Memorias del Curso-Taller Internacional

Patgenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

Othn Javier Gonzlez Gaona Filiberto Reyes Villanueva EDITORES

Memorias del Curso-Taller Internacional

Patgenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

Othn Javier Gonzlez Gaona Filiberto Reyes-Villanueva EDITORES

DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLOGICA INSTITUTO TECNOLGICO DE CIUDAD VICTORIA
Ciudad Victoria, Tamaulipas, Mxico. 2009

Memorias del Curso-Taller Internacional Patgenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA DR. CARLOS ALFONSO GARCA IBARRA DIRECTOR GENERAL

INSTITUTO TECNOLGICO DE CIUDAD VICTORIA ING. FRANCISCO RUVALCABA GONZLEZ DIRECTOR

CONSEJO TAMAULIPECO DE CIENCIA Y TECNOLOGA DR. JULIO MARTNEZ BULNES DIRECTOR

Memorias del Curso-Taller Internacional Patgenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

PRIMERA EDICIN D.R. LOS EDITORES DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA INSTITUTO TECNOLGICO DE CIUDAD VICTORIA Boulevard Emilio Portes Gil N 1301 Pte. Ciudad Victoria, Tamaulipas, Mxico. 87010

ISBN 03-2009-021013440600-01

Coordinacin Editorial: Othn Javier Gonzlez Gaona y Filiberto Reyes Villanueva

Colaboracin en la Edicin: M.C. Martha Isabel Benavides Martnez

Esta publicacin no puede ser reproducida, almacenada o transmitida en forma alguna ni por ningn medio electrnico, mecnico, qumico, ptico o de grabacin o fotocopia, sin permiso previo y por escrito de los autores.

Impreso por el Instituto Tecnolgico de Ciudad Victoria, El Consejo Tamaulipeco de Ciencia y Tecnologa, con el apoyo del FONDO MIXTO DE FOMENTO A LA INVESTIGACIN CIENTFICA. CONACYT-GOBIERNO DEL ESTADO DE TAMAULIPAS

Agradecimiento

La publicacin de estas memorias fue financiada por el Fondo Mixto de Fomento a la Investigacin Cientfica del CONACyT-Gobierno del Estado de Tamaulipas, mediante proyecto clave 055297- 2006-C11. A las autoridades de la Secretara de Salud del Estado de Tamaulipas, por financiar parcialmente los gastos para la asistencia de patlogos de insectos expertos de Canad, Estados Unidos de Amrica y Holanda, al Curso-Taller Internacional sobre Patgenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti y Aedes albopictus. A las autoridades del Instituto Tecnolgico de Ciudad Victoria (ITCV): Ing. Francisco Rubalcaba Gonzlez e Ing. Gaspar Nolasco Antonio, Director y Subdirector Acadmico respectivamente, por el apoyo y facilidades para el evento y la terminacin de estas memorias. Al Dr. Jorge Horta Vega, por su entusiasta apoyo a este evento Curso-Taller, en su calidad de Jefe de la Divisin de Estudios de Postgrado e Investigacin del ITCV. A la C. M.C. Martha Isabel Benavides Martnez por la revisin ortogrfica y forma. A los autores quienes con sus aportaciones al conocimiento de los patgenos del dengue se debe este libro.

PRLOGO
La circulacin de los cuatro serotipos del virus del dengue, ms las abundantes poblaciones de su vector primario, el mosquito Aedes aegypti en todo el pas y la presencia de poblaciones del vector secundario, A. albopictus en el noreste y sur del territorio nacional, crean las condiciones ideales para que anualmente se presenten epidemias de esta enfermedad en Mxico. El dengue es una arbovirosis reemergente en toda Amrica Latina, y nuestro pas es endmico para este problema, dados los altos ndices de mortalidad y morbilidad que ocasiona en la sociedad. Este escenario existe porque los programas de control vectorial slo se basan en la aplicacin de insecticidas qumicos contra ambos transmisores y en la educacin comunitaria. Los qumicos, aparte de ser caros, se aplican de una manera desorganizada espacialmente, y no garantizan el 100% de mortalidad porque ya hay poblaciones resistentes del vector a estos productos. Por otro lado, la comunidad se muestra aptica para ser educada en la aplicacin de medidas preventivas en los grandes centros urbanos. Lo anterior, ms la ausencia de cursos sobre combate vectorial mediante microorganismos patgenos y parsitos de ambos vectores, en las universidades y centros de educacin superior en Mxico, fueron los factores que motivaron la organizacin del Curso-Taller Internacional sobre Control Microbiano de los Vectores del Dengue, Aedes aegypti y Aedes albopictus, por parte de Instituto Tecnolgico de Cd. Victoria celebrado del 6 al 8 de Octubre de 2006 en esta ciudad del estado de Tamaulipas, Mxico. El propsito de este evento fue el de concentrar a expertos mundiales sobre patgenos de mosquitos, para actualizar en esta especialidad, a todos aquellos estudiantes y profesionales que se desempean en el rea de la salud pblica, y dar a conocer nuevas alternativas de control del vector, ms eficientes, ms econmicas y ms amigables ecolgicamente. sta es una compilacin de las presentaciones de los expertos participantes. Tenemos la esperanza de que estas memorias funcionen como fuente bibliogrfica educativa y plataforma para que a un futuro inmediato, se incentive la investigacin y conduccin de proyectos sobre parsitos y patgenos para regular y controlar a los vectores del dengue en Mxico.

Dr. Filiberto Reyes Villanueva Cd. Reynosa, Tamaulipas, Mxico Octubre, 2009

I. Aedes aegypti , Aedes albopictus y el Dengue: Una Amenaza para la Salud Pblica en Amrica Latina
Filiberto Reyes-Villanueva1 y Gary S. Clark2
1

Instituto Politcnico Nacional. Centro de Biotecnologa Genmica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elas Pia. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, Mxico. Email: frv65@hotmail.com 2 Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, USDA/ARS/CMAVE, Gainesville, Fl, 32604, P.O. Box 14565, USA. E-mail: Gary.Clark@ars.usda.gov

1.1 Introduccin e Historial Epidemiolgico La palabra Dengue tiene su origen en el dialecto africano swahili: ki denga pepo (enfermedad causada por malos espritus) (Seijo 2001). Es una enfermedad causada por un Flavivirus de cadena simple de ARN con una fuerte variacin expresada en la existencia de cuatro serotipos: DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 y por la consecuente ausencia de una vacuna. La circulacin de los cuatro serotipos facilita la ocurrencia de infecciones repetidas en la misma persona, ocasionando as el cuadro clnico mortal del dengue hemorrgico. Las cuatro variantes virales son transmitidas por el mosquito Aedes aegypti como vector primario (Fig. 1), y por A. albopictus como vector secundario a nivel mundial (Gubler 1988).

Fig. 1. El mosquito Aedes aegypti, vector primario del Dengue a nivel mundial. En los aos 40s y 50s, 21 pases latinoamericanos lograron la erradicacin de A. aegypti, empero la falta de recursos y/o el abandono de las campaas trajeron como resultado la reinfestacin y se perdi el esfuerzo realizado en aos anteriores. En 1985, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) intent revitalizar la lucha contra el vector, pero la situacin del dengue y del dengue hemorrgico empeor. Para los 90s, prcticamente todos los pases ya estaban infestados de nuevo por el vector (Fig. 2) y el dengue adquiri otra vez

el status de un grave problema para la salud pblica (Gubler y Clark 1995). Segn datos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), ms de 100 pases han sido afectados por epidemias de dengue o de dengue hemorrgico. Anualmente ocurren ms de 50 millones de casos de ambos tipos de dengue, con alrededor de 500,000 hospitalizaciones y 20,000 defunciones. Las tasas de ataque llegan a 64 por 1,000 habitantes y los nios constituyen el 95% de los casos (Halstead 1992). Adems del sufrimiento que produce la enfermedad, su control es costoso y las epidemias tienen un efecto negativo importante en el desarrollo socioeconmico de los pases. En las Amricas, la reemergencia de esta enfermedad se empez a manifestar en los aos 60s con epidemias en Venezuela, Jamaica y Puerto Rico. A fines de los 70s el dengue se reintrodujo en forma pandmica que afect a El Salvador, Guatemala, Honduras, Mxico, y en Texas en los Estados Unidos de Amrica (Rigau-Perez et al. 1994). De 1978 a 1980 se notificaron 700,000 casos, pero se estima que la pandemia afect a muchas ms personas, probablemente a varios millones. En los 80s hubo varias epidemias importantes en pases endmicos y el DEN-1 se expandi hacia Sudamrica, con brotes en Bolivia, Brasil, Ecuador, Paraguay y Per, pases que haca muchos aos no experimentaban la enfermedad o que jams la haban notificado. En esos brotes enfermaron millones de personas y algunas murieron. Costa Rica y Panam, los dos ltimos pases tropicales infestados por A. aegypti pero exentos de dengue, informaron en 1993 que en sus territorios ya haba comenzado la transmisin autctona de la enfermedad (Pinheiro y Corber 1997).

Fig. 2. Distribucin de la infestacin de Aedes aegypti en los pases Latinoamericanos desde antes de 1981 hasta 1995 (Modificado de Gubler y Clark 1995). En 1994 se introdujo el DEN-3 en la regin. Ese serotipo fue detectado simultneamente en Panam y Nicaragua, y en este ltimo pas se origin una epidemia de dengue y dengue hemorrgico (CDC 1995). En 1995, el DEN-3 se disemin a otros pases de Centroamrica excepto Belice y Mxico. Debido a que el DEN-3 no circulaba en las Amricas desde 1978 (16 aos de ausencia), se estim que hay 200 millones de personas susceptibles en riesgo en las reas infestadas por A. aegypti y que exista el peligro de grandes epidemias. En 1995 fuertes epidemias de dengue azotaron Centroamrica, el Caribe y Suramrica (Brasil, en particular) y 41 pases informaron de 284,483 casos, o sea, la mayor incidencia de dengue desde 1981. En 1996 se registraron 250,707 casos, de los cuales alrededor de 80% correspondieron a Brasil (OPS 1995, Pinheiro y Corber 1997).

Puede afirmarse que hoy da en Mxico existen condiciones epidemiolgicas y sociales similares a las que favorecieron el agravamiento del dengue hemorrgico en Asia durante los 50s. No obstante, podemos decir que ahora es peor por los procesos de invasin que est llevando a cabo el vector secundario A. albopictus. En el noreste, este vector ya tiene poblaciones bien establecidas en las principales ciudades fronterizas como Piedras Negras en Coahuila, Nuevo Laredo, Reynosa y Matamoros en Tamaulipas, y en 22 municipios de Nuevo Len (Jorge Orta Pecina, Secretaria de Salud de Nuevo Len, comunicacin personal). El vector ya est bien establecido en Tapachula, Chiapas, y todo indica que se va dispersando hacia el norte por el corredor de la zona del Soconusco (Rogelio Danis Lpez, INSP, comunicacin personal). Es decir, se encuentran altas densidades de ambos vectores junto con la circulacin de los cuatro serotipos del virus y hacinamiento de poblaciones humanas marginadas en los cinturones de pobreza de las grandes ciudades. La primera y ms grave epidemia de dengue hemorrgico en las Amricas fue causada por DEN-2 en Cuba en 1981. Se notificaron 344,203 casos de dengue y dengue hemorrgico, incluidos 10,312 casos graves y 158 defunciones (Gubler y Trent 1994). La segunda epidemia ms importante ocurri en Venezuela de 1989 a 1990, con 5,990 casos y 70 muertes. En esa ocasin circularon los serotipos DEN-1, DEN-2 y DEN-4, pero en los casos mortales se detect solamente el DEN-2. Alrededor del 66% de los casos y defunciones por dengue hemorrgico en Cuba y Venezuela ocurrieron en menores de 14 aos. La extensa difusin del dengue hemorrgico que ha tenido lugar desde la epidemia de Cuba en 1981 es muy preocupante. Hasta 1996 se notificaron casos todos los aos, con excepcin de 1983. En ese perodo, 25 pases registraron 41,669 casos de dengue hemorrgico (Gubler y Clark 1994). La creciente hiperendemicidad del dengue, con la circulacin de los cuatro serotipos, constituye un serio factor de riesgo para que la situacin llegue a agravarse an ms (Lancioti et al. 1994).

1.2 Algunas Fallas en la Situacin Actual de los Programas de Control de Aedes aegypti A lo largo de los aos, las actividades de los pases contra A. aegypti se han visto obstaculizadas por factores econmicos, polticos, sociales y administrativos de distintos grados de complejidad. Uno de los problemas principales ha sido la falta de aplicacin de medidas de prioridad oficial a la prevencin y el control del dengue. Las actividades de lucha contra el vector no se han sostenido de forma apropiada debido a que no se han institucionalizado los programas, no hay integracin intra ni intersectorial y no se ha logrado la participacin de las comunidades (Snchez et al. 2004). La mayora de los programas se han incorporado a los ministerios de salud como servicios de A. aegypti o se han combinado con los de malaria o de control de vectores. Por lo general hay poca o nula comunicacin y colaboracin entre programas y otras entidades relacionadas, sean gubernamentales, no gubernamentales o universidades y centros de investigacin. Los programas son dirigidos por profesionales de la medicina con escaso o nulo conocimiento en bionoma de vectores, y de ah la explicacin de algunas fallas principalmente las asociadas al uso de insecticidas qumicos. Las fallas existen porque un medico debe trabajar en equipo con personal con perfil en entomologa mdica a nivel posgrado, lo cual lamentablemente no ocurre. Adems, el personal recibe poco adiestramiento y no lleva a cabo investigaciones operacionales. La principal medida contra el vector es la aplicacin de insecticidas. Errnea y frecuentemente se aplican larvicidas a recipientes que podran destruirse o removerse y encima de eso se usan excesivamente los adulticidas a ultrabajo volumen (UBV) en las reas donde no hay transmisin de dengue. Estas fallas obedecen a que la aplicacin de insecticidas qumicos no

se ha diseado sobre un esquema de muestreo estadstico de las poblaciones larvales y de adultos del vector a nivel urbano, para poder aplicar un control qumico estratificado espacialmente y sistematizado estacionalmente, sobre focos endmicos perfectamente caracterizados. Adems, el control qumico es til para la supresin de epidemias, pero no es apropiado para el control vectorial (PAHO 1994). En la mayora de los pases, las estrategias propuestas y los recursos asignados han sido inadecuados e insuficientes para llevar a cabo programas de lucha con miras a la erradicacin de A. aegypti. El control y la erradicacin, a veces considerados indistintamente, son dos estrategias con metodologas y metas diferentes. La erradicacin implica cobertura universal de todos los criaderos del mosquito en todas las casas de todas las localidades infestadas en el pas, hasta eliminar totalmente el vector y montar vigilancia permanente contra la reinfestacin. Esto se realiza en cuatro fases consecutivas: preparatoria, de ataque, de consolidacin y de mantenimiento. Los pases suelen avanzar a ritmo distinto de una fase a otra, ya que ello depende de las condiciones locales y de los recursos disponibles. El costo inicial de esta estrategia es alto, pero una vez eliminado el mosquito, los gastos en vigilancia contra la reinfestacin son mucho menores y se evita totalmente la transmisin. Por otro lado, la estrategia de control es el uso eficiente de recursos limitados para evitar epidemias y mortalidad. Los esfuerzos se concentran en las zonas determinadas de mayor riesgo para reducir, pero no erradicar, al vector. El costo de la estrategia de control es menor que el de la fase de ataque de la erradicacin, pero mayor que el de la fase de mantenimiento o vigilancia contra la reinfestacin. Despus de algunos aos en marcha, la estrategia de control puede costar ms que la de erradicacin (OPS 1995).

1.3 El Plan Continental de la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) versus Aedes aegypti El control de recipientes artificiales como los envases desechables, llantas y barriles donde se cra el mosquito A. aegypti es la piedra angular para prevenir el dengue. Sin embargo, junto con el control de los criaderos, hay que implantar el saneamiento ambiental, la participacin social, la comunicacin, la educacin para la salud, el control qumico y el control biolgico. Por lo tanto, una estrategia efectiva exige el concurso de varias disciplinas, tales como la entomologa, la ingeniera, la psicologa, la comunicacin y la educacin sanitarias as como la sociologa y antropologa mdicas. Desde luego, cualquier accin tiene que fundamentarse en el conocimiento de la distribucin de los criaderos principales de una localidad y de los factores que contribuyen a su existencia. Al mismo tiempo, hay que asegurarse de la calidad de los servicios bsicos de saneamiento ambiental y modificar el comportamiento humano (Lloyd et al. 1992). Entonces, hay que aclarar que el combate qumico es slo un componente complementario a la eliminacin de los criaderos de A. aegypti.

1.4 Saneamiento Ambiental Las actividades de saneamiento, que en este caso se refieren a la eliminacin de criaderos del vector, tienen que ver principalmente con el control del agua y de los residuos slidos. En lugares donde no hay suministro de agua a domicilio o el agua es de mala calidad, es comn almacenar agua en tanques, barriles y otros recipientes, en los que pueden producirse grandes cantidades de mosquitos. De igual modo, cuando la recoleccin de basura es irregular o deficiente, la acumulacin de materiales desechados en los patios como latas, botellas y llantas, en los que se

acumula el agua de lluvia, provee una variedad de criaderos para los mosquitos. Se necesita tambin prestar atencin a los recipientes y llantas abandonados en reas pblicas y en basureros improvisados a orillas de los ros y carreteras, as como en los almacenamientos de materiales para algunas industrias, por ejemplo la de renovacin de llantas (Leontsini et al. 1993). En un programa de eliminacin de A. aegypti, las principales medidas de saneamiento son mejorar el sistema de abastecimiento de agua, manejar adecuadamente la recoleccin y el reciclaje de desechos slidos, eliminar los criaderos artificiales y naturales, y gestionar el sistema de vigilancia ambiental. Otras obras importantes relacionadas son arreglar el alcantarillado y el drenaje urbano y controlar los roedores. Por supuesto que stas deben ser consideradas medidas fundamentales para mejorar la calidad de vida de la poblacin y no slo para controlar endemias. Segn datos de la OPS, en 1997 en Amrica Latina, el 80% de los municipios de zonas urbanas contaban con agua potable, y un porcentaje igual tena recoleccin de basura, pero slo el 59% tena eliminacin adecuada de los desechos urbanos como criaderos potenciales de A. aegypti. Estas cifras son slo aproximaciones, ya que en cada pas varan las coberturas de servicios y los elementos involucrados en la formacin de criaderos, segn las condiciones locales. Adems, los datos municipales no significan necesariamente que dentro de cada uno de ellos, todas las casas tengan los servicios de agua y recoleccin de basura.

1.5 La Participacin y Comunicacin Social La participacin de una comunidad debe formar una parte integral y continua de cualquier programa de lucha contra A. aegypti, sobre todo de los componentes de saneamiento ambiental y control qumico. Esta participacin requiere una comunicacin continua entre las comunidades y el personal encargado de ejecutar el programa, con objeto de poner en marcha actividades tendientes a modificar los comportamientos humanos que propician la proliferacin y el mantenimiento de criaderos potenciales de A. aegypti. Los criaderos no pueden eliminarse con slo mejorar los servicios bsicos; tambin es esencial modificar las prcticas y comportamientos humanos que favorecen su existencia. En muchos casos, esas prcticas se relacionan con el aprovisionamiento de agua, ya sea la de uso domstico, que se acumula en materiales desechados como llantas, botellas y latas; a la que se mantiene en bebederos para los animales domsticos, y la que se estanca en recipientes que contienen plantas (Fernndez et al. 1998, Sanders et al. 2004). Tambin es importante contar con la participacin de personas influyentes de alta credibilidad, como veterinarios y botnicos. La colaboracin del sector privado es importante. ste puede patrocinar programas de comunicacin y actividades comunitarias, poner mensajes o instrucciones en las latas, platos para plantas y otros productos que suelen convertirse en criaderos, y promover el reciclaje de materiales y el uso de productos antimosquitos, como larvicidas, tapas para barriles y tela metlica (Lloyd et al. 1992).

1.6 El Control Qumico Junto con la participacin comunitaria, el tratamiento qumico focal por trabajadores de salud es la operacin fundamental de la fase de ataque de un programa contra A. aegypti. Cada trabajador debe inspeccionar las reas peridomiciliares y el interior de las viviendas y aplicar larvicidas en los depsitos de agua que no se hayan podido destruir o eliminar. Debe

emplearse una cantidad mnima de un insecticida seguro, con un grado de toxicidad muy bajo, que no represente un peligro de contaminacin para el ambiente. Los trabajadores de salud, adems del tratamiento focal, tienen la tarea de educar a los moradores en la forma de colaborar para que el larvicida surta el efecto esperado (OPS 1995).

