Introduccin a la

[Prctica 3: Cintica Enzimtica de la Glucosa-Oxidasa] Biotecnologa

RESUMEN
El presente reporte est elaborado en miras a focalizar y entender la aplicacin del mtodo experimental en lo que refiere a la verificacin de mediciones haciendo uso del modelo de Michaelis-Menten para una reaccin qumica a travs del estudio de la catlisis enzimtica para la enzima glucosa-oxidasa al preparar soluciones con diferentes concentraciones de glucosa (50, 100, 500, 1000, 2000, 3000 y 4000 ppm), donde en los frascos del espectrofotmetro a 10L de solucin de glucosa se le aadan 10 ml de reactivo enzimtico(Glucosa Oxidasa) para todas las soluciones de las diferentes concentraciones preparadas, luego en un frasco aparte se prepar el blanco para la realizacin de la curva de calibracin, el cual se prepar usando 10 ml de reactivo enzimtico con 100L de agua destilada, para cada solucin de las diferentes concentraciones se dio un tiempo de reaccin de 45 minutos a 25C y se tomaba la lectura de la absorbancia cada 5 min. hasta llegar a 30 min. y luego hasta 45 min. Luego, con los datos de absorbancia obtenidos para las diferentes concentraciones se elabor la curva de calibracin y el clculo de las concentraciones de quinoneimina producidas existentes en cada tiempo t junto con el clculo de la velocidad de aparicin de sta y la velocidad de desaparicin de la glucosa, para despus establecer para cada concentracin los parmetros de Michaelis-Menten que se muestran en los clculos mostrados en ste reporte.

INTRODUCCIN TERICA
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad de la enzima.1 La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima. La velocidad puede determinarse bien midiendo
1

la aparicin de los productos desaparicin de los reactivos.

la

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se hace el estudio de la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin. Para evitar esta complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el parte del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.2

PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedic ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf

Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH

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Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Una forma prctica de linealizar los datos es haciendo uso de la grfica de LineweaverBurk, que es la forma ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.4

En otras palabras: [S]= concentracin del sustrato [P]= concentracin del producto [v0]= velocidad inicial + = aparicin de producto - = desaparicin de sustrato Se ha tomado el supuesto que la enzima usada en la prctica (Glucosa-Oxidasa) se comporta segn el modelo de cintica de Michaelis-Menten de donde se deduce la siguiente ecuacin:

La ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas de sustrato nico. La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax.3

Fig. 1: La recta obtenida de la linealizacin es la pendiente que representa a: Km/Vmax, el intercepto es equivalente a 1/Vmax de la reaccin enzimtica.

El reactivo enzimtico del que se har uso contiene dos enzimas: Glucosa-Oxidasa (GOD), la cual se hidroliza a cido glucnico
4

PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.
3

Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUMICA DE HARPER; Mxico; Editorial El Manual Moderno; p.77-93. http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedic ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf

Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUMICA DE HARPER; Mxico; Editorial El Manual Moderno; p.93-98. Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.

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y Peroxidasa (POD), que comprueba la presencia de perxido de hidrgeno. De donde luego ocurren las siguientes reacciones:

La segunda reaccin antes mostrada ocurre tan rpido que podemos suponer que la velocidad de aparicin de la quinoneimina es igual a la velocidad de consumo de glucosa y es igual a la velocidad de aparicin de perxido de hidrgeno, la velocidad de aparicin de la quinoneimina la mediremos en el espectrofotmetro de UV visible y de aqu partiremos para hacer el clculo de las dems variables.5

http://www.uco.es/organiza/departamentos/b ioquimica-biolmol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRA.pdf

Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUMICA DE HARPER; Mxico; Editorial El Manual Moderno; p.99-110.

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MTODOS
Materiales utilizados: Espectrofotmetro de UV visible. Celda para espectrofotmetro. Frascos volumtricos de 500ml. Pipeta graduada de 1 mL. Pipeta graduada de 10mL. Perilla de succin.

Reactivos: Reactivo enzimtico (Glucosa Oxidasa y Glucosa Peroxidasa). Solucin de Glucosa. Agua destilada.

a cabo para todas las concentraciones que se prepararon en el paso no. 1. 3. En otro frasco de uso en el espectrofotmetro, se prepar una solucin de 10 ml de reactivo enzimtico con 100L de agua destilada; ste fue usado para tomar el blanco de la curva de calibracin. 4. Se dej que la reaccin transcurriera en un tiempo de 45 min. a T=25C, donde se tomaba lectura de la absorbancia para cada concentracin en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 500nm. 5. Luego transcurridos los 45 min. y haber hecho la toma de datos, se llen la primera tabla de datos de absorbancia proporcionada.

