFA-AMILASE
Método Cinético
Gal G2 - CNP
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades pancreáticas agudas ou crônicas e no diagnóstico da parotidite
(caxumba).

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A α – amilase é uma hidrolase que degrada complexos de carboidratos, sendo, predominantemente, de origem pancreática
e da glândula salivar. São conhecidas duas isoenzimas: a pancreática e a salivar, na proporção de 40:60 em soro de
indivíduos sadios. As dosagens da amilase sérica e urinária são amplamente utilizadas no diagnóstico de doenças do
pâncreas, bem como na investigação da função pancreática. Na maioria dos pacientes com pancreatite aguda, seus níveis
séricos elevam-se duas a 12 horas após o início do episódio, atingindo pico em 24 horas e retornando ao normal entre 48 a
72 horas. A magnitude da elevação sérica não é diretamente relacionada com a gravidade do envolvimento pancreático,
mas indica, com grande probabilidade, um diagnóstico de pancreatite aguda. Aumentos da amilase sérica não são
necessariamente devidos à pancreatite. Tumores de pulmão e de ovário podem produzir hiperamilasemia em torno de 50
vezes do intervalo de referência. Em torno de 25% da amilase sérica é normalmente eliminada na urina. Na insuficiência
renal está aumentada em proporção à extensão do comprometimento renal. Amilase sérica normal pode ser encontrada
(em torno de 20%) em pacientes com pacreatite aguda. Em episódios agudos de pancreatite crônica, níveis de amilase
podem estar ligeiramente aumentados, porém, freqüentemente, permanecem em níveis normais.
A amilase pode ligar-se a proteínas (ex.: imunoglobulinas), formando complexos de alto peso molecular denominados
macroamilases. Isso é caracterizado por amilase sérica elevada e urinária normal e pode ocorrer em indivíduos sadios.
Níveis aumentados
Parotidite
Pancreatite aguda
Macroamilasemia
Gravidez ectópica
Oclusão mesentérica
Queimaduras graves
Lesão de glândula salivar
Doença intra-abdominal (peritonite, apendicite aguda etc.)
Intoxicação alcoólica
Insuficiência renal grave
Obstrução das vias biliares
Obstrução intestinal
Obstrução do canal pancreático
Câncer de pâncreas
Cetoacidose diabética
Neoplasias (pulmão ou ovário)
Níveis diminuídos
Insuficiência pancreática
Fibrose cística avançada
Hepatopatias graves

AMILASE URINÁRIA

Uma quantidade significativa de amilase sérica é excretada na urina e, portanto, elevações séricas serão refletidas na
mesma. A amilase urinária parece atingir níveis mais elevados, persistindo por períodos mais longos, quando comparada
com a sérica. A macroamilasemia se caracteriza por elevação dos níveis séricos de amilase com valores urinários normais.
A relação entre o clearance de amilase/creatinina auxilia no diagnóstico diferencial da macroamilasemia (clearance muito
baixo). A relação normal é de 1% a 4%. Encontra-se aumentada na pancreatite aguda, diminuída na macroamilasemia e
normal ou pouco diminuída na hiperamilasemia salivar.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A α-amilase catalisa a hidrólise do 2-cloro-4-nitrofenil-α-galactosilmatóside (Gal-G2-α-CNP) liberando 2-cloro-4-nitrofenol. A


quantidade de 2-cloro-4-nitrofenol liberada é medida a 405 nm, sendo proporcional à atividade da enzima no soro.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas. Realizar a coleta pela manhã.

Amostras
Pode ser usado soro, urina, líquido pleural ou líquido ascítico.
Soro: obtido da maneira usual.
Urina: de 2 a 24 horas, sem conservantes. Colhido de maneira usual. Quando se determina a amilase na amostra de urina,
deve-se também determinar a creatinina na mesma amostra. O resultado deverá ser reportado com Relação
amilase/Creatinina (U/g), com o objetivo de compensar as variações de atividade da amilase em amostras obtidas de cada
micção.

11
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

Líquido pleural ou líquido ascítico: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


A α-amilase em soro e plasma é estável pelo menos por 5 dias a 2-8ºC. A heparina não interfere como anticoagulante.
o
A dosagem da amilase urinária deve ser feita em urina de 2 a 24 horas, mantida entre 2 e 8 C, sem conservantes.
Outros líquidos biológicos também devem ser colhidos sem conservantes,

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise ou sinais de contaminação bacteriana.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

α - AMILASE - Gal G2 - CNP Registro M.S.: 80027310013


Códigos: BT 11.001.00 – 2 fr com 15mL
BT 11.001.00 – 2 fr com 30mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente Substrato: Tampão biológico pH 6,00 – 50 mmol/L; Cloreto de sódio – 70 mmol/L; Cloreto de cálcio – 6 mmol/L;
Gal G2 – CNP 2,22 mmol/L

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 – 8 º C

Cuidados especiais:
- Pipetar o substrato com a boca, soprar no substrato, usar material contaminado com saliva e suor e conversar
junto ao frasco destampado são ações que podem contaminar o reagente com quantidades microscópicas de
saliva ou suor, capazes de deteriorar irreversivelmente o substrato.
- Segundo estudos de estabilidade a absorbância do substrato, medida contra a água, apresenta um acréscimo de
0,003 por mês. Elevações repentinas da absorbância do substrato indicam contaminação com saliva ou suor,
capazes de deteriorar irremediavelmente o substrato.
- Não utilizar o reagente quando sua absorbância, medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 0,005
ou quando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 405 nm, com cubetas termostatizadas
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Centrífuga.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

12
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y É necessário o uso de proteção respiratória, para evitar a contaminação do reativo.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y Recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

OBS: Leituras de absorbância do reativo superiores a 0,600 A com o aparelho zerado em 405 nm com água deionizada
indicam deterioração do reativo.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente durante alguns minutos, a temperatura desejada.
2. Pipetar em uma cubeta:

Soro / Plasma Urina Líquidos Pleural /


Ascítico
Reativo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Amostra 10μl 10μl 10μl

3. Misturar e inserir no porta-cubetas termostatizado.


13
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO – Bioquímica

4. Anotar a absorbância após 1 minuto e efetuar novas leituras após mais 1, 2 e 3 minutos (A1, A2 e A3 respectivamente).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

Para linearidade:
ΔA / min x 7537 a 37oC

Amilase Urinária/Hora
Amilase (U/l) x volume urinário (ml)
Amilase urinária (U/h) =
1000 x tempo de coleta (h)

Relação Amilase/Creatinina

Amilase (U/l) x 100


Relação Amilase/Creatinina (U/g) =
Creatinina (mg/dl)

Relação depuração da amilase / depuração da creatinina

Determinar a atividade da amilase e a concentração da creatinina no soro e em uma amostra de urina e aplicar os
resultados na seguinte fórmula:

Amilase na urina (U/l) x Creatinina no soro (mg/dl)


Relação (%): x 100
Amilase no soro (U/l) x Creatinina na urina (mg/dl)

Método para cálculo do fator

VT x 1000 VT = volume total do ensaio


Fator = VA = volume da amostra
ε x VA x d 1000 = conversão de U/ml para U/l
d = espessura da solução
ε = absortividade milimolar do 2-cloro-4-nitrofenol em 405 nm, pH 6,0 a 37 ºC (12,9)
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L

Valores de referência:
Para os Líquidos Pleural / Ascítico os valore são iguais aos do soro.Valores maiores que 3 vezes o limite superior de
referência indicam aumento considerável da atividade da amilase sérica. Incluir o procedimento a ser adotado diante de
um resultado crítico.

37ºC
Soro/Plasma < 86 U/L
Urina < 470 U/L

Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
A reação é linear entre 10 e 1038 (0,150 a 405nm)U/L. Para valores acima de 1038 U/L, diluir a amostra com solução
salina 0,9% e repetir a dosagem. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição.Caso sejam encontrados valores
superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos valores de linearidade. Indicar
o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Temperatura de incubação: A determinação deve efetuar-se a 37ºC.
Os anticoagulantes fluoreto, oxalato, citrato e EDTA interferem.
Amostras com hemólises produzem resultados falsamente diminuídos.
Valores de bilirrubina até 20 mg/dL e hiperlipemia (triglicerides até 1500 mg/dL) não interferem.
Falsos Valores elevados: Meperidina, codeína, morfina, álcool, diuréticos, salicilatos, tetraciclina, amostra contaminada.

14
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Falsos Valores baixos: Citratos, oxalatos e fluoretos.


14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Winn-Deen, E.S., DAVID, H.Sigler E., amd Chavez R., Clin Chem., 34,10,(1988), 2005.
y Rauscher, E., et al, Clin Chem., 31,1:14 (1985)
y I.D.P., Wootton and H. Freeman, Microanalysis Medical Biochemistry (1982).
y CNPG3 Technology: Genzyme Manual, 1-35, Cambridge, 1996;
y Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia: W.B. Saunders
Company, 1996; 525-527.
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 79-80, 91.
y Kaufman RA, Tietz NW. Clin Chem 1980; 26: 846-853.
y Pesce AJ, Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 1987; 817-830.
y Rosenblum JL. Clin Chem 1992; 38:920.
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Alfa-Amilase – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

15
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL


Método Colorimétrico
Malloy-Evelyn – DMSO
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação hepática, biliar e nas doenças hemolíticas.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A bilirrubina é formada principalmente pela degradação da molécula heme e é transportada até o fígado, veiculada pela
albumina. Nesta fase a bilirrubina é insolúvel em água e é conhecida como Bilirrubina Não Conjugada ou Bilirrubina
Indireta.
No fígado, a bilirrubina se liga ao ácido glicurônico para formar a Bilirrubina Conjugada, mediante a atuação da enzima uridil
difosfato glucoroniltransferase, transformando-se assim em Bilirrubina Direta ou Bilirrubina Conjugada. A Bilirrubina
Conjugada ou Bilirrubina Direta é excretada pelas vias biliares até o intestino, onde é metabolisada pela flora bacteriana
residente, à um grupo de produtos complexo, conhecidos como estercobilinogenio.
Esta eliminação se dá de maneira praticamente completa.
A Bilirrubina Total é a soma das duas bilirrubinas (Direta + Indireta). Esta Bilirrubina apresenta níveis séricos elevados na
presença de obstrução das vias biliares, doenças hemolíticas e na insuficiência hepática.
O monitoramento da Bilirrubina do neonato, em particular do prematuro é de suma importância, pois uma elevação
acentuada da Bilirrubina Indireta, superando a barreira hemato-encefálica podendo causar danos cerebrais irreversíveis.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Quase todas as técnicas de quantificação da Bilirrubina se baseiam na reação de Malloy-Evelyn, que quantifica
colorimetricamente a formação de azobilirrubina, de coloração vermelha, quando a bilirrubina reage sob determinadas
condições com o ácido sulfanílico diazotado.
A Bilirrubina conjugada, muito polar, reage em meio aquoso com o reativo de diazotação, Bilirrubina Direta, a coloração
aparece após o contato do soro e o reativo. A Bilirrubina livre, pouco polar, não dá uma reação direta e é preciso adicionar
um terceiro reativo para que seja produzida a reação de diazotação com o aparecimento da cor; por este motivo se chama
Bilirrubina Indireta.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 04 horas. No caso de recém-nascidos, antes da próxima mamada.

Amostras
Soro: obtido da maneira usual.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro. Estável por 8 horas a temperatura ambiente, 12 horas entre 2-8 ºC ou 24 horas congelado. Proteger da luz.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

BILIRRUBINA DIRETA E TOTAL – DMSO Registro M.S.: 80027310029


Códigos: BT 10003 – 1 fr. - 50 mL R1 (Bilirrubina Direta )+ 1 fr. - 50 mL R2 (Bilirrubina Total) + 1 fr. - 5 mL R3 (Nitrito)
BT 10003 – 1 fr. -250 mL R1 (Bilirrubina Direta )+ 1 fr. -250 mL R2 (Bilirrubina Total) + 1 fr. -25 mL R3 (Nitrito)

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente 1 – Bilirrubina Direta: Ácido sulfanílico 35 mmol/L, ácido clorídrico 180 mmol/L.
Reagente 2– Bilirrubina Total: Ácido sulfanílico 40 mmol/L, ácido clorídrico 60 mmol/L, Dimetilsulfóxido 10 mmol/L
Reagente 3 – Nitrito: Nitrito de sódio 33 mmol/L,azida sódica 16 mmol/L.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar protegido da luz.
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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Conservar entre 2 – 8 º C

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 550 nm.(530 - 570) com cubeta.
y Pipetas automáticas e ponteiras
y Banho Maria.
y Centrífuga.
y Cronômetro.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.

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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos:


Modo mono-reativo: Preparar alíquotas na proporção de 30 partes de Reativo 1 (Bilirrubina Direta) ou Reativo 2
(Bilirrubina Total) + 1 parte de Reativo 3 (Nitrito).
Estável por 48 horas, quando mantido em frasco fechado a 2-8°C e realizadas calibrações diárias. Os reativos de trabalho
desenvolvem uma coloração alaranjada, porém isto não interfere no resultado final.

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio: (Nota 1)

Branco Total Total Branco Direta Direta


R-1 – Bil Direta - -- 1,0 mL 1,0 mL
R-2 – Bil. Total 1,0 mL 1,0 mL - -
R-3 - Nitrito - 30 μL - 30 μL
Amostra/Padrão 50 μL 50 μL 50 μL 50 μL

2. Agitar bem e deixar reagir durante 5 minutos a temperatura ambiente. Ler as absorbâncias.

Nota:
1) Para pediatria pode-se variar os volumes proporcionalmente:
R – 1 / R - 2 = 1000 μL
R–3 = 30 μL
Amostra = 20 μL

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Conservar a amostra e o reativo protegidos da luz.

11. CÁLCULOS

CÁLCULOS

Cálculos:
Bilirrubina Total = AT – ABT x Concentração da Padrão
AP – ABP
Bilirrubina Direta = AD – ABD x Concentração da Padrão
AP – ABP
Onde: AT = Absorbância amostra Bilirrubina Total
ABT = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Total
AD = Absorbância amostra Bilirrubina Direta
ABD = Absorbância branco da amostra de Bilirrubina Direta
AP = Absorbância do Padrão
ABD = Absorbância do Branco de Padrão

Com fator:
Bilirrubina Total (mg/dL) = AT – ABT x 25,0
Bilirrubina Direta (mg/dL) = AD – ABD x 15,0

UNIDADES SI:
mg/dL bilirrubina x 17,1 = μmol/L bilirrubina

Exemplo: AT = 0,092 AD = 0,033


ABT = 0,040 ABD =0,020
AT - ABT =0,052 AB- ABD = 0,013

Bilirrubina Direta = (mg/dL) = 0,013 x 15 = 0,19 mg/dL


Bilirrubina Total = (mg/dL) = 0,052 x 25 = 1,30 mg/dL

Para amostras pediátricas, com volume de amostra reduzido para 20 μL, os valores de fator se modificam para:
BD = 36,5 e BT = 60,8.

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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL bilirrubina x 17,1 = μmol/L bilirrubina

Valores de referência
Bilirrubina Total: até 1,2 mg/dL (20,5 μmol/L)
Bilirrubina Direta: até 0,4 mg/dL (6,8 μmol/L).
Bilirrubina Total (Recém-nascidos) – mg/dL
Idade Cordão < 24 horas < 48 horas 3 a 5 dias 7 dias
Pré-maturo 2,9 8,0 12,0 15,0 15,0
Termo 2,5 6,0 10,0 12,0 10,0
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade: até 15 mg/dL = 256 μmol/L


Para valores superiores diluir a amostra 1:2 com solução salina e repetir a determinação multiplicando o resultado por 2.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
A leitura da amostra de branco evita a interferência da lipemia, hemólise ou turbidez dos soros liofilizados.
Falsos Valores baixos: Soros fortemente hemolisados podem fornecer valores falsamente diminuídos

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Hijmans Van der Bergh AA, Muller P., Biochem. 77, 90 (1916).
y Malloy, H.T. and Evelyn, KA, J.Biol.. Chem. 119, 481 (1937).
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501
y Sims FH, Horn C. Am J Clin Path 1958; 28: 412.
y Matimek, RG Clin. Chim. Acta, 13, 161 (1966).
y Walters MI, Gerarde RW, Microchem 15, 231 (1970).
y Bilirrubina Direta e Total – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 69.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 62

19
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CÁLCIO ASX
Método ARSENAZO III
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D,
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia, má
absorção, deficiência da vitamina D, diminuições de albumina e em situações que cursam com fósforo elevado
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. A hemólise pode elevar os
resultados.
Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação de
nefrolitíase. Exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinação é preferida na urina de 24 h; urina recente
pode ser utilizada realizando a razão cálcio: creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias, hiperabsorção
intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia, hipertireoidismo,
feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal, osteomálacia, raquitismo,
alcalose, uso de diuréticos e estrógenos.
Cálcio Iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose).

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A pH levemente ácido o cálcio forma com o arsenazo (III) um complexo azul, cuja intensidade é medida a 650 nm. A
intensidade de cor é proporcional a quantidade de cálcio presente na amostra. Não é observada nenhuma interferência do
magnésio no pH mencionado.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados).

Amostras
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L)
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível,
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Cálcio na amostra de soro ou plasma é estável 7 dias entre 2-8oC ou 6 meses à –20 ºC.
Urina: até 02 semanas em HCl 50% à temperatura ambiente.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Não deve ser utilizado soro hemolisado.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CÁLCIO ASX (ARSENAZO III) Registro M.S.: 80027310052


Códigos: BT 12002 – 2 fr. com 50,0 mL cada + 1 fr. Padrão – 2,0 mL
20
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Arsenazo III 0.18 mmol/L, Tampão MÊS 1.6 mmol/L, pH 6,8, conservantes
Padrão: Solução de Cálcio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15 - 30 ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 15 - 30º C


Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 650 nm (600-660) com cubetas.
y Banho de água a 37 ºC.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
21
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.


y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos..Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bem e deixar os tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente..


3. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA)da Amostra frente ao Branco á 650 nm (600 – 660 nm). A cor é estável durante
20 minutos.
Para análise bicromática utilizar filtro de referência: 700 nm.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com cálcio.
y O material utilizado na preparação do reativo deverá estar completamente isento de íons cálcio. Sugerimos a
lavagem com ácido nítrico 6N ou com detergente não iônico. Depois lavar várias vezes com água deionizada..

11. CÁLCULOS

Determinar a absorbância do padrão Ap e Calcular o Fator de calibração:

FC = concentração do padrão
FC = Fator de Calibração
Absorbância padrão

Cálcio Sérico:
Cálculo da concentração de Cálcio: (Multiplicar a absorbância pelo fator de calibração)
Concentração Cálcio (mg/dL) = Abs. Teste x FC

Cálcio Urinário
Ca Urina (mg/dL) = Abs. Teste x FC

Dosagem de Cálcio na urina de 24 horas:

mg/24 = cálcio urina (mg/dL) x vol urinário 24 h (mL)


100

Cálculo do Cálcio Ionizável:


Cal ioniz. = cálcio ionizável
6 x Ca – (0,19 x P) + A Ca = Cálcio sérico em mg/dL
Cal ioniz.= 3 P = Proteína Total (g/dL)
A = Albumina (g/dL)
(0,19 x P) + A + 6
12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL cálcio x 0,25 = mmol/L cálcio
22
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Valores de referência
Soro e plasma:
Crianças: 10,0 –11,6 mg/dL = 2,5 - 2,9 mmol/L
Adultos: 8,8 – 10,8 mg/dL = 2,2 – 2,7 mmol/L
Urina: 100-300 mg/24 horas = 25 – 87,5 mmol/24 horas
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 20mg/dL = 5 mmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
A hemoglobina (1,5 g/L), a bilirrubina (20 mg/dL), o magnésio (10 mg/dL) e os fosfatos (20 mg/dL) não interferem.
Triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos.
Falsos Valores elevados: estrógenos, sais de cálcio, vitamina D, antiácidos, dieta rica em cálcio.
Falsos Valores baixos: cortisona, gentamicina, meticilina, uso excessivo de laxante, heparina, dieta pobre em cálcio,
cloreto de s´dio intravenoso.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Zak B., Epstein E., Babinski E.S., Review of Calcium Methodologies - Annals of Clinical and laboratory Science 5,
195 – 212 (1975).
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5 ª edição
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 96-98.
y Cálcio – Arsenazo III – Bula do Kit – Biotecnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

23
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CÁLCIO
Método Colorimétrico
(o-CRESOLFTALEÍNA)
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Para determinação dos níveis de Cálcio sérico. Este íon atua como mediador na contração muscular, transmissão nervosa
e mediação da coagulação sanguínea. O hormônio paratireoideano e a Vitamina D aumentam a absorção do cálcio do trato
gastrointestinal, liberando-o para os ossos em caso de déficit desse íon.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Sangue: o cálcio total encontra-se ligado às proteínas (47%) e livre (43%). Hipercalcemia é encontrada no
hiperparatireoidismo, algumas neoplasias com ou sem metástases ósseas, mieloma, desidratação, hipervitaminose D,
síndrome de imobilidade, hipertireoidismo, hepatopatias, insuficiência renal, sarcoidose, linfoma, uso de diuréticos e
estrógenos. Níveis baixos de cálcio total são encontrados na osteomalácia, pancreatite, hipomagnesemia, hipervolemia,
má absorção, deficiência vitamina D, diminuições da albumina, e em situações que cursam com fósforo elevado
(insuficiência renal, hipoparatireoidismo). Níveis críticos de cálcio total são aqueles inferiores a 6 mg/dL e superiores a 14
mg/dL. Na interpretação dos valores normais deve-se levar em conta níveis de albumina. Hemólise pode elevar seus
resultados.