1.7 Control de Emergencias Durante los brotes epidmicos, como medida de emergencia es importante utilizar compuestos qumicos que eliminen a los mosquitos adultos. Por lo tanto, cada programa debe mantener en buen estado algunas unidades de equipo pesado porttil e insecticidas. Las aplicaciones de insecticidas fros (de ultrabajo volumen) o calientes (por nebulizacin trmica) son las medidas adecuadas para disminuir rpidamente la densidad del mosquito dando muerte a las hembras infectadas e infecciosas. Los insecticidas se aplican desde la calle, con las mquinas instaladas sobre vehculos. Deben aplicarse en ciclos de corta duracin (de 3 a 5 das) que se repitan sucesivamente hasta que haya una disminucin estable del nmero de enfermos en la zona. Esos tratamientos espaciales a volumen ultrabajo son apropiados para reas urbanas en ciudades de tamao mediano o grande, con calles planas pavimentadas. En las reas inaccesibles al vehculo, se realizan aplicaciones con equipo porttil como medida de apoyo a las aplicaciones con equipo pesado. Los tratamientos se llevan a cabo dentro de todas las habitaciones de las casas, en los patios y corrales. Otro tratamiento adulticida de emergencia se aplica en el exterior e interior de los recipientes que no se pueden destruir, como apoyo al tratamiento con larvicidas. Se usa insecticida de efecto residual en forma de suspensin en las zonas de mayor densidad del vector (Guzmn y Kouri 2002).

1.8 La Vigilancia Entomolgica Esta actividad tiene cuatro metas: 1) establecer los ndices de infestacin o reinfestacin en cada localidad, 2) determinar la importancia relativa de los diferentes tipos de recipientes como criaderos de mosquitos, 3) investigar la presencia de otros vectores (como Aedes albopictus) que representan factores de riesgo en la transmisin del dengue, y 4) vigilar el grado de susceptibilidad de los mosquitos Aedes a los insecticidas. La vigilancia entomolgica se realiza en dos etapas. En la primera es preciso conocer la distribucin espacial de los mosquitos a fin de definir el riesgo de transmisin del dengue. En la segunda etapa se establecen los mtodos de vigilancia para determinar los grados de infestacin y detectar nuevas infestaciones. Los mtodos principales de vigilancia son la inspeccin de casas y el empleo de ovitrampas y larvitrampas (OPS 1995). Con el primer mtodo se examinan todos los recipientes dentro y fuera de las casas y se hace una identificacin microscpica de las lar-vas encontradas. Los resultados se expresan como el ndice de casas (porcentaje con estadios larvarios de A. aegypti) y el ndice Breteau (nmero de recipientes infestados por cada 100 casas inspeccionadas). Las ovitrampas son recipientes con agua colocados por los inspectores en las casas para atraer a los mosquitos a depositar huevos en ellos. Se hacen comnmente con secciones radiales de llantas y frascos de plstico o de vidrio. Son especialmente tiles para detectar nuevas infestaciones o reinfestaciones y resultan econmicas en funcin del tiempo que invierten en ello los inspectores. Los resultados se expresan como un porcentaje de las trampas positivas. Para determinar el grado de infestacin, no es necesario inspeccionar todas las casas de una localidad. Segn las indicaciones publicadas por la OPS, dependiendo del tamao del rea donde se realiza la

encuesta y la precisin deseada en el ndice, se puede tomar una muestra generalmente de 10 a 33% de las casas distribuidas uniformemente en el lugar (OPS 1995). Para detectar nuevas infestaciones, se visitan peridicamente los lugares con mayor probabilidad de convertirse de nuevo en focos de infestacin para el resto del lugar, como cementerios, talleres de cambio de llantas y cementerios de automviles (Kittayapong y Strickman 1993).

1.9 La Vigilancia Epidemiolgica El objetivo de este sistema es la deteccin temprana de casos de dengue de manera que puedan aplicarse medidas de control lo ms rpido posible, para interrumpir la transmisin y prevenir epidemias. Para ello es necesario realizar bsquedas activas de casos y estudios epidemiolgicos. En todo ello se ha de tener en cuenta la situacin epidemiolgica particular de la zona de que se trate. De acuerdo a la OPS (OPS 1995) las etapas de vigilancia epidemiolgica son: Sistematizar y dar prioridad a la vigilancia activa como instrumento principal en la deteccin temprana de casos o brotes epidmicos. Fortalecer la vigilancia activa en todas las instituciones de salud, estatales y privadas, locales y municipales, con personal debidamente capacitado. Establecer puntos o centros centinela para vigilar la enfermedad y conocer los serotipos que circulan. Es especialmente importante poder reconocer el serotipo DEN-3 del dengue en las zonas donde no se haba detectado antes. Actualizar los conocimientos del personal mdico de los diversos niveles de atencin de la salud para que perfeccione su capacidad de diagnstico diferencial, clasificacin clnica y tratamiento del dengue. Hacer anlisis integrales del curso de los sndromes febriles y de la situacin entomolgica local para intensificar la bsqueda activa de casos. Estratificar las diferentes zonas urbanas por factores de riesgo basados en la densidad poblacional de larvas y adultos del vector, la distribucin espacial de los casos que se hayan presentado, el saneamiento ambiental, el abastecimiento de agua y los antecedentes de dengue. Aplicar las normas tcnicas divulgadas por la OPS para consolidar la vigilancia serolgica y virolgica de casos sospechosos. Informar a los centros locales de los resultados de laboratorio. Incrementar la cobertura y mantener el control de la calidad de la red de laboratorios y des-centralizar el diagnstico serolgico teniendo en cuenta las caractersticas epidemiolgicas, de comunicaciones, de las vas de acceso y socioeconmicas de cada pas. La vigilancia epidemiolgica requiere la bsqueda activa y toma de muestras de casos febriles o comprobacin del diagnstico clnico en las comunidades, acompaada de informacin sobre el inicio de la fiebre y el lugar de residencia de cada paciente. Las

muestras tienen que procesarse en el laboratorio para identificar el serotipo viral infeccioso y para que sea inmediata la notificacin a los centros de atencin mdica. La vigilancia epidemiolgica se apoya en la entomolgica para determinar el tipo de mosquito presente. Adems, exige investigacin sobre los mejores mtodos de control del dengue para las distintas localidades y estudios de factores sociales que influyen en el comportamiento de la comunidad ante los criaderos de mosquitos, situaciones de alerta epidemiolgica, etc. La ejecucin adecuada de la vigilancia requiere sistemas de informacin y adiestramiento del personal involucrado en diagnstico clnico, tcnicas de laboratorio, tratamiento de casos y otros aspectos. La evaluacin peridica es esencial para mantener el nivel de excelencia (OPS 1998).

1.10 Conclusiones El dengue, es una enfermedad viral con variacin gentica manifiesta en cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) los cuales, al circular conjuntamente, permiten la ocurrencia de infecciones repetidas en la misma persona, ocasionando el cuadro clnico mortal de dengue hemorrgico. Las cuatro variantes son transmitidas por Aedes aegypti como vector primario y Aedes albopictus como secundario. En los pases Latinoamericanos, el abandono de las campaas contra esta enfermedad provoc a partir de los 60s, la reinfestacin de A. aegypti y con ello el resurgimiento de este problema de salud pblica. Actualmente esta situacin tiende a agravarse, dadas las altas densidades del vector, aunado a la circulacin de los cuatro serotipos y el hacinamiento de poblaciones marginadas que viven en condiciones de pobreza e insalubridad generando as las condiciones epidemiolgicas para ello. Consecuencia aparte, es el efecto negativo en el desarrollo socioeconmico de los pases. A. albopictus ya est bien establecido en el noreste de Mxico, en Tamaulipas y Nuevo Len; y todo indica que su invasin proveniente de U.S.A. seguir expandindose hacia lo largo de la costa del Golfo de Mxico. El vector tambin se encuentra en Chiapas, a donde llego proveniente de Guatemala. La presencia de este vector significa un factor que viene a complicar ms la situacin epidemiolgica del dengue, porque es altamente competente para transmisin transovarica del virus. El plan contra A. aegypti debe ser integral. Considerando que el uso de insecticidas es slo complementario, debe realizarse ste de manera sistematizada y en base a un programa de muestreo del vector con tamaos de muestra optimizados a niveles conocidos de probabilidad. El muestreo puede hacerse con ovitrampas, captura de adultos (media aritmtica), % de recipientes positivos para larvas o pupas por cuadra, pero enfocando la medida como el estadstico p de la distribucin binomial para poder inferir con poder probabilstico sobre los parmetros del vector y su estratificacin poblacional; y esto hasta la fecha no existe. El uso de los ndices aedicos ha sido la medida clsica poblacional para A. aegypti pero no son confiables. Ya existen estudios serios en la literatura en donde se ha demostrado que estos ndices no estn correlacionados con la fluctuacin poblacional de adultos del vector. Esto se debe a que los ndices fueron diseados para la fiebre amarilla, y se extrapolaron empricamente para usarlos con dengue. Hacen falta estudios para muestreo estadstico de las poblaciones de A. aegypti y A. albopictus.

Una vez que se tengan estos programas de muestreo estadstico del vector, ya se podrn estimar poblaciones o densidades criticas por localidades y ciudades, para monitoreo del vector, deteccin temprana de casos de dengue, eficacia del control qumico por zonas o colonias, susceptibilidad a insecticidas y otras medidas adecuadas para prevenir una epidemia.

1.11 Literatura Citada Centers for Disease Control and Prevention. 1995. Dengue type 3 infection-Nicaragua and Panama, October-November 1994. MMWR 44:21-24. Fernndez EA, Leontsini E & Sherman C. 1998. Trial of a community-based intervention to decrease infestation of Aedes aegypti mosquitoes in cement washbasins in El Progreso, Honduras. Acta Tropica 70: 171-183. Gubler DJ. 1988. Dengue. In: Monath TPM (ed.) Epidemiological of Arthropod-Borne Viral Disease. Boca Raton (FL), CRC Press, 380 p. Gubler DJ & Clark GG. 1994. Community-based integrated control of Aedes aegypti: a brief overview of current programs. Am J Trop Med Hyg 50: 50-60. Gubler DJ & Trent DW. 1994. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas. Infect Agents Dis 2: 383-393. Gubler DJ & Clark GG. 1995. Dengue/dengue hemorrhagic fever: The emergence of a global health problem. Emerg Infect Dis 2: 55-57. Guzmn MG & Kouri G. 2002. Dengue: an update. The Lancet Infect Dis 2: 33-42. Halstead SB. 1992. The XXth century dengue pandemic: need for surveillance and research. Rapp Trimest Statist Sanit Mondo 45:292-298. Kittayapong P & Strickman D. 1993. Three simple devices for preventing development of Aedes aegypti larvae in water jars. Am J Trop Med Hyg 49: 158-165. Lanciotti RS, Lewis JG, Gubler DJ & Trent DW. 1994. Molecular evolution and epidemiology of dengue-3 viruses. J Gen Virol 95: 65-75. Leontsini E, Gil E, Kendall C & GG Clark. 1993. Effects of a community-based Aedes aegypti programme on mosquito larval production sites in El Progreso, Honduras. Trans Royal Soc Trop Med Hyg 87: 267-271. Lloyd LS, Winch P, Ortega-Canto J & Kendall C. 1992. Results of a community-based Aedes aegypti control program in Merida, Yucatan, Mexico. Am J Trop Med Hyg 46: 635-642. OPS. 1995. Dengue y Dengue Hemorrgico en las Amricas: Guas para su Prevencin y Control. Washington DC: Organizacin Panamericana de la Salud (Publicacin cientfica 548).

OPS. 1998. Plan continental de ampliacin e intensificacin del combate a Aedes aegypti. Pan Am J Public Health 2: 124-130. PAHO. 1994. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: guidelines for prevention and control. Scient Pub. 548: 29-30. Pinheiro FP & Corber SJ. 1997. Global situation of dengue hemorrhagic fever, and its emergence in the Americas. WHO Statist Quart 50: 161-169. Rigau-Perez JG, Gubler DJ, Vorndam AV & Clark GG. 1994. Dengue surveillance United States, 1986-1992. MMWR 43: 7-19. Snchez L, Prez D, Cruz G, Silva LC, Boelaert M & Vander SP. 2004. Community participation in the control of Aedes aegypti: opinions of the populations in one section of Havana, Cuba. Rev Panam Salud Public a 15: 19-25. Seijo A. 2001. El dengue como problema de salud pblica. Arch Argent Pe diatr 99: 510-521.

II. Competencia Vectorial de Aedes aegypti: El Vector del Dengue

Filiberto Reyes-Villanueva
1

Instituto Politcnico Nacional. Centro de Biotecnologa Genmica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elas Pia. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, Mxico. Email: frv65@hotmail.com

2.1 Introduccin El dengue es la arbovirosis ms importante en las Amricas por su resurgencia marcada en las ltimas dcadas (Seijo 2001). Es causada por un Flavivirus de cadena simple de ARN muy variable y definido en cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 Y DEN-4) para los cuales no existe vacuna. Todos ellos producen la fiebre de dengue clsico (FD), mientras que las infecciones secundarias asociadas al DEN-2 (Monath 1995) producen la expresin grave y letal conocida como fiebre hemorrgica del dengue (FHD) (Gubler 2006). El virus es primitivo y se especula que originalmente era patgeno de mosquitos para despus adaptarse a los primates y al hombre (Gubler 1997). Se ha estimado que el 20% de la poblacin mundial est en riesgo de infeccin, con una incidencia de 100 millones de casos de FD y 250,000 de FHD (Monath 1995). Estas incidencias ocasionan la muerte de hasta 10,000 nios anualmente debido al FDH (Rico-Hesse et al. 1997). En Mxico, dado que circulan los 4 serotipos (Ibez-Bernal et al. 1997) y que el vector primario Aedes aegypti est ampliamente distribuido, la situacin tambin es muy grave con ms de 30,000 casos por ao. En el noreste, el nmero de casos fue de 5,000 en Nuevo Len en el 2003, en el 2005 rebas los 10,000 en Tamaulipas, y en el 2007 hubo 5,000 casos en Nuevo Len, con al menos 500 de FDH (MMWR 2008). 2.2 La Competencia Vectorial de Aedes aegypti Aedes aegypti transmite horizontal y verticalmente los cuatro serotipos del virus DEN y en Mxico ya circulan todos (Gunther et al. 2007). Desde 1899, Carlos Finlay propuso que el virus de la fiebre amarilla era transmitido verticalmente por A. aegypti (Finlay 1899). Los primeros reportes comprobados para el DEN datan desde 1983, cuando fue identificado en el sureste de Asia (Burma) y en Trinidad y Tobago para Amrica Latina, donde aislaron el virus a partir de larvas de A. aegypti colectadas en casas donde haban ocurrido casos recientes de dengue (Khin y Than 1983, Hull et al. 1984). En Mxico, ya se report la transmisin vertical (no se sabe si es transovum o transovarica) de los serotipos 2, 3 y 4 que fueron aislados de adultos recin emergidos de larvas colectadas en dos zonas endmicas de Oaxaca; es un estudio reciente y el nico en la literatura para A. aegypti en Mxico (Gunther et al. 2007). Esta transmisin vertical es una adaptacin del virus al vector para sobrevivir los perodos interepidmicos o el invierno, por lo que A. aegypti es el reservorio natural del virus (Tesh 1984). Y esto ya fue demostrado en laboratorio cuando el virus fue mantenido hasta la 7 generacin en A. aegypti con una tasa de infeccin vertical de 15% (Cuadro 1) (Joshi et al. 2002). La susceptibilidad del vector a la infeccin viral est asociada a las tasas de transmisin vertical que presente una determinada poblacin. A mayor transmisin

vertical la susceptibilidad del vector a la infeccin se incrementa (Mourya et al. 2001). Por lo tanto, A. aegypti es el vector primario del dengue a nivel mundial por su capacidad de transmisin ms sus hbitos altamente antropoflicos, endofgicos y endoflicos (Hawley 1988). Ahora bien, la competencia vectorial se define como la capacidad innata de un vector para infectarse con un patgeno, permitir su reproduccin y/o replicacin en l y luego transmitirlo eficientemente hacia la poblacin husped expuesta, y es una expresin de factores intrnsecos y extrnsecos respecto al vector (Hardi et al. 1983). Cuando una hembra queda infectada por una picadura sobre una persona viremica y que despus se torna infecciosa, es el resultado de la interaccin de la estructura gentica del mosquito, del serotipo viral, la respuesta inmune del humano virmico sobre el cual el mosquito se aliment, ms el efecto potencial del ambiente. Cuadro 1. Mosquitos Positivos (%) para el Virus Dengue en Siete Generaciones Sucesivas de Aedes aegypti* (Tomado de Joshi et al. 2002). Machos Nmeros positivos Probados (%) 123 3 (2.4) 158 12 (7.6) 258 22 (8.5) 122 8 (6.6) 154 14 (9.1) 145 13 (9.0) 157 16 (10.2) Hembras Nmeros positivos positivo Probados (%) 167 5 (3.0) 144 14 (9.7) 173 34 (19.7) 125 21 (16.8) 166 23 (13.9) 120 18 (15.0) 176 26 (14.8)

Total (%) 2.8 8.6 13.0 11.7 11.6 11.7 12.6

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

* P = 0.0088 por la prueba exacta de Fisher, en donde la proporcin de machos y hembras fueron comparadas

El tiempo (das) que transcurre desde la ingesta de sangre virmica hasta que el virus infecta glndulas salivales, se conoce como Perodo de Incubacin Extrnseca (PIE) (Fig. 2), mientras que los das que transcurren entre dos alimentaciones a replecin o bien entre dos oviposiciones, se llama ciclo gonotrfico (CG) (Clements 1992). Cuando existe una congruencia de una sola comida de sangre-una oviposicin para un CG, se dice que ese mosquito posee concordancia gonotrfica y es concordante. Si no exhibe esa tendencia o hay varias alimentaciones parciales o completas (pregravidez) o bien varias oviposiciones, se ha propuesto el concepto de discordancia gonotrfica y el mosquito es discordante (Swelengrebel 1929, Rao 1947, Gillies 1955). A. aegypti es un mosquito discordante porque la ingestin de comidas mltiples ya est bien documentada en la literatura desde hace mucho tiempo (MacDonald 1956). Puede ingerir hasta 5 l de sangre pero si ingiere 2 l o menos, la hembra va a digerir la sangre en 36-48 h y se tornar hambrienta nuevamente (Klowden 1994). Procesando hembras histolgicamente se ha registrado una alta incidencia de comidas mltiples parciales (Scott et al. 1993). Tambin se sabe que la longitud alar se relaciona directamente con el volumen de sangre ingerida y que cuando la longitud

alar es menor de 2.7 mm, esa hembra requerir una 2da comida en 24-36 h (Klowden y Lea 1979, Feinsod y Spielman 1980). El tamao corporal es muy variable en las poblaciones naturales y afecta la duracin del PIE y del CG. El tamao del adulto depender de la densidad larval en los criaderos. Se considera que de una densidad de 200 larvas/L emergern adultos grandes con longitud alar de 3.0 3.7 mm, una densidad de 400 larvas/L producir adultos con longitud alar de 2.4 3.3 mm, y finalmente los criaderos con hacinamiento extremo de ms de 1000 larvas/L producirn adultos pequeos en el rango de 2.1 2.9 mm (Briegel 1990). Por lo tanto, entre los diferentes factores extrnsecos, el tamao corporal es importante porque afecta al tamao del inculo viral, al producto del ttulo viral y al volumen de sangre ingerida (tamao del mosquito), y ello a su vez determina la probabilidad para que el virus se disemine dentro de la hembra hasta llegar a la infeccin de glndulas salivales (Rosen et al. 1985).

Fig. 2. Estructuras que funcionan como barreras de competencia vectorial en un mosquito contra la invasin de un patgeno. En el caso del virus Dengue ste tiene que pasar por membrana peritrfica (C), epitelio estomacal y lmina basal (D), y glndulas salivales (H). El tiempo que transcurre desde la ingestin de la sangre virmica hasta que el virus est en glndulas salivales, se conoce como Perodo de Incubacin Extrnseca (PIE) (Tomado de Beerntsen et al. 2000).