Procedimiento: Aviso previo a la realizacin de la prctica: Se tuvo presente la pureza del reactivo de trabajo, ste deba encontrarse sin nada que lo contamine, ya que los oxidantes dan color al mismo permitiendo el acrecentamiento de blancos, los reductores disminuyen la respuesta de color y los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores de enzimas. Evitando todo contacto con la piel y membranas mucosas. Preparacin de la curva de calibracin: 1. Se prepararon soluciones de glucosa anhidra con las concentraciones a continuacin: 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 ppm. 2. En los frascos de uso para el espectrofotmetro, se aadi a 100L de solucin de glucosa, 10ml de reactivo enzimtico. Esto se llev

Obtencin de datos para la elaboracin de la curva de cintica qumica: 1. Nuevamente se prepararon las soluciones glucosa + reactivo enzimtico y el blanco como fue detallado en el procedimiento de elaboracin de la curva de calibracin. De las soluciones de glucosa-reactivo enzimtico se tuvieron que preparar desde la concentracin de 50ppm hasta 3000ppm, exceptuando la ltima de 4000ppm. 2. Para cada concentracin preparada, se iba tomando el dato de absorbancia en lapsos de tiempo de 5 min. por lectura hasta llegar a 30 min. y luego una ltima lectura de absorbancia en 45 min. para luego llenar la segunda tabla de datos de absorbancia dada.

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CLCULOS Y RESULTADOS
Para medir la disminucin de la concentracin de la glucosa tomaremos como base la reaccin secundaria de produccin de quinoneimina, que es un compuesto coloreado de rojo, del cual podemos medir su concentracin en la solucin usando un espectrofotmetro de absorcin de UV visible. La glucosa es oxidada por la enzima glucosa oxidasa (GOD) para formar un compuesto orgnico y perxido de hidrgeno, luego el perxido junto con un tinte incoloro y fenol, por la accin de la enzima peroxidasa (POD), son transformados a quinoneimina y agua (ver sistema de reacciones 1).
Glucosa + 2 + 2 O

Ahora bien los datos obtenidos son: Concentracin Inicial de Glucosa en ppm 0 50 100 500 2000 3000 4000 Absorbancia de la Quinoneimina 0 0,3676 0,396 0,5894 1,0434 1,2546 1,5173

Tabla 1: Datos para la curva de calibracin.

[G] (ppm) 50 100 500 1000 2000 3000 Datos de Absorbancia 15 20 25 min min min 0,3667 0,3670 0,3671 0,3939 0,3942 0,3954 0,5889 0,5909 0,5917 1,1402 1,1467 1,1480 1,0454 1,0479 1,0482 1,2559 1,2626 1,2646

5 min 0,3620 0,3849 0,5384 0,9689 0,9497 1,0934

6 12 7 + 2 2

10 min 0,3656 0,3926 0,5811 1,1076 1,0298 1,2275

30 min 0,3673 0,3954 0,5964 1,1481 1,0470 1,2625

2 H2 O2 + Tinte Incoloro + Fenol Quinoneimina + 4 2

Tabla 2: Datos de absorbancia en el tiempo a diferentes concentraciones iniciales de glucosa [G].

La segunda reaccin es casi inmediata por lo que la velocidad de produccin de quinoneimina est determinada por la formacin de perxido de la primera reaccin. Por esta razn se puede asumirse que la velocidad de formacin del complejo coloreado es igual a la velocidad de formacin del perxido de hidrgeno y esta a su vez es igual a la velocidad de desaparecimiento de glucosa (sustrato de la GOD).

Podemos calcular la curva de calibracin en trminos de la concentracin de la quinoneimina [Q]. Sabemos por estequiometria que por cada mol que se produce de quinoneimina, se necesitan 2 moles de perxido y por tanto 2 moles de glucosa para formarlo, entonces: = 2 [] = 1 Xo ppm de Glucosa 2 1000 mg 180 g de Glucosa g mol Xo ppm mol = (Ec.1) 360000 Lt
1

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Con esto podemos formar una nueva tabla:
Concentracin de la Glucosa (en ppm) 0 50 100 500 2000 3000 4000 Concentracin Quinoneimina (mol/Lt) 0 0,000138889 0,000277778 0,001388889 Absorbancia 0 0,3676 0,396 0,5894

Para Xo de 50 ppm de glucosa:

Concentracin Inicial de 50 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 0,362 0,3656 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,000189295 0,000200524

0,005555556 1,0434 0,008333333 1,2546 0,011111111 1,5173 Tabla 3: Datos para la grfica de la curva de calibracin.