Urina: é útil na investigação dos efeitos da vitamina D e PTH sobre a reabsorção óssea. Também utilizado na avaliação
de nefrolitíase. O exame deve ser realizado após 4 dias de dieta. Sua determinação é preferida na urina de 24 h. Urina
recente pode ser utilizada realizando a razão cálcio / creatinina. Hipercalciúria é encontrada nas hipercalcemias,
hiperabsorção intestinal de cálcio, distúrbios da reabsorção tubular de cálcio, corticoterapia, osteoporose, acromegalia,
hipertireoidismo, feocromocitoma, Cushing. Hipocalciúria pode ser secundária à hipocalcemia, insuficiência renal,
osteomalácia, raquitismo, alcalose, uso de diuréticos e estrógenos.

Cálcio iônico: O cálcio iônico é a fração biologicamente ativa do cálcio sérico total, representando 43% desse. Sua
concentração é mais baixa à noite e maior pela manhã. A dosagem do cálcio iônico independe da albumina, entretanto
varia com o pH (aumenta na acidose; diminui na alcalose).

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O composto o-cresolftaleína (CFC) reage com Cálcio presente na amostra em meio alcalino originando um complexo
colorido que se pode quantificar espectrofotometricamente.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.
A determinação na urina requer uma dieta prévia de pelo menos 3 dias livres de cálcio (eliminar leite e derivados).

Amostras
Podem ser utilizados soro, plasma ou urina
Soro não hemolisado, plasma (heparina). Evitar amostra de plasma contendo EDTA, citrato ou oxalato. A amostra deve
ser obtida por via venosa, porém sem deixar o torniquete por muito tempo, para evitar que alterações no nível de albumina
– ao redor do torniquete forme um gradiente de concentração de cálcio. O uso do torniquete pode aumentar o nível de
cálcio em 0,5 mg/dL (0,10 mol/L)
Não utilizar soro proveniente de pacientes em Terapia com EDTA – hiperparatireoidismo. Neste caso, é recomendável o
uso da técnica espectrofotométrica de Absorção Atômica.O soro deve ser separado do coágulo o mais rápido possível,
Urina: Coletar todo volume da micção de 24 horas, homogeneizar bem todo o volume de 24 horas, separar 5,0 mL e
adicionar 1 gota de HCl concentrado. Esta é a amostra teste.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Cálcio na amostra de soro ou plasma é estável 7 dias entre 2-8oC ou 6 meses à –20 ºC.
Urina: até 02 semanas em HCl 50% à temperatura ambiente.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Não deve ser utilizado soro hemolisado.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CÁLCIO o-CRESOLFTALEÍNA-Complexona (CFC) Registro M.S.: 80027310027


Códigos: BT 12001 – 1 fr. com 50,0 mL RA + 1 fr. com 50,0 mL RB + 1 fr. Padrão – 2,0 mL
24
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reativo A: Tampão Etanolamina 500 mmol/L.


Reativo B: orto-cresolftaleína complexona 0,62 mmol/L; 8-hidroxiquinoleína 69 mmol/L.
Padrão de Cálcio: Solução estabilizada de Cálcio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15 e 30º C

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 15 - 30º C


Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 570 nm (550-590) com cubetas.
y Banho de água a 37 ºC.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
25
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos..Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos Reativos:


Reativo de Trabalho: Mistura na proporção de 1 mL de Reativo A + 1 mL de Reativo B.
Estável por 24 horas a temperatura ambiente.

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reat. Trab. 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente.


3. Decorridos os 10 minutos, ler a absorbância do Padrão e da Amostra frente ao Branco do reativo à 570 nm.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O material utilizado na preparação do reativo de trabalho deverá estar completamente isento de íons cálcio.
Sugerimos a lavagem com ácido nítrico 6N ou com detergente não iônico. Depois lavar várias vezes com água
deonizada.
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com cálcio.
y A técnica se caracteriza por Absorbâncias dos brancos muito baixas, leituras acima de 0,200 de Absorbância indicam
contaminação grosseira por cálcio e os reativos devem ser desprezados. Um novo reativo de trabalho deve ser
preparado.

11. CÁLCULOS

Determinar a absorbância do padrão Ap e Calcular o Fator de calibração:

FC = concentração do padrão
Absorbância padrão FC = Fator de Calibração

Cálcio Sérico:

Cálculo da concentração de Cálcio: (Multiplicar a absorbância pelo fator de calibração)


Concentração Cálcio (mg/dL) = Abs. Teste x FC

Cálcio Urinário
Ca Urina (mg/dL) = Abs. Teste x FC

Dosagem de Cálcio na urina de 24 horas:

mg/24 = cálcio urina (mg/dL) x vol urinário 24 h (mL)


100

Cálculo do Cálcio Ionizável:

Cal ioniz. = cálcio ionizável


Ca = Cálcio26sérico em mg/dL
P = Proteína Total (g/dL)
A = Albumina (g/dL)
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

6 x Ca – (0,19 x P) + A
Cal ioniz.= 3

(0,19 x P) + A + 6

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL cálcio x 0,25 = mmol/L cálcio

Valores de referência
Cálcio no Soro: 8,5 - 10,5 mg/dL = 2,12 - 2,63 mmol/L
Cálcio iônico: 4,0 - 5,4 mg/dL = 1,0 – 1,35 mmol/L
Urina: 60 - 200 mg/24 horas = 1,5 - 5,03 mmol/24 horas

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 20 mg/dL (5,0 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
A hemoglobina (1,5 g/L), a bilirrubina (20 mg/dL), o magnésio (10 mg/dL) e os fosfatos (20 mg/dL) não interferem.
Triglicérides acima de 900 mg/dL produzem resultados falsamente elevados por interferência fotométrica.
Falsos Valores elevados: estrógenos, sais de cálcio, vitamina D, antiácidos, dieta rica em cálcio.
Falsos Valores baixos: cortisona, gentamicina, meticilina, uso excessivo de laxante, heparina, dieta pobre em cálcio,
cloreto de s´dio intravenoso.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Martineck, R.G. – J.Am. Med. Tech. 33:416 (1971).


y Henry, R.J. – Clinical Chemistry, Principles and Techniques, Harper & Row Publishers (1964).
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Jacobs DS, Kasten Jr BL. Laboratory Test Handbook, Hudson: Lexi-Comp Inc., 1996; 96-98.
y Cálcio – o-Cresolftaleína – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

27
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CLORO
Método Colorimétrico
(Mercúrio – Tiocianato)
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na dosagem de íons cloretos no sangue. A determinação dos cloretos em amostras de sangue e
urina faz parte da avaliação dos distúrbios hidro-eletrolíticos e ácido-básicos. A dosagem do cloreto no suor é útil no
diagnóstico da fibrose cística.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Cloro Sérico
É o principal ânion extracelular. Juntamente com o sódio, representa a maioria dos constituintes osmoticamente ativos do
plasma. Desta forma, está envolvido na manutenção da pressão osmótica e balanço hidroeletrolítico. A maior parte do cloro
ingerido é absorvida e o excesso excretado na urina.

Níveis Aumentados Níveis Diminuídos


Insuficiência renal aguda Acidose metabólica
associada a elevação de
ânions
orgânicos(cetoacidose
diabética e insuficiência
renal)
Acidose metabólica Acidose respiratória
associada à diarréia
prolongada com perda de
bicarbonato
Acidose tubular renal Alcalose metabólica
Alcalose respiratória Aldosteronismo
Alguns casos e Doença de Addison
hiperparatireoidismo
primário
Desidratação Hipersudorese
Diabetes insipidus Nefrite perdedora de sal
Hiperfunção adrenocortical Secreção gástrica
persistente
Intoxicação por salicilato Vômito prolongado

Cloro Urinário
Normalmente a excreção urinária de cloro se aproxima da ingestão. São observados níveis fisiologicamente aumentados na
diurese pós-menstrual e diminuídos na retenção hídrica pré-menstrual.

Níveis Aumentados Níveis Diminuídos


Aumento da ingestão Diminuição da ingestão de
sal
Uso de diurético Vômito
Depleção de potássio Diarréia
Doença de Addison Aspiração gástrica
Necrose tubular aguda Diabetes insipidus
Pielonefrites Fístulas gastrointestinais
Rim policístico Síndrome de Cushing
Síndrome de Bartter
Uso de teofilina

Cloro, Líquor
Acompanha as alterações (diminuição ou elevação) dos níveis séricos. Diminuindo na meningite tuberculosa e outras
meningites bacterianas.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O íon cloreto reage com o íon mercúrico liberando uma quantidade equivalente de íon tiocianato que em presença de ferro
trivalente forma um complexo colorido violeta. A intensidade da coloração do complexo é proporcional a concentração do
íon cloreto presente na amostra.

28
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Usar soro ou plasma (EDTA, oxalato, citrato, heparina), urina (colhida com intervalo de 24 horas), suor e líquor.
Soro ou plasma: obtido da maneira usual. Para evitar a passagem do cloreto para as hemácias, o plasma ou soro, devem
ser separados até 1 hora após a coleta.
O analito é estável por 7 (sete) dias entre 15 – 30oC e vários meses a 10oC negativos.
Urina ou líquor: Para dosagem no líquor ou na urina, utilizar amostras centrifugadas. Urina de 24 horas. Diluir a urina 1:2.
Multiplicar o resultado obtido por 2.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


O íon cloreto é estável na amostra até 04 dias se armazenado entre 2-8oC.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CLORETO Registro M.S.: 80027310028


Códigos: BT 12003 – 1 fr com 50mL. + 1 fr Padrão – 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tiocianato de mercúrio 12.9 mM, nitrato de ferro (III) 170 mM, ácido nítrico 50 mM.
Padrão: Solução de íons Cloreto (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15 – 30ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 15 a 30º C.


Manter protegido da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 460 - 500 nm com cubetas.
y Banho de água a 37 ºC.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

29
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão - 5 μL -
Amostra - - 5 μL
Reagente 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

2. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 5 minutos à temperatura ambiente.


3. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco á 460-500 nm.
A cor é estável durante 30 minutos.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Cuidados especiais com a água utilizada! Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou
Água Reagente.

11. CÁLCULOS

Abs. Amostra X Concentração do padrão = mEq/L cloreto


Abs. Padrão
30
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Onde:
Abs. Amostra Æ Absorbância da Amostra
Abs. Padrão Æ Absorbância do Padrão

Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Cloreto (mEq/L) = Absorbância do Teste x Fator

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mEq/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mmol/L = mEq/L x 0,5

Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma:
98 – 110 mEq/L = 49 – 55 mmol/L
Para amostras de Urina:
170 – 250 mEq/24h = 85 – 125 mmol/L
Suor até 40 mEq/L.
Líquor: 118 a 132 mEq/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 200 mEq/L (100 mmol/L)
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Para amostras Lipêmica, ictéricas e hemolizadas, fazer o branco da amostra com água destilada.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Zall D.M.,Fisher D., Garner D.O.,Anal. Chem.,28,1665 (1956)


y Skeggs L. Metodologia Technicon.
y Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501.
y Cloro – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 11-12.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 58-59

31
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

COLESTEROL
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação dos riscos de aterosclerose e monitoramento de pacientes diabéticos, obesos e com
hipotiroidismo.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

O colesterol é um componente estrutural importante da membrana celular e precursor para biossíntese de ácidos biliares e
hormônio esteróides. O colesterol total compreende todo colesterol encontrado em várias lipoproteínas, sendo cerca de
60% a 70% transportados pela LDL- lipoproteína, 20% a 35% pela HDL-lipoproteina e 5% a 12% pela VLDL-lipoproteina.
O colesterol é o principal lipídio associado à doença vascular aterosclerótica.
Uma dosagem de colesterol elevada é uma boa indicação dos riscos de aterosclerose, a qual é uma degeneração de
artérias de grande e médio calibre através da deposição de lipoproteínas, dentre elas o colesterol, com conseqüente
inflamação e fibrose de suas paredes. A aterosclerose desencadeia várias disfunções em vários órgãos principalmente no
coração, cérebro e rins.

AUMENTO: icterícia obstrutiva, D. de Von Gierke, hepatite por vírus, cirrose porta, S. nefrótica, pancreatite crônica, após
pancreatectomia, diabetes mellitus, hipotireoidismo, hipercolesterolemia familiar(deficiência de receptores LDL),
hipercolesterolemia poligênica, hiperlipidemia familiar combinada, disbetalipoproteinemia familiar, aterosclerose, gota,
anorexia nervosa, hepatoma, S. de Cushing, porfiria intermitente aguda, gravidez. Drogas: corticosteróides.

DIMINUIÇÃO: hepatopatias graves, inanição, uremia terminal, septicemia, hipertireoidismo, S. de má absorção, má


nutrição, uso de ACTH e corticóides, anemia perniciosa, anemia hemolítica , anemia hipocrômica severa, hemofilia,
acantocitose, D. de Addison, grandes queimados, D.de Gaucher, D. de Tangier, abetalipoproteinemia, linfangiectasia
intestinal.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Os ésteres de colesterol existentes na amostra são hidrolisados pela enzima colesterol esterase produzindo o colesterol
livre. A enzima colesterol oxidase, em presença de oxigênio, catalisa a oxidação do colesterol livre, produzindo peróxido de
hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do reagente fenólico (fenol) pelo peróxido de hidrogênio formado, em
presença de 4-aminoantipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta máximo de
absorção em 500 nm.
col. Esterase
Colesterol esterificado + H2O ------------------>Colesterol + Ac. graxo

col. oxidase
Colesterol +1/2 O2 ----------------> Colestenona + H2O2

peroxidase
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol -------------> Quinonaimina +4H2O

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente:
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.

Amostras:
Soro ou plasma, líquido ascítico ou líquido pleural.
Soro: obtido da maneira usual. Separar dentro das próximas 2 horas da coleta. Soro ou plasma heparinizado, outros
anticoagulantes podem interferir no resultado final. Não usar amostras visivelmente hemolisadas.
Líquido ascítico ou líquido pleural: O material não é colhido no laboratório. O exame é feito somente com material
enviado até 06 horas depois da coleta

Armazenamento e estabilidade das amostras:


As amostras de soro / plasma podem ser guardadas 2 – 8OC por uma semana ou – 20OC por 2 meses.

Volumes mínimos e ideais


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise intensa.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material.
32
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

5. COMPONENTES DO KIT

COLESTEROL Registro M.S.: 80027310039


Códigos: BT 10.004 – 1 fr com 250mL + 1 fr Padrão – 2,0 mL
BT 10.004 – 4 fr com 250mL + 1 fr Padrão – 2,0 mL.

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tampão fosfato 182,42 mmol/L– pH 7,2; 4-Clorofenol 20 mmol/L; 4-Aminoantipirina 0,6 mmol/L; Colesterol
esterase (CHE) > 750 U/L; Colesterol oxidase > 200 U/L; Peroxidase > 2000 KU/L, Colato de Sodio 8 mM.
Padrão: Solução de Colesterol (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 – 8 º C

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 500 nm (490-510) com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.

33
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.


y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Deixar o Reagente durante alguns minutos á temperatura ambiente ou em um banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão - 10 µL -
Amostra - - 10 µL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante 10 minutos a 37ºC.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e a (AA) da Amostra frente ao Branco á 500 nm.
A cor é estável durante 30 minutos.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

Colesterol (mg/dL) = Abs. Amostra X Concentração do Padrão


Abs. Padrão

Devido à ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Colesterol (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mmol/L = mg/dL x 0,026

Valores de referência

Faixa Etária Valor (mg/dL) Interpretação


Menor que 170 Desejável
2 a 19 anos De 170 a 199 Limítrofe
Maior que 200 Aumentado
Menor que 200 Ótimo
20 anos ou De 200 a 239 Limítrofe
acima Maior que 240 Alto

34
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

* Dados das III Diretrizes Brasileiras sobre


Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose – 2001.

Líquido Ascítico ou Líquido Pleural:


y Inferior ao soro com triglicérides elevados: = quiloso
y Superior ao soro com triglicérides normal: = quiliforme
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 800 mg/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
- Ácido Ascórbico: mesmo em baixas concentrações (abaixo de 2 mg/dL) o ácido ascórbico induz a resultados falsamente
diminuídos.
- Hemoglobina e Triglicérides elevados (amostra com turvação evidente): Hemoglobina acima de 150mg/dL (hemólise
significativa) e hiperlipemia acentuada induzem a resultados falsamente aumentados.
Bilirrubina: Bilirrubina até 15 mg/dL não interfere no resultado do teste.
Falsos valores elevados: Esteróides, anticoncepcional oral, bromatos, fenotiazina, sulfonamidas, fenitoína, aspirina e
epinefrina.
Falsos valores diminuídos: neomicina, tetraciclina, heparina, agentes hipoglicemiantes, kanamicina, colchicina.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Trinder P. - Ann Clin Biochem 6124 (1969).


y Abell, L.L.; Levy, B.B.; Kendalll, F.E.:J. Biol. Chem. 195-357 (1952)
y Castelli, W.P. – Current Prescribing 6177: 39 (1977). Bull Org Mond Santé. 1970;43:891.
y Fredriickson DS, Levy RJ, Lee RS. New Engl J Med 1967; 276:24, 94, 148, 215, 276.
y Good NE, Winger GD, Winter W, Connoly TN, Izawa S, Singh RMM. Biochemistry 1966;5:467.
y Colesterol – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 125.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 67-68

35
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

HDL COLESTEROL DIRETO


Método Enzimático Colorimétrico
Direto – Sem precipitação
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de dislipidemias associadas a patologias coronárias.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Vários estudos sugerem existir uma forte correlação inversa entre os níveis de C-HDL e o risco de aterosclerose. Isso deve-
se ao fato da HDL-lipoproteína estar envolvida no chamado transporte reverso do colesterol para ser metabolizado no
fígado (sítio de maior excreção do colesterol).
Valores de C–HDL são dependentes de sexo e idade, tendendo a decrescer temporariamente após infarto agudo do
miocárdio.
Em doenças da tireóide, seus valores não devem ser usados como estimativa de risco de aterosclerose, visto que o
hipotireoidismo aumenta e o hipertireoidismo diminui seus níveis.
Valores de HDL – colesterol são aproximadamente 1/5 do colesterol total.

Fatores que contribuem para o decréscimo do colesterol HDL


ƒ Fatores genéticos: hipoalfalipoproteinemia.
ƒ Fumo.
ƒ Obesidade.
ƒ Hipertrigliceridemia.
ƒ Sedentarismo.
ƒ Esteróides,androgênios, progestágenos, anabólicos, tiazídicos.
ƒ Bloqueadores beta adrenérgicos.
ƒ Neomicina.
ƒ Anti-hipertensivo.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O anticorpo antiβ-lipoproteína humana presente no Reagente A se liga as lipoproteínas (LDL, VLDL e Quilomicrons)
deixando a lipoproteína HDL livre.
Quando é adicionado o Reagente B, somente o Colesterol HDL reage com a cadeia enzimática (CHE-CO). O peróxido de
hidrogênio produzido pela reação enzimática produz um complexo de cor azul sob condensação oxidativa com F-DAOS e
4-AAP, em presença de peroxidase. A concentração do HDL presente na amostra é proporcional a absorbância, medida à
600 nm.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.