Las hembras grandes ingieren el doble de sangre que las pequeas y su fecundidad se cuadruplica; tambin presentan una mayor agresividad de picadura conforme aumenta su longevidad (Steinwascher 1982), lo cual sugiere que estas hembras pueden ser ms peligrosas epidemiolgicamente. No obstante, las hembras pequeas son ms propensas a ingerir comidas mltiples completas o parciales en el mismo CG por ser adultos dbiles nutricionalmente (Nasci 1991). En nuestros estudios llevados a cabo con las poblaciones de A. aegypti en la zona metropolitana de Monterrey, NL, hemos observado que la poblacin de adultos exhibe una curva bimodal en el ao con el pico mayor durante el perodo agostonoviembre en congruencia con las lluvias de origen ciclnico (Salas-Luvano y ReyesVillanueva 1994). Tambin hemos registrado que las comidas mltiples son un evento comn en las poblaciones vectoriales locales con lo cual aumenta el riesgo de infeccin. En otro estudio demostramos que la longitud alar de las hembras de Monterrey, NL, varan de 1.8 hasta 3.3 mm y que las pequeas (longitud alar < 2.9 mm) son ms propensas a ingerir 2-3 alimentaciones de sangre en 36 horas (Reyes-Villanueva 2004). Este escenario es muy peligroso porque cada comida significa una picadura por una hembra que puede ser infecciosa al tener el virus en glndulas salivales. Mediante un modelo logstico (Fig. 3)

observamos que las hembras grandes tienen una probabilidad para comidas mltiples de 0.20 la cual se eleva hasta 0.60 para el caso de las pequeas (Reyes-Villanueva y RodrguezPrez 2004). En resumen, la longitud alar es una variable clave a registrar en las poblaciones de A. aegypti cuando se est conduciendo un estudio sobre competencia vectorial, tanto en laboratorio como en campo. El PIE se acorta a mayor temperatura. A 30oC se ha reportado que flucta entre 12 y 15 das, para mosquitos infectados con una dosis viral alta y baja respectivamente (Watts et al. 1987). Aqu es importante la dosis con que se infecta el mosquito porque sta determina el tiempo en das de la viremia en los enfermos (Halstead 2008). En los estudios pioneros sobre este tpico y llevados a cabo con humanos, se determin que el PIE duraba entre 4.5 y 7 das, extendindose en algunos casos hasta 10 das, y que ocurri cuando los mosquitos se infectaron al alimentarse sobre enfermos a las 618 h antes de perodo febril (Simmonds et al. 1931). Recientemente se public que independientemente de la temperatura, el PIE tiene una duracin de entre 8 y 10 das, si las hembras se alimentan sobre sangre virmica cuyos ttulos sean superiores a 105 107/ml (Monath 1995). En general, el PIE es muy variable y se necesita que la dosis infecciosa media para mosquitos (DIM50) se eleve hasta un ttulo de 108 partculas por ml, sin mencionar el efecto del serotipo, porque en un experimento se registr que cuando los mosquitos se alimentaron sobre humanos enfermos con el DEN-1 (poco adaptado a humano) el PIE se alarg a 14 das (Sabin 1952). En un estudio se infectaron mosquitos con DEN-2 y con dosis ascendentes de ttulos virales; se encontr que a los 14 das postalimentacin, la tasa de mosquitos positivos para el virus fue de 3% a la dosis ms baja de DIM50/ml de 105.2, mientras que la proporcin lleg hasta el 100% cuando se alimentaron con una DIM50 DE 109.2 (Fig. 4). Por lo tanto, en este estudio los autores concluyeron que una dosis de 108 era suficiente para infectar al 90% de los mosquitos con el DEN-2 (Vazeille-Falcoz et al. 1999). En un estudio reciente con DEN-2 se encontr que el nmero de copias de ARN del DEN-2 alcanz un mximo a los 8 das postinfeccion fluctuando entre 6 y 9 das mediante el uso de PCR en laboratorio (Richardson et al. 2006). En conclusin pensamos que un estimador promedio para el PIE es de 10 das, en la consideracin de que a menudo, los mosquitos infecciosos fallan para transmitir el virus a una persona sana (Bancroft et al. 1982). Otra variable clave de competencia vectorial es estimar el CG.

Fig. 3. Regresin logstica para estimar la probabilidad de que una hembra de A. aegypti permanezca como gonoinactiva (= pregravida) despus de alimentarse de sangre a replecin, en funcin de la longitud alar, para las poblaciones vectoriales de Monterrey, NL (Reyes-Villanueva y Rodrguez-Prez 2004). El intervalo entre dos oviposiciones (o entre dos alimentaciones a replecin tericamente) es relevante porque permite estimar la probabilidad para que una hembra llegue a transmitir al virus. El CG se ha estudiado en este vector desde hace mucho tiempo. A nivel de laboratorio el CG se ha estimado con un intervalo de 3 a 5 das, pero en estudios usando la tcnica de marcaje-recaptura se ha estimado en 4 das en Tanzania, frica a una temperatura promedio de 24oC (McClelland y Conway 1971). Estos autores reportaron que una hembra fue recapturada al 4to da y luego otra vez al 5to da, evidencindose que la ingesta mltiple son comunes hasta tambin el 2do CG. Nuevamente, la incidencia de comidas mltiples complica el clculo del CG. En los estudios de laboratorio de CG al menos el 50% de las hembras se alimentan por segunda ocasin al primer da y en el campo se ha encontrado que una proporcin significativa de hembras capturadas, tiene sangre fresca en el estmago o bien son semi o grvidas completas (MacDonald 1956), tal y como lo hemos encontrado en Monterrey. Otro mtodo para calcular el CG en campo es mediante el anlisis con correlaciones cruzadas de una serie de tiempo de capturas diarias (Mutero y Birley 1987). Este mtodo se basa en la correlacin por mnimos cuadrados que existe entre las paridas y totales de una poblacin al analizarse con diferentes das de retraso (lags). Nosotros colectamos una serie de tiempo de 20 das consecutivos y al aplicar este mtodo pero con estimadores de mxima verosimilitud con SAS, el CG result ser de 5 das para A. aegypti de Monterrey (Cuadro 2). Pensamos que este mtodo es ms confiable y ms prctico para la estimacin del CG a partir de poblaciones de campo del vector. El CG est asociado a otra variable de competencia vectorial para estimar la probabilidad de infeccin, que es la tasa diaria de sobrevivencia. Esta variable se expresa como una fraccin a nivel de centsimas porque se refiere a un valor de probabilidad y su smbolo es P. Los experimentos para determinar el valor de P en campo son notoriamente variables pero si hay

consenso en que el estimador para una poblacin se ubica entre 0.87 y 0.91 con un promedio de 0.89 para los estudios en reas endmicas de Asia (Focks et al. 1993).

Fig. 4. Proporcin de hembras de A. aegypti infectadas con DEN-2 a los 14 das postalimentacin y a dosis ascendentes de partculas virales (DIM 50) (Modificado de Vazeille-Falcoz et al. 1999).

El valor integral de P = 0.89 resulta en una longevidad promedio de 8.6 das. Debido a que la poblacin declina exponencialmente con la edad y aunque la mayora de las hembras muere a edad temprana, la cola de esta distribucin contiene las raras hembras ms viejas (e infecciosas) que son capaces de transmitir al virus. No obstante la mayora de las hembras no son infecciosas antes de morir. Tradicionalmente se ha considerado que P se mantiene constante en la vida del mosquito (Service 1993), pero estudios recientes sealan que P aumenta con la edad del vector. Mediante marcaje-recaptura de A. aegypti en campo en Puerto Rico, encontraron que P s aumenta con la edad, ya que sus valores fueron de P = 0.75 para hembras jvenes de 3 das (edad de liberacin de marcadas), y de 0.84 para hembras de 13 das de edad (edad de liberacin de marcadas) (Harrington et al. 2001). La tcnica de marcaje-recaptura es recomendable para estimar sobrevivencia en poblaciones vectoriales.

Da Lag -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Correlaciones Cruzadas Covarianza Correlacin -1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 -0.786265 -0.00605 | . | . | -3.266613 -0.02512 | . *| . | 8.054254 0.06195 | . |* . | 8.176998 0.06289 | . |* . | -5.245652 -0.04035 | . *| . | -33.908800 -0.26080 | . *****| . | 1.782453 0.01371 | . | . | 42.800442 0.32919 | . |******* . | 10.129850 0.07791 | . |** . | -45.005990 -0.34615 | . *******| . | -28.727923 -0.22095 | . ****| . | 0.501575 0.00386 | . | . | 104.670 0.80504 | . |**************** | 2.727815 0.02098 | . | . | -71.125933 -0.54705 | ***********| . | -43.083926 -0.33137 | . *******| . | 46.301484 0.35612 | . |******* . | 69.888476 0.53753 | . |*********** | -20.704669 -0.15924 | . ***| . | -50.379272 -0.38748 | . ********| . | -8.203819 -0.06310 | . *| . | 25.149308 0.19343 | . |**** . | 26.969411 0.20743 | . |**** . | -42.095753 -0.32377 | . ******| . | -6.889695 -0.05299 | . *| . | "." 2 ES

Cuadro 2. Determinacin del ciclo gonotrfico para poblaciones de A. aegypti en la zona de Monterrey, NL, mediante anlisis de correlaciones cruzadas (mtodo de Birley modificado para mxima verosimilitud) de series de tiempo con SAS para una serie de tiempo de 20 das de captura con cebo humano (Reyes-Villanueva F, material indito). Note como el primer pico del ndice R despus del da 0 se ubica al da 5, estimndose el CG en 5 das). Una vez que el virus se disemina a las glndulas salivales la probabilidad de transmisin vara con la frecuencia de picadura, lo cual ya mencionamos se relaciona con la duracin del CG. ste es el punto clave. Las hembras que toman 2 3 comidas parciales (interrumpidas) despus de una comida a replecin en el mismo CG, pueden ser comidas infecciosas y an ms si las toman sobre diferentes personas. Epidemiolgicamente el mayor nmero de comidas parciales debido a un aumento en la temperatura en 2 3 oC, equivale a que la densidad de A. aegypti se duplique (Halstead 2008). Por lo tanto, porque las comidas parciales son ms incidentes en las hembras pequeas, es necesario registrar la proporcin de las pequeas como variable de competencia y estimar cul es su proporcin en el sector de las hembras ms viejas. Aparte de la tcnica de marcaje-recaptura, una forma emprica y prctica de estimar el % de hembras viejas es midiendo el grado de desgaste mediante una escala ordinal en los bordes posteriores de las alas de las hembras capturadas en campo (Service 1993).

2.3 Fecundidad La fecundidad de A. aegypti se ha trabajado desde los estudios clsicos de Paul A. Woke en 1937. En un estudio posterior se report que la sangre humana era la mejor para la

fecundidad del vector en comparacin a la de otros siete vertebrados, incluyendo anfibios (una rana) (Woke et al. 1956). Sin embargo, estos estudios pioneros se llevaron a cabo sin controlar otras variables independientes clave como lo son la densidad larval y el tamao corporal del adulto. Woke determin la fecundidad mxima de A. aegypti porque us una densidad de slo 50 larvas/L y aunque no registr tamao corporal seguramente trabaj con hembras muy grandes y nutricionalmente ptimas en sus estudios. En otro estudio clsico se pes el volumen de sangre ingerida (mg) por cada hembra y se correlacion con el nmero de huevos puestos, y se calcul la ecuacin de regresin Y = 15.2 + 28.2X, pero curiosamente no mencionaron nada acerca de la densidad larval usada para obtencin de los adultos (Hien 1976). Aunque la fecundidad est limitada por el nmero de ovariolas que tiene cada ovario (100120 ovariolas/ovario) en A. aegypti (Christophers 1960), s disminuye marcadamente con la edad fisiolgica en los mosquitos (Hurd et al. 1995). El nmero de huevos vara entre 72 y 158/hembra, de manera que la mediana del nmero de ovariolas (113) es muy similar a la mediana de huevos/hembra (115). Hembras jvenes (3 das de edad) que se alimentaron slo de sangre de pollo produjeron una media de 60 3 huevos, mientras que hembras viejas (12 das) alimentadas de azcar y sangre de pollo pusieron 75 5 huevos respectivamente (Nayar y Sauerman 1977). La isoleucina es un aminocido esencial para la vitelognesis en mosquitos (Briegel 1990). La sangre de aves y roedores tiene mayores niveles de este aminocido que la sangre humana (Day et al. 1994). No obstante paradjicamente cuado A. aegypti se alimenta slo de sangre humana es ms fecundo y longevo que cuando se alimenta sobre aves o roedores. Lo anterior se debe a que la ingestin de sangre pobre en isoleucina induce en las hembras la movilizacin de nutrientes de sus propias reservas para completar la ovognesis (Briegel 1990). En Puerto Rico, adultos grandes de 2.95 mm de longitud alar y confinados en jaulas, se alimentaron con sangre humana, y sangre humana ms azcar; reportaron una media de 18 huevos/da en aquellos con slo sangre humana, y de 13 huevos/da para aquellos con dieta combinada (Naksathit y Scott 1998). Este estudio de Puerto Rico puede ser til como referencia para estudios de fecundidad. Es necesario medir la longitud alar cuando se va a estimar fecundidad en mosquitos alimentados solo con sangre humana, tal y como sucede en las poblaciones urbanas de A. aegypti que usualmente no ingieren azcares (Edman et al. 1992, Scott et al. 1997), aunque en el sur tropical de Mxico s se ha reportado hasta un 21% de mosquitos positivos para azcares en campo (Martnez-Ibarra et al. 1997). Dada la controversia en este tpico, es aconsejable controlar tambin la densidad larval de cra de la colonia experimental, lo cual permitir una mayor confiabilidad en los estimadores de fecundidad si se registra el tamao corporal independientemente de la dieta, y luego correlacionarlo con el nmero de huevos puestos por cada hembra, tal y como lo manej Briegel (1990). Segn este autor, como ya se mencion anteriormente, la densidad larval puede ser de 200, 400 y 1000 larvas/l y la longitud alar estar en el rango de 3.03.7 mm, 2.43.3 mm y 2.12.9 mm respectivamente. Este criterio tambin es confiable para aplicarlo experimentalmente en estudios de fecundidad de A. aegypti. En nuestros estudios hemos encontrado hembras muy pequeas en el rango de 1.8 2.0 mm para Monterrey, as la mediana del rango 1.8 3.3 mm es 2.6 mm para la localidad (Reyes-Villanueva 2004). 2.4 Dispersin de adultos Debido a que A. aegypti es altamente sinantrpico, sus poblaciones de adultos tienden a permanecer en o muy cerca de los sitios (o cuadras) en donde se criaron como larvas (Edman et al. 1998). Estudios clsicos en base a marcaje-recaptura han demostrado que aunque los

adultos se pueden desplazar hasta 500 m o ms (en frica), la mayora de la poblacin se queda en un dimetro no mayor de 50 m a partir del punto de liberacin, en zonas urbanas (Sheppard et al. 1969, Trpis y Haussermann 1986, Trpis et al. 1995). Se debe a que su comportamiento altamente endofgico y endoflico hace que las hembras permanezcan dentro de las casas en la vecindad inmediata de sus sitios de cra, y adems los machos tambin tienden a entrar a las casas para buscar y copular con las hembras. No obstante, el comportamiento de oviposicin determina en parte el grado de dispersin de los adultos; si en un sitio o en las casas de una cuadra urbana se eliminan los criaderos larvales y de oviposicin, los adultos van a tender a desplazarse a las cuadras vecinas en busca de sitios de oviposicin. El grado de abundancia y caractersticas de los criaderos larvales como sitios de oviposicin, son variables en funcin de la estacin, localidad, colonia y nivel socioeconmico de los habitantes de las casas. En la medida que haya pocos criaderos es que las hembras de A. aegypti tendern a estar fuera de las casas dispersndose en busca de sitios de oviposicin. Por lo tanto se requiere hacer una inspeccin muy cuidadosa de los criaderos larvales potencialmente disponibles para oviposicin, en las casas de la colonia o localidad donde se llevar a cabo un estudio sobre dispersin de este vector. Tambin la tcnica de marcajerecaptura es la aconsejable en este tipo de estudios (Edman et al. 1998). 2.5 Literatura Citada Bancroft WH, Scott RM, Brandt WE, McCown JM & Eckels KH.1982. Dengue-2 vaccine: infection of Aedes aegypti mosquitoes by feeding on viremic recipients. Am J Trop Med Hyg 31: 1229-1231. Beerntsen BT, James AA & Christensen BM. 2000. Genetics of mosquito vector competence. Microbiol & Mol Biol Rev 64: 115-137. Briegel H. 1990. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol 36: 165-172. Christophers SR. 1960. Aedes aegypti (L.) The Yellow Fever Mosquito: its Life History, Bionomics and Structure. Cambridge University Press. 738 pp. Clements AN. 1992. The Biology of Mosquitoes. Vol.1, Reproduction. London: Chapman & Hall. Development, Nutrition and

Day FJ, Edman JD & Scott TW. 1994. Fitness of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) maintained on blood, with field observations from Thailand. J Med Entomol 31: 611-617. Edman JD, Scott TW, Costero A, Morrison AC, Harrington LC & Clark CG. 1998. Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) movement influenced by availability of oviposition sites. J Med Entomol 35: 578-583. Edman JD, Strickman D, Kittayapong P & Scott TW. 1992. Female Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand rarely feed on sugar. J Med Entomol 29: 1035-1038. Feinsod FM & Spielman A. 1980. Nutrient-mediated juvenile hormone secretion in mosquitoes. J Insect Physiol 26:113-117.

Finlay CJ. 1899. Mosquitoes considered as transmitters of yellow fever and malaria. Med Rec 55: 737 739. Focks DA, Haile DG, Daniels E & Mount GA. 1993. Dynamic life table model for Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): simulation results and validation. J Med Entomol 30: 10081028. Gillies MT. 1955. The pre-gravid phase of ovarian development in Anopheles funestus. Ann Trop Med Parasit 49:320:325. Gorrochotegui-Escalante N, Gomez-Machorro C, Lozano-Fuentes S , Fernndez-Salas I , Muoz ML, Farfan Ale JA , Garcia-Lejo J , Beaty BJ & Black IV WC. 2002. Breeding structure of Aedes aegypti populations in Mexico varies by region. Am J Trop Med Hyg 66: 213-222. Gubler DJ. 1997. Dengue and dengue hemorrhagic fever: its history and resurgence as a global public health problem. In: Gubler DJ, Kuno G (eds.) Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Fort Collins CO: Center for Agriculture Bioscience International, 1-22. Gubler DJ. 2006. Dengue and dengue hemorrhagic fever. In: Guerrant R, Walker D and Weller P (eds.) Tropical Infectious Diseases. 2nd Ed. Philadelphia, PA, Elsevier. Gunther J, Martnez-Muoz JP, Prez-Ishiwara DG & Salas-Benito J. 2007. Evidence of vertical transmission of dengue virus in two endemic localities in the state of Oaxaca, Mexico. Intervirology 50: 347-352. Halsted SB. 2008. Dengue virus mosquito-interactions. Annu Rev Entomol 53: 273-291. Hardy JL, Houk EJ, Kramer LD & Reeves W. 1983. Intrinsic factors affecting vector competence of mosquitoes for arboviruses. Ann Rev Entomol. 28: 229-262. Harrington LC, Buonaccorsi JP, Edman JD, Costero A, Kittayapong P, Clark CG & Scott TW. 2001. Analysis of survival of young and old Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Puerto Rico and Thailand. J Med Entomol 38: 537-547. Hawley WA. 1988. The biology of Aedes albopictus. J Am Mosq Control Assoc Suppl 1, 40 pp. Hien DS. 1976. Biology of Aedes aegypti (L. 1762) and Aedes albopictus (Skuse, 1895) Diptera, Culicidae). Acta Parasit Pol 24: 37-54. Hull B, Tikasingh E, deSouza M & Martinez R . 1984. Natural transovarial transmission of dengue 4 virus in Aedes aegypti in Trinidad. Am J Trop Med Hyg 33: 1248- 1250. Hurd H, Hogg JC & Renshaw M. 1995. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitol Today 11: 411-416. Ibaez-Bernal S, Briseo B, Mutebi JP, Argot E, Rodriguez G, Martinez-Campos C, Paz R, de la Fuente-San Roman P, Tapia-Conye R & Flisser A. 1997. First record in America of Aedes albopictus naturally infected with dengue virus during the 1995 outbreak at Reynosa, Mexico. Med & Vet Entomol 11: 305-309.