Graficando y obteniendo la curva de regresin ms ajustada tenemos:

Curva de Calibracin de Absorbancia vrs Concentracin Molar de Q 0.012 0.01 0.008 [Q] = -0.0026abs4 + 0.0049abs3 + 0.0045abs2 0.0016abs - 9E-06 R = 0.9997

0,3667 0,000203995 0,367 0,000204945 0,3671 0,000205262 0,3673 0,000205896 Tabla 4: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 50 ppm de glucosa [G].
Variacin de Q vrs t G inicial = 50 ppm
0.00025 0.0002 Q (mol/Lt) 0.00015 0.0001 0.00005 0 [Q] = 2E-10t5 - 2E-08t4 + 7E-07t3 - 1E-05t2 + 8E-05t - 9E-06 R = 0.9992

Q (mol/Lt)

0.006
0.004 0.002 0 -0.002 0 0.5 1 Absorbancia 1.5 2

-0.00005 0

10

15

20

25

30

35

Tiempo (min)

Grfico 1: Curva de Calibracin con la curva de mejor ajuste.

Grfico 2: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

Ahora tenemos una ecuacin para encontrar [Q] a partir de la absorbancia con muy buena aproximacin:
= 0,002 4 + 0,0049 3 + 0,0045 2 0,0016 9 1006

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

= 2 1010 5 2 108 4 + 7 10 1 105 2 + 8 105 9 106
7 3

(Ec. 3)

(Ec. 2) Entonces con los datos de la tabla 2 obtenemos para cada concentracin inicial de glucosa:

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Luego para Xo de 100 ppm de glucosa:
Concentracin Inicial de 100 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 0,3849 0,3926 0,3939 0,3942 0,3954 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,00026417 0,000291192 0,000295846 0,000296924 0,000301249

Luego para Xo de 500 ppm de glucosa:

Concentracin Inicial de 500 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 0,5384 0,5811 0,5889 0,5909 0,5917 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,00098026 0,001245819 0,001297405 0,001310784 0,001316153

0,3954 0,000301249 Tabla 5: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 100 ppm de glucosa [G].
Variacin de Q vrs t G inicial = 100 ppm
0.00035 0.0003 0.00025 0.0002 0.00015 1E-04 5E-05 -1E-19 -5E-05 0

0,5964 0,001347896 Tabla 6: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 500 ppm de glucosa [G].
Variacin de Q vrs t G inicial = 500 ppm
0.0016 0.0014 0.0012 0.001 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 0 -0.0002 0

Q (mol/Lt)

Q (mol/Lt)

[Q] = -1E-08t4 + 8E-07t3 - 2E-05t2 + 0.0003t - 5E-06 R = 0.9991

10

15

20

[Q] = -4E-09t4 + 3E-07t3 - 8E-06t2 + 9E-05t - 7E-06 R = 0.994

25 30 Tiempo (min)

35

10

15

20

25

30

35

Tiempo (min)

Grfico 3: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

Grfico 4: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

= 4 109 4 + 3 107 3 8 106 2 + 9 105 7 106

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

= 1 108 4 + 8 107 3 2 105 2 + 3 104 5 106

(Ec. 4)

(Ec. 5)

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Luego para Xo de 1000 ppm de glucosa:
Concentracin Inicial de 1000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 0,9689 1,1076 1,1402 1,1467 1,148 1,1481 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,004830775 0,0064844 0,00688594 0,006966297 0,006982377 0,006983614

Luego para Xo de 2000 ppm de glucosa:

Concentracin Inicial de 2000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 0,9497 1,0298 1,0454 1,0479 1,0482 1,047 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,004612282 0,005542709 0,005729074 0,005759072 0,005762674 0,005748269

Tabla 7: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 1000 ppm de glucosa [G].
Variacin de Q vrs t G inicial = 1000 ppm
0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 -0.001 0

Tabla 8: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 2000 ppm de glucosa [G].