Amostras
Soro não hemolisado, plasma (heparina ou EDTA)

Armazenamento e estabilidade das amostras:


O Colesterol é estável na amostra 7 dias à 2-8 ºC ou 30 dias à –20 ºC.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Soro hemolisado.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material.

5. COMPONENTES DO KIT

COLESTEROL HDL - DIRETO Registro M.S.: 80027310035


Códigos: BT 10.006 – 1 fr R-A com 45 mL. + 1 fr. R-B com 15 mL + 1 fr Calibrador – 1,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
36
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reativo A: 4-aminoantipirina 0,9 mM, POD > 2400 U/L, Ascorbato oxidase > 2700 U/L; Anticorpos antiβ-lipoproteína
humana 2,0 U/L.
Reativo B: Colesterol esterase > 4000 U/L, Colesterol oxidase > 2000 U/L; F-DAOS 0,8 mM; Tampão MES 30 mM, pH 7,0.
Calibrador: Soro liofilizado (Valor da concentração vide etiqueta do frasco).

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 e 8º C.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 600 nm, com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.

37
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.


y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos:


Calibrador: Reconstituir o calibrador com exatamente 1,0 mL de água destilada ou deionizada.
Fechar o frasco e homogeneizar cuidadosamente, para dissolver todo o liofilizado. Evitar a formação de espuma. Deixar em
repouso por 30 minutos antes do uso.
O calibrador é estável 03 dias se conservado entre 2-8ºC ou 30 dias a –20ºC, depois de reconstituído.
Congelar e descongelar somente uma vez. Homogeneizar cuidadosamente depois de descongelado.
Reagentes: Os reagentes são fornecidos na forma líquida, pronto para uso. A estabilidade dos reativos é de pelo menos 60
dias, após o frasco aberto, se conservados de 2-8ºC e tomados os devidos cuidados para evitar contaminação.

Procedimento manual
Técnica Micro:

1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Calibrador Amostra


Água 4 μL - -
destilada
Calibrador - 4 μL -
Amostra - - 4 μL
Reativo A 300 μL 300 μL 300 μL

2. Homogeneizar, incubar a 37 ºC por 5 minutos.


3. Ler a absorbância a 600 nm (A1) da amostra e (A1p) do padrão. Adicionar:

Reativo B 100 µL 100 µL 100 µL

4. Homegeneizar e incubar 5 minutos a 37 ºC.


5. Ler a absorbância (A2p) do Padrão e (A2) da amostra frente ao Branco a 600 nm.
6. A reação é estável por 30 min. se protegida da luz.

Técnica Macro:

1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Calibrador Amostra


Água 10 μL - -
destilada
Calibrador - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reativo A 750 μL 750 μL 750 μL

2. Homogeneizar, incubar a 37 ºC por 5 minutos. Adicionar:


3. Ler a absorbância a 600 nm (A1) da amostra e (A1p) do padrão. Adicionar:

Reativo B 250 µL 250 µL 250 µL

4. Homogeneizar e incubar 5 minutos a 37 º C.


5. Ler a absorbância (A2p) do Padrão e (A2) da Amostra frente ao Branco a 600 nm.
6. A reação é estável por 30 min. se protegida da luz.

38
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

A1p = ΔA padrão
A2-A1 = ΔA amostra
[P]= Concentração do Padrão

ΔA padrão x valor da concentração do padrão = mg/dL de HDL-c


ΔA amostra

Com Fator: Fator de calibração = [P]


ΔA padrão

Concentração de HDL em mg/dL = ΔA amostra x Fator Calibração

Exemplo: A2 = 0,280
A1= 0,142
A2p= 0,167
A1p= 0,056
[P] = 35 mg/dL

ΔA amostra= 0,280-0,142=0,138
ΔA padrão= 0,167-0,056=0,111

Fator = 35 = 315,3
0,111

Colesterol HDL (mg/dL) = 0,138 x 315,3 = 43,5 mg/dL.

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mmol/L Colesterol = mg/dL colesterol x 0,026

Valores de referência

Desejável Risco Alto risco


moderado
Colesterol LDL < 130 130 – 159 ≥160
Colesterol Total < 200 200 – 239 ≥ 240
Col. HDL – Homens > 55 35 – 55 < 35
Col. HDL - Mulheres > 65 45 – 65 < 45

Estes valores são unicamente orientativos, sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos
de referência. Pelas últimas Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, os valores de
referência para HDL Colesterol podem ser consultados por faixa etária, como mostrado na tabela abaixo:

Faixa Etária Valor (mg/dL) Interpretação


Até 10 anos Maior que 40 Desejável
De 10 a 19 anos Maior que 35 Desejável
Menor que 40 Baixo
20 anos ou acima
Maior que 60 Alto
Diabéticos Maior que 45 Desejável

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 180 mg/dL
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Ácido Ascórbico (até 50 mg/dL), Hemoglobina (até 500 mg/dL), Bilirrubina (até 40 mg/dL) e lipídios (até 5 g/dL) não
interferem.

39
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Gordon T et al.: High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease. The Framingham Study,
Am J. Med., 62,707 (1977).
y Sachiko Izawa et al.: A new direct method for measuring HDL – Cholesterol which does not produce any biased values.
J.Med. And Pharm.Sci., 1385-1388, 37 (1997)
y HDL Colesterol –Direto – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 241.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 67-68

40
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

HDL COLESTEROL
Método Precipitante – Ácido Fosfotúngstico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação dos riscos de doenças coronarianas e renais causadas por aterosclerose.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Vários estudos sugerem existir uma forte correlação inversa entre os níveis de C-HDL e o risco de aterosclerose. Isso se
deve ao fato da HDL-lipoproteína estar envolvida no chamado transporte reverso do colesterol para ser metabolizado no
fígado (sítio de maior excreção do colesterol).
Valores de C–HDL são dependentes de sexo e idade, tendendo a decrescer temporariamente após infarto agudo do
miocárdio.
Em doenças da tireóide, seus valores não devem ser usados como estimativa de risco de aterosclerose, visto que o
hipotireoidismo aumenta e o hipertireoidismo diminui seus níveis.
Valores de HDL – colesterol são aproximadamente 1/5 do colesterol total.

Fatores que contribuem para o decréscimo do colesterol HDL:


ƒ Fatores genéticos: hipoalfalipoproteinemia.
ƒ Fumo.
ƒ Obesidade.
ƒ Hipertrigliceridemia.
ƒ Sedentarismo.
ƒ Esteróides,androgênios, progestágenos, anabólicos, tiazídicos.
ƒ Bloqueadores beta adrenérgicos.
ƒ Neomicina.
ƒ Anti-hipertensivo

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Os quilomicrons e as lipoproteínas de baixíssima densidade (VLDL) e de baixa densidade (LDL) presentes na amostra,
precipitam em presença de fosfotungstato e íons magnésio. O sobrenadante da centrifugação contém as lipoproteínas de
elevada densidade (HDL), cujo colesterol quantifica-se espectrofotometricamente mediante as reações acopladas descritas
abaixo.
col. esterase
Colesterol esterificado + H2O -------------> Colesterol + Ac. graxo

col. oxidase
Colesterol + ½ O2 + H2O --------------> Colestenona + H2O2

peroxidase
2H2O2 + 4-Aminoantipirina +DCFS ------------->Quinonaimina+4H2O

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum não é
imprescindível para a dosagem de colesterol total, mas o é para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A
abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2
minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos.

Amostras
Soro não hemolisado, plasma (heparina ou EDTA).

Armazenamento e estabilidade das amostras:


O Colesterol é estável na amostra 3 dias à 2-8 ºC.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise intensa.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

HDL COLESTEROL (PRECIPITANTE) Registro M.S.: 80027310054


Códigos: BT 10.005 – 1 fr com 50mL. + 1 fr Padrão – 2,0 mL
41
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Ácido Fosfotúngstíco 16 mmol/L, cloreto de magnésio 3,5 mmol/L..


Padrão: Solução padrão de Colesterol (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 e 8º C.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 600 nm, com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
42
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.


y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
Precipitação
1. Pipetar em tubo de centrífuga

Amostra 250 μL
Reagente precipitante 250 μL

2. Agitar e deixar durante 10 minutos à temperatura ambiente.


3. Centrifugar durante 10 minutos a um mínimo de 4.000 rpm.
4. Recolher com cuidado o sobrenadante.
5. Deixar o Reagente durante alguns minutos á temperatura ambiente ou em um banho de água.
6. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Água destilada 100 μL - -
Padrão de colesterol HDL - 100 μL -
Sobrenadante - - 100 μL
Reagente do Colesterol 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

7. Agitar bem e incubar nos tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente ou durante 10 minutos a 37ºC
8. Ler a absorbância (A) do Padrão e da Amostra frente ao Branco à 500 nm.
A cor é estável durante pelo menos 30 minutos.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Manter sempre a relação Amostra/Preciptante igual a 1:1.
y Após a centrifugação, remover o sobrenadante límpido dentro de 15 minutos, para evitar resultados falsamente
elevados.
y Amostras lipêmicas e ocasionalmente amostras não lipêmicas podem apresentar o sobrenadante turvo. Neste caso
diluir a amostra 1:2 com NaCI 150 mmol/l e repetir a precipitação. Multiplicar o resultado final por 2. Caso o sobrenadante
permaneça ainda turvo a amostra não pode ser utilizada para determinar o colesterol HDL.

11. CÁLCULOS

Aa= Absorbância da amostra


Ap= Absorbância do padrão
( )
[P]= Concentração do Padrão = 40 mg/dL *
( )
* 40 equivale ao valor do padrão (20 mg/dL) corrigido de acordo com o fator de diluição (1:2) usado na precipitação.
( )
Abs. Amostra X 40 * = mg/dL Colesterol HDL
Abs. Padrão

Com Fator: Fc (Fator de calibração)= 40


Ap
Concentração de HDL em mg/dL= Aa x Fc.

Exemplo: AA = 0,244 Fc = 40 = 131,1

43
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Ap= 0,305 0,305

Concentração de HDL(mg/dL)= 0,244 x 131,1= 31,99 mg/dL

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mmol/L Colesterol = mg/dL colesterol x 0,026

Valores de referência

Desejável Risco Alto risco


moderado
Colesterol LDL < 130 130 – 159 ≥160
Colesterol Total < 200 200 – 239 ≥ 240
Col. HDL – Homens > 55 35 – 55 < 35
Col. HDL - Mulheres > 65 45 – 65 < 45

Estes valores são unicamente orientativos, sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos
de referência. Pelas últimas Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose, os valores de
referência para HDL Colesterol podem ser consultados por faixa etária, como mostrado na tabela abaixo:

Faixa Etária Valor (mg/dL) Interpretação


Até 10 anos Maior que 40 Desejável
De 10 a 19 anos Maior que 35 Desejável
Menor que 40 Baixo
20 anos ou acima
Maior que 60 Alto
Diabéticos Maior que 45 Desejável

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 150 mg/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Àcido ascórbico >0,3 mmol/L, a hemoglobina >3 g/L e a bilirrubina >0,25 mmol/L interferem.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Warnick, R.G. et al. Clin Chem. 2:217,1985.


y Burstein M, Scholnick HR, Morfin R. J Lipid Res 1970; 11: 583.
y Virella, M.F.L. et al. Clin Chem. 23:882,1977.
y Grove TH. Clin Chem 1979; 25:560.
y Friedwald W.T. et al. Clin. Chem. 18:707,1977.
y Kostner, G.M., et al. Clin Chem 25(6):939,1979.
nd
y Bergmeyer, H.U. (Ed.) Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press 2 ed., p.148,1985.
y HDL Colesterol (Precipitante) – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 241.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 67-68

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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CREATININA
Método Cinético Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação da função renal.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

CREATININA SÉRICA
Trata-se de um produto metabólico formado pela descarboxilação da creatina-fosfato no músculo, tendo, portanto, uma
relação direta com a massa muscular.Homens e atletas produzem maiores quantidades de creatinina que crianças, idosos
e mulheres em geral. O decréscimo da massa muscular no idoso deve ser considerado na interpretação dos resultados. A
creatinina não é afetada normalmente pela dieta, porém, se quantidades excessivas de carnes forem consumidas, os
níveis séricos poderão sofrer aumento por um período de 48 horas. Com a redução do fluxo sanguineo renal, a creatinina
eleva-se mais lentamente que a uréia. A concentração de creatinina somente torna-se anormal quando aproximadamente
metade ou mais de néfrons tenham sido comprometidos.
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Diminuição do fluxo sanguíneo renal: Baixa estatura
insuficiência cardíaca congestiva,
choque, desidratação
Insuficiência renal por decréscimo da Desnutrição
filtração glomerular
Obstrução do trato urinário Diminuição da massa muscular
Intoxicação por metanol Doença hepática severa
Terapia com metildopa, trimetoprim, Gravidez
hidantoína, cefalosporinas e ácido
ascórbico

CREATININA URINÁRIA
É filtrada livremente pelos glomérulos somente sendo reabsorvida em certas condições clínicas, como: diabetes melittus,
insuficiência cardíaca congestiva etc. A secreção tubular da creatinina pode ser inibida por drogas como: cimetidina,
trimetoprim e probenecide.
Exercícios severos e ingestão de altas quantidades de carne podem causar aumentos significativos na excreção de
creatinina, enquanto a diminuição da massa muscular nos idosos provoca diminuição.
A determinação da creatinina urinária em mg/kg de peso é um parâmetro indicativo do volume correto da urina colhida no
período de 24 horas.
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Adenoma hipofisário Distrofia muscular
Diabetes mellitos Doença muscular
inflamatória
Doenças infecciosas Doenças com diminuição
da massa muscular
Encefalite Doença renal avançada
Hipotireoidismo Hipertireoidismo
Anemia
Leucemia
Paralisia

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A creatinina presente na amostra reage com o picrato em meio alcalino originando um complexo de cor vermelho-
amarelada. Mede-se a velocidade de formação desse complexo utilizando uma cinética de 2 pontos durante os períodos
iniciais da reação, a reação do picrato com outros cromogênios presentes na amostra é lenta, ocorrendo nos períodos finais
da reação, o que não interfere na dosagem da creatinina.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras:
Soro, plasma ou urina.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


A creatinina em soro ou plasma é estável 24 horas a 2-8ºC.
Os anticoagulantes como a heparina, EDTA, oxalato ou fluoreto, não interferem.

45
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Urina: amostra de urina de 24 horas deve ser conservada em geladeira durante o período de coleta e até o momento da
dosagem. Estável 4 dias a 2-8oC. Diluir a urina fresca 1/100 com água destilada. Multiplicar o resultado obtido por 100.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise ou intensa turvação.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CREATININA Registro M.S.: 80027310025


Códigos: BT 10.007 – 1 fr. 50mL RA + 1 fr. 50mL RB + 1 fr. Padrão – 2,0 mL
BT 10.007 – 1 fr. 250mL RA + 1 fr. 250mL RB + 1 fr. Padrão – 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Ácido pícrico 18 mmol/L.


Reagente B: Hidróxido sódico 1,8 mmol/L, Tetraborato sódico 20 mmol/L.
Padrão: Solução de Creatinina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15-30oC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes a temperatura ambiente.


Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura a 500 nm (490-510), com cubeta termostatizável.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.
46
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
y O Reativo B é caustico. Evitar contato com a pele.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reagentes:


Reagente de Trabalho: Misturar volumes iguais de Reativo A e Reativo B. Homogeneizar.
Estável por 10 dias a temperatura ambiente.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho e a amostra ou padrão a 37ºC durante alguns minutos.
2. Ajustar o espectrofotômetro em zero frente a água destilada.
3. Pipetar em uma cubeta pré-aquecida a 37ºC:

Reagente de Trabalho 1,0 mL

4. Inserir em porta-cubetas termostatizado a 37ºC.


5. Quando a temperatura no interior da cubeta alcançar 37ºC pipetar :

Padrão ou Amostra 100 µL

6. Misturar e acionar imediatamente o cronômetro.


7. Ler a absorbância à 500 nm aos 30 segundos (A1) e aos 90 segundos (A2).

Dosagem em urina:
1. Medir o volume urinário de 24 horas.
2. Centrifugar uma alíquota de 10 mL, por 10 minutos a 3000 rpm.
3. Fazer uma diluição do sobrenadante na proporção de 1:50 com água destilada ou deionizada.
4. Proceder a dosagem conforme o procedimento descrito acima, para o soro.
5. Multiplicar o resultado obtido por 50.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

Cuidados especiais
y Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas de segurança estabelecidas. Fazer
referência ao Manual ou POP de Segurança.
y As amostras muito leitosas, o procedimento corretivo com desproteinização não é eficiente e, nestes casos, não é
possível dosar a creatinina com exatidão.

47
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

11. CÁLCULOS

(A2 - A1) amostra x valor padrão = mg/dL creatinina


(A2 - A1) padrão

COM FATOR: Fc = Valor do padrão


(A2 - A1) padrão

Creatinina (mg/dl) = (A2 - A1) amostra x Fc

Exemplo:
A1 – p = 0,222 Fc = 2 = 2 = 10,7
A2 - p = 0,409 0,409-0,222 0,187
A1 - A = 0,137
A2 _ A = 0,222 Creatinina (mg/dl)=(0,222 – 0,137) x 10,7= 0,91 mg/dl

Valor do Padrão: 2 mg/dl

Cálculo na Urina
Fc = Valor Padrão .
(A2 – A1) Padrão

Creatinina em mg/dl = (A2 – A1) amostra x Fc

Creatinina Urina (mg/24 horas) = Creatinina mg/dL x Volume urinário 24hs (mL)
100
Creatinina em mg/kg peso/24 horas:

Urina mg/kg peso /24 horas = Creatinina urina mg/ 24 horas


Peso (kg)

Depuração Da Creatinina Endógena (Clearence):

Depuração (mL/minuto) = U x VM
S
Onde:
U = creatinina na urina (mg/dL)
S = creatinina no soro (mg/dL)
VM = volume minuto (Vol. Urinário de 24 h, em mL, dividido por 1440 minutos)
Atenção: A depuração deverá ser corrigida para a superfície corporal do paciente.

Cálculo da Superfície Corporal sem utilização do Nomograma:

SC = P0,425 x A0,725 x 0,007184

Onde:
2
SC = superfície corporal em m
P = peso em Kg
A = altura em cm

Determinação do Clearence:
2
Clearence (mL/min/1,73 m ) = Depuração(mL/min) x 1,73
Superfície corporal
Exemplo:
Creatinina na urina (mg/dl) = 120
Creatinina no soro (mg/dl) = 0,91
Volume de 24 horas = 1800 mL
Volume/minuto = 1800/1440 = 1,25
Peso = 70 kg
Altura = 170 cm
Superfície corporal = 1,81 m2
Depuração (mL/min) = 120 x 1,25 = 164,83 mL/min.
0,91
Depuração (mL/min/1,73 m2) = 164,83 x 1,73 = 157,5 mL/min
1,81

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL

48
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL creatinina x 88,4 = μmol/L creatinina

Valores de referência
Soro ou Plasma
• Homens: 0,6 - 1,2 mg/dL = 53 - 97 μmol/L
• Mulheres: 0,5 - 1,0 mg/dL = 44-80 μmol/L

Urina (mg/24 horas)


• Adultos: Homem: 1000 a 2000 mg/24 horas
Mulher: 800 a 1800 mg/24 horas.

Creatinina na Urina (mg/kg/24 horas)


• Crianças 2 - 3 anos: 6 a 22 mg/Kg/24 horas.
• Crianças maiores de 3 anos: 12 a 30 mg/Kg peso/24 horas.
• Adultos: Mulheres: 16 a 22 mg/Kg peso/24 horas
Homens: 21 a 26 mg/Kg peso/24 horas
Clearence
2
• Criança: 70 a 140 mL/minuto/1,73 m
Adultos: Homem: 98 a 160 mL/minuto/1,73 m2
2
Mulher: 95 a 150 mL/minuto/1,73 m

Obs: mg/Kg = mg/24 horas dividido pelo peso corporal do paciente.


Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 12 mg/dL = 1768 μmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
A hemoglobina (0,1 g/L), a bilirrubina (10 mg/dL), a proteína e compostos cetônicos não interferem. A determinação pode
ser afetada por concentrações elevadas de substâncias redutoras.
Falsos Valores elevados: A creatinina urinária aumenta com dietas hiperprotéicas, cefalosporinas, ácido ascórbico e
levodopa.
Falsos Valores baixos: Urinas muito acidificadas podem apresentar forte interferência negativa.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Bartels H, Bohmer M. Clin Chem Acta 1971; 32: 81.


• Fabiny DL, Ertinghausen G. Clin Chem 1971; 17: 696
y Creatinina – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 143.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 70-71

49
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CREATINO QUINASE (CK-NAC)


Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada nos casos de infarto do miocárdio e miopatias (distrofia muscular progressiva, dermatomiosites,
trauma muscular etc).

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A Creatino Quinase (CK) também denominada ATP-Creatino-N-fosfotransferase, existe sob a forma de um dímero, e é uma
importante enzima reguladora da produção e utilização de fosfatos de alta energia nos tecidos contráteis. A CK total é
encontrada em concentrações muito altas na musculatura esquelética e cardíaca. Quantidades apreciáveis são
encontradas no cérebro, estando presente também no intestino e nos pulmões. A CK não é encontrada no fígado.
A CK total possui alta sensibilidade clínica para o diagnóstico do IAM (>90%), porém os resultados não são específicos
para lesão miocárdica. Várias condições não relacionadas ao miocárdio provocam elevação da CK total.
A CK é um dímero, isto é, compõe-se de duas cadeias diferentes, chamadas M (muscle) e B (brain). Estas duas cadeias
podem combinar-se de três formas, formando as chamadas isoenzimas da CK: CK-MM, CK-MB, e CK-BB. A CK-MM é
encontrada em grande quantidade principalmente na musculatura estriada. A CK-BB é a isoenzima encontrada no
cérebro, sendo predominante também no cólon, íleo, estômago e bexiga. A CK-MB está presente no miocárdio, onde
representa cerca de 20% da CK contra 80% de CK-MM. A CK-MB é encontrada também no músculo estriado esquelético
em pequena proporção (entre 1% e 4%, sendo o restante CK-MM).

Níveis Aumentados Níveis Diminuídos


Infarto do miocárdio Diminuição da massa muscular
Lesões da musculatura cardíaca Doenças do tecido conjuntivo
ou esquelética
Miopatias congênitas e Doença alcoólica do fígado
adquiridas
Acidente vascular cerebral Terapia com esteróides
Fisioterapia
Injeções intramusculares
Hipotireoidismo
Doenças infecciosas
Embolia pulmonar
Hipertermia maligna
Convulsões generalizadas
Neoplasias de próstata, vesícula
e trato gastrintestinal

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A creatino quinase (CK) catalisa a fosforização do ADP pelo fosfato de creatino, obtendo-se creatino e ATP. A
concentração catalítica é determinada, empregando-se as reações acopladas da hexoquinase e glicose-6-fosfato
desidrogenase, a partir da velocidade de formação do NADPH, medido à 340 nm.
CK
Fosfato de creatino + ADP ------------> Creatino + ATP
HK
ATP + Glicose ------------> ADP + Glicose-6-fosfato
G6P-DH
Glicose-6-fosfato + NADP+------------->Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Evitar exercícios físicos antes da colheita do material.

Amostras
Usar soro ou plasma colhido em EDTA. Não utilizar amostras hemolizadas.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro. A atividade enzimática é estável por 24 horas entre 15 – 25 ºC e 7 dias entre 2 – 8 ºC.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise.

50
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CREATINO QUINASE (CK-NAC) Registro M.S.: 80027310034


Códigos: BT 11002 - 1 fr. com 20 mL + 1 fr. com 5 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Imidazol 100 mmol/L, pH 6,7, EDTA 2 mmol/L, acetato de magnésio 10 mmol/L, D-glicose 20 mmol/L.
Reagente B: Fosfato de creatina 30 mmol/L, N-acetil-cisteína 20 mmol, ADP 2 mmol, AMP 5 mmol, di (adenosina-5)
pentafosfato 10 μmol/L, NADP 2 mmol/L, hexoquinase > 3000 U/L, glicose – 6 - fosfato desidrogenase > 2500 U/L, EDTA 2
mmol/L.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8oC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
o
Conservar o KIT a 2-8 C.
Evitar exposição à luz intensa.
Os reativos são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, sempre que conservados bem fechados e se evitada a
contaminação durante o uso.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro com cubeta termostatizada para leituras a 340 nm.
y Pipetas automáticas e ponteiras
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.

51
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reagentes


Reativo de Trabalho: Misturar na proporção de 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
o
Estável 20 dias a 2-8 C.
Após a preparação do Reativo de Trabalho, mantê-lo protegido da luz.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reativo de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
2. Pipetar:

Amostra 20 μL
Reativo de trabalho 1,0 mL

3. Misturar e transferir de imediato a uma cubeta. Inserir nas porta-cubetas termostatizado. Acionar o cronômetro.
4. Aos 3 minutos, anotar a absorbância inicial (A0) e efetuar novas leituras após 1, 2 e 3.minutos (A1, A2 e A3,
respectivamente)
5. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais. Calcular o incremento médio de
absorbância por minuto (ΔA/min).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

Cuidados especiais
Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas estabelecidas de segurança.

11. CÁLCULOS

Usando as leituras das absorbâncias encontradas, calcular a média da variação de absorbância por minuto (ΔA/min).
Calcular a média das absorbâncias por minuto:

ΔA/min = (A1 – A0) + (A2 – A1) + (A 3– A2)


3

Multiplicar o valor abaixo pelo valor do ΔA/min:

340 nm - 8095 `a 37°C

52
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): μkat/L = U/L x 0,0167

Valores de referência
37ºC
Mulheres < 170 U/L
Homens < 195 U/L
Estes valores são unicamente orientativos; é recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até ΔA/min = 0,250 à 340nm (2023 U/L). Para valores superiores repetir a reação com amostra diluída
em solução fisiológica, multiplicando o resultado final pelo fator de diluição.
Temperatura de incubação: A determinação também pode efetuar-se a 30º C (método IFCC).
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Concentrações de hemoglobina acima de 200 mg/dL interferem no teste. A hemólise interfere.
Falsos Valores elevados: Injeções intramusculares, traumas, cirurgias, intoxicação por barbitúricos, anfotericína B,
ampicilina, carbenicilina, clofibrato, clorpromazine.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y International federation of Clinical Chemistry Clinica Chimica Acta. 105:147F (1980)


y Deutschen gesellschaft fur Klinische Chemie Z. Klin. Chem. 10:281 (1972).
y Scandinavian Society for Clinical Chemistry: Scand. J. Cin. Lab Invest. 33:291 (1974).
y CK-NAC – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 142.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 71.

53
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

CREATINO QUINASE – MB (CK-MB)


Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação da extensão da lesão causada nos casos de infarto do miocárdio e
em paciente com doenças ou traumas na musculatura esquelética.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A CK é um dímero composto por duas subunidades: B (cérebro) e M (músculo) no qual encontra-se 3 isoenzimas distintas:
CK-BB, CK-MB e CK-MM.
A CK-MB encontra-se basicamente no músculo estriado e miocárdio. Assim qualquer dano ou lesão nestes tecidos provoca
uma elevação dos níveis de CK-MB em soro, o que se utiliza quase que unicamente para diagnóstico do infarto do
miocárdio. No infarto agudo do miocárdio é importante a proporção do CK-MB em, relação ao CK total, não havendo
quantidade de CK-MB absoluta.
A isoenzima CK-MB têm sido considerada o marcador bioquímico de referência para o diagnóstico de lesão miocárdica e,
por isso, têm sido a base para comparação com outros marcadores. Apesar da CK-MB ser, em termos de diagnóstico,
específica para lesão do miocárdio, o músculo esquelético possui maior atividade de CK total por grama de tecido, e pode
ter até 4% de CK-MB. Isto pode diminuir a especificidade especialmente em paciente com lesões concomitantes na
musculatura esquelética e cardíaca.
A elevação e a queda características da CK-MB, em uma dosagem seriada são quase patognomônicas para o diagnóstico
de infarto do miocárdio. A elevação inicial dos níveis de CK-MB ocorre entre 4 e 6 horas após o início dos sintomas
atingindo o seu pico após 24 horas e retornando ao normal entre 48 e 72 horas. Para um diagnóstico com alta sensibilidade
e especificidade, recomenda-se a dosagem seriada ao longo de um período de 8 a 12 horas.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O método baseia-se na determinação da atividade da CK na presença de um anticorpo contra o monômero M. Este


anticorpo inibe totalmente a isoenzima CK-MM e a metade da atividade da forma CK-MB, sem afetar o monômero B das
isoenzimas CK-MB e CK-BB. Como normalmente a isoenzima CK-BB não encontra-se no sangue, a determinação da
quantidade do monômero B é praticamente específica para a forma CK-MB.
A concentração catalítica de CK-B, correspondente à metade da atividade CK-MB é determinada, empregando-se as
reações acopladas da hexoquinase (HK) e Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH), a partir da velocidade de formação
do NADPH, medido à 340 nm.
CK-B
Creatina Fosfato + ADP ------------> Creatino + ATP
HK
ATP + Glicose ------------> ADP + Glicose-6-fosfato
G6P-DH
+ +
Glicose-6-fosfato + NADP ------------->Gluconato-6-fosfato + NADPH + H

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Evitar exercícios físicos antes da coleta do material.

Amostras:
Usar soro ou plasma colhido em EDTA ou heparina. Não utilizar amostras hemolizadas

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro ou plasma
Diluir as amostras que possuam uma atividade de CK total superior ou igual a 1000 U/L com solução salina (NaCl 0,9%).
Multiplicar o resultado pelo fator de diluição.
A CK-MB em soro é estável pelo menos por 7 dias a 2-8º C.
Evitar exposição à luz solar intensa. A atividade enzimática é estável por 8 horas entre 15 – 25°C.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

CREATINO QUINASE – MB (CK-MB) Registro M.S.: 80027310036


Códigos: BT 11003 – 1 fr. com 20 mL + 1 fr. com 5 mL

54
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Tampão Imidazol 100 mmol/L, pH 6,7, Acetato de Magnésio 10 mmol/L, D-glicose 20 mmol/L,
Reagente B: Creatino-fosfato 30 mmol/L, ADP 2 mmol, AMP 5 mmol, di (adenosina-5) pentafosfato 10 μmol/L, NADP 2
mmol/L, hexoquinase 2500 U/L, glicose – 6 - fosfato desidrogenase 2000 U/L, Anticorpo anti-CK-MM policlonal >2000U/L..
Controle: Soro controle de CK-MB. Verifique valores na etiqueta do frasco. NÃO UTILIZAR COMO CALIBRADOR.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 - 8ºC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Conservar o KIT a 2-8oC.


Evitar exposição à luz intensa.
Os reativos são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, sempre que conservados bem fechados e se evitada a
contaminação durante o uso.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro com cubeta termostatizada para leituras a 340 nm.
y Pipetas automáticas e ponteiras
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
55
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.


y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reagentes


Reativo de Trabalho: Misturar na proporção de 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
o
Estável por 10 dias a 2-8 C.
Após a preparação do Reativo de Trabalho, mantê-lo protegido da luz.

Procedimento manual
6. Pré-aquecer o Reativo de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
7. Pipetar:

Amostra 20 μL
Reativo de trabalho 1,0 mL

8. Misturar e transferir de imediato a uma cubeta. Inserir nas porta-cubetas termostatizadas. Acionar o cronômetro.
9. Aos 5 minutos, anotar a absorbância inicial (A10) e aos 10 minutos anotar novamente(A15).
10. Calcular a diferença das absorbâncias A10 - A5 (ΔA).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

Determine a diferença de absorbância: A10– A5= ΔAbs.

CK-MB (U/L) = ΔAbs. x 1350

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L x 16,67 = nkat/L

Valores de referência:
Temperatura 37ºC
U/L <25
A atividade de CK-MB representa de 6 a 20% da atividade de CK total.
Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até 1000 U/L.
Diluir as amostras que possuam uma atividade de CK Total superior a 1000 U/L, com uma solução de cloreto de sódio 9
g/L 1:1. Neste caso multiplicar o resultado obtido por 2. A diluição é realizada para que a atividade de CK total fique menor
que 1000 U/L. O reativo, uma vez preparado, possui um anticorpo anti CK-M humano, em quantidade suficiente para inibir
até 1500 U/L de CK-MM.

56
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Hemoglobina acima de 200 mg/dL interfere nos resultados.
A hemólise interfere.
Concentrações de CK-MM superiores a 1500 U/L não são inibidas pelo anticorpo e interferirá na determinação.
Falsos Valores positivos: Pode ocorrer em algumas doenças neurológicas.
Falsos Valores baixos: Podem ser obtidos se o exame for realizado muito precocemente, antes de 2 horas ou após 48
horas do IM.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y S.Stein Med. Weit 36: 572(1985).


y Wu, A.H.B., Bowers, C.N.: Clin. Chem. 28,2017 (1982) S. STEIN, W.: Med. Weit 36,572 (1985).
y International Federation of Clinical Chemistry Clinica Chimica Acta. 105:147F (1980)
nd
y Tietz, N.W. Fundamentais of Clinical Chemis”,2 Ed.; W.B. Saunders, Philadelphia, PA (1976).
y CK-MB – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 116.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 72.

57
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

FERRO Ferrozine
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de anemias, anemias hemolíticas, neoplasias da medula óssea e
hepatopatias.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

O ferro é um íon importante para a formação da hemoglobina, mioglobina e outras substâncias como os citocromos, a
citocromo oxidase, a peroxidase e a catalase. Portanto, é essencial se conhecer os meios pelos quais o ferro é utilizado no
corpo.
A quantidade total de ferro no corpo é em média de cerca de 4 g, dos quais cerca de 65% estão presentes na forma de
hemoglobina. Cerca de 4% estão presentes sob forma de mioglobina, 0,1% sob forma dos diversos compostos hêmicos
que promovem a oxidação celular, 0.1% combinado à proteína transferrina no plasma sangüíneo e 15 a 30% armazenados,
principalmente no fígado sob forma de ferritina.
Haverá um aumento de ferro sérico no tratamento de anemias com ferro, neoplasia da medula óssea, drogas
mielossupressoras, anemia hemolítica e perniciosa, hepatopatias virais e crônicas.
Esse aumento ocorre pelo fato da liberação do ferro da sua forma de armazenamento no fígado (nas lesões
hepatocelulares), diminuição da sua utilização na formação da hemoglobina principalmente nas neoplasias da medula
óssea e na hemólise aumentada nas doenças hemolíticas, onde teremos uma elevação na destruição da hemoglobina
liberada e conseqüentemente liberação de ferro.
A diminuição sérica ocorrerá na gravidez, crianças alimentadas unicamente com leite, nos casos de grandes hemorragias e
menstruação abundante.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O íon férrico presente na amostra e unido a transferrina é liberado por ação do guanidinio e reduzido a ferroso pela
hidroxilamina. O íon ferroso forma um complexo colorido com a ferrozina que se pode quantificar através de leitura
espectrofotométrica.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostra sempre no mesmo
horário, devido a variações diurnas do ferro sérico.

Amostras:
Usar soro.

Armazenamento e estabilidade da amostra


O analito é estável 4 dias entre 2 – 8º C.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise e lipemia excessiva.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

FERRO (Ferrozine) Registro M.S.: 80027310026


Códigos: BT 12005 – 1 fr; com 50 mL + 1 fr com 1,25 mL + 1 fr de padrão com 2 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reativo A: Tampão acetato 100 mmol – pH 4,9, cloridrato de guanidina 4,5 mmol/L, hidroxilamina 0,1 mmol/L.
Reativo B: Ferrozine 40 mmol/L.
Padrão de Ferro: Solução de Ferro (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O CONTATO
COM OS OLHOS E A PELE.
y Reagente pronto para uso.
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8 ºC.
58
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 560 nm (546-570), com cubetas
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras
y Cronômetro
y Tubos de ensaio de acrílico ou plástico, descartáveis.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

59
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativos prontos pra uso

Procedimento manual
Dois tubo/amostra
1. Pipetar:

Branco Branco Branco


Padrão Amostra
Reativo Padrão Amostra
Água destilada ---- 250μL ---- ---- ----
Amostra ---- ---- ---- 250μL 250μL
Padrão de Ferro ---- ---- 250μL ---- ----
Reativo A - Tampão 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Reativo B - Ferrozine ---- ---- 25μL ---- 25μL

2. Homogeneizar suavemente. Incubar 10 minutos à Temperatura ambiente.


3. Ler as absorbâncias:P1 do branco do padrão, P2 do padrão, A1 do branco da amostra, A2 da amostra, zerando o
parelho com o branco do reativo. Ler as absorbâncias a 560 nm.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Limpeza do material: todo material a ser utilizado na técnica deve estar livre de íons ferro. Deve-se deixar o
mesmo submerso em uma solução de Ácido Nítrico ou Clorídrico 10-15%, por 6 horas e, após, eliminar a
acidez com numerosas lavagens com água deionizada (livre de ferro), condutividade menor que 0,01
μSiemens.
y Secar o material a no máximo 80ºC em estantes de aço inox ou revestidos de plástico.
y Todo material utilizado nos procedimentos deve ser de plástico ou acrílico.
y ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O
CONTATO COM OS OLHOS E A PELE.

11. CÁLCULOS

Ferro(μg/dL)= A2 – A1 x [P] onde,


P2 - P1

A2 = Absorbância da amostra
A1 = absorbância do Branco da amostra
P2 = absorbância do padrão
P1 = absorbância do Branco do Padrão
[P] = valor do padrão

Com Fator : Fator Calibração = [P] .


(P2 – P1)

Exemplo:
A2 = 0,156 Ferro(μg/dL)= 0,156-0,042 x 100
A1 = 0,042 0,108-0,006
P2 = 0,108P1 = 0,006
[P] = 100 mg/dL Ferro (μg/dL) = 0,114 x 100
0,102

Ferro (μg/dL) = 111,8 mg/dl

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada : µg/dL


UNIDADES Sistema Internacional (SI) : µg/dL ferro x 0,179 = µmol/L ferro

Valores de Referência:
Para amostras de Soro e Plasma:
y Homens: 70-155 µg/dL = 12,5 - 27,7 µmol/L

60
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Mulheres: 55-140 µg/dL = 9,84 - 25,1 µmol/L


Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 500 µg/dL = 89.5 µmol/L
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Não devem ser usados soros lipêmicos, ictéricos ou hemolisados.
Falsos Valores elevados:
Falsos Valores baixos:

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Stookey LL. Anal Chem 1970; 42:779-81.


y Itano M. Am J Clin Pathol 1978; 70:516-22.
y Artiss JD, Vinogradov S, Zak B. Clin Biochem 1981; 14:311-15
y Ferro Ferrozine – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 200.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 74

FERRO CRX
Método Cromazurol B
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada principalmente na avaliação de anemias, anemias hemolíticas, neoplasias da medula óssea e
hepatopatias.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

61
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

O ferro é um íon importante para a formação da hemoglobina, mioglobina e outras substâncias como os citocromos, a
citocromo oxidase, a peroxidase e a catalase, por isso é essencial conhecer os meios pelos quais o ferro é utilizado no
corpo.
A quantidade total de ferro no corpo é em média de cerca de 4g, dos quais cerca de 65% estão presentes na forma de
hemoglobina. Cerca de 4% estão presentes sob forma de mioglobina, 1% sob forma dos diversos compostos hêmicos que
promovem a oxidação celular, 0.1% combinado à proteína transferrina no plasma sangüíneo e 15 à 30% armazenados,
principalmente no fígado sob forma de ferritina.
Haverá um aumento de ferro sérico no tratamento de anemias com ferro, neoplasia da medula óssea, drogas
mielossupressoras, anemia hemolítica e perniciosa, hepatopatias virais e crônicas.
Esse aumento ocorre pelo fato da liberação do ferro da sua forma de armazenamento no fígado (nas lesões
hepatocelulares), diminuição da sua utilização na formação da hemoglobina principalmente nas neoplasias da medula
óssea e na hemólise aumentada nas doenças hemolíticas, onde teremos uma elevação na destruição da hemoglobina
liberada e conseqüentemente liberação de ferro.
A diminuição sérica ocorrerá na gravidez, crianças alimentadas unicamente com leite, nos casos de grandes hemorragias e
menstruação abundante.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O ferro sérico reage com o cromazurol B do CTMA-Br para formar um complexo colorido azul. A intensidade de cor do
complexo é proporcional a concentração de ferro presente na amostra.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas. Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostra sempre no mesmo
horário, devido a variações diurnas do ferro sérico.