Joshi V, Mourya DT & Sharma RC. 2002. Persistance of dengue-3 virus through transovarial transmission passage in successive generations of Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg 67: 158-161. Khin MM & Than KA. 1983. Transovarial transmission of dengue 2 virus by Aedes aegypti in nature. Am J Trop Med Hyg 32:590-594. Klowden MJ. 1994. Endogenous regulation of the attraction of Aedes aegypty mosquitoes. J Am Mosq Control Assoc 10:326-332. Kowden MJ & Lea AO. 1979. Abdominal distention terminates subsequent host-seeking behavior of Aedes aegypti following a blood meal. J Insect Physiol 25: 583-585. MacDonald WW. 1956. Aedes aegypti in Malaya. II Larval and adult biology. Ann Trop Med Parasitol 50: 399-414. Martnez-Ibarra JA, Rodrguez MH, Arredondo-Jimnez JI & Yuval B. 1997. Influence of plant abundance on nectar feeding by Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in southern Mexico. J. Med. Entomol 34:58993. McClelland GAH & Conway GR. 1971. Frequency of blood feeding in the mosquito Aedes aegypti. Nature 232: 485-486. MMWR. 2007. Dengue hemorrhagic fever-U.S.-Mexico border, 2005. Morbidity and Mortality Report 57: 785-789. Monath TP. 1995. Dengue: The risk to developed and developing countries. In: Roizman B (ed.) Infectious Diseases in an Age of Change. National Academic Press, Washington DC. Mourya DT, Gokhale BA, Varde PV, Sapkal GN, Padvidri VS & Gore MM. 2001. Horizontal and vertical transmission of dengue-2 virus in highly and lowly susceptible strains of Aedes aegypti mosquitoes. Acta Virol 45: 67-71. Mutero CM & Birley MH. 1987. Estimation of the survival rate and oviposition cycle of field populations of malaria vector in Kenya. J Appl Ecology 24: 853-863. Naksathit AT & Scott TW. 1998. Effects of female size on fecundity and survivorship of Aedes aegypti fed only human blood versus human blood plus sugar. J Am Mosq Control Assoc 14: 148-152. Nasci R. 1991. Influence of larval and adult nutrition on biting persistence in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 28: 522-526. Nayar JK & Sauerman DM. 1977. The effect of nutrition on survival and fecundity in Florida mosquitoes. Part 3. Utilization of blood and sugar for fecundity. J Med Entomol 12: 220-225. Rao VV. 1947. On gonotrophic discordance among certain Indian Anopheles. Ind J Mal 1:4349.

Rawlins SC & Wan JOH. 1995. Resistance in some Caribbean populations of Aedes aegypti to several insecticides. J Am Mosq Control Assoc 11: 59-65. Reyes-Villanueva F. 1990. El dengue: Bionoma del vector, transmisin y opciones para su control en Mxico. Ciencia 41: 45 -55. Reyes-Villanueva F. 2004. Egg development may require multiple bloodmeals among small Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) field-collected in northeastern Mexico. Fla Entomol 87: 630-632. Reyes-Villanueva F. & Rodrguez-Prez MA. 2004. The logistic model for predicting the frequency of non-gonoactive females with relation to body size and collection method, in wild Aedes aegypti populations from Monterrey, Mxico. Salud Pblica Mx 46: 234-240. Reyes-Villanueva F, Jurez-Eguia M & Flores-Leal A.1990. Effects of sublethal dosages of Abate upon adult fecundity and longevity of Aedes aegypti. J Am Mosq Control Assoc 6: 739741. Richardson J, Molina-Cruz A, Salazar MI & Black IV W. 2006. Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg 74: 132-141. Rico-Hesse R, Harrison LM, Salas RA, Tovar D, Nisalak A, Ramos C, Boshell J, de Mesa MT, Nogueira RM, & da Rosa AT. 1997. Origins of dengue type 2 viruses associated with increased pathogenicity in the Americas. Virology 230: 244-251. Rosen L, Roseboom LE, Gubler DJ, Lien JC, Chaniotis BN. 1985. Comparative susceptibility of mosquito species and strains to oral and parenteral infection with dengue and Japanese encephalitis viruses. Am J Trop Med Hyg 34: 603-615. Sabin AB. 1952. Research on dengue during World War II. Am J Trop Med Hyg 1: 30-50. Salas-Luvano M & Reyes-Villanueva F. 1994. Variacin estacional de las poblaciones de Aedes aegypti en Monterrey, Mxico. Salud Pblica Mex 36: 385-392. Scott TW, Clark GG, Lorenz LH, Amerasinghe PH, Reiter P & Edman J. 1993. Detection of multiple blood feeding in Aedes aegypti during a single gonotrophic cycle using a histologic technique. J Med Entomol 30: 94-99. Scott TW, Naksathit A, Day JF, Kittayapong P & Edman JD. 1997. A fitness advantage for Aedes aegypti and the viruses it transmits when females feed only on human blood. Am J Trop Med Hyg 57: 235-239. Seijo A. 2001. El dengue como problema de salud pblica. Arch Argent Pediatr 99: 510-521. Service SW.1993. Mosquito Ecology: Field Sampling Methods. 2nd ed. Springer- Verlag, 924 pp.

Sheppard PM, Macdonald WW, Tonn RJ & Grab B. 1969. The dynamics of an adult population of Aedes aegypti in relation to dengue haemorrhagic fever in Bangkok. J Anim Ecol 43: 661-702. Simmonds JF, St.John JH & Reynolds FHK. 1931. Experimental studies of dengue. Philipp J Sci 44: 1-252. Steinwascher K. 1982. Relationship between pupal mass and adult survivorship and fecundity for Aedes aegypti. Environ Entomol 11: 150-153. Swellengrebel NH. 1929. La dissociation des fonctions sexuelles et nutritives (Dissociation gono-trophique) d' Anopheles macullipennis comme cause du paludisme dans les pays-bas et ses rapports avec "Infection domiciliare". Ann Inst Pasteur Paris 43:1370-89. Tanada Y & Kaya HK. 1993. Insect Pathology. Academic Press, New York. Tesh RB. 1984. Transovarial transmission of arboviruses in their invertebrate vectors. In: Harris KF (ed.) Current Topics in Vector Research, Vol 2, Praeger Publishers, New York, pp. 56-76. Trpis M & Hausermann W. 1986. Dispersal and other population parameters of Aedes aegypti in an African village and their possible significance in epidemiology of vector-borne diseases. Am J Trop Med Hyg 35: 1263-1279. Trpis M, Hausermann W & Craig Jr GB. 1995. Estimates of population size, dispersal and longevity of domestic Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) by mark-recapture in the village of Shauri Moyo in eastern Kenya. J Med Entomol 32: 27-33. Vazeille-Falcoz M, Mousson L, Rodham F, Chungue E & Failloux E. 1999. Variation in oral susceptibility to dengue type 2 virus of populations of Aedes aegypti from islands of Tahiti, French Polynesia. Am J Trop Med Hyg 60: 292-299. Watts DM, Burke DS, Harrison BA, Whitmer RE & Nisalak A. 1987. Effects of temperature on the vector efficiency of Aedes aegypti for dengue 2 virus. Am J Trop Med Hyg 36: 143-152. WHO- World Health Organization. 1992. Expert Committee on Vector Biology and Control. Vector Resistance to Pesticides, 818 report, unpublished document, WHO technical report series. 63pp. Woke PA, Mona SA & Rosenberger Jr. CH. 1956. The numbers of eggs developed related to the quantities of human blood ingested in Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Ann Ent Soc Am 49: 435-441.

III. Control de Mosquitos con Aplicaciones de Spinosad: Un Nuevo Bioinsectida

Juan Guillermo Bond Compean1, Carlos F. Marina 1, Claudia M. Prez2 y Trevor Williams 2,3
1

Centro de Investigacin de Paludismo- INSP, Tapachula, Chiapas; Mxico, Email: gbond@insp.mx . 2El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Tapachula, Chiapas, Mxico, 3Instituto de Ecologa, A.C., Veracruz, Mxico.

3.1 Introduccin El control de los insectos vectores de importancia mdica en Mxico se realiza principalmente a travs de la aplicacin de insecticidas rganofosforados y piretroides (Arredondo-Jimnez et al. 1993, WHO 1995). Sin embargo, existe evidencia desde hace aos de que el uso excesivo de estos insecticidas provocan daos a la salud del hombre y al ambiente (Attaran et al. 2000, Walker 2000). Por otra parte, los mosquitos han desarrollado resistencia hacia los insecticidas sintticos (Sina y Aultman 2001, Braga et al. 2004). Estos problemas han causado que la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) considere necesario el desarrollo de nuevos mtodos de control, que sean menos dainos a la salud humana debido a la persistencia y bioacumulacin de compuestos xenobiticos persistentes en los ecosistemas, as como a los organismos no blanco y al ambiente. En este contexto, la OMS considera de gran importancia la identificacin y evaluacin de nuevos mtodos de control alternativos en la lucha antivectorial (WHO, 1991; 1995).

3.2 El Spinosad: Un Insecticida Biorracional El spinosad es una mezcla de dos molculas macrlidos tetracclicas, spinosina A y D, producidas durante la fermentacin de un actinomiceto del suelo Saccharopolyspora spinosa (Thompson et al. 1999). Su modo de accin se caracteriza por la excitacin del sistema nervioso central de los insectos, mediante la activacin de los receptores acetilcolnicos nicotnicos post-sinpticos y los receptores GABA, causando contracciones involuntarias de los msculos, temblores y la muerte (Salgado1997). Este bioinsecticida presenta muy baja toxicidad para mamferos y aves, mientras que se considera ligeramente txico para peces (Thompson et al. 1999) y poco txico para la mayora de los insectos depredadores que funcionan como enemigos naturales (Williams et al. 2003). Debido a estas caractersticas, la Agencia de Proteccin al Ambiente de los Estados Unidos (EPA) lo ha clasificado como un material de bajo riesgo (Thompson et al. 2000). El spinosad, se ha utilizado principalmente para el control de plagas de cultivos de los rdenes Lepidptera, Coleptera y Dptera (Thompson et al.1999, Watson 2001). Las investigaciones sobre la toxicidad de spinosad hacia los dpteros son escasas y principalmente estn enfocadas al control de las moscas de la fruta (Adn et al. 1996, McQuate et al. 2005). 3.3 Toxicidad del Spinosad en Laboratorio Existen pocos estudios realizados con vectores de importancia mdica. Debido a la aparicin de la resistencia a insecticidas sintticos en varias especies de mosquitos (Sina y Aultman 2001, Braga et al. 2004) y a la bsqueda de nuevas opciones para el control de estos insectos,

varios trabajos de investigacin se han enfocado a realizar experimentos en laboratorio para conocer el potencial del spinosad como larvicida. En general, se puede observar que es altamente txico para la mayora de los vectores estudiados (Cuadro 1), con valores de concentracin letal 50% (CL50) de 0.006 a 0.3 partes por milln (p.p.m.). Sin embargo, existen algunas diferencias en la susceptibilidad intra e interespecfica. Estas diferencias pueden deberse a algunas condiciones genticas entre las especies o a diferencias entre cepas de la misma especie de vector. Por otra parte, Paul et al. (2006) reportaron una CL50 muy alta (160 p.p.m.) para Aedes aegypti, con una exposicin de 72 h. Este resultado contrastante no tiene explicacin dada la alta toxicidad demostrada del spinosad en el control de mosquitos en campo (Cuadro 1).

3.4 Spinosad en el Control de Mosquitos: Pruebas de Campo Estudios realizados en campo confirman la eficiencia del spinosad en el control de larvas de mosquitos comparado con el insecticida rganofosforado temefos y el insecticida microbiano Vectobac, Bacillus thuringiensis israelensis (Bti). Recipientes tratados con spinosad a 10 p.p.m. inhibieron por 22 semanas el establecimiento de estadios inmaduros de A. aegypti, Culex spp. y chironmidos (Cuadro 2). Los tratamientos de spinosad a 1 y 5 p.p.m. impidieron el establecimiento de larvas de A. aegypti en recipientes en condiciones seminaturales por 8 y 13 semanas, y se observ un porcentaje de inhibicin de 55 y 84%, respectivamente (Bond et al. 2004). El tratamiento de temefos tuvo una eficiencia para impedir la cra de A. aegypti entre 8 y 11 semanas. Por otra parte, el spinosad a 1 y 5 p.p.m. demostr mayor eficiencia con Culex spp. debido a que inhibi la cra de larvas por 15 y 17 semanas, respectivamente. El tratamiento de Bti (Vectobac), realiz una pobre proteccin con slo dos semanas de inhibicin contra el establecimiento de inmaduros de A. aegypti y redujo la reproduccin en slo un 22% comparado con el control. Sin embargo, durante el curso del experimento se pudo observar un pequeo nmero de larvas muertas que sugieren que el patgeno persisti y sigui causando mortalidad en las larvas de mosquito. El Vectobac no fue efectivo contra Culex spp. (Bond et al. 2004). En un estudio reciente llevado a cabo durante las estaciones de sequa y lluvia en cementerios en el sur de Chiapas, se compar la eficiencia del spinosad a 1 y 5 p.p.m. con la de temefos y Bti (Prez et al. 2006). El spinosad a 1 p.p.m. inhibi completamente la cra de A. aegypti por 8 semanas mientras que a 5 p.p.m. la impidi hasta por 11 semanas (Cuadro 2). En cambio el tratamiento de temefos result en un control absoluto de 11 a 14 semanas, mientras que el Vectobac mostr un desempeo similar al que se observ en el estudio de Bond et al. (2004) pues inhibi la cra del mosquito durante slo dos semanas.

Cuadro 1. Toxicidad Aguda del Spinosad en Estudios de Laboratorio en Larvas de Diferentes Especies de Mosquitos.

Especie

Tiempo de Exposicin al Spinosad

CL50 (p.p.m.*) Referencia

Aedes albopictus A. aegypti

24 h 1h 1h 24 h 24 h 72 h 1h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h

0.2 0.4 0.025 0.026 0.0096 0.32 0.35 160 0.024 0.01 0.011 0.039 0.0064 0.027 0.093 0.12

Anopheles albimanus A. gambiae A. stephensi Culex pipiens C. quinquefasciatus C. quinquefasciatus Cepa VBFmcq** Cepa HAmCq** Cepa MAmCq** Cepa S-Lab**

Liu et al. (2004a) Bond et al. (2004) Prez et al. (2006) Romi et al. (2006) Darriet et al. (2005) Paul et al. (2006) Bond et al. (2004) Darriet et al. (2005) Romi et al. (2006) Romi et al. (2006) Cetin et al. (2005) Darriet et al. (2005) Liu et al. (2004b)

24 h 24 h 24 h 24 h

0.3 0.07 0.3 0.1

* p.p.m. = partes por milln (1 mg/litro = 1 p.p.m.). ** Cepas con resistencia a los insecticidas sintticos.

Por otra parte, tanques spticos turcos tratados con 100 y 200 g de spinosad por hectrea tuvieron una eliminacin de las larvas de C. pipiens por siete das y un alto nivel de control (>80%) hasta 14 das post-tratamiento (Cetin et al. 2005). La breve duracin del control observado en los tanques spticos probablemente fue debido a la dilucin continua del material activo y la degradacin microbiana en este tipo de hbitat. En un estudio reciente, el spinosad fue formulado con sacarosa y aplicado por pulverizacin a rboles de acacia en un oasis aislado del desierto de Israel (Muller y Schlein 2006). Los adultos de Anopheles sergentii y A. caspius utilizan los flores de acacia como su principal fuente de azcares y la aspersin de spinosad result en una disminucin muy importante del nmero de mosquitos capturados, hasta casi eliminar la poblaciones de estos vectores. Finalmente, en la mosca tsetse (Glossina palpalis gambiensis y G. morsitans morsitans) se evalu la toxicidad por va tpica y se encontr que el spinosad es extremadamente txico para dicho insecto, pudiendo llegar a ser una alternativa al uso de insecticidas como el endosulfn y la deltametrina en las aspersiones areas en pases africanos (Deken et al. 2004).

Cuadro 2. Tiempo (en semanas) de inhibicin absoluta de establecimiento de inmaduros de Aedes aegypti, Culex spp. y chironmidos en recipientes tratados con spinosad, temefos y Vectobac (Bacillus thuringiensis israelensis) en tres estudios de campo.

Especie Estudio y tratamientos

A. aegypti 3.5 Persist encia de Spinos ad y Respu esta de Ovipo sicin de Aedes aegypt i Estudio 1- Bond et al. (2004) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibicin absoluta Spinosad 1 p.p.m. Spinosad 10 p.p.m. Temefos Estudio 2- Bond et al. (2004) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibicin absoluta Spinosad 5 p.p.m. Vectobac Temefos Estudio 3- Prez et al. (2006) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibicin absoluta Spinosad 1 p.p.m. Spinosad 5 p.p.m. Vectobac Temefos 5286

Culex spp.

Chironmidos

646

1014

8 > 22 8 2326

15 > 22 13 203

8 > 22 2 934

13 2 11

17 0 16

7 3 2

La 527- 2814 persist encia del 7 -8 spinos 9 -11 ad 2 puede 11 -14 ser afectada por la radiacin solar. Soluciones de spinosad fueron expuestas a la radiacin solar directa y comparada con tratamientos establecidos en condiciones de sombra y laboratorio. Los resultados de este estudio indican que la desactivacin del spinosad expuesto al sol fue aproximadamente diez veces mas rpida comparada con condiciones de sombra (Prez et al. 2006). La vida media del tratamiento expuesto al sol fue de aproximadamente 2 das comparado con >20 das en la sombra. Hubo una correlacin importante entre la dosis acumulativa de radiacin ultravioleta (UV) y la actividad residual insecticida de las soluciones de spinosad expuestas al sol. Por otra parte, se realiz un experimento en jaulas con recipientes de agua pura y tratados con spinosad para investigar la atraccin-repelencia de mosquitos adultos. Las hembras grvidas de A. aegypti fueron ms atradas por el tratamiento de 20 p.p.m. de spinosad comparado con agua sola. Este efecto no se detect a una concentracin menor (5 p.p.m.). Sin embargo, las hembras ovipositaron un nmero similar de huevos en ambos tratamientos con spinosad (5 20 p.p.m.) comparados con sus respectivos tratamientos control. La eclosin de los huevos no fue afectada por el spinosad aunque el 94-100% de las larvas que eclosionaron en los tratamientos con spinosad murieron dentro de 24 h, debido a la presencia de residuos del bioinsecticida en la superficie de los huevos y en el papel filtro que se emple como sustrato de oviposicin (Prez et al. 2006).

3.6 Discusin y Conclusiones Los experimentos realizados en laboratorio con spinosad han demostrado que este producto es altamente txico contra larvas de diferentes especies de mosquitos de importancia mdica.

Estos estudios hacen suponer que este producto puede ser una valiosa alternativa en el control de larvas de moquitos culcidos y puede ser incluido dentro de los programas de manejo integrado de plagas de insectos vectores. Para maximizar la eficiencia de este bioinsecticida es necesario realizar estudios sobre formulacin de liberacin lenta y su validacin en diversas condiciones de campo. En los pocos estudios de campo realizados hasta la fecha se ha observado que la persistencia del spinosad a concentraciones bajas (1 y 5 p.p.m.) es similar a la de temefos, y notablemente mejor que la del Bti. El spinosad es an ms efectivo a una concentracin de 10 p.p.m. Sin embargo, hay que tomar en cuenta que este producto es afectado por la radiacin solar (Prez et al. 2006) y podra disminuir notablemente su eficiencia y/o la duracin del control en criaderos de mosquitos como Anopheles albimanus y A. pseudopunctipennis que, por lo general, se encuentran expuestos al sol. Es interesante notar que durante estos experimentos de campo hemos observado una gran cantidad de huevos de mosquito en las paredes de los recipientes, indicando que el spinosad no repele la oviposicin. Sin embargo, en estos recipientes no se observaron larvas emergidas durante los muestreos, lo cual indica un efecto ovicida o larvicida del spinosad. Las propiedades ovicidas del spinosad han sido reportadas para especies de lepidpteros (Bret et al. 1997, Peterson et al. 1998) aunque al parecer la actividad ovicida del spinosad es menor en ambientes acuticos comparados con los causados por solventes orgnicos (Pineda et al. 2000). El spinosad es un compuesto que presenta muy baja toxicidad a los vertebrados. En el caso de los mamferos la DL50 es mayor a 5000 mg/Kg en ratones. Para las aves, la toxicidad es casi nula, en tanto que para los peces se clasifica de ligera a moderada y una CL 50 entre 5 y 30 p.p.m., dependiendo de la especie (Thompson et al. 2000). Asimismo, los riesgos hacia la salud humana son mnimos y eso puede ser una ventaja para su uso en el control de mosquitos. Sin embargo, el impacto del spinosad sobre organismos acuticos no blanco ha sido poco estudiado. Este compuesto es txico para varias especies de invertebrados acuticos como lo son Daphnia spp., chironmidos, camarones y moluscos (Pest Management Regulatory Agency 2001). Se ha observado que la exposicin continua de Daphnia pulex a spinosad a >0.01 p.p.m, puede llevar a la extincin de la poblacin, aunque el insecticida rganofosforado diazinn fue cinco veces mas txico (Stark y Vargas 2003). En conclusin, el bioinsecticida spinosad debido a sus propiedades tiene muy buenas posibilidades para ser tomado en cuenta como herramienta en los programas de control de los estadios acuticos de vectores de importancia mdica. Ser necesario emplearlo cuidadosamente en combinacin con otros insecticidas biorraccionales, como el metopreno y el Bti, para evitar el desarrollo de resistencia en las poblaciones de vectores. Adems, se requiere de estudios ms detallados que corroboren los resultados de nuestras investigaciones y tambin el desarrollo de formulaciones de liberacin lenta para ser utilizadas en tanques, tambos y otro tipo de recipientes que son utilizados para almacenar agua en las casas. Consideramos que el spinosad tiene el potencial de ser un larvicida muy eficiente en el control de insectos vectores de importancia mdica.