Variacin de Q vrs t G inicial = 2000 ppm

0.007 0.006 0.005 Q (mol/Lt) 0.004 0.003 0.002 0.001 0 -0.001 0 5 10 15 20 25 30 35 [Q] = -6E-08t4 + 5E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 2E-05 R = 0.9977

Q (mol/Lt)

[Q] = -4E-08t4 + 4E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 3E-07 R = 0.9998 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

Tiempo (min)

Grfico 5: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

Grfico 6: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

= 4 108 4 + 4 106 3 1 104 2 + 1,4 103 + 3 107

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

= 6 108 4 + 5 106 3 1 104 2 + 1,4 103 + 2 105

(Ec. 6)

(Ec. 7)

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Luego para Xo de 3000 ppm de glucosa:
Concentracin Inicial de 3000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Absorbancia de Q 0 1,0934 1,2275 1,2559 1,2626 1,2646 1,2625 Concentracin de Q (mol/Lt) -0,000009 0,006310506 0,007967348 0,008317459 0,008399711 0,008424232 0,008398484

Derivando la Ec. 3:

= 1 109 4 8 108 3 + 2,1 106 2 2 105 + 8 105

(Ec. 9) Despus para obtener la velocidad de desaparicin de la glucosa hacemos la relacin de la estequiometria: 2

[]

Entonces podemos obtener la siguiente tabla evaluando para cada tiempo t:

Concentracin Inicial de 50 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,000080 0,000223 0,000420 0,000633 0,000840 0,001033 0,001220 Velocidad de G 1 x (M/min) 0,000160 0,000446 0,000840 0,001266 0,001680 0,002066 0,002440

Tabla 9: Variacin de la concentracin de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentracin inicial de 3000 ppm de glucosa [G].

Variacin de Q vrs t G inicial = 3000 ppm

0.01 0.008

Q (mol/Lt)

0.006 0.004 0.002 0 -0.002 0 [Q] = -7E-08t4 + 6E-06t3 - 0.0002t2 + 0.0019t + 2E05 R = 0.9991 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

Tabla 10: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 50 ppm de glucosa [G].

Grfico 7: Concentracin de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

Ahora si graficamos los datos obtenemos:

Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 50 ppm
3.0E-03 2.5E-03 2.0E-03 1.5E-03 1.0E-03 5.0E-04 0.0E+00 0 10 20 Tiempo (min) 30 40

= 7 108 4 + 6 106 3 2 104 2 + 1,9 103 + 2 105

(Ec. 8) Para conocer la velocidad de reaccin inicial debemos derivar la expresin obtenida de la regresin de curva de mejor ajuste y evaluarla en el tiempo 0, as:

Grfico 8: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

r de [G] -1 x (M/min)

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

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Luego, haciendo lo mismo para las dems concentraciones iniciales: Derivando la Ec. 5: Derivando la Ec. 4:

= 1,6 108 3 + 9 107 2 1,6 105 + 9 105

= 4 108 3 + 2,4 106 2 4 105 + 3 104

(Ec. 10)

(Ec. 11)

Concentracin Inicial de 100 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,000090 0,000031 0,000004 -0,000002 0,000002 0,000002 -0,000012 Velocidad de G 1 x (M/min) 0,000180 0,000061 0,000008 -0,000003 0,000004 0,000005 -0,000024

Concentracin Inicial de 500 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,000300 0,000155 0,000100 0,000105 0,000140 0,000175 0,000180 Velocidad de G -1 x (M/min) 0,000600 0,000310 0,000200 0,000210 0,000280 0,000350 0,000360

Tabla 11: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 100 ppm de glucosa [G].
Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 100 ppm
2.0E-04 r de [G] -1 x (M/min)

Tabla 12: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 500 ppm de glucosa [G].
Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 500 ppm
7.0E-04 6.0E-04 5.0E-04 4.0E-04 3.0E-04 2.0E-04 1.0E-04 0.0E+00 0 10 20 30 40

1.0E-04 5.0E-05 0.0E+00 -5.0E-05 0 10 20 Tiempo (min) 30 40

r de [G] -1 x (M/min)

1.5E-04

Grfico 8: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

Tiempo (min)

Grfico 9: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

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Introduccin a la

[Prctica 3: Cintica Enzimtica de la Glucosa-Oxidasa] Biotecnologa

Derivando la Ec. 6:

Derivando la Ec. 7:

= 1,6 107 3 + 1,2 105 2 2 104 + 1,4 103

= 2,4 107 3 + 1,5 105 2 2 104 + 1,4 103

(Ec. 12)
Concentracin Inicial de 1000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,001400 0,000680 0,000440 0,000560 0,000920 0,001400 0,001880 Velocidad de G 1 x (M/min) 0,002800 0,001360 0,000880 0,001120 0,001840 0,002800 0,003760

(Ec. 13)
Concentracin Inicial de 2000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,001400 0,000745 0,000660 0,000965 0,001480 0,002025 0,002420 Velocidad de G -1 x (M/min) 0,002800 0,001490 0,001320 0,001930 0,002960 0,004050 0,004840

Tabla 13: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 1000 ppm de glucosa [G].