Amostras:
Usar soro. Não utilizar amostra hemolisada.

Armazenamento e estabilidade da amostra


O analito é estável 4 dias entre 2 – 8º C.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise e lipemia excessiva.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

FERRO CRX Registro M.S.: 80027310053


Códigos: BT 12004 – 2 fr. com 50 mL + 01 fr. de padrão 2 mL.

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Cromazurol B 0.13 mM, brometo de CTMA 0.82 mM, tampão acetato pH 4.75.
Padrão de Ferro: Solução de Ferro (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O CONTATO
COM OS OLHOS E A PELE.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar em temperatura ambiente.
6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes em temperatura ambiente.


O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 630 nm (620-640), com cubetas.
62
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Pipetas automáticas e ponteiras.


y Cronômetro
y Tubos de ensaio de acrílico ou plástico, descartáveis.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Reativo Padrão Amostra


Amostra ---- ---- 40μL

63
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Padrão de Ferro ---- 40μL ----


Reativo 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bem e deixar reagir durante 5 minutos a temperatura ambiente.


3. Ler a absorbância (Ap) do Padrão e (Aa) da amostra contra o Branco de Reagente a 630 nm (620-640). A cor é estável
por 2 horas ao abrigo da luz.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Limpeza do material: todo material a ser utilizado na técnica deve estar livre de íons ferro. Deve-se deixar o
mesmo submerso em uma solução de Ácido Nítrico ou Clorídrico 10-15%, por 6 horas e, após, eliminar a
acidez com numerosas lavagens com água deionizada (livre de ferro), condutividade menor que 0,01
μSiemens.
y Secar o material a no máximo 80ºC em estantes de aço inox ou revestidos de plástico.
y Todo material utilizado nos procedimentos deve ser de plástico ou acrílico.
y ATENÇÃO: OS REAGENTES SÃO NOCIVOS E IRRITANTES. NÃO PIPETAR COM A BOCA E EVITAR O
CONTATO COM OS OLHOS E A PELE.

11. CÁLCULOS

Aa Æ Absorbância da Amostra
Ap Æ Absorbância do Padrão
[P] Æ Concentração do Padrão

Ferro (μg/dL) = Aa X [P]


Ap

COM FATOR: Fator = [P]


Ap

Ferro (μg/dL) = Aa x fator

Exemplo:
Aa=0,120 F= 100 = 854,7
Ap=0,117 0,117
[P]=100 μg/dL Ferro (μg/dL) = 0,12 X 854,7 = 102,6 μg/dL

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada : μg/dL


UNIDADES Sistema Internacional : μg/dL ferro x 0,179 = μmol/L ferro

Valores de Referência
Homens: 59 - 158 µg/dL = 10,6 - 28,3 μmol/L
Mulheres: 37 - 145 µg/dL = 6,62 – 25,9 μmol/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 500 μg/dL = 89.5 μmol/L
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Não devem ser utilizados soros hemolisados.
Recomenda-se utilizar um branco da amostra com água destilada se a amostra for fortemente ictérica (Bilirrubina Total >
3 mg/dL). Soros lipêmicos ou hemolisados não são apropriados para esta Técnica.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Garcic A Clin Chim Acta 1979; 94 : 115-119.


y Paris M.Ann Biol Clin 1986; 44 : 511-516.
y Guyton, Fisiologia humana e Mecanismos das doenças 1993, 5 ª edição.
64
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Ferro CRX – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 200.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 74

FOSFATASE ALCALINA
Método Cinético Colorimétrico
(DGKC – DEA)
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de afecções ósseas e hepatobiliares.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

65
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

A fosfatase alcalina é uma enzima com atividade ótima in vitro em pH próximo de 10, presente em muitos tecidos,
particularmente no epitélio intestinal, túbulo renal, osteoblastos, fígado e placenta. A forma presente no soro de adultos
normais origina-se principalmente do fígado e esqueleto e são acentuadamente dependentes da idade., Sua função precisa
no metabolismo ainda não está de todo compreendida e parece estar associada ao transporte lipídico no intestino e
processos de calcificação óssea.
Sua dosagem é de interesse na investigação de doenças hepatobiliares e ósseas associadas com hiperatividade
osteoblástica. Os níveis mais altos de fosfatase alcalina são encontrados na doença de Paget. Mulheres no terceiro
trimestre de gravidez podem apresentar aumentos em torno de duas a três vezes do intervalo normal, devido a adicional
fração placentária. Em osteomalácia, podem ser encontrados aumentados moderados, que diminuem lentamente em
resposta à terapia por vitamina D. Visto elevar-se em metástases do fígado e ósseas, esta enzima pode funcionar como
marcador tumoral.
A resposta de suas frações, quando expostas a altas temperaturas, pode ser mais um auxílio na identificação de suas
isoenzimas.

Níveis Aumentados Níveis Diminuídos


Doenças hepáticas e do trato biliar Hipotireoidismo
Metástases para fígado e osso Uso de estrogênio, simples ou
combinado com androgênio
Acromegalia
Doença de Paget
Hipertireoidismo
Raquitismo
Mononucleose infecciosa
Hiperparatireoidismo
Crescimento ósseo fisiológico

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A determinação de fosfatase alcalina é feita através de método cinético com emprego do 4-nitrofenilfosfato de sódio. Neste
método, baseado na DGKC, o 4-nitrofenilfosfato de sódio é hidrolisado especificamente pela fosfatase alcalina do soro em
pH9,8, liberando o 4-nitrofenol, cuja velocidade de formação, medida a 405 nm, é proporcional à atividade da enzima
presente.
FAL
4-Nitrofenilfosfato + H2O ---------------> 4-Nitrofenol + fosfato

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro e plasma.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


A fosfatase alcalina em soro ou plasma é estável até 7 dias a 2-8ºC
A heparina não interfere como anticoagulante.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

FOSFATASE ALCALINA Registro M.S.: 80027310018


Códigos: BT 11005 – 1 fr. com 40 mL + 1 fr. com 10 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Dietanolamina pH 9,08 1,0 mmol/L, cloreto de magnésio 0,5 mmol/L.


Reagente B:: 4-nitrofenilfosfato 10 mmol/L.

y Reagente pronto para uso.

66
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.


y Conservar entre 2-8ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 405 nm, com cubetas termostatizadas.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Centrífuga.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.

67
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos


Reativo de Trabalho: Misturar 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
Agitar suavemente.
Estável 30 dias a 2-8°C.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho a temperatura desejada durante uns minutos.
2. Pipetar em uma cubeta:

Reagente de Trabalho 1,0 mL

Amostra 20μL

3. Misturar e inserir no porta-cubetas termostatizado a 37ºC.


4. Aos 60 segundos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras cada minuto durante 3 minutos. (A1, A2 e A3
respectivamente).
5. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.

11. CÁLCULOS

Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (ΔA/min):

ΔA/min = (A1 – A0) + (A2 – A1) + (A3-A2)


3
A atividade da fosfatase alcalina na amostra é calculada pela multiplicação do ΔA/min pelo seguinte fator:

ΔA/min x 2757 = U/L

Exemplo:
A0 = 1,179
A1 = 1,225
A2 = 1,266
A3 = 1,312
ΔA/min = (1,225 – 1,179) + (1,266-1,225)+ (1,312-1,266)
3
ΔA/min = 0,044

Fosfatase alcalina (U/L) = 0,044 x 2757 = 121,3 U/L

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L x 0,01667 = µkat/L

Valores de Referência
37ºC
Adultos 100 - 290 U/L
Crianças 180 - 1200 U/L

68
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até ΔA/min: 0,250 = 700U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
• Ácido ascórbico (vitamina C) maior que 400 mg/L
• Glicose maior que 500 mg/dL
• Triglicérides maior que 1200 mg/dL
• Os anticoagulantes fluoreto, oxalato, citrato e EDTA interferem.
• A hemólise interfere devido a fosfatase alcalina eritrocitária.
• A presença de Mg2+ e Zn2+, produz um aumento nos resultados.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Z. Klin. Chem Klin. Biochem. 8 (1970) 658; 10 (1972) 182.


y Kubler W; Symp. D. Deutsch Ges fur Lab. Med. 8 (21973).
y J. Clin Chem Clin Biochem 1983; 21: 731 – 748
y Fosfatase Alcalina – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 205.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 76

FÓSFORO - UV
Método Molibdato
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação da insuficiência renal, função da paratireóide, fraturas ósseas e em lesões
musculares extensas.

69
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

O fósforo é um importante elemento, amplamente distribuído pelo organismo na forma de fosfato orgânico ou inorgânico.
Em torno de 85% dos 600g deste elemento (medido como fósforo inorgânico) em adultos está presente no esqueleto. O
restante é principalmente combinado com lipídios, proteínas, carboidratos e incorporados a outras substâncias orgânicas
como fosfolipídios, ácidos nucléicos, fosfoproteinas e compostos de alta energia envolvidos na integridade celular
(estocagem e troca de energia).
Três órgãos são majoritariamente comprometidos com a homeostasia do fósforo: intestino delgado (absorção), rins
(filtração e reabsorção) e esqueleto (estocagem).
Em torno de 2/3 do fosfato ingerido é absorvido (absorção ativa) principalmente no jejuno e o restante é excretado pelas
fezes. A absorção é aumentada no decréscimo da ingestão de cálcio, na acidez do conteúdo intestinal e também pela
ação da vitamina D e hormônio de crescimento (GH). A ação do hormônio da paratireóide (PTH) na sua absorção é
provavelmente um efeito indireto do metabolismo da vitamina D. Cerca de 90% do fósforo plasmático é filtrado pelos
glomérulos e quase totalmente reabsorvido pelos túbulos. Os níveis séricos de fósforo são inversamente proporcionais
aos do cálcio sérico. O aumento do fósforo sérico ocorre por diminuição da filtração glomerular, aumento da reabsorção
tubular renal e aporte exógeno ou endógeno. A diminuição ocorre por desordens tubulares e aumento das perdas. O PTH
inibe a sua reabsorção tubular renal.
É recomendada a coleta pela manhã devido a relatos de variações diurnas.

Níveis Aumentados Níveis diminuídos


Insuficiência renal Defeitos tubulares de reabsorção
(síndrome de Fanconi)
Hipoparatireoidismo Hiperparatireoidismo primário
Pseudo-hipoparatireoidismo Hiperparatireoidismo secundário
Hipervitaminose D Hipotireoidismo
Osteoporose Esteatorréias
Acromegalia Osteomalácia
Mieloma múltiplo Hipovitaminose D
Leucemia mielóide crônica Raquitismo
Metástase óssea Hemodiálise
Hipocalcemia Doença hepática
Diabetes mellitus descompensada Alimentação parenteral prolongada
Desidratação e hipovolemia Antiácidos
Exercícios Diuréticos
Alcolismo
Tratamento da cetoacidose diabética

Fósforo Urinário
Fosfato urinário varia com idade, massa muscular, função renal, hormônio da paratireóide, hora do dia e dieta.
Este parâmetro é mais informativo quando efetuado em urina de 24 horas, devido a sua variação diária.

Níveis Aumentados Níveis Diminuidos


Hiperpareatireoidismo primário Hipoparatireoidismo
Hipervitaminose D Pseudo-hipoparatireoidismo
Acidose tubular renal Osteomalácia
Uso de diurético
Doença de Paget
Defeitos tubulares de
reabsorção
(síndrome de Fancini)

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O fósforo inorgânico presente na amostra reage com o molibdato de amônio, em meio ácido, originando o complexo
fosfomolibdato, que quantifica-se por espectrofotometria à 340 nm. A absorbância é proporcional a quantidade de fósforo
inorgânico presente na amostra.

7H3PO4 + 12(Mo7O24)-6 → 7H3PO4(MoO3)12 + 36 O-2

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

70
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Amostras
Soro, plasma ou urina.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro ou plasma: utilizar soro não hemolisado, plasma (heparina ou EDTA). Na utilizar fluoreto de sódio como
anticoagulante, pode-se obter valores falsamente baixos. A amostra pode ser conservada por 7 dias à 4oC.
Urina: Coletar a urina de 24 horas e acidificar com 15 mL de HCl 37% (concentrado). A amostra de urina não acidificada e
que esteve refrigerada, deve ser acidificada e/ou aquecida até 56 ºC durante 15 minutos até completa redissolução do
precipitado. A amostra de urina deve ser diluída 1:20 com água deionizada ou destilada antes da análise. Multiplicar o
resultado obtido por 20.
Importante: a amostra de urina acidificada não deve ser utilizada para dosagem de creatinina.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

FÓSFORO – UV Registro M.S.: 80027310033


Códigos: BT 12006 – 1 fr. com 50 mL + 1 fr. Padrão – 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Solução de Molibdato de Amônio 0,5 mmoL, Ácido sulfúrico 220 mmol/L; Triton X 0,1%.
Padrão: Solução de fósforo inorgânico (Vide valor da concentração do padrão na etiqueta do frasco)
O reagente de fósforo é cáustico e pode produzir queimaduras. No caso de contato com os olhos, deve-se lavar
imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Deve-se utilizar os equipamentos de
proteção adequados para manipular reagentes cáusticos.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 – 8oC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 340 nm (335-366), com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

71
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada.. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparo do reagente:
Reagente pronto para uso.

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão de fósforo - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reagente 1000 µL 1000 µL 1000 µL

o
2. Homogeneizar, incubar à 37 C por 5 minutos.
3. Ler a absorbância do Padrão e da Amostra, zerando o aparelho com o Branco à 340 nm.
A cor é estável por 1 hora.
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com íons de fósforo.

11. CÁLCULOS

Abs. Teste x Valor padrão mg/dL = mg/dL Fósforo


Abs. Padrão

72
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Onde: Abs. Teste → Absorbância do teste


Abs. Padrão → Absorbância do Padrão
Valor padrão mg/dL → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco)

Devido a ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Fósforo (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL fósforo x 0,323 = mmol/L fósforo

Valores de referência
• Soro, plasma: Adultos: 3,0 – 4,5 mg/dL
Crianças: 4,0 – 6,5 mg/dL

• Urina : 300 - 1000 mg/24 horas


Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
Reação linear até 15 mg/dL = 4,84 mmol/L .
Para amostra hiperlipêmicas ou com conteúdo elevado de Bilirrubina é preferível fazer um branco da amostra adicionando
100 μL de amostra + 3 mL de água destilada. Obtendo-se o valor da absorbância da amostra (Aamostra).
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Valores do branco elevados indicam contaminação, se os valores forem superiores a 0,600 A, desprezar o reativo.
Plasmas citratados, oxalados, fluoretados ou com EDTA produzem resultados falsamente diminuídos.
Anticoncepcionais, acetazolamida, salbutamol, alendronato, azatioprina, isoniazida, lítio e prometazina podem interferir nos
resultados.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Yee, H.Y. – Clin. Chem. 14, 898 (1968).


y Fósforo UV – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 208-209.
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 77-78

FRUTOSAMINA
Método Cinético Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

73
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Esta dosagem é utilizada na avaliação da basicamente das glicoproteínas do soro.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A glicose presente no plasma humano reage com diversas proteínas formando glicoproteínas estáveis sendo a principal
delas a albumina. Esta reação se dá através da ligação covalente da glicose com resíduos de lisina das proteínas
sanguíneas dando origem a bases de Schiff, as quais, num segundo momento, se transformam irreversivelmente em
cetoaminas estáveis (frutosaminas). Logo, a determinação de frutosamina trata-se basicamente da medição destas
glicoproteínas no soro. Desta forma, os níveis de Frutosamina no sangue são um reflexo direto dos níveis de glicose
sanguíneo tendo sua determinação grande utilidade no controle glicêmico de pacientes diabéticos ou de pacientes
hipoglicêmicos. A concentração de Frutosamina reflete o índice de variação de glicose durantes as últimas duas a três
semanas prévias à coleta da amostra.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Em meio alcalino as frutosaminas (proteínas séricas glicadas) presentes na amostra reduzem o reagente azul de
nitrotetrazol formando cor roxo-azulada. A intensidade desta coloração é proporcional a concentração de frutosamina
presente na amostra e é então determinada em espectrofotômetro a 520 nm.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro.

Armazenamento e estabilidade da amostra:

Estável 7 dias de 2 a 8 ºC. Não usar amostras hemolisadas e separar o soro o mais rapidamente o possível.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

FRUTOSAMINA Registro M.S.: 80027310069


Códigos: BT 10017 – 1 fr. com 50 mL + 1 fr. Calibrador – 3,0 mL
2 fr. com 50 mL + 1 fr. Calibrador – 3,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tampão Carbonato 200 mmol/L pH 10,3; Azul de Nitrotetrazol 0,25 mmol/L.

Calibrador: Soro liofilizado contendo albumina glicada (Valor da concentração: vide rótulo do frasco de calibrador).
Potencialmente Infectante.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 - 8 oC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual

74
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura em 520 nm (500-550) com cubeta termostatizada.


y Banho de água a 37 ºC.
y Pipetas de vidro e/ou automáticas.
y Relógio ou Cronômetro.
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.
Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

• O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


• Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais devem ser observados.
y As amostras a serem analisadas devem ser tratadas como material potencialmente infectante.
• Utilizar os EPI’s de acordo com as Boas Práticas de Laboratório Clínico.
• Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório Clínico em local próprio para
materiais potencialmente infectantes.
• Em caso de vazamento acidental, contato com os olhos, pele ou mucosa, lavar abundantemente com água corrente.
• Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
• As informações de Descarte, Segurança e Primeiros Socorros estão descritas na Ficha Individual de Segurança de
Produtos Químicos (FISPQ) deste produto.
• Não misturar diferentes lotes de reagentes.
• Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle, padrão/calibrador e reagente.
• Não trocar as tampas dos frascos dos reagentes, a fim de evitar contaminação cruzada.
• Não usar o reagente quando este mostrar-se com sinais de contaminação.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparo do reagente:
Reagente pronto para uso.

Procedimento manual
4. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Calibrador de Frutosamina - 50 μL -
Amostra - - 50 μL
Reagente 1000 µL 1000 µL 1000 µL

4. Homogeneizar e inserir no porta-cubetas termostatizado.


5. Medir a absorbância a 520 nm (500-550) aos 10 minutos (A1) e aos 15 minutos (A2).
Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

75
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

11. CÁLCULOS

(A2 - A1) amostra x valor Calibrador = mmol/L Frutosamina


(A2 - A1) Calibrador

COM FATOR: Fc = Valor do Calibrador


(A2 - A1) Calibrador

Frutosamina (mmol/L) = (A2 - A1) amostra x Fc


Exemplo:
A1C = 0,588 Fc = 2,37 = 2,37 = 16,23
A2C = 0,734 0,734-0,588 0,146
A1A = 0,630 Frutosamina (mmol/L) = (0,802 - 0,630) x 16,23
A2 A = 0,802 = 2,79 mmol/L
Valor do Calibrador: 2,37 mmol/L

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mmol/L

Valores de referência
Soro: 1,9 a 2,9 mmol/L

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
A reação é linear de 0,2 a 8,5 mmol/L. Para valores superiores a 8,5 mmol/L, diluir a amostra com NaCl 150 mM (0,9%),
realizar nova dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.
Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Baker J R et al., Clin. Chem. 31/9: 1550-1554, 1985.


• Hurst, P. Clin. Chem. 33/10: 1947, 1987.
• Ambruster D A, Clin. Chem.. 33/12: 2153, 1987.
• Westgard J. O., Barry P. L., Hunt M.R., Groth T. A multi-rule Shewhart chart quality control in clinical chemistry. Clin.
Chem., 27:493-501,1981.