3.7 Literatura Citada Adn A, Del Estal P, Budia F, Gonzlez M & Viuela E. 1996. Laboratory evaluation of the novel naturally derived compound spinosad against Ceratitis capitata. Pest Sci 48: 261-268.

Arredondo-Jimnez JI, Rodrguez MH, Brown DN & Loyola EG. 1993. Indoor low-volume insecticide spray as a method for the control of Anopheles albimanus in southern Mxico. J Am Mosq Control Assoc 9: 210-220. Attaran A, Roberts DR, Curtis CF & Kilama WL. 2000. Balancing risks on the backs of the poor. Nature Medicine 6: 729-731. Bond JG, Marina CF & Williams T. 2004. The naturally derived insecticide spinosad is highly toxic to Aedes and Anopheles mosquito larvae. Med & Vet Entomol 18: 50 -56. Braga IA, Pereira-Lima JB, Da Silva-Soares S & Valle D. 2004. Aedes aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in the states of Rio de Janeiro, Sergipe, and Halagaos, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 199 203. Bret BL, Larson LL, Schoonover JR, Sparks TC & Thompson GD. 1997. Biological properties of spinosad. Down to Earth 52: 6-13. Cetin H, Yanikoglu A& Cilek JE. 2005. Evaluation of the naturally derived insecticide spinosad against Culex pipiens L. (Diptera: Culicidae) larvae in septic tank water in Antalya, Turkey. J Vector Ecol 30: 151 154. Darriet F, Duchon S & Hougard JM. 2005. Spinosad: a new larvicide against insecticideresistant mosquito larvae. J Am Mosq Control Assoc 21: 495-496. Deken R, Speybroeck N, Gillain G, Sigue H, Batawi K & Bossche V. 2004. The macrocyclic lactone spinosad, a promising insecticide for Tsetse fly control. J Med Entomol 41: 814818. Liu H, Cupp EW, Guo A & Liu N. 2004a. Insecticide resistance in Alabama and Florida mosquito strains of Aedes albopictus. J Med Entomol 41: 946 952. Liu H, Cupp EW, Miche KM, Guo A & Liu N. 2004b. Insecticide resistance and crossresistance in Alabama and Florida strains of Culex quinquefaciatus (S.). J Med Entomol 41: 408 413. McQuate GT, Sylva CD & Jang EB. 2005. Mediterranean fruit fly (Dipt., Tephritidae) suppression in persimmon through bait sprays in adjacent coffee plantings. J Appl Entomol 129: 110 117. Muller G & Y Schlein. 2006 Sugar questing mosquitoes in arid areas gather on scarce blossoms that can be used for control. International J Parasitol. 36:1077-1080. Pest Management Regulatory Agency. 2001. Spinosad. Success 480SC Naturalyte Insect Control Product. Conserve 480 SC Naturalyte Insect Control Product. Regulatory Note REG2001-10 Pest Management Regulatory Agency, Health Canada. Ottawa, Canada. Prez CM. 2006. Spinosad, a naturally-derived insecticide, for control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): efficacy, persistence and oviposition response. Tesis de Maestra. El Colegio de la Frontera Sur, Tapachula, Chiapas.

Peterson LG, Herzog GA, DuRant JA, Pilsner PF, Micinski S & Larson LL. 1998. Ovicidal activity of Tracer against heliotine species in convencional cotton. Down to Earth 53: 22-25. Pineda S, Budia F, Schneider MI, Gobbi A, Viuela E & De Estal P. 2000. Efectividad biolgica de spinosad y del regulador de crecimiento RH-2485 sobre huevos de Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) Lepidoptera: Noctuidae). Boletn de Sanidad Vegetal Plagas 26: 483-493. Paul A, Harrington LC & Scott JG. 2006. Evaluation of novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 43: 55-60. Romi R, Proietti S, Di Luca M & Cristofaro M. 2006. Laboratory evaluation of the bioinsecticide spinosad for mosquito control. J Am Mosq Control Assoc 22: 93-96. Salgado VL. 1997. Studies on the mode of action of spinosad: insect symptoms and physiological correlates. Pest Biochem & Physiol 60: 91 102. Sina BJ & K Aultman. 2001. Resisting resistance. Trends Parasitol 17: 305-306. Stark JD & Vargas RI. 2003. Demographic changes in Daphnia pulex (Leydig) after exposure to the insecticides spinosad and diazinon. Ecotoxicol & Environ Safety 56: 334-338. Thompson GD, Hutchins SH & Sparks TC. 1999. Development of spinosad and attributes of a new class of insect control products. The University of Minnesota. Pagina Web: http://ipmworld.umn.edu/chapters/hutchins2.htm Thompson GD, Dutton R & Sparks TC. 2000. Spinosad a case study: an example from a natural products discovery programme. Pest Management Sci 56: 696 702. Walker K. 2000. Cost-comparison of DDT and alternative insecticides for malaria control. Med & Vet Entomol 14: 345-354. Watson GB. 2001. Actions of insecticidal spinosyns on -aminobutyric acid receptors from small-diameter cockroach neurones. Pest Biochem & Physiol 71:20-28. WHO. 1991. Tropical disease. Progress in research 1989-1990. Biological Control Vectors. Chapter 10. World Health Organization. Geneva. WHO. 1995. Vector Control for Malaria and Other Mosquito Borne Diseases. Report of the WHO Study Group. Technical Report Series No. 857. World Health Organization. Geneva. Williams T, Valle J & Viuela E. 2003. Is the naturally-derived insecticide spinosad compatible with insect natural enemies? Biocontrol Sci & Technol 13: 459-475.

IV. El Uso de la Bacteria Bacillus thuringiensis contra los Mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus
Alejandra Bravo de la Parra
Instituto de Biotecnologa UNAM. Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos, 62250, Mxico. Email: bravo@ibt.unam.mx

4.1 Introduccin
Una de las principales preocupaciones a nivel mundial es el control de insectos que constituyen plagas agrcolas y vectores de enfermedades. Las estadsticas muestran que alrededor del 30% de los cultivos agrcolas se pierden en campo o durante su almacenamiento debido a la presencia de insectos plagas. Adems, muchas enfermedades como la malaria y el dengue, las cuales son trasmitidas por mosquitos, cobran cada ao la vida de decenas de miles de personas, fundamentalmente nios (Porter et al. 1993). Los insectos del orden Dptera, como mosquitos, son vectores de muchas enfermedades infecciosas de amplia distribucin mundial, como el dengue, virosis transmitida mediante la picadura del mosquito Aedes aegypti. Esta enfermedad es un problema de salud pblica, debido a que es endmica en ms de 100 pases tropicales. Desgraciadamente, a la fecha, no existen vacunas ni medicamentos que puedan prevenir o curar la enfermedad, por lo que el mejor mtodo para controlar el dengue es combatir al mosquito vector A. aegypti. Hasta el momento, el control de este tipo de insectos est basado en el empleo indiscriminado de insecticidas qumicos, lo que ha provocado que se generen un sinnmero de efectos adversos a nivel ambiental y de salud pblica. Desde el punto de vista ambiental el uso de plaguicidas qumicos ha contribuido en gran medida a la contaminacin de las aguas, la alteracin del equilibrio ecolgico por destruccin de insectos y otras especies benficas y el surgimiento de plagas agrcolas y vectores nuevos. Adems se ha generado la seleccin de organismos altamente resistentes. Es por estas razones que se requieren nuevas estrategias para el control de vectores de enfermedades en humanos. La utilizacin de microorganismos en el control biolgico de insectos es una alternativa atractiva. En este capitulo se cubren los mecanismos de accin de las toxinas insecticidas producidas por la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) y el desarrollo de tecnologas para la produccin masiva de este microorganismo y su utilizacin en el control de mosquitos vectores.

4.2 Mecanismo de Accin de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biolgico de Insectos Lepidpteros. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce inclusiones cristalinas durante la fase de esporulacin. El factor fundamental que determina la toxicidad de Bt a un amplio rango de insectos, es la presencia de protenas insecticidas ( -endotoxinas) contenidas en las inclusiones cristalinas parasporales. Existen dos superfamilias de toxinas: Cry y Cyt. Las protenas Cry son muy especficas, cada toxina tiene su organismo blanco, son inocuas a

humanos, y son biodegradables. Se han utilizado como bioinsecticidas en agricultura durante los ltimos 40 aos. Actualmente se han descrito ms de 200 toxinas Cry de Bt, sin embargo, los productos comerciales se han desarrollado con un nmero muy reducido de cepas de Bt y aun existe una enorme cantidad de insectos plaga contra las cuales no existe una toxina Cry definida, por lo que es necesario desarrollar ms productos hacia plagas importantes a nivel comercial (de Maagd et al. 2003). Por otro lado, resulta interesante que las protenas Cyt de Bt subsp. israelensis (Bti) potencian sinrgicamente la actividad de las toxinas Cry y retrasan la aparicin de insectos resistentes a Cry. En nuestro laboratorio nos hemos dedicado a entender cmo funcionan las toxinas Cry y cules son las bases que explican el sinergismo entre toxinas Cyt y Cry. El entender cmo funcionan estas toxinas podr proporcionar herramientas para tener productos basados en estas protenas que sean ms eficientes y poder garantizar su inocuidad hacia otros organismos. Las protenas Cry son sintetizadas como protoxinas que cristalizan formando inclusiones de hasta 1 m de longitud. Cuando un organismo susceptible ingiere los cristales, stos son solubilizados en el ambiente alcalino del intestino medio. La protoxina soluble es activada mediante digestin proteoltica. La toxina activa se une a receptores localizados en las microvellosidades de las clulas del epitelio intestinal. Posteriormente, la toxina o parte de ella se inserta en la membrana formando poros inicos, llevando eventualmente a la lisis celular. Recientemente se propuso que la interaccin de la toxina con el primer receptor caderina induce cambios conformacionales en la estructura de la toxina que expone nuevos sitios para digestin proteoltica. Despus de que la toxina Cry se une al receptor caderina se produce un segundo corte proteoltico que elimina a la hlice -1, este procesamiento expone residuos hidrofbicos del dominio I que permite la formacin de un oligmero de 4 subunidades (Gmez et al. 2002). El oligmero es competente para la insercin en la membrana y es capaz de formar poro. El oligmero incrementa 200 veces su afinidad hacia el segundo receptor, la aminopetidasa N, la cual se encuentra y/o se moviliza hacia microdominios de membrana (lipid rafts) donde la composicin lipdica de la membrana es favorable para la insercin del oligmero y formacin del poro (Bravo et al. 2004). El poro formado por la toxina es poco selectivo permitiendo el paso de diversos cationes monovalentes hacia el interior de las clulas columnares, provocando la despolarizacin de la membrana plasmtica y la entrada de agua hasta la lisis celular (Fig. 1). El mecanismo de accin de las toxinas Cry es muy complejo, se necesitan varios pasos y sera imposible que esta toxina evolucionara para tener efecto en mamferos, en otros animales o en plantas.

4.3 Mecanismo de Accin de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biolgico de Mosquitos. En el caso de las toxinas Cry activas contra mosquitos, Bti es una bacteria que produce inclusiones cristalinas compuestas por las protenas Cry (4Aa, 4Ba, 10Aa y 11Aa) y Cyt (1Aa y 2Ba) activas contra larvas de mosquitos, vectores de diversas enfermedades humanas (Goldberg y Margalit 1977). La toxina Cyt1Aa es particularmente importante debido a que suprime la resistencia obtenida en laboratorio hacia toxinas Cry (Wirth et al. 1997) adems de sinergizar la toxicidad de las mismas contra diferentes subespecies de mosquitos (Wu y Chang 1985, Wu y Federici 1994).

Bti se ha utilizado por ms de 25 aos en frica y Asia, y an no se reportan casos de mosquitos resistentes. Pero por qu no se ha generado resistencia a este insecticida? Se ha propuesto que la presencia de ambas toxinas, Cry y Cyt, evita la resistencia, ya que se han podido aislar poblaciones de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, pero cuando se les administran las toxinas Cry junto con Cyt se recupera la toxicidad por completo.

Fig. 1. Modelo del Mecanismo de Accin de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Insectos Lepidpteros. Las toxinas Cry y Cyt matan al mosquito porque interaccionan con la membrana de las clulas del intestino y se insertan en esta membrana formando un poro que termina por romper las clulas y posteriormente matar al insecto. Cuando un insecto se vuelve resistente, es porque se modific la protena que la toxina Cry utiliza como receptor en las clulas del insecto, es decir la toxina Cry ya no se puede unir a las clulas y por lo tanto no puede formar el poro. En nuestro grupo de investigacin encontramos que el mecanismo molecular del sinergismo entre las toxinas Cry y Cyt involucra la interaccin entre estas dos toxinas. Se propone que la toxina Cyt se incorpora en la membrana y desde ah sirve como sitio de unin o receptor para las toxinas Cry. Por eso cuando se genera una poblacin de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, la resistencia es totalmente abolida cuando se administran estas toxinas Cry junto con Cyt. Se han identificado las regiones exactas de las toxinas Cry11A y Cyt1A que participan en esta interaccin. Se han aislado mutantes puntuales en ambas toxinas y se demostr que cuan-do se afecta la unin entre estas dos se abate por completo el efecto sinrgico (Prez et al. 2005). Tambin se demostr que la toxina Cyt se inserta a la membrana de los mosquitos muy eficientemente y desde ah une a la toxina Cry permitiendo que esta forme oligmeros que interaccionan con la membrana y forman el poro, es decir que la protena Cyt funciona como un receptor proteico para las toxinas Cry (Fig. 2). Este mecanismo explica la falta de aparicin de insectos resistentes a Bti en la naturaleza y tambin el mecanismo del sinergismo entre estas toxinas. ste es el primer ejemplo de una bacteria patgena cuya virulencia se basa en toxinas formadoras de poro y que ella misma

produce una protena que funciona como receptor de sus toxinas. Sin duda Bti se puede considerar una bacteria muy interesante ya que desarroll un mecanismo que le permite aumentar su actividad txica y adems evitar la aparicin de insectos resistentes a sus toxinas.

Fig. 2. Modelo del Mecanismo de Accin de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Mosquitos.

4.4 Utilizacin de Bti en control de mosquitos En el ao de 1983, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) implement un programa en 11 pases africanos, de utilizacin de Bti en el control de Simulium (vectores de oncocercosis) ya que aparecieron poblaciones de Simulium resistentes al insecticida qumico que se utilizaba (Guillet et al. 1990). Este programa ha sido uno de los ms exitosos en el control de esta enfermedad. En Alemania existe un programa ambicioso para el control en el ro Rhin del mosquito Aedes vexans utilizando Bti, tambin por la aparicin de poblaciones de mosquitos resistentes al insecticida qumico Temefos (Becker 1997). En los ltimos aos se est utilizando Bti en Brasil para controlar las poblaciones de Aedes aegypti en la regin de Ro de Janeiro, debido a la aparicin de poblaciones resistentes a insecticidas qumicos y por un repunte en los casos de dengue hemorrgico en esta regin (Regis et al. 2000). En todos estos casos, Bti ha mostrado que es un insecticida biolgico eficiente en el control de estas poblaciones de insectos vectores de enfermedades humanas. Una de las ventajas ms importantes de Bti para su aplicacin en programas de control de poblaciones de mosquito es su alta especificidad y su inocuidad hacia el hombre, animales e incluso otras poblaciones de insectos. Las formulaciones de Bti se pueden aplicar a reservorios de agua que se utilizan en consumo humano, lo que no es factible con los insecticidas qumicos. Otra ventaja es la falta de aparicin de insectos resistentes. Despus de ms de 20 aos de aplicacin masiva de productos basados en Bti, no hay reportes de aparicin de poblaciones de mosquitos resistentes a Bti. De hecho Bti se ha ocupado tradicionalmente en regiones donde las poblaciones de mosquitos han generado resistencia a insecticidas qumicos. El xito en la aplicacin de Bti para el control de mosquitos depende en gran medida de tener una formulacin efectiva adecuada al lugar en donde ser aplicada. Como se explic anterior-mente, Bti es activo contra el estado larvario de los mosquitos. Es por esto que su aplicacin se tiene que dar en los reservorios de agua donde se desarrollan las larvas. En la actualidad existen formulaciones de Bti comerciales que garantizan el acceso de la toxina a

las larvas de Aedes aegypti sin enturbiar el agua. La Dra. Regis desarroll una formulacin donde el tiempo de actividad insecticida es de un mes a mes y medio, dependiendo si el reservorio de agua a tratar est expuesto a luz solar (Regis y Nielsen-Le Roux 2000). Otro aspecto importante para poder tener xito en el control de A. aegypti utilizando Bti, es la participacin activa de la comunidad. Esta tiene que ser la responsable de la aplicacin de la formulacin de Bti y permitir el acceso a sus casas y reservorios de agua al personal encargado de monitorear la efectividad y la aplicacin de Bti. Por lo anterior cualquier programa de aplicacin de Bti requiere una campaa de informacin y una convocatoria amplia de la sociedad para su aplicacin. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un producto formulado con Bt como componente activo, que fue evaluado a nivel laboratorio. La cepa de Bt utilizada es una cepa mexicana que presenta grandes semejanzas a Bti (Ibarra et al. 2003). El crecimiento de esta bacteria se realiz en la planta piloto del Instituto de Biotecnologa UNAM. ste es un formulado slido al que se aadieron atrayentes para la larva, es activo durante un mes, matando el 100% de las larvas y no se disuelve en el agua por lo que permanece en el reservorio de agua. Este ltimo punto es muy importante ya que implica que este formulado no se diluye cuando se presenta recambio de agua constante. El siguiente paso es realizar una prueba piloto en casas para evaluar la efectividad de este formulado y determinar si es necesario hacer nuevas modificaciones.

4.5 Conclusiones
En esta presentacin se describi a detalle el mecanismo de accin de las toxinas Cry de la bacteria Bacillus thuringiensis, en donde se observa que la alta especificidad se basa en la interaccin con diferentes receptores y se mostr que la bacteria Bt israelensis produce una protena (Cyt) que funciona como receptor de sus otras toxinas (Cry). De esta manera Bti desarroll un mecanismo que le permite aumentar su actividad txica y evitar la aparicin de insectos resistentes a sus toxinas. Finalmente, se present el desarrollo de sistemas de produccin y de formulaciones efectivas que permiten tener una estrategia alternativa para controlar al mosquito transmisor del dengue en nuestro pas.

Podemos decir que el desarrollo de estrategias para el control de plagas utilizando B. thuringiensis, tiene potencial para sustituir paulatinamente el uso de insecticidas y biocidas qumicos, lo que podra proteger a la poblacin de infecciones de dengue y permitir tener un medio ambiente limpio a travs del uso de sustancias no txicas y biodegradables. 4.6 Literatura Citada Becker N. 1997. Microbial control of mosquitoes: management of the Upper Rhin mosquito population as model. Parasitol Today 13: 485-487.