Tabla 14: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 2000 ppm de glucosa [G].

Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 1000 ppm

4.0E-03 3.5E-03 3.0E-03 2.5E-03 2.0E-03 1.5E-03 1.0E-03 5.0E-04 0.0E+00 0 10 20 Tiempo (min) 30 40

Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 2000 ppm

6.0E-03 5.0E-03 4.0E-03 3.0E-03 2.0E-03 1.0E-03 0.0E+00 0 10 20 Tiempo (min) 30 40

r de [G] -1 x (M/min)

Grfico 10: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

r de [G] -1 x (M/min)

Grfico 11: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

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Introduccin a la

[Prctica 3: Cintica Enzimtica de la Glucosa-Oxidasa] Biotecnologa

Derivando la Ec. 8:

= 2,8 107 3 + 1,8 105 2 4 104 + 1,9 103

(Ec. 14)
Concentracin Inicial de 3000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 Velocidad de Q (M/ min) 0,001900 0,000315 -0,000580 -0,000995 -0,001140 -0,001225 -0,001460 Velocidad de G 1 x (M/min) 0,003800 0,000630 -0,001160 -0,001990 -0,002280 -0,002450 -0,002920

Ahora que tenemos las velocidades iniciales a diferentes concentraciones graficamos el inverso de las velocidades iniciales de reaccin (1/Vo) vrs la concentracin inicial de sustrato, que en este caso es la glucosa (1/[G]), para poder obtener los parmetros del modelo de reaccin de MichaelisMenten.
[Go] mol/Lt 0,000277778 0,000555556 0,002777778 0,005555556 0,011111111 0,016666667 - Vo M/min 0,000160 0,000180 0,000600 1 / [G] 3600 1800 360 - 1 / Vo 6250 5555,556 1666,667

Tabla 15: Velocidad de reaccin de aparicin de la quinoneimina [Q] y de conversin de la glucosa [G] en el tiempo para una concentracin inicial de 3000 ppm de glucosa [G].

0,002800 180 357,1429 0,002800 90 357,1429 0,003800 60 263,1579 Tabla 16: Inversos de la concentracin inicial de glucosa [Go] y de la velocidad inicial en funcin de la glucosa (Vo).

Velocidad de Reaccin d[G]/dt vrs t [G] inicial = 3000 ppm

6.0E-03 4.0E-03

1/Vo vrs 1/[G] de la Glucosa-oxidasa

8,000 7,000 6,000 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 0 -1000 -1,000 0

r de [G] -1 x (M/min)

-1/ Vo

2.0E-03

0.0E+00
-2.0E-03 0 -4.0E-03 10 20 Tiempo (min) 30 40

y = 1.8196x + 561.4 R = 0.8827

1000 1/[G]

2000

3000

4000

Grfico 12: Velocidad de reaccin en funcin de la glucosa versus el tiempo en minutos.

Grfico 13: Grfico de los inversos de velocidad vrs. los inversos de la concentracin inicial para obtener los parmetros de la Michaelis-Menten.

La grfica parece apegarse a la linealidad de groso modo debido a su varianza de 0,8827. Por tanto podemos suponer que el modelo elegido no dista de la realidad.

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Introduccin a la

[Prctica 3: Cintica Enzimtica de la Glucosa-Oxidasa] Biotecnologa

Con el intercepto en y (x=0) de la curva de ajuste podemos obtener el valor de la velocidad mxima de reaccin: 1 = 561,4 => = 0,00178 Luego con el intercepto en x (y=0) podemos adquirir el valor de la constante de reaccin de Michaelis-Menten: 1 561,4 = => = 0,00324 1,8196

Quedando totalmente definido el modelo para la reaccin Michaelis-Menten.

BIBLIOGRAFA
3,4,5 - Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUMICA DE HARPER; Mxico; Editorial El Manual Moderno; p.77-110. 2,4 - Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197. 1 - PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME PREPARATIONS IN FOOD MANUFACTURE; (Symposium, London,1959); Monograph No.11; Industrial Chemical Society; London.

Pginas de Internet consultadas: 5 - http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRA.pdf Consultada el da Jueves 27 de Mayo de 2010 a las 22:49 horas

1,3 - http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedicados/Quimica%20clinica/ 12503%20glucosa.pdf Consultada el da Sbado 29 de Mayo de 2010 a las 23:56 horas

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