76
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

γ - GLUTAMILTRANSFERASE (GAMA - GT)


Método Cinético Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação das colestases hepáticas, doenças obstrutivas da árvore biliar e no monitoramento
da administração de algumas drogas.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Esta enzima está presente em numerosos tecidos, mas a concentração mais elevada está nos rins, pâncreas e fígado.
É usada na avaliação das colestases hepática, doença obstrutiva da árvore biliar, no uso prolongado de drogas que
induzem o sistema microssomal hepático, como exemplo, fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, ácido valpróico e
contraceptivos, e no acompanhamento do tratamento de alcólatras, nas neoplasias do fígado valores elevados podem
ocorrer. Diminuição dos valores podem ocorrer no uso de azatioprina, clofibrato, estrógenos e metrovidazol.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A gama-glutamiltransferase (γ−GT) catalisa a transferência do grupo γ−glutamilo da γ−glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida a


glicilglicina, liberando 5-amido-2-nitrobenzoato. A concentração catalítica é determinada a partir da velocidade de formação
do 5-amido-2-nitrobenzoato.
γ-GT
L−γ−glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina ⎯⎯→ L-γ−glutamil- glicilglicina + 5-amido-2-nitrobenzoato

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.

Amostras:
Soro ou plasma.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro não hemolisado, Plasma (EDTA ou heparina). Anticoagulantes contendo citrato, fluoreto ou oxalato inibem a atividade
da GGT.
A y-Glutamiltransferase em soro é estável pelo menos por 7 dias a 2-8 ºC

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Evitar amostras com hemólise.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

γ - GLUTAMILTRANSFERASE (γ - GT) Registro M.S.: 80027310012


Códigos: BT 11006 – 1 fr. com 40 mL + 1 fr. com 10 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A:Tampão TRIS 100 mmol/L - pH 8,25,Glicilglicina 100 mmol/L.


Reagente B: L-y-Glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida 4mmol/L.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8 ºC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Não utilizar reativos com a data de validade vencida.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

77
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 405 ou 410 nm, com cubetas termostatizadas
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Centrífuga.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

78
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos


Reativo de Trabalho: Misturar 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
Estável 6 semanas a 2-8°C.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho a temperatura desejada durante alguns minutos.
2. Pipetar:

Reativo de Trabalho 1,0 mL


Amostras 100 µL

3. Inserir no porta-cubeta termostatizado a 37º C. Pré-incubar o reativo por 5 minutos.


4. Aos 60 segundos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras cada minuto durante 3 minutos. (A1, A2 e A3
respectivamente).
5. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais. Calcular o incremento médio de
absorbância por minuto (ΔA/min).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é
de grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.

11. CÁLCULOS

Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (ΔA/min).

ΔA/min = (A1 - A0) + (A2 – A1) + (A3 – A2)


3

A atividade de γ-GT na amostra é calculada pela multiplicação do ΔA/min, utilizando –se o seguinte fator

Fator (F) = 1158

γ-GT = ΔA/min X F

Exemplo:

A0 = 1,16 A1 = 1,18 A2 = 1,22 A3 = 1,25.


ΔA/min = (1,18-1,16)+(1,22 -1,18)+(1,25-1,22)
3

ΔA/min = 0,03 γ-GT (U/L)= 0,03 x 1158 = 34,7 U/L

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L x 16,67 = µkat/L

Valores de referência
37°C
Homens 10 – 47
Mulheres 7 – 30
Fator de correlação: 37°C / 30°C – 1’24
37°C / 25°C – 1’68
Estes valores são unicamente orientativos. É recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até 1000 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

79
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Interferências:
O etanol e vários fármacos induzem a síntese hepática da y-glutamiltransferase.
Anticoagulantes contendo citrato, fluoreto ou oxalato inibem a atividade da GGT.
Valores de Bilirrubina até 38 mg/dL, Hemoglobina até 180 mg/dL e Triglicérides até 1800 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Falsos Valores elevados: Valores de Triglicérides entre 1800 e 3500 mg/dL produzem resultados falsamente elevados. O
uso de fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, ácido valpróico e contraceptivos, também podem aumentar o valor da GGT.
Falsos Valores baixos: O uso de azatioprina, clofibrato, estrogenose metronidazol, podem causar resultados diminuídos.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Commitee of the Scand. Soc. for Clin. Chem. – Scand. J. Clin. Lab.
y Invest., 366, 119 (1976).
y Szasz G. – Clin Chem. 22, 2051 (1976).
y γ - glutamiltransferase (Gama GT) – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 215
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 78

80
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

GLICOSE
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação do controle de produção, consumo e armazenamento da glicose no organismo.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Útil no estabelecimento do diagnóstico e monitoração terapêutica do diabetes mellitus, na avaliação de distúrbios do


metabolismo de carboidratos, no diagnóstico diferencial das acidoses metabólicas, desidratações, hipoglicemias e na
avaliação da secreção inapropriada de insulina.
A reformulação dos critérios diagnósticos do diabetes mellitus pela American Diabetes Association (ADA) visou sua
precocidade diagnóstica, com o objetivo de desacelerar a progressão da doença e o aparecimento de suas complicações
tardias. A avaliação laboratorial deve ser considerada em todos os indivíduos acima de 45 anos de idade. Esta faixa etária
e freqüência de investigação devem ser reconsideradas nos obesos (índice de massa corpórea > 27 Kg/m2), em parentes
em 1º grau de pacientes diabéticos, em etnias de alto risco, em mães de bebês macrossômicos ou que desenvolveram
Diabetes Mellitus Gestacional (DMG), pacientes hipertensos e naqueles com níveis baixos de HDL-Colesterol (<35 mg/dL)
e /ou elevados de triglicerídeos (250 mg/dL).

Níveis Elevados Níveis Diminuídos


Diabetes Insulinomas
Hipertireoidismo Tumores extrapancreáticos
(fibromas, sarcomas, hepatomas,
mesoteliomas)
Feocromocitoma Insuficiência adrenal (doença de
Addison)
Pancreatite aguda Hipotireoidismo
Extresse Hipopituitarismo
Várias drogas * Hiperinsulinismo
Pancreatite crônica
Desnutrição síndrome de má-
absorção
Alcoolismo
Dano hepático (insuficiência
cardíaca severa, necrose hepática
fulminante)
Várias drogas**

* Ácido Acetilsalicílico, atropina, ácido ascórbico, anticonvulsivantes, diuréticos (tiazídicos, clortalidona, ácido etacrínico,
furosemida), adrenalina, corticóide, dopamina, indometacina, rifampicina, estrogênios, carbonato de lítio, contraceptivos
orais, tiabendazol, etc.
** Bloqueadores pela adrenérgicos, esteróides anabólicos, anti-histamínicos, etanol, inibidora da MAO, acetaminofen,
levodopa, etc.

Glicose, Líquor
Níveis Aumentados Níveis Diminuídos
Hiperglicemia diabética Hemorragias subaracnóides
Encefalite epidêmica Meningoencefalites não
bacterianas
Glicose sérica aumentada Meningite piogênica aguda
Meningite tuberculósica
Meningite criptocócica
Sífilis neurológica
Sarcoidose
Tumor primário ou metastático
das meninges

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A enzima glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose existente na amostra, em presença de oxigênio, produzindo
peróxido de hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do fenol pelo peróxido de hidrogênio formado, em
presença de 4-amino-antipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um máximo de
absorção em 500 nm. A intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose na amostra.

glicose oxidase
Glicose + O2 + H2O --------------------> Ácido Glucônico + H2O2
peroxidase

81
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

2H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol --------------> Quinonimina + 4 H2O

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Glicemia de jejum: recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.

Amostras
Soro.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro límpido, obtido no máximo duas horas após a coleta, por centrifugação, para evitar a glicólise (falso baixo) ou plasma
obtido com anticoagulante fluoretado.
Observações para todas as amostras: a separação da parte fluida dos elementos figurados (hemácias, leucócitos e
outras células) deve ser feita de forma imediata, para que não haja consumo do analíto. Outra forma de se evitar este
problema é a coleta de uma fração do líquido em fluoreto.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de coágulo.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

GLICOSE Registro M.S.: 80027310031


Códigos: BT 10008 – 1 fr com 250 mL + 1 fr. Padrão com 2,0 mL
BT 10008 – 4 fr. com 250 mL + 1 fr. Padrão com 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Tampão fosfato 182,42 mmol/L - pH 7,0; 4-Aminoantipirina 0,3 mmol/L; GOD-Glicose oxidase > 15000 U/L;
POD-Peroxidase > 1200 U/L; Fenol 10 mmol/L.
Padrão: Solução de Glicose (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)
y Reagente pronto para uso.
y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 - 8ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8º C


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 505 nm (490-510), com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

82
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso.

Procedimento manual
1. Deixar o Reagente durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão de glicose - 10 µL -
Amostra - - 10 µL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar bem e incubar os tubos durante 10 minutos a 37ºC ou durante 15 minutos a temperatura ambiente 25ºC.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 505 nm.
A cor é estável durante pelo menos 1 hora.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

83
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

11. CÁLCULOS

Abs. Teste x Valor padrão mg/dL = mg/dL Glicose


Abs. Padrão

Onde: Abs. Teste → Absorbância do teste


Abs. Padrão → Absorbância do Padrão
Valor padrão mg/dL → valor da concentração do Padrão (vide etiqueta do frasco)

Devido a ótima reprodutibilidade, que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator:

Fator de calibração = Conc. do Padrão . Concentração do Padrão – Vide etiqueta do frasco.


Absorbância do Padrão

Glicose (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL glicose x 0,0555 = mmol/L glicose

Valores de referência
Soro ou plasma: 70 a 110 mg/dL
Líquor: 40 a 75 mg/dL, (2/3 da glicemia)
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
Até 400 mg/dL = 22 mmol/L
Para valores superiores, diluir a amostra 1:2 ou 1:4 com NaCl 0,85%, repetir a dosagem e multiplicar o resultado pelo fator
de diluição.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
O ácido ascórbico (5 mg/dL), a hemoglobina (0,2 g/dL) e a bilirrubina (40 mg/dL) não interferem. A lipemia moderada não
afeta os resultados.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Trinder R. - Ann Clin Biochem 1969; 6:24.


y Henry, R. J. Cannon, D.C. Winkelman, J. – Clinical Chemistry Principles and Techniques, 2 ed. Harper and Row
Publishers Inc. N.Y.; p. 1288 (1974).
y Glicose – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 231-233
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 81-82

84
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

MAGNÉSIO MONO
Método colorimétrico
MAGON SULFONADO
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada como auxílio na detecção de hipoparatireoidismo, hiperaldosteronismo e hipertireoidismo.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Magnésio Sérico
É o quarto mais abundante cátion no organismo humano. Atua como um c-fator essencial para enzimas ligadas à
respiração celular, glicólise e transporte (através da membrana) de outros cátions (cálcio e sódio). O magnésio é essencial
para a preservação da estrutura molecular de DNA, RNA e ribossomas. Um terço do magnésio sérico é ligado à proteína,
principalmente à albumina; os outros 2/3 existem predominantemente como íon livre e um pequeno percentual como
complexo de ânions. O magnésio ingerido é absorvido no intestino delgado e excretado na urina. O processo de absorção
parece ser de controle deficiente, sendo afetado por síndromes de má-absorção, com sua homeostase exercida
basicamente pela excreção renal (a qual é regulada pela reabsorção tubular). Diminuições do magnésio são mais
significativas e frequentes que o excesso, e sintomas dessa depleção não ocorrem em níveis séricos até 1,0 mEq/L.
Severas diminuições estão ligadas à função neuromuscular como tetania, convulsão, fraqueza, irritabilidade e delírio. Níveis
baixos de magnésio, após um infarto do miocárdio, podem indicar um mau prognóstico.

Níveis aumentados
Uso de sais de magnésio
Antiácidos e laxantes
Doença de Addison
Desidratação grave
Insuficiência renal
Acidose diabética
Hipertireoidismo
Hipercalcemia

Níveis diminuídos
Associados com hipocalemia e
hipocalcemia
Alcoolismo crônico
Pancreatite aguda
Má-absorção
Lactação excessiva
Diálise
Diarréia grave
Diabetes mellitus
Terapia diurética
Dietas pobres em magnésio
Hiperaldosteronismo primário
Má-nutrição
Nefropatias tubulares
Hiperparatireoidismo
Hiperaldosteronismo

Magnésio Urinário

A excreção do magnésio está intimamente ligada à dieta. Sua análise tem sido utilizada antes e após administração
terapêutica de magnésio.

Níveis Aumentados
Álcool
Diuréticos
Síndrome de Bartter
Glomerulonefrite crônica
Aldosteronismo

85
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Terapia com drogas


(ciclosporina, diuréticos
tiazídicos, corticosteróides)

Níveis Diminuídos
Dieta pobre
Má-absorção
Hipoparatireoidismo
Decréscimo da função renal

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O magnésio presente na amostra reage com azul de xilidina II (Magon Sulfonado) em meio alcalino formando um complexo
intensamente corado com máximo de absorção em 510 nm. O desenvolvimento de um monoreagente líquido estável, sem
solventes orgânicos voláteis, torna o método especialmente adaptável a analisadores automáticos.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro, plasma e urina.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


o
Soro ou plasma obtido com heparina. Sob refrigeração o magnésio é estável por 15 dias entre 2-8 C.
Urina e líquido céfalo-raquidiano.
Dosagem na urina: efetuar a homogeneização prévia de todo o material, tomar uma amostra de cerca de 5 mL e adicionar 1
gota de HCl concentrado. Tal procedimento transforma todos os sais de magnésio presentes na urina em sais solúveis.
Diluir a urina 1:5 (1,0 mL de urina + 4,0 mL de água destilada ou deionizada). Proceder a seguir como descrito para o soro.
Multiplicar o resultado obtido por 5.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise, mesmo discreta.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

MAGNÉSIO Registro M.S.: 80027310015


Códigos: BT 12007 – 1 fr com 50 mL. + 1 fr Padrão – 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Carbonato de potássio 120 mM, EGTA 40 mM, Magon sulfonado (xilidil blue) 0,1 mM e azida sódica 18,5 mM.
Padrão: Solução aquosa de íons Magnésio (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15 e 30º C.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 15 e 30º C.


O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 510 nm, com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.

86
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Pipetas automáticas e ponteiras.


y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos.Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
y O reagente contém azida sódica que é tóxica, portanto, tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. No descarte do reagente,
usar bastante água, pois a azida pode formar compostos explosivos com tubulações de cobre e chumbo.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos:


Reativo pronto para uso.

Procedimento manual
1. Os reagentes devem estar a temperatura ambiente.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

87
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Branco Padrão Amostra


Padrão - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar bem e deixar os tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente.


4. Ler a absorbância (Ap) do Padrão e da Amostra(Aa) frente ao Branco a 510 nm.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

Cuidados especiais
y O uso de detergente iônico para limpar o material é outra fonte de contaminação com íons magnésio.

11. CÁLCULOS

Aa x Valor padrão = mg/dL Magnésio


Ap

Onde
Aa → Absorbância da Amostra
Ap → Absorbância do Padrão
Padrão → Valor da Concentração do Padrão

Urina (mg/24horas) = Magnésio Urina (mg/dL) x volume de 24 h em mL


100

Com Fator: F = Valor padrão


Ap

Magnésio (mg/dL) = Aa x F
F= 2 = 10,5
Exemplo: 0,191
Aa = 0,175
Ap = 0,191 Magnésio(mg/dL) = 0,175 x 10,5 = 1,8 mg/dL
Valor Padrão = 2,0 mg/dL

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL magnésio x 0,41 = mmol/L magnésio

Valores de referência
Para amostras de Soro e Plasma: 1,9 – 2,5 mg/dL
Para amostras de Urina/24 h: 48 – 152 mg/24h
Liquido Céfalo Raquidiano: 2,5 – 3,5 mg/dL
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
A reação é linear até 4,5 mmol/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
Hiperlipemia, ácido ascórbico, mesmo em elevadas concentrações (acima de 26 mg/dL) e bilirrubina (até 20 mg/dL) não
interferem.
Devido ao alto conteúdo intracelular de megnésio, hemólises mesmo discretas interferem significativamente. Não utilizar
amostras hemolisadas.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Chauman UPS, Ray Sarkar BC. Anal Biochem 1969; 32:70.


y Gindler EM, Heth DA. Clin Chem 1971; 17:662.
y Maxwell et al. – Clin Chem. 31/3, 520-522 (1982)
88
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Magnésio - Magon – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 324-325
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 87

89
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

PROTEÍNA TOTAL
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades hepáticas e renais.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor clínico, porque a alteração em uma das frações pode ser compensada
por alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças crônicas, em que há diminuição de albumina com aumento
de gamaglobulina.
O nível de proteínas séricas é basicamente um reflexo de sínteses hepáticas ou de perda de proteínas devido a
enfermidade renal, desnutrição severa, queimaduras graves e hemodiluição.
A eliminação excessiva de proteínas pelos rins ou a diminuição da síntese hepática provoca uma diminuição na pressão
coloidosmótica do plasma, que aumenta a reabsorção de sódio e água levando a edema.

Valores Aumentados
A concentração de proteína total do soro está comumente aumentada em pacientes com desidratação, mieloma múltiplo,
macroglobulinemia, crioglobulinemia, lupus eritematoso, artrite reumatóide, sarcoidose, infecções crônicas, linfogranuloma
e endocardite bacteriana sub-aguda.

Valores Diminuídos
A concentração de proteína total do soro está diminuída na hiperhidratação, desnutrição grave, insuficiência renal, nefrose,
queimaduras graves, síndrome de má absorção, deficiência de cálcio e vitamina D.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A proteína presente na amostra reage com os íons cobre (II) em meio alcalino, originando um complexo de cor violácea,
cuja absorbância em 550 nm é proporcional à concentração protéica da amostra.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro e plasma.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro e plasma heparinizado. Estável 8 dias à 2-8º C.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

PROTEÍNAS TOTAIS Registro M.S.: 80027310030


Códigos: BT 10.009 - 1 fr de 250 mL + 1 fr de Padrão - 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Sulfato de cobre 10 mM, tartarato de sódio e potássio 15 mM, iodeto de potássio 15 mM, hidróxido de sódio 140
mM.
Padrão: Solução de Albumina bovina (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco).

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 15-30 ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes a temperatura ambiente.


90
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Manter ao abrigo da luz.


O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 545 nm (535-555), com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

91
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

Procedimento manual
1. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Água destilada 10 μL - -
Padrão Proteína - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente.


3. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco à 545 nm. A cor é estável durante pelo menos 2
horas.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

A Amostra X Valor da concentração do padrão = g/dL proteína


A Calibrador

onde, A amostra = Absorbância da amostra,


A padrão = Absorbância do padrão.

Com fator
Fator de calibração (FC) = concentração do padrão
A do padrão
Exemplo:
A amostra = 0,352
A padrão = 0,25
Concentração do padrão = 5 g/dL
FC= 5,0 = 20 Proteína (g/dL) = 0,352 x 20
0,25
Proteína (g/dL) = 7,04 g/dL

Globulina = Proteína Total - Albumina

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: g/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): g/L = g/dL x 10

Valores de referência
Valores Normais
Soro : 6,5 – 8,0 g/dL
Plasma: 6,8 – 8,3 g/dL
Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
A reação é linear até 12 g/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências

Interferências: a hemoglobina (0,2 g/L) e a bilirrubina (15 mg/dL) interferem.


O soro deve ser obtido o mais breve possível.
As amostras de soro hemolisado ou contendo expansores plasmáticos (Dextram, Hemacel ou PVP), fornecem valores
elevados.

92
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Soros fortemente lipêmicos podem causar turvação.


Vários íons de amônio interferem no teste pela formação de complexo cúprico amônio.
A concentração de proteína total aumenta com o passar do dia.
No inverno, em geral, a concentração de proteína total é maior que no verão.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Gornall AG, Bardawill CS, David MM. J Biol Chem 1949; 177:751.
y Henry, R.: Sobel, C. & Berkman, S Anal Chem 29/10: 1491 (1957).
y Doumas, B. T: Watson, WA & Biggs. H.G Clin. Chim. Acta 31/1:87 (1971).
y Proteína Total – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 398-400
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 90-91

93
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

PROTEÍNA URINÁRIA
Método Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação renais.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A proteinúria é um marcador de doença renal e constitui um fator de risco independente para a sua progressão. Aumentos
ou decréscimos no valor de proteinúria são importantes marcadores do prognóstico renal do paciente. Dessa forma, em
pacientes com doença renal a pesquisa de proteinúria constitui um elemento importante no diagnóstico e no
acompanhamento.
A sua presença e a determinação do seu grau podem, em associação a outros achados, ajudar a estabelecer o diagnóstico
de certas síndromes ou entidades patológicas cujos achados renais são conhecidos.
A urina de pessoas saudáveis não contém proteínas ou contém somente em pequenas quantidades; normalmente o
glomérulo evita a passagem das mesmas do sangue para o filtrado glomerular.
Alterações glomerulares causam o aumento da permeabilidade das proteínas plasmáticas o que ocasiona a proteinúria.
A presença persistente de proteína na urina indica enfermidade renal.
Concentrações elevadas de proteínas no líquido cefalorraquidiano (Líquor) podem ser devidas a infecções ou à pressão
intracraniana elevada.
O diagnóstico clínico deve ser realizado levando-se em conta todos os dados clínicos e de laboratório.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A proteína presente na amostra reage com o vermelho de pirogalol e o molibdato, em meio ácido, formando um complexo
colorido. A intensidade da cor formada é proporcional à concentração protéica da amostra.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Amostras
Urina e Líquor.