Bravo A, Gmez I, Conde J, Muoz-Garay C, Snchez J, Miranda R, Zhuang M, Gill SS & Sobern M. 2004. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringienis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochim Biophys Acta 1667:38-46. De Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N & Schnepf HE. 2003. Structure, diversity and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet 37:409-433. Goldberg LJ & Margalit J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq News 37:355358. Gmez I, Snchez J, Miranda R, Bravo A & Soberon M. 2002. Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix -1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin. FEBS lett. 513: 242-246. Guillet P, Kurstack DC & Meyer BR. 1990. Use of Bacillus thuringiensis israeliensis for Onchocerciasis control in West Africa. In: H. de Barjac, DJ Sutherland (eds) Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, Rutgers Univ Press, New Jersey, 187-190. Ibarra JE, del Rincn MC, Ordz S, Noriega D, Benintende G, Monnerat R, Regis L, de Oliveir CMF, Snchez J & Bravo A. 2003. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquito species. Appl Environ Microbiol 69:5269-5274. Prez C, Fernandez LE, Sun J, Folch JL, Gill SS, Sobern M & Bravo A. 2005. Bti Cry11Aa and Cyt1Aa toxins interactions support the synergism-model that Cyt1Aa functions as membrane-bound receptor. Proc Natl Acad Sci (USA) 102:18303-18308. Porter AG, Davidson EW & Liu JW. 1993. Mosquitocidal toxins of Bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol Rev 57, 838861. Regis L, da Silva SB & Melo-Santos MA. 2000. The use of bacterial larvicides in mosquito and black fly control programes in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 95:207-210. Regis L & Nielsen-LeRoux C. 2000 Management of Resistance to Bacterial Vector Control. In: E Charles J-F, Dlecluse A & LeRoux N (eds.) Entomopathogenic Bacteria: From Laboratory to Field Application. Kluwer Academic Publishers.The Netherlands. p 410440. Wirth MC, Georghiou GP & Federici BA. 1997. CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIV resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus. Proc Natl Acad Sci. (USA) 94:1053610540. Wu D & Chang FN. 1985. Synergism in mosquitocidal activity of 26 and 65 kDa proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis crystal. FEBS Lett. 190:232236.

Wu D, Johnson JJ & Federici BA. 1994. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 13:965972.

IV. El Uso de la Bacteria Bacillus thuringiensis contra los Mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus
Alejandra Bravo de la Parra
Instituto de Biotecnologa UNAM. Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos, 62250, Mxico. Email: bravo@ibt.unam.mx

4.1 Introduccin
Una de las principales preocupaciones a nivel mundial es el control de insectos que constituyen plagas agrcolas y vectores de enfermedades. Las estadsticas muestran que alrededor del 30% de los cultivos agrcolas se pierden en campo o durante su almacenamiento debido a la presencia de insectos plagas. Adems, muchas enfermedades como la malaria y el dengue, las cuales son trasmitidas por mosquitos, cobran cada ao la vida de decenas de miles de personas, fundamentalmente nios (Porter et al. 1993). Los insectos del orden Dptera, como mosquitos, son vectores de muchas enfermedades infecciosas de amplia distribucin mundial, como el dengue, virosis transmitida mediante la picadura del mosquito Aedes aegypti. Esta enfermedad es un problema de salud pblica, debido a que es endmica en ms de 100 pases tropicales. Desgraciadamente, a la fecha, no existen vacunas ni medicamentos que puedan prevenir o curar la enfermedad, por lo que el mejor mtodo para controlar el dengue es combatir al mosquito vector A. aegypti. Hasta el momento, el control de este tipo de insectos est basado en el empleo indiscriminado de insecticidas qumicos, lo que ha provocado que se generen un sinnmero de efectos adversos a nivel ambiental y de salud pblica. Desde el punto de vista ambiental el uso de plaguicidas qumicos ha contribuido en gran medida a la contaminacin de las aguas, la alteracin del equilibrio ecolgico por destruccin de insectos y otras especies benficas y el surgimiento de plagas agrcolas y vectores nuevos. Adems se ha generado la seleccin de organismos altamente resistentes. Es por estas razones que se requieren nuevas estrategias para el control de vectores de enfermedades en humanos. La utilizacin de microorganismos en el control biolgico de insectos es una alternativa atractiva. En este capitulo se cubren los mecanismos de accin de las toxinas insecticidas producidas por la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) y el desarrollo de tecnologas para la produccin masiva de este microorganismo y su utilizacin en el control de mosquitos vectores.

4.2 Mecanismo de Accin de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biolgico de Insectos Lepidpteros. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce inclusiones cristalinas durante la fase de esporulacin. El factor fundamental que determina la toxicidad de Bt a un amplio rango de insectos, es la presencia de protenas insecticidas ( -endotoxinas) contenidas en las inclusiones cristalinas parasporales. Existen dos superfamilias de toxinas: Cry y Cyt.

Las protenas Cry son muy especficas, cada toxina tiene su organismo blanco, son inocuas a humanos, y son biodegradables. Se han utilizado como bioinsecticidas en agricultura durante los ltimos 40 aos. Actualmente se han descrito ms de 200 toxinas Cry de Bt, sin embargo, los productos comerciales se han desarrollado con un nmero muy reducido de cepas de Bt y aun existe una enorme cantidad de insectos plaga contra las cuales no existe una toxina Cry definida, por lo que es necesario desarrollar ms productos hacia plagas importantes a nivel comercial (de Maagd et al. 2003). Por otro lado, resulta interesante que las protenas Cyt de Bt subsp. israelensis (Bti) potencian sinrgicamente la actividad de las toxinas Cry y retrasan la aparicin de insectos resistentes a Cry. En nuestro laboratorio nos hemos dedicado a entender cmo funcionan las toxinas Cry y cules son las bases que explican el sinergismo entre toxinas Cyt y Cry. El entender cmo funcionan estas toxinas podr proporcionar herramientas para tener productos basados en estas protenas que sean ms eficientes y poder garantizar su inocuidad hacia otros organismos. Las protenas Cry son sintetizadas como protoxinas que cristalizan formando inclusiones de hasta 1 m de longitud. Cuando un organismo susceptible ingiere los cristales, stos son solubilizados en el ambiente alcalino del intestino medio. La protoxina soluble es activada mediante digestin proteoltica. La toxina activa se une a receptores localizados en las microvellosidades de las clulas del epitelio intestinal. Posteriormente, la toxina o parte de ella se inserta en la membrana formando poros inicos, llevando eventualmente a la lisis celular. Recientemente se propuso que la interaccin de la toxina con el primer receptor caderina induce cambios conformacionales en la estructura de la toxina que expone nuevos sitios para digestin proteoltica. Despus de que la toxina Cry se une al receptor caderina se produce un segundo corte proteoltico que elimina a la hlice -1, este procesamiento expone residuos hidrofbicos del dominio I que permite la formacin de un oligmero de 4 subunidades (Gmez et al. 2002). El oligmero es competente para la insercin en la membrana y es capaz de formar poro. El oligmero incrementa 200 veces su afinidad hacia el segundo receptor, la aminopetidasa N, la cual se encuentra y/o se moviliza hacia microdominios de membrana (lipid rafts) donde la composicin lipdica de la membrana es favorable para la insercin del oligmero y formacin del poro (Bravo et al. 2004). El poro formado por la toxina es poco selectivo permitiendo el paso de diversos cationes monovalentes hacia el interior de las clulas columnares, provocando la despolarizacin de la membrana plasmtica y la entrada de agua hasta la lisis celular (Fig. 1). El mecanismo de accin de las toxinas Cry es muy complejo, se necesitan varios pasos y sera imposible que esta toxina evolucionara para tener efecto en mamferos, en otros animales o en plantas.

4.3 Mecanismo de Accin de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biolgico de Mosquitos. En el caso de las toxinas Cry activas contra mosquitos, Bti es una bacteria que produce inclusiones cristalinas compuestas por las protenas Cry (4Aa, 4Ba, 10Aa y 11Aa) y Cyt (1Aa y 2Ba) activas contra larvas de mosquitos, vectores de diversas enfermedades humanas (Goldberg y Margalit 1977). La toxina Cyt1Aa es particularmente importante debido a que suprime la resistencia obtenida en laboratorio hacia toxinas Cry (Wirth et al. 1997) adems de sinergizar la toxicidad de las mismas contra diferentes subespecies de mosquitos (Wu y Chang 1985, Wu y Federici 1994).

Bti se ha utilizado por ms de 25 aos en frica y Asia, y an no se reportan casos de mosquitos resistentes. Pero por qu no se ha generado resistencia a este insecticida? Se ha propuesto que la presencia de ambas toxinas, Cry y Cyt, evita la resistencia, ya que se han podido aislar poblaciones de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, pero cuando se les administran las toxinas Cry junto con Cyt se recupera la toxicidad por completo.

Fig. 1. Modelo del Mecanismo de Accin de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Insectos Lepidpteros. Las toxinas Cry y Cyt matan al mosquito porque interaccionan con la membrana de las clulas del intestino y se insertan en esta membrana formando un poro que termina por romper las clulas y posteriormente matar al insecto. Cuando un insecto se vuelve resistente, es porque se modific la protena que la toxina Cry utiliza como receptor en las clulas del insecto, es decir la toxina Cry ya no se puede unir a las clulas y por lo tanto no puede formar el poro. En nuestro grupo de investigacin encontramos que el mecanismo molecular del sinergismo entre las toxinas Cry y Cyt involucra la interaccin entre estas dos toxinas. Se propone que la toxina Cyt se incorpora en la membrana y desde ah sirve como sitio de unin o receptor para las toxinas Cry. Por eso cuando se genera una poblacin de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, la resistencia es totalmente abolida cuando se administran estas toxinas Cry junto con Cyt. Se han identificado las regiones exactas de las toxinas Cry11A y Cyt1A que participan en esta interaccin. Se han aislado mutantes puntuales en ambas toxinas y se demostr que cuan-do se afecta la unin entre estas dos se abate por completo el efecto sinrgico (Prez et al. 2005). Tambin se demostr que la toxina Cyt se inserta a la membrana de los mosquitos muy eficientemente y desde ah une a la toxina Cry permitiendo que esta forme oligmeros que interaccionan con la membrana y forman el poro, es decir que la protena Cyt funciona como un receptor proteico para las toxinas Cry (Fig. 2). Este mecanismo explica la falta de aparicin de insectos resistentes a Bti en la naturaleza y tambin el mecanismo del sinergismo entre estas toxinas. ste es el primer ejemplo de una bacteria patgena cuya virulencia se basa en toxinas formadoras de poro y que ella misma

produce una protena que funciona como receptor de sus toxinas. Sin duda Bti se puede considerar una bacteria muy interesante ya que desarroll un mecanismo que le permite aumentar su actividad txica y adems evitar la aparicin de insectos resistentes a sus toxinas.

Fig. 2. Modelo del Mecanismo de Accin de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Mosquitos.

4.4 Utilizacin de Bti en control de mosquitos En el ao de 1983, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) implement un programa en 11 pases africanos, de utilizacin de Bti en el control de Simulium (vectores de oncocercosis) ya que aparecieron poblaciones de Simulium resistentes al insecticida qumico que se utilizaba (Guillet et al. 1990). Este programa ha sido uno de los ms exitosos en el control de esta enfermedad. En Alemania existe un programa ambicioso para el control en el ro Rhin del mosquito Aedes vexans utilizando Bti, tambin por la aparicin de poblaciones de mosquitos resistentes al insecticida qumico Temefos (Becker 1997). En los ltimos aos se est utilizando Bti en Brasil para controlar las poblaciones de Aedes aegypti en la regin de Ro de Janeiro, debido a la aparicin de poblaciones resistentes a insecticidas qumicos y por un repunte en los casos de dengue hemorrgico en esta regin (Regis et al. 2000). En todos estos casos, Bti ha mostrado que es un insecticida biolgico eficiente en el control de estas poblaciones de insectos vectores de enfermedades humanas. Una de las ventajas ms importantes de Bti para su aplicacin en programas de control de poblaciones de mosquito es su alta especificidad y su inocuidad hacia el hombre, animales e incluso otras poblaciones de insectos. Las formulaciones de Bti se pueden aplicar a reservorios de agua que se utilizan en consumo humano, lo que no es factible con los insecticidas qumicos. Otra ventaja es la falta de aparicin de insectos resistentes. Despus de ms de 20 aos de aplicacin masiva de productos basados en Bti, no hay reportes de aparicin de poblaciones de mosquitos resistentes a Bti. De hecho Bti se ha ocupado tradicionalmente en regiones donde las poblaciones de mosquitos han generado resistencia a insecticidas qumicos. El xito en la aplicacin de Bti para el control de mosquitos depende en gran medida de tener una formulacin efectiva adecuada al lugar en donde ser aplicada. Como se explic anterior-mente, Bti es activo contra el estado larvario de los mosquitos. Es por esto que su aplicacin se tiene que dar en los reservorios de agua donde se desarrollan las larvas. En la actualidad existen formulaciones de Bti comerciales que garantizan el acceso de la toxina a

las larvas de Aedes aegypti sin enturbiar el agua. La Dra. Regis desarroll una formulacin donde el tiempo de actividad insecticida es de un mes a mes y medio, dependiendo si el reservorio de agua a tratar est expuesto a luz solar (Regis y Nielsen-Le Roux 2000). Otro aspecto importante para poder tener xito en el control de A. aegypti utilizando Bti, es la participacin activa de la comunidad. Esta tiene que ser la responsable de la aplicacin de la formulacin de Bti y permitir el acceso a sus casas y reservorios de agua al personal encargado de monitorear la efectividad y la aplicacin de Bti. Por lo anterior cualquier programa de aplicacin de Bti requiere una campaa de informacin y una convocatoria amplia de la sociedad para su aplicacin. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un producto formulado con Bt como componente activo, que fue evaluado a nivel laboratorio. La cepa de Bt utilizada es una cepa mexicana que presenta grandes semejanzas a Bti (Ibarra et al. 2003). El crecimiento de esta bacteria se realiz en la planta piloto del Instituto de Biotecnologa UNAM. ste es un formulado slido al que se aadieron atrayentes para la larva, es activo durante un mes, matando el 100% de las larvas y no se disuelve en el agua por lo que permanece en el reservorio de agua. Este ltimo punto es muy importante ya que implica que este formulado no se diluye cuando se presenta recambio de agua constante. El siguiente paso es realizar una prueba piloto en casas para evaluar la efectividad de este formulado y determinar si es necesario hacer nuevas modificaciones.

4.5 Conclusiones
En esta presentacin se describi a detalle el mecanismo de accin de las toxinas Cry de la bacteria Bacillus thuringiensis, en donde se observa que la alta especificidad se basa en la interaccin con diferentes receptores y se mostr que la bacteria Bt israelensis produce una protena (Cyt) que funciona como receptor de sus otras toxinas (Cry). De esta manera Bti desarroll un mecanismo que le permite aumentar su actividad txica y evitar la aparicin de insectos resistentes a sus toxinas. Finalmente, se present el desarrollo de sistemas de produccin y de formulaciones efectivas que permiten tener una estrategia alternativa para controlar al mosquito transmisor del dengue en nuestro pas.

Podemos decir que el desarrollo de estrategias para el control de plagas utilizando B. thuringiensis, tiene potencial para sustituir paulatinamente el uso de insecticidas y biocidas qumicos, lo que podra proteger a la poblacin de infecciones de dengue y permitir tener un medio ambiente limpio a travs del uso de sustancias no txicas y biodegradables. 4.6 Literatura Citada Becker N. 1997. Microbial control of mosquitoes: management of the Upper Rhin mosquito population as model. Parasitol Today 13: 485-487.

Bravo A, Gmez I, Conde J, Muoz-Garay C, Snchez J, Miranda R, Zhuang M, Gill SS & Sobern M. 2004. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringienis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochim Biophys Acta 1667:38-46. De Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N & Schnepf HE. 2003. Structure, diversity and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet 37:409-433. Goldberg LJ & Margalit J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq News 37:355358. Gmez I, Snchez J, Miranda R, Bravo A & Soberon M. 2002. Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix -1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin. FEBS lett. 513: 242-246. Guillet P, Kurstack DC & Meyer BR. 1990. Use of Bacillus thuringiensis israeliensis for Onchocerciasis control in West Africa. In: H. de Barjac, DJ Sutherland (eds) Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, Rutgers Univ Press, New Jersey, 187-190. Ibarra JE, del Rincn MC, Ordz S, Noriega D, Benintende G, Monnerat R, Regis L, de Oliveir CMF, Snchez J & Bravo A. 2003. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquito species. Appl Environ Microbiol 69:5269-5274. Prez C, Fernandez LE, Sun J, Folch JL, Gill SS, Sobern M & Bravo A. 2005. Bti Cry11Aa and Cyt1Aa toxins interactions support the synergism-model that Cyt1Aa functions as membrane-bound receptor. Proc Natl Acad Sci (USA) 102:18303-18308. Porter AG, Davidson EW & Liu JW. 1993. Mosquitocidal toxins of Bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol Rev 57, 838861. Regis L, da Silva SB & Melo-Santos MA. 2000. The use of bacterial larvicides in mosquito and black fly control programes in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 95:207-210. Regis L & Nielsen-LeRoux C. 2000 Management of Resistance to Bacterial Vector Control. In: E Charles J-F, Dlecluse A & LeRoux N (eds.) Entomopathogenic Bacteria: From Laboratory to Field Application. Kluwer Academic Publishers.The Netherlands. p 410440. Wirth MC, Georghiou GP & Federici BA. 1997. CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIV resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus. Proc Natl Acad Sci. (USA) 94:1053610540. Wu D & Chang FN. 1985. Synergism in mosquitocidal activity of 26 and 65 kDa proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis crystal. FEBS Lett. 190:232236.

Wu D, Johnson JJ & Federici BA. 1994. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 13:965972.

VI. Protozoarios y Microsporidios Entomoparsitos de Aedes aegypti

Filiberto Reyes Villanueva1 y James J. Becnel2

Instituto Politcnico Nacional. Centro de Biotecnologa Genmica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elas Pia. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, Mxico. Email: frv65@hotmail.com 2 Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, USDA/ARS/CMAVE, Gainesville, Fl, 32604, P.O. Box 14565, USA. E-mail: jbecnel@gainesville.usda.ufl.edu