Armazenamento e estabilidade das amostras:

Urina
- Utilizar amostra colhida no período de 24 horas, não havendo necessidade de adicionar conservantes.
- Homogeneizar a urina, medir o volume e separar uma amostra de cerca de 20 mL.
- Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm.
- Utilizar o sobrenadante para proceder o ensaio.

Líquor:
Utilizar amostra centrifugada.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

PROTEÍNAS URINÁRIA Registro M.S.: 80027310128


Códigos: BT 10.009 - 1 fr de 250 mL + 1 fr de Padrão - 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente: Vermelho de pirogalol 0,04 mmol/L, Molibdato de sódio 0,13 mmol/L, Ácido succínico 0,05 Mol/L, pH 2,5.
Oxalato de sódio 1 mmol/L, Benzoato de sódio 0,35 mmol/L, SDS 0,1mmol/L.
Padrão: Solução de Albumina (valor de padrão: vide rótulo do frasco).

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 - 8 ºC.

94
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes 2 a 8 ºC.


Manter ao abrigo da luz.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual

y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura em 598 nm com cubetas termostatizada.


y Pipetas de vidro e/ou automáticas.
y Relógio ou Cronômetro.
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

• O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


• Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos devem ser observados.
y As amostras a serem analisadas (urina ou líquor) devem ser tratadas como material potencialmente infectante.
• Utilizar os EPI’s de acordo com as Boas Práticas de Laboratório Clínico.
• Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório Clínico em local próprio para
materiais potencialmente infectantes.
• Em caso de vazamento acidental, contato com os olhos, pele ou mucosa, lavar abundantemente com água corrente.
• Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
• As informações de Descarte, Segurança e Primeiros Socorros estão descritas na Ficha Individual de Segurança de
Produtos Químicos (FISPQ) deste produto.
• Não misturar diferentes lotes de reagentes.
• Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle, padrão/calibrador e reagente.
• Não trocar as tampas dos frascos dos reagentes, a fim de evitar contaminação cruzada.
• Não usar o reagente quando este mostrar-se com sinais de contaminação.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso

95
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Procedimento manual

1. Pipetar em tubos de ensaio:


BRANCO PADRÃO AMOSTRA
Padrão --- 20 μL ---
Amostra --- --- 20 μL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Homogeneizar manter os tubos durante 5 a 37 ºC.


3. Medir a absorbância do Padrão (Ap) e da Amostra (Aa) frente ao Branco a 600 nm. A cor é estável durante 30
minutos.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

Urina de 24horas:

A Amostra X concentração do padrão X vol.(L) urina 24h = mg proteínas/24h


A Padrão

Líquor (LCR):
A Amostra X concentração do padrão = mg/L proteínas
A Padrão

onde, A amostra = Absorbância da amostra,


A padrão = Absorbância do padrão.

Com fator
Fator de calibração (FC) = concentração do padrão
A Padrão
Exemplo:
A amostra = 0,025
A padrão = 0,133
Concentração do padrão = 1000 mg/L
Volume urinário 24h = 1,2L

FC = 1000 = 7519 Proteína (mg/24h) = 0,025 x 1,2 x 7519


0,133

Proteína Urinária = 226 mg/24 h

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: g/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): g/L = Proteinúria (mg/L) x 0,001

Valores Normais

CRIANÇAS ADULTOS
Líquor 300 - 1000 mg/L 150 - 450 mg/L

ADULTOS E CRIANÇAS GESTANTES


Urina < 100 mg/24h < 150 mg/24h

Estes valores são unicamente orientativos. Recomendamos que cada laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade
A linearidade da reação é de 3000 mg/L. Para valores superiores, diluir a amostra com água deionizada ou destilada,
realizar nova dosagem e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Indicar o procedimento de diluição adotado
pelo laboratório.
96
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Interferências

Interferências: hemólise (LCR).


A presença de detergentes (surfactantes) na amostra ou seus resíduos em materiais e/ou equipamentos de laboratório
interferem com a reação. A presença de Lauril sulfato de sódio (0,1%) e Triton X100 (1%) também interferem na reação.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Watanabe, N. Kamei, S., Ohkubo, A., Yamanaka, M., Oshawa, S., Clin. Chem. 32: 1551 (1986).
• Orsonneau JL et al. An Improved Pyrogallol Red-Molybdate Method for Determing Total Urinary Protein. Clin Chem 1989;
35:2233-22236.
• Koller A. Total serum protein. Kaplan A et. Al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1316-
1324 and 418.
• Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC Press, 1995.
• Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC Press, 2001.
• Burtis A et al. Tietz Testbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. AACC 1999.
• Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory tests, 3rd ed. AACC 1995.
• Westgard J. O., Barry P. L., Hunt M. R., Groth T. A multi-rule Shewhart chart quality control in clinical chemistry. Clin.
Chem., 27: 493-501, 1981.

97
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

TGO / AST
Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de hepatites agudas e é um bom indicador no diagnóstico de infarto agudo do
miocárdio.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A Transaminase Oxalacética – TGO (sinonímia, Aspartato


Aminotransferase (AST)), é uma enzima encontrada no miocárdio, fígado, musculatura esquelética, rim e cérebro. Níveis
elevados dessa enzima auxiliam no diagnóstico de doenças cardíacas, hepáticas e musculares.
A atividade dessa enzima no infarto do miocárdio eleva-se dentro das primeiras 12 horas, atingindo um pico em 24 horas e
retornando ao normal por volta do quinto dia. Pequenas elevações são observadas durante a gravidez. Níveis aumentados
também são encontrados em necrose hepática, anemias hemolíticas, pancreatite aguda, cirrose hepática,
hepatites, icterícia obstrutiva, mononucleose, hipotireoidismo, trauma e necrose cerebral, dermatomiosites, queimaduras
severas, distrofias musculares, lesões da musculatura esquelética, cateterização e angioplastia cardíaca. Inúmeras drogas
comumente usadas podem elevar os níveis de AST (isoniazida, eritromicina, progesterona, esteróides anabólicos etc.),
sendo usada na monitoração de terapias que utilizam drogas hepatotóxicas.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

O Aspartato aminotransferase (AST ou GOT) catalisa a transferência do grupo amino do aspartato a 2-oxo-glutarato,
formando oxalacetato e glutamato. A concentração catalítica se determina, empregando a reação acoplada de malato
desidrogenase (MDH), a partir da velocidade de desaparecimento do NADH, medido à 340 nm.
AST
L-Aspartato + 2-Oxoglutarato -----------> Oxaloacetato + L-Glutamato

MDH
Oxalacetato + NADH + H+ ------------> Malato + NAD+
LDH
Piruvato endógeno + NADH ------------> L- Lactato + NAD

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.

Amostra
Soro ou plasma.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro não hemolisado, plasma (EDTA ou heparina).
A atividade enzimática é estável por 4 dias entre 2 – 8°C.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise ou sinais de contaminação bacteriana.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

TGO / AST Registro M.S.: 80027310017


Códigos: BT 11007 – 1 fr com 40 mL R-A + 1 fr. com 10 mL R-B
BT 11007 – 1 fr. com 200 mL R-A + 1 fr. com 50 mL R-B

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Tampão Tris 80 mmol - pH 7,8., L-aspartato 240 mmol, MDH - malato desidrogenase > 600 U/L, LDH - lactato
desidrogenase > 1200 U/L,
Reagente B: Malato desidrogenase 0,18 mmol, 2-Oxoglutarato: 12mmol.

y Reagente pronto para uso.


98
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.


y Conservar entre 2-8 ºC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Não utilizar reativos com a data de validade vencida.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 340 nm, com cubetas termostatizadas
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Centrífuga.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.

99
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos


Reativo de Trabalho: Misturar 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
Estável 2 semanas a 2-8°C.
Proteger o reativo de trabalho da luz.
Descartar o reativo de trabalho quando a leitura da absorbância contra água for < 0,800 a 340 nm.

Procedimento manual
1. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho durante 5 minutos, à 37ºC.
2. Pipetar em uma cubeta:

37oC
Reagente de Trabalho 1000 μL
Amostra 100 μL

3. Misturar e inserir nas porta-cubetas termostatizadas. Acionar o cronômetro.


4. Aos 60 segundos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras cada minuto durante 3 minutos. (A1, A2 e A3
respectivamente).
5. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais. Calcular o incremento médio de
absorbância por minuto (ΔA/min).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.

11. CÁLCULOS

Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (∆A/min.).

(∆A/min.) = (A0 – A1) + (A1 – A2) + (A2 – A3)


3

A atividade da TGO na amostra é calculada pela multiplicação do ∆A/minuto pelo seguinte fator:

Fator (37ºC) 1746

Exemplo:
Temperatura = 37ºC
A0= 1,268
A1= 1,228
A2= 1,189
A3= 1,152

∆A/min.= (1,268 – 1,228) + (1,228 – 1,189) + (1,189 – 1,152)


3
∆A/min.= 0,039

TGO (U/L) = 0,039 x 1746 = 67,5 U/L

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): U/L x 16,67 x 10–9 Kat/L = µkat/L

Valores Normais:
100
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

37ºC
HOMENS até 37 U/L
MULHERES até 31 U/L

Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até: ΔA/min de 0,250 = 440 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Falsos valores elevados: Acetaminofem, Anfotericina B, Alopurinol, Anticoncepcionais orais, Metildopa, Fenotiazinas,
Colchicina, Narcóticos, Corticoesteróides, Barbiturados.
Falsos valores baixos: Salicilatos (aspirina)

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Karmen A. et al. – J. Clin. Invest. 34, 126 (1955)


• Young D.S. el al. – Clin. Chem. 21, 5 (1975)
• TGO – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
• Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
• Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 455
• Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 93

101
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

TGP / ALT
Método Cinético - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de pacientes com lesões hepáticas virais, tóxicas e cirrose.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A Transaminase Pirúvica – TGP (sinonímia: Alanina Aminotransferase (ALT), é uma enzima intracelular presente em
grandes quantidades no fígado e rim, e pequenas quantidades na musculatura esquelética e coração. Como teste de
função hepática, a ALT é mais sensível para detecção de danos do hepatócito do que para obstrução biliar, sendo
considerada um excelente marcador hepatocelular. Níveis elevados são encontrados na hepatite infecciosa e tóxica,
doença pancreática, cirrose, icterícia obstrutiva e carcinoma metastático. Em pacientes com infarto do miocárdio a ALT
geralmente está normal ou ligeiramente elevada. Entretanto, insuficiência cardíaca ou choque com necrose hepática
concomitante pode levar a elevações de seus níveis.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A Alanina Aminotransferase (ALT ou GPT) catalisa a transferência do grupo amino da alanina a 2-oxoglutarato, formando
piruvato e glutamato. A concentração catalítica se determina, empregando a reação acoplada de lactato desidrogenase
(LDH), a partir da velocidade de desaparecimento do NADH, medido à 340 nm.
LDH

Piruvato endógeno + NADH -----------> L-Lactato + NAD

ALT
L - alanina + 2-Oxoglutarato -----------> Piruvato + L-Glutamato

LDH
Piruvato + NADH ------------> D - Lactato + NAD+

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas.

Amostra:
Soro ou plasma.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro não hemolisado, plasma (EDTA ou heparina).
A atividade enzimática é estável por 4 dias entre 2 – 8°C e 2 semanas.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


Presença de hemólise ou sinais de contaminação bacteriana.
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

TGP / ALT Registro M.S.: 80027310019


Códigos: BT 11008 – 1 fr com 40 mL R-A + 1 fr. com 10 mL R-B
BT 11008 – 1 fr. com 200 mL R-A + 1 fr. com 50 mL R-B

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Tampão Tris 100 mmol - pH 7,5, L-alanina 500 mmol, MDH - malato desidrogenase > 600 U/L, LDH - lactato
desidrogenase > 1200 U/L,
Reagente B: Malato desidrogenase 0,18 mM, 2-Oxoglutarato: 15mM.

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.

102
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Conservar entre 2-8 ºC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8 °C. NÃO CONGELAR.


Não utilizar reativos com a data de validade vencida.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leituras a 340 nm, com cubetas termostatizadas
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Centrífuga.
y Cronômetro.
y Tubos de ensaio

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y Os reagentes não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Evitar contaminações com íons metálicos.
y Não misturar diferentes lotes de reagentes. Evitar contaminação microbiana do reagente e não utilizar reagentes que
tenham sinais de contaminação ou precipitação.
y Não dispensar o reagente em tubulação contendo ferro galvanizado.
y Não contaminar a vidraria ou o reagente com saliva ou suor, devido aos seus altos conteúdos de α-amilase. Não soprar
a pipeta utilizada. Não conversar nas proximidades do frasco destampado, pois o reagente pode se contaminar
irreversivelmente. O aparecimento de cor amarelada no reagente é sinal de contaminação por α-amilase.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
103
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação dos reativos


Reativo de Trabalho: Misturar 04 partes de Reativo A + 01 parte de Reativo B.
Estável 2 semanas a 2-8°C.
Proteger o reativo de trabalho da luz.
Descartar o reativo de trabalho quando a leitura da absorbância contra água for < 0,800 a 340 nm.

Procedimento manual
6. Pré-aquecer o Reagente de Trabalho durante 5 minutos, `37ºC.
7. Pipetar em uma cubeta:
o
37 C
Reagente de Trabalho 1000 μL
Amostra 100 μL

8. Misturar e inserir nas porta-cubetas termostatizadas. Acionar o cronômetro.


9. Aos 60 segundos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras cada minuto durante 3 minutos. (A1, A2 e A3
respectivamente).
10. Comprovar que as diferenças entre absorbâncias sejam sensivelmente iguais. Calcular o incremento médio de
absorbância por minuto (ΔA/min).

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos.

11. CÁLCULOS

Usando as leituras das absorbâncias, calcular a média da variação da absorbância por minuto (∆A/min.):

(∆A/min.) = (A0 – A1) + (A1 – A2) + (A2 – A3)


3

A atividade da TGP na amostra é calculada pela multiplicação do ∆A/minuto pelo seguinte fator:
Fator (37ºC) 1746

Exemplo:
Temperatura: 37ºC
A0 = 1,297
A1 = 1,278
A2 = 1,263
A3 = 1,245
∆A/min.= (1,297 – 1,278) + (1,278 – 1,263) + (1,263 – 1,245)
3
∆A/min = 0,017

TGO (U/L) = 0,017 x 1746 = 29,6 U/L

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: U/L


Sistema Internacional - SI
-3
1 U/L = 16,67 x 10-9 Kat/L = 16,67 x 10 µKat/L
1 µkat/L = 60 U/L

Valores Normais

104
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

37ºC
HOMENS até 42 U/L
MULHERES até 32 U/L

Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que laboratório estabeleça seus próprios intervalos de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até: ΔA/min de 0,200 = 350 U/L.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Falsos valores elevados: hemólise

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Wroblewski F., LaDue JS.- Proc. Sec. Exp. Biol. And med. 1956; 34:381
y Henry R.J. et al. – Am. Jnl. Clin. Path. 1960.
y Deustchen Gesellschaft fur Klinische Chemie (DGKC) Z. Klin. Chem. 10: 281 (1972).
y Scandinavian Society for Clinical Chemistry (SSCC) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33: 291 (1974).
y International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) Clinica Chimica Acta 105: 147 (1980).
y TGP – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 455
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 93

105
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

TRIGLICÉRIDES
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada como parâmetro na avaliação dos riscos de doenças cardiovasculares.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

Os triglicerídeos são ésteres de glicerol. Os triglicerídeos provenientes da dieta sofrem digestão no duodeno e íleo
proximal. Através da ação de lípases e ácidos biliares, são hidrolisados a glicerol e ácidos graxos. Após absorção são
ressintetisados nas células epiteliais intestinais e combinados com colesterol e apolipoproteínas para formar quilomícrons,
que são transportados via ducto torácico para a circulação.
O aumento de triglicerídeos no plasma é indicativo de distúrbios metabólicos.
Esta dosagem serve como parâmetro na avaliação dos riscos de doenças cardiovasculares, no diabetes, no
hipotireoidismo, na pancreatite aguda, na uremia, na obesidade e nos hábitos alimentares errôneos.
O aumento dos triglicerídeos no diabetes está relacionado ao aumento da mobilização das áreas de armazenamento de
lipídeos (triglicerídeos) em decorrência da diminuição da insulina, produzindo seu metabolismo anormal e depósito de
lipídeos nas paredes vasculares levando à arteriosclerose.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A enzima lípase lipoprotéica hidrolisa os triglicerídeos existentes na amostra, produzindo glicerol livre. A enzima glicerol
quinase fosforila o glicerol livre formado cujo produto, em presença de oxigênio e sob a ação catalítica da enzima glicerol-P-
oxidase, produz peróxido de hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do reagente fenólico (p-clorofenol) pelo
peróxido de hidrogênio formado, em presença da 4-amino-antipirina, produzindo um composto róseo-avermelhado
(quinonimina), que apresenta um máximo de absorção em 500 nm.
lipase
Triglicérides ⎯⎯⎯→ Glicerol + Ácidos graxos

glicerol quinase
Glicerol + ATP ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ L-Glicerolfosfato + ADP

L-Glicerolfosfato-oxidase
L-Glicerolfosfato + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ Dihidroxiacetona-P + H2O2

peroxidase
2H2O2 + Clorofenol + 4-AF ⎯⎯⎯⎯⎯→ p-benzoquinona monoímio fenazona + 4 H2O

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
Recomenda-se jejum mínimo de 8 horas e jejum alcoólico de 24 horas.

Amostra
Soro ou plasma

Armazenamento e estabilidade das amostras:


O analito é estável por 3 dias a 2-8 ºC.

Volumes mínimos e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

TRIGLICÉRIDES Registro M.S.: 80027310014


Códigos: BT 10010 – 1 fr. com 250 mL + 1 fr. Padrão com 2,0 mL
BT 10010 – 2 fr. com 250 mL + 1 fr. Padrão com 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

106
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Reagente de Trabalho: GK – glicerolquinase > 1000 U/L; POD – Peroxidase > 1000 U/L; LPL – Lipoproteína lípase > 2000
U/L; GPO – Glicerol-3-fosfato oxidase > 5000 U/L; 4 clorofenol 2,7 mM; 4-aminoantipirina 0,3 mM; ATP - adenosina
trifosfato 2,0 mM; tampão Tris 50,0 mM pH 7,2.
Padrão: Solução de Glicerol equivalente à concentração de Triglicérides (valor da concentração do padrão vide etiqueta do
frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8 ºC.

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8º C


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 500 nm (490-510), com cubetas.
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.

107
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo pronto pra uso.

Procedimento manual
1. Deixar ambientar o Reagente durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão triglicérides - 10 µL -
Amostra - - 10 µL
Reagente 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar bem e incubar os tubos durante 15 minutos à temperatura ambiente (16-25º C) ou durante 10 minutos a 37º
C.
4. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 500 nm.
A cor é estável durante pelo menos 1 hora.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).
Cuidados especiais
y Cuidado com a limpeza do material utilizado para os testes. Lavar no mínimo 3 vezes com água deionizada para
eliminar qualquer vestígio de Glicerol que é um forte contaminante nas reações do triglicérides.

11. CÁLCULOS

Com calibrador ou padrão:


A Amostra X valor do padrão = mg/dL Triglicérides
A Padrão

onde: A amostra = absorbância da amostra


A padrão = absorbância do padrão

Com fator:

ƒc = valor do padrão
Apadrão

Triglicérides (mg/dL) = Aamostra X ƒc

Exemplo:
Aamostra = 0,276 F= 200 = 806,5
Apadrão = 0,248 0,248

Valor do padrão: 200 mg/dL Triglicérides= 0,276 x 806,5= 222,6 mg/dL

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): mg/dL Triglicerides x 0,0113 = mmol/L Trigliceridese

Valores de referência
30 - 170 mg/dl = 0.70 - 1.70 mmol/L
Esses valores são unicamente orientativos. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.
108
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até 1000 mg/dL Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o
valor encontrado fique dentro dos valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências
O ácido ascórbico (0,3 mmol/L), a hemoglobina (3 g/L) e a bilirrubina (0,25 mmol/L) interferem. A lipemia não afeta os
resultados.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Schettler G., And Nussel E., Arb. Med. Prav. Med., 10 (1975) 25.
y Jacobs, N.J., Van Denmark, P.J. Aarch. Biochem. Biophys. 88 (1960), 250-255.
y Kodischek, L.K., Umbreit, W.W. Bacteriol. 98 (1969) 1063-1068.
y Trinder P. - Ann Clin Biochem 6 (1969); 24-27.
y Triglicérides – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 460-461
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 94

109
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

URÉIA ENZIMÁTICA
Método Enzimático Colorimétrico
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades renais e hepáticas.

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A uréia é o metabólito quantitativamente mais importante do catabolismo das proteínas. Produzida no fígado, ela passa
para a circulação sangüínea, onde é degradada em nível intersticial e eliminada pelo suor, trato gastrintestinal e rim. É
livremente filtrada pelos glomérulos dependendo do estado de hidratação e 40% a 80% da uréia filtrada são passivamente
reabsorvidas nos túbulos proximais. Sua concentração varia em indivíduos sadios e é influenciada por diversos fatores
como: grau de hidratação, dieta protéica e função renal. É utilizada na avaliação do estado do funcionamento renal.
A uremia é observada na dieta rica em proteínas, insuficiência cardíaca congestiva, nefrite, insuficiência renal aguda e
carcinomas no trato urinário.
A diminuição da uréia está relacionada a insuficiência hepática grave, aumento da diurese e redução do catabolismo
protéico. A lesão renal provoca uma retenção de substâncias tóxicas como a uréia através de distúrbios da filtração,
reabsorção, secreção e excreção. Na lesão hepática, haverá uma diminuição da conversão de amônia em uréia, causando
uma hiperamoniemia.

Níveis aumentados
A - Pré-renal
Condições em que a circulação através dos rins é menos eficiente que o
normal
Desidratação (diarréia persistente)
Choque
Diminuição do volume sangüíneo (hemorragias digestivas)
Catabolismo protéico aumentado (febre, estresse, queimaduras etc.)
Insuficiência cardíaca
B - Renal
Diminuição da filtração glomerular como conseqüência de uma doença
renal aguda ou crônica
Nefropatias
Tratamento com glicocorticóides (efeito antianabólico)
C - Pós Renal
Resultado de uma obstrução do trato urinário. Obstrução do trato urinário
(cálculo, obstrução prostática etc.)
Níveis diminuídos
Caquexia, gravidez, doença celíaca, hemodiluição, na infância,
insuficiência hepática aguda e ingestão protéica diminuída.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A uréia é hidrolisada na presença da enzima urease e água, com produção de NH3 e CO2. A amônia formada reage com
salicilato e hipoclorito de sódio em meio alcalino, originando uma coloração verde (reação de Berthelot modificada). O
aumento da absorbância em 580 nm é proporcional a concentração de uréia na amostra.

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro, plasma (heparina) e urina.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


A uréia no soro é estável por 7 dias a 2 – 8 º C.
Não usar anticoagulantes fluoretados e nem contendo sais de amônio.
A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo 2mL de HCl a 50% (v/v). Centrifugar antes de processar. Diluir a
urina 1/50 com água destilada. Multiplicar o resultado obtido por 50.

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.
Critérios para a rejeição de amostras
y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material.

110
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

5. COMPONENTES DO KIT

URÉIA ENZIMÁTICA Registro M.S.: 80027310068


Códigos: BT 10013 – 1 fr com 50 mL R-A + 1 fr com 50 mL R-B + 1fr com 2,0 mL R-C fr + Padrão com 2,0 mL
BT 10013 – 1 fr com 250 mL R-A + 1 fr com 250 mL R-B + 1fr com 10,0 mL R-C fr + Padrão com 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A: Tampão fosfato pH 6,70 – 50 mmol/L, EDTA 2 mmol/L, Salicilato sódico 60 mmol/L, Nitroprussiato de sódio
3,2 mmol/L.
Reagente B: Hipoclorito de sódio 140 mmol/L e hidróxido de sódio 150 mmol/L.
Reagente C: Urease – 30.000 U/L.
Padrão: Solução de Uréia (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2 e 8º C

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8º C


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 580 nm, com cubetas
y Banho de água a 37 °C.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.

111
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo A de Trabalho: Misturar na proporção de 25,0 mL de Reativo A-1 + 1,0 mL de Reativo A-2
Estabilidade do Reativo A de Trabalho: 15 dias, se refrigerado.
Reativo B: pronto para uso.

Procedimento manual
1. Deixar ambientar os Reagentes durante alguns minutos à temperatura ambiente ou em um banho de água.
2. Pipetar em tubos de ensaio:

Branco Padrão Amostra


Padrão de uréia - 10 μL -
Amostra - - 10 μL
Reagente A de trabalho 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar bem e incubar os tubos durante 5 minutos a 37º C.


4. Pipetar:

Reagente B 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

5. Agitar bem e incubar os tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente (15-30º C) ou durante 5 minutos a 37º C.
6. Ler a absorbância (AP) do Padrão e (AA) da Amostra frente ao Branco a 580 nm.
A cor é estável por 30 minutos..

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

A Amostra x Valor Padrão = mg/dL uréia,


A Calibrador

Onde,
Aamostra = Absorbância da amostra
Apadrão = Absorbância do padrão

Com fator:
F = Valor do Padrão Uréia = Aamostra x F
Apadrão

112
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Exemplo:
Aamostra = 0,109
Apadrão = 0,237
Valor padrão = 70mg/dL

F= 70 = 295,4
0,237

Uréia(mg/dL) = 0,109 x 295,4 = 32,2mg/dL

Dosagem na urina (mg/24 hs):

mg/24 hs = Uréia urinária (mg/dL) X Volume urinário de 24 horas (mL)


100

Uréia urina (g/24 h) = Uréia urina (mg/24 h)


1000

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): Soro / plasma: mg/dL uréia x 0,166 = mmol/L uréia
Urina: mg/24h ÷ 1000 = g/24h uréia.

Valores de referência
- Soro e plasma: 15 – 45 mg/dL (2,49 – 7,49 mmol/L)
- Urina: 20 – 35 g / 24 horas
Estes valores são unicamente orientativos sendo recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
referência.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear até 200 mg/dL.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
O ácido ascórbico, mesmo em concentrações elevadas (acima de 20 mg/dL), hemoglobina até 400 mg/dL, hiperlipemia e
bilirrubina até 20 mg/dL, não interferem nos resultados.
Não devem utilizar-se sais de amônia como anticoagulantes, já que interferem na reação.

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Chaney AL, Marbach CP. Clin Chem 1962; 8:130.


y Searcy RL, Reardon JE, Foreman JA. Amer J Med Technol 1967; 33:15.
y Tobacco A, et al. Clin Chem 1979; 25:336.
y Bergmeyer, H.U. (Ed.) Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press, p.449, 1985.
y Fawcet, J.K. & Scott, J.E. Brit, J. Clin Path. : 13:156,1980.
y Uréia Enzimática – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 467
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 94

113
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

URÉIA UV
Método Cinético Enzimático - UV
1. INDICAÇÃO MÉDICA

Esta dosagem é utilizada na avaliação de enfermidades renais e hepáticas

2. SIGNIFICADO CLÍNICO E FISIOPATOLÓGICO

A uréia é o metabólito quantitativamente mais importante do catabolismo das proteínas. Produzida no fígado, ela passa
para a circulação sangüínea, onde é degradada em nível intersticial e eliminada pelo suor, trato gastrintestinal e rim. É
livremente filtrada pelos glomérulos dependendo do estado de hidratação e 40% a 80% da uréia filtrada são passivamente
reabsorvidas nos túbulos proximais. Sua concentração varia em indivíduos sadios e é influenciada por diversos fatores
como: grau de hidratação, dieta protéica e função renal. É utilizada na avaliação do estado do funcionamento renal.
A uremia é observada na dieta rica em proteínas, insuficiência cardíaca congestiva, nefrite, insuficiência renal aguda e
carcinomas no trato urinário.
A diminuição da uréia está relacionada a insuficiência hepática grave, aumento da diurese e redução do catabolismo
protéico. A lesão renal provoca a retenção de substâncias tóxicas como a uréia devido aos distúrbios da filtração,
reabsorção, secreção e excreção. Na lesão hepática, haverá uma diminuição da conversão de amônia em uréia, causando
uma hiperamoniemia.

Níveis aumentados
A - Pré-renal
Condições em que a circulação através dos rins é menos eficiente
que o normal
Desidratação (diarréia persistente)
Choque
Diminuição do volume sangüíneo (hemorragias digestivas)
Catabolismo protéico aumentado (febre, estresse, queimaduras etc.)
Insuficiência cardíaca
B - Renal
Diminuição da filtração glomerular como conseqüência de uma
doença renal aguda ou crônica
Nefropatias
Tratamento com glicocorticóides (efeito antianabólico)
C - Pós Renal
Resultado de uma obstrução do trato urinário (cálculo, obstrução
prostática etc.)

Níveis diminuídos
Caquexia, gravidez, doença celíaca, hemodiluição, na infância,
insuficiência hepática aguda e ingestão protéica diminuída.

3. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A uréia da amostra é hidrolisada pela enzima urease com produção de gás carbônico e íons amônio. Estes são captados
por uma segunda enzima, a glutamato desidrogenase, a qual em presença de outros substratos como o NADH2 e α-
cetoglutarato, produz NAD e glutamato. A diminuição da concentração de NADH2 no meio pode ser medida
espectrofotometricamente em 340 nm, sendo proporcional à concentração de uréia na amostra.
Urease
Uréia + H2O ---------------> 2 NH4+ + CO2
glutamato desidrogenase
NH4+ + NADH + H+ + 2-Oxoglutarato ------------------------>Glutamato + NAD+

4. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Preparo do paciente
O paciente deve estar em jejum de, pelo menos, 08 horas.

Amostras
Soro, plasma ou urina.

Armazenamento e estabilidade das amostras:


Soro e plasma (heparina ou EDTA): Estáveis por 7 dias a 2-8ºC.

Urina de 24 horas: Centrifugar antes de processar. Diluir a amostra 1/50 com água destilada (0,1 mL de urina + 4,9 mL de
H2O destilada ou deionizada). Multiplicar o resultado obtido por 50.

114
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Volumes mínimo e ideal


y A serem definidos pelo próprio laboratório.

Critérios para a rejeição de amostras


y Fazer referência ao Manual ou POP de coleta, separação e distribuição do material

5. COMPONENTES DO KIT

URÉIA UV Registro M.S.: 80027310045


Códigos: BT 10012 – 1 fr com 40,0 mL R-A + 1 fr com 10,0 mL R-B + 1 fr com Padrão 2,0 mL
BT 10012 – 1 fr com 200,0 mL R-A + 1 fr com 10,0 mL R-B fr + + 1 fr com Padrão 2,0 mL

BioTécnica Indústria e Comércio Ltda


Rua Ignácio Alvarenga nº 96, Vila Verônica - Varginha - M.G. - Brasil.
Tel/Fax: 0 (XX) 35 - 3214.4646
Site: www.biotecnicaltda.com.br / e-mail: sac@biotecnicaltda.com.br

Reagente A : Tampão TRIS 115mmol/L pH 7,6; α-cetoglutarato 7,5 mmol/L.


Reagente B: Enzimático: NADH 0,25 mmol/L; Urease ≥ 8 KU/L, glutamato desidrogenase > 800 U/L, ADP 1,2 mmol/L.
Padrão: Solução de Uréia (valor da concentração do padrão vide etiqueta do frasco)

y Reagente pronto para uso.


y Estabilidade: Estável até a data de validade do kit.
y Conservar entre 2-8 ºC

6. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

Manter todos os componentes entre 2 e 8º C


Evitar deixar em Temperatura Ambiente por períodos prolongados, evitando assim a deterioração das enzimas.
O reativo é estável até a data de validade do Kit. A data de validade aparece no rótulo da embalagem.
Não utilizar reativos que estejam com as datas de validade expiradas.

7. MATERIAL ADICIONAL NÃO FORNECIDO

Procedimento técnico manual


y Espectrofotômetro ou fotômetro para leitura de 340 nm (330-350) com cubeta termostatizada.
y Pipetas automáticas e ponteiras.
y Cronômetro
y Tubos de ensaio.

Procedimento automatizado
y Indicar nome, modelo e local onde se encontra o equipamento analítico, fazendo referencia ao Manual ou POP para
utilização do mesmo.

Procedimento alternativo
y Indicar o equipamento alternativo e os procedimentos para a medição do ensaio. Enumerar as diferenças separadas
quando procedimentos manuais substituem procedimentos automatizados.

8. CONTROLE DE QUALIDADE

Materiais
Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, código), instruções de preparo e freqüência
da utilização dos mesmos.

Limites de tolerância
Descrever os procedimentos para os limites de tolerância, o sistema adotado para a utilização do mapa de Levey-Jennings
e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante dos valores que ultrapassem tais limites. Fazer
referência ao Manual ou POP para utilização dos materiais de controle.

Verificação de novo lote de controle e/ou reagente


Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e/ou reagentes.

Gerenciamento dos dados


Definir como os dados relativos ao controle de qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao Manual ou
POP da garantia da qualidade.

115
Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

9. CUIDADOS E PRECAUÇÕES

y O kit destina-se somente para uso diagnóstico in vitro.


y Seguir com rigor a metodologia proposta, para a obtenção de resultados exatos.
y Os procedimentos higiênicos normais para o manuseio de materiais bioquímicos e biológicos devem ser observados.
y O reagente, uma vez usado, contém soro, plasma ou urina, eventualmente infectado, e deve ser tratado como material
potencialmente infeccioso. Descartar as sobras das reações de acordo com as Boas Práticas de Laboratório, em lugar
apropriado para material potencialmente infectante.
y O reagente e o padrão não contêm substâncias perigosas nas quantidades reportadas.
y O nível de água no banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contém as reações.
y Em caso de vazamento acidental, lavar o local com água corrente.
y Não é necessário nenhum tipo de proteção respiratória, mas recomenda-se o uso de óculos de segurança e de luvas
descartáveis durante o manuseio das substâncias.
y Em caso de contato com os olhos ou pele, lavar abundantemente com água corrente.
y Em caso de ingestão procurar atendimento médico.
y Fazer referência ao Manual ou POP de segurança.
y Não misturar ou trocar diferentes lotes de reativos.
y Não utilizar o reativo quando este mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
y A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes. A limpeza da vidraria
deve ser feita com detergente neutro. O enxágüe deve ser exaustivo, sendo o último, com água destilada ou
deionizada. Fazer referência ao manual ou POP de Controle de Qualidade de Água ou Água Reagente
y A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção
de resultados corretos. Fazer referência ao Manual ou POP de limpeza e validação da qualidade da limpeza dos
materiais.
y Usar pipetas de vidro e ponteiras descartáveis separadas para cada amostra, controle (se utilizado) e reagente. Não
trocar as tampas dos frascos de reagentes. Isso evitará contaminação cruzada, o que poderia causar resultados
errôneos.
y O reagente contém azida sódica que é tóxica, portanto, tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. No descarte do reagente,
usar bastante água, pois a azida pode formar compostos explosivos com tubulações de cobre e chumbo.

10. PROCEDIMENTO TÉCNICO

Preparação do reativo:
Reativo de Trabalho: Misturar na proporção de 50,0 mL de Reativo A + 0,5 mL de Reativo B + 0,5 mL de Reativo C.
Estabilidade do Reativo A de Trabalho: 15 dias, se refrigerado.
Descartar o reativo de trabalho se sua absorbância em 340 nm, medida frente a água, for inferior a 1,00.

Procedimento manual

Reagente de Trabalho: Misturar 4 (quatro) partes do Ragente A com 1 (uma) parte do Reagente B. Ex: Adicionar 4,0 mL
de Reagente A – Tampão a 1,0 mL de Reagente B – Enzimático.

O reagente de trabalho é estável por 4 semanas se mantido ao abrigo da luz, refrigerado de 2 a 8ºC e fora de refrigeração
somente o tempo necessário para as dosagens.

• Desprezar o Reagente de Trabalho se sua absorbância em 340 nm, medida frente a água, for inferior a 0,900.

B) Procedimento

1. Pré-aquecer o reagente de trabalho e a amostra a 37ºC durante 2 minutos.


2. Pipetar em uma cubeta pré-aquecida a 37ºC.

Reagente de Trabalho 1,0 mL


Padrão ou amostra 10 μL

3. Misturar e acionar o cronômetro simultaneamente


4. Anotar a absorbância aos 30 segundos (A1) e aos 120 segundos (A2) da amostra e do padrão, a 340 nm.

Procedimento automatizado
Fazer referência ao Manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes
para o sistema automático (Programação ou Protocolo).

11. CÁLCULOS

(A2 - A1) amostra x Valor padrão = mg/dL Uréia.


(A2 - A1) padrão

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Procedimento Operacional Padrão - Bioquímica

Fator de calibração = Valor do padrão / (A2 - A1) padrão


Uréia (mg/dL) = ΔAteste x Fator

Exemplo:
A1- amostra = 0,023 F= 70 = 70 = 752,7
A2- amostra = 0,054 (0,145 – 0,052) 0,093
A1-padrão = 0,052 Uréia (mg/dL) = (0,054-0,023) x 752,7
A2- padrão = 0,145 Uréia (mg/dL) = 23,34 mg/dL
Valor do padrão = 70 mg/dL

Dosagem na Urina (mg/24 horas)


mg/24 horas = Uréia urinária (mg/dL) x Volume urinário de 24 h/mL
100

12. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Unidade utilizada: mg/dL


UNIDADES: Sistema Internacional (SI): Soro / plasma: mg/dL uréia x 0,166 = mmol/L uréia
Urina: mg/24h ÷ 1000 = g/24h uréia.

Valores de referência
y Soro e plasma: 15-45 mg/dL
y Urina: 20-35 g/24 horas
Estes valores são unicamente a título orientativo; é recomendável que cada laboratório estabeleça seu próprio intervalo de
normalidade.

13. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

y Linearidade:
A reação é linear entre 6 e 250 mg/dL. Para valores acima de 250 mg/dL, diluir a amostra com água destilada. Multiplicar o
resultado obtido pelo fator de diluição.
Caso sejam encontrados valores superiores à linearidade, diluir a amostra de modo que o valor encontrado fique dentro dos
valores de linearidade. Indicar o procedimento de diluição adotado pelo laboratório.

y Interferências:
Não devem ser utilizados sais de amônia como anticoagulantes, pois os mesmos interferem na reação.
Ácido Ascórbico e Hemoglobina: Ácido Ascórbico apenas em concentrações elevadas (acima de 20 mg/dL) e
hemoglobina (acima de 200 mg/dL) induzem a resultados falsamente elevados.
Bilirrubina: A bilirrubina até 15 mg/dL não interfere.
Falsos Valores elevados: Hidroclorotiazida, ácido Etacrínico, furosemida, tianterene, bacitracina, cefalosporida,
gentamicina, kanamicina, cloranfenicol, meticilina, mitramicina, neomicina, vancomicina, metildopa, guanetimidina, morfina,
lítio, salicilato, propanolol, sulfonamidas.
Falsos Valores Diminuídos: fenotiazinas, timol.

Sensibilidade: 6 mg/dL

14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

y Talke H, Schubert GE. Klin Wschr 1965; 43:174.


y Bergmeyer HU. (Ed.) Methods of Enzymatic Analysis, Academic Press. p. 444, 1985..
y Hallet C.J. & Cook, J.G.M. Clin. Chim. Acta 35:37,1971.
y Kassirer, J.P. New Engl. J. Med. 285: 385, 1971.
y Uréia UV – Bula do Kit – BioTécnica Ind e Com. Ltda – Revisão Maio/2005.
y Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro,
1997.
y Manual de exames – Laboratório Fleury – 1999 – 467
y Manual de exames – Laboratório H. Pardini – 2002 – 94

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