6.1 Introduccin Los miembros del subreino Protozoa representan un grupo heterogneo de protistas que pertenecen al reino Protoctista (Sleigh 1989). El termino Protozoo fue usado por primera vez por Goldfuss en 1817, segn Dobell (1911) y citado por Cox (1991). Estos organismos unicelulares comprenden un grupo antiguo que se origin, antes de que aparecieran las levaduras y animales simples como porferos y celenterados. En general poseen una fase mvil con cilios, flagelos o pseudpodos. Las clulas vegetativas tienen membrana y carecen de una pared estructural rgida como en hongos y plantas. En muchos casos la membrana est cubierta por el glicocalix, una pelcula que contiene los dominios de glicolpidos y glicoprotenas, ambos responsables por las funciones del reconocimiento y adhesin a la clula husped, adems de funcionar como barrera qumica y albergar a varias enzimas. Debido a su naturaleza hidrocarbonada, el glicocalix se puede observar fcilmente con varias pruebas de lectina. La estructura dinmica del glicocalix proporciona una alta capacidad de sobrevivencia a los protozoarios cuando estn dentro del husped, para evitar ser reconocidos por el sistema inmune (Boucias y Pendland 1998). Son bsicamente acuticos y la mayora son anaerobios aerotolerantes capaces de desarrollarse en un ambiente reducido de oxgeno. Usan la ruta metablica de la gliclisis para catabolizar azcares y excretar cidos orgnicos. Carecen de un tracto digestivo por lo que ingieren y translocan molculas pequeas como aminocidos, carbohidratos, vitaminas, etc. mediante sistemas de transporte activo compuestos por membranas protenicas. Las molculas grandes y materiales slidos son ingeridas como solutos (pinocitosis) o como partculas (fagocitosis), en vacuolas alimenticias que se fusionan a lisosomas donde son hidrolizados a compuestos ms simples. Los taxa ms grandes de protozoarios contienen especies que van desde aquellas de vida libre hasta endocomensales obligados. En estos ltimos existen especies que viven en asociacin ntima con eucariontes y exhiben un rango amplio de relaciones simbiticas. Por ejemplo, los que viven en el tracto digestivo de insectos pueden ser mutualistas, con una funcin clave en proporcionar los nutrientes necesarios para el insecto; otros protozoarios son parsitos y usan al insecto como husped primario o secundario (Brooks 1988). Muchos son parsitos intracelulares obligatorios como los microsporidios. Estos agentes infecciosos

poseen la capacidad de poder entrar a la clula husped, multiplicarse, afectar o no las funciones bsicas de la clula y despus salir de ella. Los protozoarios son el grupo de entomopatgenos con mayor diversidad especfica y numrica. Existen seis Phyla (Apicomplexa, Ciliophora, Rhyzopoda, Zoomastigina, Haplosporidia y Microsporidia) que contienen especies entomopatgenas. Debido a los cambios constantes en la taxonoma y a que Boucias y Pendland (1998) revisaron las generalidades de protozoarios patgenos de insectos, aqu slo se tocarn los grupos de gregarinas y microsporidios, los cuales tienen el mayor potencial como agentes de biocontrol de insectos plaga. Cabe aclarar que en el pasado ambos grupos fueron ubicados por Kudo (1954) en la clase Sporozoa, la cual fue propuesta por Butschli (1883-1889). 6.2 Apicomplexa Gregarinas La taxonoma de este grupo ha sido ambigua porque los protozoarios, en general, estn formados por grupos parafilticos (grupos con ancestro comn pero que no incluyen todos sus descendientes) (Lipscomb 1991), y por lo mismo, varios esquemas han sido propuestos. Uno, el ms aceptado y actualmente vigente, es el de Levine (1985), quien propuso el phyllum Apicomplexa para las gregarinas en general y despus lo divide en dos clases: Perkinasida (con slo una especie parsita de ostras, Perkinsus marinus) y Sporozoasida. Esta ltima la divide en tres subclases: Gregarinasina, Coccidiasina y Piroplasmasina. Segn Levine, Apicomplexa agrupa ~ 4,000 especies y ms de 300 gneros, y para gregarinas seala que hay ~ 218 gneros. Al nivel de orden, Levine adopt el criterio de Grass (1953), dividiendo la clase Gregarinasina en tres rdenes: Archigregarinida (4 gneros y ~ 15 especies), Neogregarinida (14 gneros y ~ 50 especies) y Eugregarinorida (~ 200 gneros y 1,400 especies). Otra propuesta ha sugerido la clase Gregarinea, phyllum Sporozoea y reino Protista (Sleigh 1989). Con un enfoque ms natural, se ubican a los microsporidios en un phyllum aparte (Microspora) debido a sus peculiares caractersticas. Posteriormente, con un ngulo artificial y basado en el criterio anterior, otro zologo (Cox 1991) propuso una clasificacin para los protozoarios, ordenndolos en siete grupos y diez phylla dentro del Reino Protista. Aqu, las gregarinas tambin quedan en la clase Gregarinea, phyllum Sporozoea y en el grupo 7: los Esporozoariossin medios obvios de locomocin. Aqu se adopta el sistema de los cinco Reinos para los seres vivos (Whittaker 1959) que despus fue modificado (Grant 1963) en: Monera (procariontes unicelulares), Protista (eucariotes unicelulares), Fungi (hongos), Animalia (animales) y Plantae (plantas). El Cuadro 1 muestra algunos reportes de nuevas especies en las ltimas dcadas, como fuente de informacin para el lector interesado en la taxonoma de estos protozoarios. A pesar del pobre conocimiento del grupo, la mayora de las especies conocidas de gregarinas se han encontrado en insectos. Por ejemplo, se han encontrado en 850 (<0.31%) de las ms de 277,000 especies conocidas de escarabajos (Levine 1988). As, dentro del total de los invertebrados conocidos, slo se conoce una tercera parte del 1% correspondiente a las gregarinas. La descripcin de nuevas especies se basa en la morfometra de los diferentes estados del ciclo biolgico, asumiendo que existe especificidad del husped. Sin embargo, mediante un anlisis electrofortico de los polipp-tidos (Schrevel y Philippe 1993), patrones de isoenzimas y el secuenciado de la pequea subunidad de DNA ribosmico se han podido separar especies ntimamente relacionadas.

Cuadro 1. Algunos Nuevos Gneros y Especies de Gregarinas Entomoparsitas Reportadas en la Literatura de los Ultimos 30 Aos. Gregarina Amoebogregarina nigra Husped Autor Kula y Clopton Ao 1999

Melanoplus differentialis
Gregarina triboliorum Actinocephalus longus Mukundaella vannusus Odonaticola truncatus Gregarina blattarum Leydiana migrator Gregarina termitis Tribolium confusum Enallagma pervum Onychogargia atrociana Pseudagrion decorum Blatella humbertiana Gromphadorhina portentosa Reticulotermes flavipes R. virginianus Elyptocystis triboli Ascogregarina bostrichidorum Farinocystis tribolii Anisolobus indicus Gregarina ovata Gregarina forficulae Ascogregarina geniculati Brutiospora indicola Diplocystis tipulae Monoica apis Apigregarina stammani Acuta rousseaui Leydiana apis Con la biologa molecular ya se est buscando una clasificacin menos artificial. Las sequencias genmicas en el ARN ribosmico de las gregarinas, difieren de las secuencias de los otros grupos de Sporozoea y se ha postulado que comprenden un grupo monofiltico (Carreo et al. 1999). Se especula que este grupo se origin como una rama primigenia dentro del rbol filo-gentico del resto de los grupos conocidos como esporozoarios. Una posible explicacin es el tipo de gamogonia que presentan (formacin de gametos a partir de Aedes geniculatus Stethorus spp. Tipula paludosa Munstermann y Levine Kundu y Haldar Scherlock Stejskal 1983 1981 1979 1972 Tribolium castaneum Sengupta et al. Purrini y Keil 1991 1989 Bhoopaty Clopton Hall y Hostettler 1996 1995 1993 Wattwood et al. Sarkar 1997 1997

Prostephanus truncatus
Tribolium castaneum Coccinella septempunctata Forficula auriculata Rabindra et al. Haldar et al. Ball et al. 1989 1988 1986

Apis mellifera

gamontes) con un rara unin de gamontes o formas sexuales, llamada syzygy (del griego syn = junto, zygon = huevo). En este fenmeno, numerosos gametos masculinos y femeninos se diferencian dentro de cada tipo o sexo de gamonte, en lo que es el gamotocito. Las gregarinas son parsitos monoxenos o estenoxenos de cavidades corporales de invertebrados, con trofozoitos (gamontes) y fases sexuales grandes extracelulares (Cox 1991). Artificialmente, las gregarinas se dividen en dos grupos por la morfologa del trofozoito. El primero son las gregarinas Cefalinas (Cephaline), en donde el trofozoito o gamonte se divide en tres partes: el epimerito (rgano apical para adhesin), protomerito (seccin anterior de la clula) y deuteromerito (seccin posterior de la clula). El segundo es las gregarinas Acefalinas (Acephaline) con slo dos partes: el protomerito y el deuteromerito. La divisin celular mltiple o esquizogonia sirve para una clasificacin de las gregarinas en los tres rdenes ya mencionados: Orden Archigregarinida Sin esquizogonia y trofozoitos con microtbulos subpeliculares y movimientos pendulares. Parsitos de invertebrados marinos. Ej. Selenidioides. Orden Eugregarinorida Sin merogonia y trofozoitos que se deslizan mediante ondas a lo largo de la clula. Parsitos de insectos y otros invertebrados. Ej. Ascogregarina spp. comn en Dptera (Insecta). Pueden ser aseptadas (Acephalinas) o septadas (Cephalinas). Orden Neogregarinida Merogonia presente y parsitos de insectos. Se pueden reproducir por merogonia en epitelio o cuerpo graso del husped, y por lo mismo son ms virulentas que las Eugregarinas. Ejemplo, Mattesia grandis, parsito de Anthonomus grandis (plaga del algodonero). Son ms pequeas que las eugregarinas y tienen gamonte aseptado. Actual-mente, existen 214 gneros y ~1,450 especies de estas gregarinas que parasitan insectos (Levine 1985). Respecto a la merogonia (divisin celular mltiple), existen dos tipos en las neogregarinas y son las siguientes: Micronuclear. Ocurre en esporozoitos cuando se transforman en parsitos intracelulares. En Mattesia trigodermae, una vez que sus oocistes son ingeridos y dan lugar a los esporozoitos, estos emigran al cuerpo graso de su husped, Trigoderma granarium (una plaga de granos almacenados) (Canning 1964). Macronucelar. En la misma interaccin parsito/husped, los merozoitos pequeos a su vez, por esquizogonia, dan lugar a ncleos ms grandes (~ 2 m dimetro) apareciendo ~20 merozoitos (Ormieres et al. 1971). 6.3 Ciclo de Vida y Morfologa Una vez que los oocistes (usualmente en forma de un baln de futbol americano) estn en el estmago del husped, cada uno origina ocho (o ms) esporozoitos (bro 1976). Se transforman en parsitos intracelulares o merozoitos mediante esquizogonia, como sucede en la neogregarina Lipocystis polyspora en su husped Panorpa communis (Corliss 2000). Otra opcin es que como parsitos intracelulares en fase de trofozoito temprano, no tienen reproduccin esquizognica, como se observa en la eugregarina Ascogregarina taiwanensis en su husped Aedes albopictus (Reyes-Villanueva 2001a). En este caso, la fase parsita intracelular dura las primeras 6072 horas despus que ocurre la infeccin va oral, para despus romper la clula husped y salir al lmen mesentrico larval (Walsh y Gallaway 1969). Tambin existe la modalidad de que los esporozoitos recin eclosionados pasen a la cavidad

corporal (hemocele) o slo se adhieran como parsitos extracelulares a las clulas epiteliales mesentricas, como se ha reportado en la eugregarina Leydana canadensis en su larva husped, el lepidptero Lambdina fiscellaria (Lucarotti 2000), o en Gregarina blattarum parasitando el estmago de la cucaracha Blatella humbertiana (Bhoopathy 1996). Despus de crecer un tiempo, como endo o ecto-parsitos celulares, los trofozoitos se despren-den del epitelio y se transforman en gamontes, los cuales son formas libres que se desplazan en el espacio ectoperitrofico (Fig. 1). Los gamontes son formas sexuales (haploides) idnticas morfolgicamente, por lo que al encontrarse dos de diferente signo o sexo, se fusionan en una syzygy (Fig. 2). Despus ambos se rodean de una cubierta protectora y se trans-forman en un gametocito que es excretado en ~ dos semanas despus de la infeccin como ocurre en Hoplorhynchus spp. parsito del odonato Enallagma boreale (bro 1974).

Fig. 1. Infeccin doble inducida en una larva de Aedes albopictus. Los dos gamontes de color claro (izquierda) son de Ascogregarina culicis, y el de citoplasma color caf (derecha) es de Ascogregarina taiwanensis. La lnea inferior izquierda es una escala de 100 micras (Foto tomada por el Dr. Filiberto Reyes-Villanueva). En el gametocito, cada gamonte o forma sexual entra en una serie de divisiones mltiples o gametogonia (= gamogonia) para originar gametos masculinos (biflagelados) y femeninos (no flagelados redondeados). Cada par de gametos se fusiona para dar origen a un oociste o forma infecciosa (tambin la forma de resistencia). As, el gametocito se transforma en un esporocito, el cual libera cientos de oocistes que van a dar al medio ambiente para reiniciar el ciclo (Fig. 2). De un oociste (= espora) emergen ocho esporozoitos, pero a veces emergen 16, 32 y hasta 64 esporozoitos a travs de canales que salen del oociste, como se ha reportado en Ascogregarina bostrichidorum que ejerce una fuerte patogenicidad en Prostephanus truncatus (Purrini y Keil 1989). Los esporozoitos pueden ser parsitos intracelulares tempranos, como se observa en la eugregarina A. taiwanensis en larvas del mosquito Aedes albopictus, donde no hay una merogonia vegetativa (Chen et al. 1997). Sin embargo, en la neogregarina Ophryocystis electroscirrha si existe una merogonia cuando los esporozoitos invaden las clulas epiteliales de las larvas de Danaus plexippus (la mariposa monarca), para la cual es altamente patognica. A lo largo de los cinco estadios larvales de D. plexippus, el parsito completa dos

ciclos merognicos. Despus de la pupacin, el parsito termina una fase sexual (gametogonia) y forma el oociste alrededor de las escamas de la mariposa en formacin en el capullo pupal. La mayor densidad de oocistes se encuentra en el abdomen (Leong et al. 1992). Otra opcin es que los esporo-zoitos slo se adhieren a las clulas epiteliales, como sucede con G. blattarum en Blatella germanica (Clopton y Gold 1996).

Fig. 2. Diagrama del ciclo de vida (todo intracelular) de Ascogregarina taiwanensis en Aedes albopictus, mostrando las tres partes del ciclo: la esporogonia despus de la ingestin de oocistes y penetracin de los esporozoitos en las celulas epiteliales de la larva. La gamogonia, en que los trofozoitos haploides se desarrollan en pares de gamontes que producen gametos por merogonia, y donde pares de isogametos producen cigotos (la nica fase diploide), en la que se producen oocistes y cada uno con ocho esporozoitos (1115), listos para reiniciar el ciclo en un nuevo husped (tomado de Tseng 2004 ).

6.4 Rutas de Infeccin para el Husped en el Ciclo de Transmisin Las gregarinas son diseminadas en las poblaciones de sus huspedes, principalmente mediante ingestin de su fase infecciosa que es el oociste (= espora), aunque en casos raros se presenta una transmisin vertical transovum. Las diferentes rutas que sigue el oociste en el ciclo de transmisin son: 6.4.1 Transmisin Horizontal (de individuo a individuo por ingestin de la forma infecciosa del parsito). Esta ruta es la comn en la epizootiologa de enfermedades de insectos y tiene cinco formas de infeccin: Va oral desde el agua - El oociste puede estar en el fondo lodoso de los criaderos larvales de mosquitos, a donde llega al descomponerse el cuerpo de adultos infec-tados con Ascogregarina que mueren sobre la superficie del agua (Reyes-Villa-nueva et al. 2001b).

Tambin se ha postulado esta ruta infecciosa para las gregari-nas Monoica apis y Apigregarina stammeri que reducen la longevidad de la abeja Apis mellifera L. en Venezuela (Stejskal 1972). Va heces fecales - La infeccin ocurre por ingestin de heces fecales con oocistes, como sucede con G. blattarum en la cucaracha B. germanica (Clopton y Gold 1996). Va presa - El oociste es ingerido cuando est dentro del cuerpo de su husped y ste es devorado por algn depredador, el cual termina infectado por la gregarina. Como en los adultos de Enallagma boreale (Odonata: Coeanegrionidae), donde las hembras se infectan con la gregarina Hoplorhynchus spp., cuyos oocistes estn adheridos a las patas de moscos Chironomidae, presas comunes de Odonota (bro 1974). Tambin mediante el canibalismo se sabe que ocurre transmisin en acrdidos (Watson 1915). Autoinfeccin - Watson (1915) recuper oocistes en todas las fases de desarrollo, incluyendo aquella con esporoductos bien desarrollados, a partir del intestino de grillos infectados con Leidyana eratica y crey que los gametocitos podan expul-sar los oocistes maduros estando dentro del mismo husped. Tambien encontr oocistes bien desarrollados en el intestino de saltamontes en Sudfrica, y observ una tendencia a grandes asociaciones en la parte anterior del mesentern del hus-ped y agrupaciones pequeas en la parte posterior. Se ha sugerido que la autoinfeccin puede ocurrir regularmente en las eugregarinas en la medida que los oocistes son retenidos por un tiempo largo en el estmago y que liberen esporo-zoitos. Una vez que los oocistes pasan al proctodeo es improbable que ocurra la eclosin e infeccin debido a la membrana peritrfica (capa de quitina) que protege al epitelio en ese lugar. Va venrea - O. electroscirrha tambin se transmite entre macho y hembra de D. plexippus durante la cpula, cuando el macho infectado transmite mecnicamente los oocistes que trae sobre su aparato reproductor a la hembra sana (Altizer y Oberhauser 1999). 6.4.2 Transmisin vertical (la forma infecciosa del parsito pasa de los padres a la progenie). Usualmente tiene tasas bajas de transmisin en la poblacin husped, y existe la hiptesis de que el parsito puede evolucionar hacia la extincin si infringe algn efecto nocivo (virulento) significativo sobre el husped (McLaughlin y Myers 1970). Si estos parsitos evolucionan hacia formas benignas, pueden tomar la ruta evolutiva del simbionte. Las modalidades de infeccin son: Transovum En mosquitos, las hembras tambin depositan oocistes sobre el corion de los huevos, va recto, sobre el agua al momento de la oviposicin. Los oocistes estn en los tbulos de Malpighi y son desplazados al proctodeo cuando la hembra contrae los msculos abdominales para ovipositar (Beier y Craig 1985). Lo mismo pasa para la neogregarina Ophryocystis electroscirrha en la mariposa monarca, D. plexippus. Los oocistes son transmitidos cuando hembras infectadas diseminan oocistes sobre el corion de los huevos puestos en la superficie de las plantas hospederas (Asclepiadceas) (McLaughlin y Myers 1970). La alta incidencia de Leidyana canadensis en larvas de Lambdina fiscellaria fiscellaria (Lepidoptera: Geometridae), demuestra que las infecciones son adquiridas de manera temprana, posiblemente cuando emergen las larvas del huevo e ingieren los oocistes sobre la superficie corinica (Lucarotti et al. 1998). Las larvas tambin se pueden infec-tarse al contaminarse en el ambiente que rodea el sitio de oviposicion, alrededor del tnel de los descortezadores de la madera o en los musgos o lquenes que estn en la corteza del tronco

(Carrol 1956). Las superficies se contaminan con los oocistes que salen va anus a partir de las hembras husped. Transovrica - Una verdadera transmisin vertical o transovrica, ocurre cuando el parsito/patgeno est dentro de los huevos (u oocitos) al momento de la oviposi-cin, y esta no est documentada para el caso de gregarinas de insectos.

6.5 Rango de Husped, Patogenicidad y Sntomas Las gregarinas entomoparsitas no matan al husped salvo pocas excepciones. Su impacto negativo se expresa sobre el grado de adaptabilidad del husped (fitness), como disminucin del tamao corporal, longevidad y fecundidad, adems de cambios en la coloracin e inducir aletargamiento en el husped. Por lo mismo, el efecto se espera que ocurra a largo plazo en las poblaciones (Beier y Craig 1985). Otra cualidad es que tienen un rango estrecho de huspedes, y la mayora tienden a tener un husped especfico natural, sobre el cual el efecto patognico es mnimo. En cambio, cuando una gregarina infecta de manera cruzada a un husped no natural o extrao, tambin se puede observar que el ciclo del parsito se trunca por respuestas inmunolgicas del husped, o contrariamente, que su patogenicidad se incrementa dramticamente. Aunque existe poca informacin respecto a la fisiologa de la infeccin de estos parsitos, la gregarina Farinocystis tribolii disminuy los niveles de protenas libres y lpidos totales en los individuos de Tribolium castaneum (Herbst). Las gregarinas Cephaline varan en su rango de huspedes, con algunas especies monoxnicas. Por ejemplo, Gregarina polymorpha, G. cuneata, y G. steini estn restringidas a larvas del escarabajo de la harina Tenebrio molitor, y G. niphandrodes infecta exclusivamente al adulto de T. molitor (Clopton 1992). En contraste, Corbel (1968) estudi las infecciones cruzadas de seis especies de gregarinas entre 24 especies de ortpteros y concluy que la especificidad slo se presenta al nivel de superfamilia dentro del Orden. Johny et al. (1999) tambin estudiaron el rango de huspedes en tres gregarinas parsitas de acrdidos y conclu-yeron que Leidyana subramanii, Retractocephalus dhawanii y Hentschelia gillii infectan 17, 8 y 3 especies de saltamontes, respectivamente. Estudios in vivo inoculando esporozoitos de nueve especies de gregarinas (cuatro especies de Stylocephalus, tres de Xiphocephalus y dos de Cystocephalus) en el lumen de larvas de ocho especies de Tenebrionidae (Coleoptera), demostraron que slo cinco gregarinas fueron capaces de producir oocistes viables, lo cual confirm la especificidad de husped de estos protozoarios (Patil et al. 1985).

6.6 Patogenicidad Celular Las gregarinas causan su ms severa patologa durante su desarrollo intracelular. Por ejemplo, Leydana subramanii afecta las cavidades de las clulas, degenera sus ncleos y las clulas se tornan fuertemente basfilas durante las tincin. El dao a las clulas epiteliales altera la funcin digestiva en saltamontes. La clula infectada se torna ms corta pero no pierde la capa de microvellosidades en la superficie externa epitelial. Es probable que disminuya de tamao al perder su contenido por el parasitismo. El ltimo estado ninfal de saltamontes logra sobrevivir a fuertes infecciones, quizs porque reemplaza el epitelio perdido en cada muda. La presencia de clulas epiteliales infectadas en un saltamontes

moderadamente infectado, sugiere que slo las clulas sanas fueron seleccionadas para ser parasitadas por los nuevos esporozoitos y que la tasa de infeccin es irrelevante. La exposicin prolongada a la infeccin induce tumora-ciones por la hipertrofia de las clulas en el tejido conectivo externo del mesentern (Pushkala y Muralirangan 1997).

6.7 Patogenicidad en el Husped Algunas eugregarinas son patognicas a insectos. La mayora de stas estn en las familias Gregarinidae, Leidyanidae, Didymorphidae, Stylocephalidae y Actinocephalidae (Tanada y Kaya 1993). Reportes antiguos de gregarinas patgenas (Harry 1970, Dunkel y Boush 1968) se han mencionado por Zuk (1987) sobre gregarinas de los grillos Gryllus veletis y G. pennsylvanicus. Adems, se report que la longevidad y peso fueron disminuidos significativamente y que los machos altamente infectados produjeron menos espermatforos que los sanos. Tambin se ha reportado que Gregarina spp. al infectar plagas de la raz (Levine 1979), aumenta la mortalidad del adulto e inhibe el desarrollo ovrico y el crecimiento del cuerpo graso en la catarinita Diabrotica virgifera virgifera. Infecciones iniciales con ms de 2,000 oocistes por insecto causaron un 100% de mortalidad en machos en los primeros tres das de vida, an con buen alimento y condiciones ptimas de insectario (Brooks y Jackson 1990). En la langosta Schistocerca gregaria, a menudo se encuentran cientos de trofozoitos que daan el epitelio de los ciegos gstricos y comnmente se observan gamontes en los restos de las clulas destruidas. Los trofozoitos libres y los gamontes maduros forman grandes hacinamientos por tigmotaxis, que consisten en una barrera que bloquea el mesentern en los saltamontes infectados (Canning 1964), o cuando destruyen el epitelio mesentrico facilitan la penetracin de bacterias patognicas al hemocele. Leidyana gryllorum Watson y Gregarina cuneata Stein son patognicas a sus huspedes Gryllus domesticus y Tenebrio molitor respectivamente, al evitar el paso de alimento por el tracto digestivo. Casos de una alta patogenicidad son descritos para A. bostrichidorum, la cual mata a su husped, el barrenador Prostephanus truncates, a cuyas larvas les destruye el epitelio mesentrico (Purrini y Keil 1989). Recientemente, se he renovado el inters por usar gregarinas para el control de saltamontes (Pushkala y Muralirangan 1997, Muralirangan et al. 2000, Johny et al. 2000). Se ha evaluado la patogenicidad contra saltamontes de tres gregarinas de la India: Leidyana subramanii Retractocephalus dhawanii y Hentschelia gillii (Pushkala et al. 2000) (Johny et al. 2000). El impacto patognico de L. subramanii redujo la tasa de consumo alimenticio (peso ganado por insecto) en el saltamontes Atractomorpha crenulata. La tasa de consumo de alimento en machos fue de 17, 12 y 6 mg despus de infectarse con las concentraciones de 0, 210 3 y 2104 oocistes/saltamonte, respectivamente. En hembras, la tasa de consumo disminuy cuando se infectaron con 2103 y 2104 oocistes/saltamonte, en comparacin a los insectos sanos. Se obtuvieron resultados similares cuando se infect al saltamonte A. crenulata con oocistes de Retractocephalus dhawanii). Asimismo, el peso promedio en los machos fue de 22, 19 y 13 mg, y en las hembras de 56, 32 y 29 mg, para las infecciones con 0, 210 3, 2104, respectivamente. Finalmente, el periodo de oviposicin de hembras infectadas se prolong en 30-35 das contra 8-10 das en las hembras control (Johny et al. 2000).

6.8 Produccin en Masa La propagacin de protozoarios en laboratorio esta limitada a dos factores: la disponibilidad del husped y la facilidad para que ocurra la transmisin del parsito al husped. Los oocistes pueden ser ingeridos junto con el alimento preferido del husped, por lo que es necesario primero determinar la dosis ptima de oocistes para obtener la mxima produccin de ellos. En L. subramanii, los gametocitos son cosechados a los 12-15 das postingestin de oocistes, de los individuos infectados del saltamontes Eyprepocnemis alacris alacris. Si las heces fecales con los gametocitos son tratadas con cido propinico al 0.5 % durante 10 minutos, secadas bajo condiciones de laboratorio e incubadas a una temperatura de 35o C, despus de 48 a 72 h los oocistes en largas cadenas espiraladas, seran liberados de los gametocitos presentes en las heces fecales. Tales oocistes son aislados y almacenados a 4 o C y permanecen viables por ms de un ao para infectar poblaciones de saltamontes. Para aislar los oocistes de las heces fecales, stas se ponen con agua destilada (1 parte de la mezcla: 3 partes de agua destilada) y se mezclan con un agitador magntico para separar las cadenas de oocistes. Despus el extracto se filtra en doble tela fina de nylon (40 m); y luego es pasado a travs de un algodn hmedo (2-5 cm) mediante una jeringa. Posteriomente, la suspensin es centrifugada a 750 g por 20 min en una suspensin de 50% percoll en agua destilada. Los oocistes se sedimentan en el fondo de donde son removidos con agua destilada por tres veces para sacar el percoll del fondo. As, la suspensin es pura en un 90% y se almacena a 4o C. La concentracin de oocistes se hace segn la descripcin de Undeen y Vavra (1997) con un hemocitmetro bajo un microscopio de contraste de fase. Antes de inocular los oocistes en un experimento, la concentracin deseada se puede establecer a partir de una suspensin stock con agua destilada. La produccin de gametocitos de G. garnhami a partir de Schistercerca gregaria lleg a un mximo al da 12 y 13 y descendi drsticamente al da 16. Se recuperaron alrededor de 3,000 gametocitos de 19 saltamontes, con un promedio de 350 gametocitos/saltamonte. Hubo un promedio de 15,000 500 esporas por gametocito y un promedio de 7 a 10 oocistes por da de colecta despus de inocular con oocistes de L. subramanii a una concentracin de 3,500 oocistes por insecto (Johny et al. 1999). Los oocistes de L. subramanii son rutinariamente almacenados en heces fecales refrigeradas, sin limpiar los oocistes antes del almacenaje. El cido propinico es usado como un antimictico que evita el crecimiento del micelio en el excremento durante el periodo de incubacin. En el caso de Ascogregarina culicis en el mosquito Aedes aegypti, las larvas de 24 h de edad se pueden infectar con una concentracin de 100 oocistes/larva. Alrededor del da 9 postinfeccin se inicia la emergencia de adultos en las jaulas, a los cuales de les debe proporcionar uvas secas como fuente de carbohidratos mas agua. Los oocistes se pueden cosechar de estos adultos a los ocho das de vida porque despus se empiezan a morir. Una muestra de ~ 200 mosquitos (machos y hembras) anestesiados con CO 2 se maceran en un homogeneizador de vidrio con unos 15 ml de agua destilada. Despus el extracto se pasa a travs de un algodn hmedo (2-3 cm) dentro de una jeringa grande de 20 cm3 sobre un tubo Eppendorf, el cual se centrifuga a 5,000 rpm por 10 minutos. El paquete es resuspendido en 5 ml de agua destilada y de ah se puede calcular la concentracin de oocistes/ml con un hemocitmetro. Es recomendable hacer tres conteos y obtener una media. En el caso de A. taiwanensis en A. albopictus se sigue el mismo procedimiento, excepto que curiosamente aqu los adultos tardan ms das en morir en las jaulas, por lo que los oocistes se pueden cosechar hasta ~12 das postinfeccin (Reyes-Villanueva 2001a).

6.8.1 Gregarinas y Control de Insectos Pushkala y Muralirangan (1997) reportaron 70% de mortalidad en el tercer instar del saltamontes Eyprepocnemis alacris alacris cuando fue tratado con oocistes de L. subramanii en el laboratorio. No obstante sus estudios no especificaron la concentracin de oocistes. Muralirangan et al. (2000) observaron tasas de mortalidad de 22, 57, 73 y 83% cuando se infect a E. alacris alacris con L. subramanii a las concentraciones de 2102, 2103, 2104 y 2105 oocistes/saltamontes, respectivamente. En el caso de Atractomorpha crenulata (Fab.) la tasa de mortalidad registrada fue de slo 15% a una infeccin de 210 4 oocystes/ saltamontes, indicando que E. alacris alacris es ms susceptible a L. subramanii que A. crenulata. Tambin se estudi el efecto de L. subramanii sobre E. alacris alacris en jaulas en el campo (Muralirangan et al. 2000). Se observ que hubo un 100% de infectividad en L. subramanii a los 10 das postaplicacin en todas las jaulas con saltamontes, a excepcin de las del control, pero la tasa de mortalidad fue de 48, 32 y 56% respectivamente par las dosis 2104, 2105 y 2106 oocistes/ml despus de 20 das. Ascogregarina taiwanensis es un parsito patognico comn en el mosquito Aedes albopictus en Malasia, con una CL50 de 3,790 oocistes por larva. Tambin Ascogregarina culicis ataca a A. albopictus y, aunque produce oocistes viables en este husped, se producen tasas muy bajas de infeccin (Sulaiman et al. 1993). En EUA, A. taiwanensis es un parsito con altos niveles de prevalencia (~70%) en las poblaciones silvestres del mosquito Aedes albopictus. A pesar de que puede infectar larvas del vector primario del dengue, Aedes aegypti, a veces no se completa el ciclo de la gregarina porque los gametocitos se quedan en los seis tbulos de Malpighi del mosquito adulto, y no maduran a oocistes (Reyes-Villanueva 2001b). Sin embargo, en un estudio con infecciones experimentales, A. taiwanensis infect al 42% de las larvas del mosquito A. epactius y al 90% de las larvas de A. atropalpus. En ambos huspedes, el parsito exhibi un desarrollo anormal y se observ melanizacion de trofozoitos y gametocitos. Los mismos efectos se observaron en los trofozoitos al infectar a larvas de A. aegypti y Culex restuans. Despus de infecciones cruzadas, se recuperaron algunos oocistes slo de A. aegypti y A. atropalpus, los cuales fueron infecciosos para A. albopictus. La infeccin fue muy baja (25%, 12 trofozoitos por larva) en A. triseriatus, y no hubo desarrollo de gametocitos ni de oocistes (Munstermann y Wesson 1990). Cuando se expusieron larvas mezcladas de A. aegypti y A. albopictus de 24 h de edad a concentraciones iguales de oocistes de sus respectivas gregarinas A. culicis y A. taiwanensis, las larvas de cuarto instar de ambos huspedes presentaron en sus tractos digestivos, diferentes intensidades de infeccin (nmero de gamontes de cada parsito por larva). A. aegypti exhibi una intensidad de infeccin de A. culicis, que fue el doble de la de A. albopictus infectado con A. taiwanensis. Adems, las larvas de A. albopictus prcticamente no presentaron gamontes de A. culicis, mientras que las de A. aegypti si aparecieron infectadas cruzadamente con gamontes de A. taiwanensis (Reyes-Villanueva et al. 2003). Estas interacciones husped/parsito en las infecciones cruzadas pueden tener una relacin con el fenmeno de que A. aegypti ya fue virtualmente desplazado por A. albopictus en todo el sureste de EUA. Para Ascogregarina chagasi, parsito del vector de la leishmaniasis, Lutzomyia longipalpis, existe una transmisin vertical transovum. Bajo condiciones de insectario, el parsito reduce la longevidad y fecundidad de su husped. En Inglaterra se le considera responsable por la

destruccin de las colonias de este dptero. Si se lavan los huevos del husped con una solucin de formol al 0.1%, se eliminan a los oocistes del parsito (Dougherthy et al. 1991). Cuando se infectaron con esta gregarina a cepas brasileas (no naturales) de L. longipalpis en el laboratorio, se indujeron tasas bajas de infeccin que como quiera reducen su longevidad en comparacin a las cepas colombianas (Wu y Tesh 1989). En Venezuela, se observ que las gregarinas Monoica apis, Apigregarina stammeri, Acuta rousseaui y Leydiana apis, parsitas de Apis mellifera, destruyeron el epitelio estomacal, causando la muerte de las obreras y la desaparicin de colmenas enteras. Esto no es extrao ya que una sola abeja puede tener 200 oocistes y albergar hasta 800,000 gamontes (Stejskal 1972). Finalmente, la neogregarina Ophryocyistis elektroscirrha, la cual pasa por dos ciclos merognicos en las clulas epiteliales de la mariposa monarca, Danaus plexippus, causa un fuerte dao celular cuando las larvas son inoculadas con una dosis de 1,000 esporas/larva. Las larvas infectadas dejan de alimentarse a los pocos das de la infeccin, se tornan plidas, aletargadas y mueren, mientras que las sobrevivientes tambin mueren durante la muda. Preparaciones de larvas agonizantes con tincin de Giemsa, muestran abundancia de bacterias en el mesentern y epitelio, sugirindose que una septicemia es la causa de la muerte. Los adultos sobrevi-vientes de infecciones ligeras, aparte de los problemas para desplegar las alas durante la emergencia, tienen el abdomen hmedo y con grandes zonas descamadas (McLaughlin y Myers 1970).

6.9 Microsporidia Los microsporidios son un grupo raro de eucariontes carentes de mitocondrias, que son par-sitos intracelulares obligatorios de otros eucariontes incluyendo al hombre. Han evolucionado de una manera muy sofisticada ya que son altamente efectivos en su sobrevivencia, pero sus adaptaciones han ido hacia la simplicidad tanto morfolgica, como fisiolgica y genmica. El genoma de los microsporidios vara de 2.3 Mpb a 19.5 Mpb (Mtnier y Vivars 2001). Tienen todas las caractersticas de eucariontes como son: cromosomas lineales, telomeros, y segregacin por mitosis. No obstante, el aparato de Golgi se ha modificado en una estructura tubular (filamento polar) que es usada en el proceso de infeccin del husped. El agente causal de la pebrina en las abejas, Nosema bombycis es el primer registro de un microsporidio en la literatura y fue descrito por Nageli en 1857, pero colocado en el grupo de las levaduras. Despus fue Balbiani (1882) quien lo revis y lo coloc en un nuevo grupo, al que llamo Microsporidia. Por el filamento polar que es el aparato de Golgi modificado (Vavra 1965, Cali y Takvorian 1994), por el genoma que tiene todas las caractersticas de eucarion-tes, y por los diferentes tipos de esporas en los ciclos biolgicos, los taxnomos modernos han colocado a estos entomopatgenos en su propio phylum: Microspora. Para una historia ms detallada de la sistemtica y evolucin de este grupo, se sugiere consultar a Sprague et al. (1992), y Keeling y Fast (2002). Actualmente existen ~150 gneros y ms de 1,200 especies descritas de microsporidios (Sprague y Becnel 1999). Hasta ahora, los microsporidios slo infectan a animales, incluyendo a ciliados y gregarinas (Vivier 1975). Dada la diversidad de especies que se conoce hoy en da, es probable que el nmero real de especies quizs se aproxime al nmero

de especies totales en la escala zoolgica (Keeling y Fast 2002). Estos parsitos son ms prevalentes en artrpodos y peces, aunque tambin Encephalitozoon cuniculi originalmente descrito en 1922, infecta conejos y otros mamferos (Wright y Craighead 1922), mientras que entre las 13 especies que infectan al hombre, E. bieneusi causa diarreas fatales en los enfermos de SIDA (Sandfort et al. 1994).

6.10 Espora y Procesos de Infeccin La espora es la caracterstica tpica de este grupo de parsitos intracelulares, ya que por su morfologa y funcin, es la nica fase extracelular reconocible para la identificacin y diagnstico, y adems responsable por la infeccin del husped y sobrevivencia del grupo (Fig. 3). Aunque la espora es la fase de resistencia ambiental, pueden morir al exponerse por 30 minutos a etanol 70%, formaldehdo 1% o perxido de hidrgeno al 1%, o en una autoclave a 120 C por 10 min. El rango del tamao de la espora vara desde 1 micra en E. bieneusi hasta 40 micras en Bacillidium filiferum (Vavra y Becnel 1999). La forma puede ser esfrica, ovoide o bacilar, aunque la mayora son ovoides. La forma esporal puede ser uniforme dentro de la misma especie, pero tambin puede haber diferentes tipos de esporas en el mismo ciclo (polimrfico).

Fig. 3. Estructura de la espora de un microsporidio. A, es el disco de anclaje del filamento o tubo polar [Fp]. El polaroplasto tubular [Pt]. El polaroplasto lamelar [Pl], y el disco de anclaje se usan en la taxonoma del grupo. D, es el ncleo que puede ser simple o doble (como diplocarin en Nosema). En, es la endospora y la regin ms ancha interna. Ex, es la exospora. P, es la membrana plasmtica que separa la cubierta de la espora del esporoplasma (Sp). Vp, es la vacuola posterior. R, son los ribosomas arreglados helicoidalmente. La espora est rodeada de una membrana y dos paredes rgidas. La pared de la exospora esta compuesta de una matriz protenica densa y granulofibrosa (Bigliardi et al. 1996). La pared de la endospora est compuesta de alfa-quitina y protenas. Dentro de la espora est el

esporoplasma o citoplasma de la espora, el cual es el material infeccioso de los microsporidios. El esporoplasma contiene uno o dos ncleos arreglados como un diplocarin, mientras que el citoplasma es rico en ribosomas. Hay tres estructuras relacionadas con la infeccin: el polaroplasto, el filamento o tubo polar, y la vacuola posterior. El polaroplasto es un complejo membranoso en la parte anterior de la espora. El tubo polar es el organelo responsable por la infeccin, formado por una membrana y capas de glicoprotenas, y con un dimetro de 0.10.2 micras y longitud de 50500 micras. En su parte apical tiene una estructura en forma de paraguas llamada disco de anclaje (anchoring disk) del cual se extiende el tubo a la parte posterior de la espora. El tubo es recto de un tercio hasta la mitad de su longitud y el resto esta arreglado helicoidalmente en el esporoplasma, hasta llegar a la vacuola posterior. El nmero de giros, el arreglo de uno al siguiente, guardan una posicin fija y por lo mismo son caractersticas taxonmicas en el grupo al nivel de especie (Sprague et al. 1992). La germinacin de la espora de los microsporidios es uno de los eventos subcelulares ms curiosos e interesantes en biologa, que involucra generar una cantidad alta de energa y una liberacin controlada de la misma. Todos ello en una serie de eventos extremadamente rpidos y concatenados que termina con la liberacin del esporoplasma dentro de la clula husped. El proceso se inicia con un factor ambiental que depende de las especies y del hbitat (Undeen y Epsky 1990), pero que tambin es pobremente conocido (Keohane y Weiss 1998). El pri-mer signo de germinacin en una espora es una hinchazn generalizada tanto del polaroplasto como de la vacuola posterior; esto debido a que aumenta la presin osmtica de la espora por las acuaporinas que transportan agua a travs de la membrana del esporoplasma (Frixione et al. 1997). No se saben los detalles de este proceso pero se ha observado un descenso drstico de trealosa durante la germinacin (Undeen et al. 1987). Se ha especulado que la trealosa se puede hidrolizar a dos molculas de glucosa, aumentando as el nmero de molculas solubles que atraen las molculas de agua al interior (Undeen y Vander Meer 1994). No obstante en las especies de Nosema no bajan los niveles de trealosa, por lo que se han sugerido otros modelos para explicar la germinacin como el de la concentracin de iones Ca+ en el interior del polaro-plasto. Este modelo asume que durante la ruptura de la membrana en la activacin de la espora, se libera Ca + de la endomembrana hacia el esporoplasma. Estos iones inducen la entrada de agua y la activacin de la trealosa, la cual mejora el cambio hipertnico en el esporoplasto (Keohane y Weiss 1998). Esta fuerza interna rompe la parte apical de la espora, por donde es expulsado el filamento polar que se transforma en un tubo por las glicoprotenas, para que el esporoplasto pueda pasar a travs de l, y sea depositado en el citoplasma de la clula husped. Durante la expulsin, el tubo funciona como un arpn que perfora la membra-na de las clulas cercanas ocurriendo as la infeccin. Un proceso interesante es que el esporoplasma entra a la clula husped con una nueva y recin formada membrana plasmtica, quedando su membrana original en la espora vaca. De esta manera, el parsito evita ser reconocido como invasor por la clula husped. Al inicio de la germinacin, la membrana del polaroplasto es empujada por el tubo hacia el husped y sta es responsable por la sntesis de la nueva membrana plasmtica de la fase intracelular parsita (Weidner et al. 1999) (Fig. 4). El filamento polar es el aparato de Golgi modificado (Vavra 1965, Cali y Takvorian 1994). Una vez que el aparato de Golgi se transforma en el tubo polar, la espora disminuye de tamao y se forma la capa interna quitinosa de la espora madura. Una vez dentro del citoplasma del husped, las fases vegetativas pueden tener dos arreglos nucleares en sus clulas: clulas uninucledas llamadas esquizontes, y clulas binucledas llamadas merontes. De ah se inicia la fase de crecimiento vegetativo que puede ser esquizognica o merognica, hasta entrar a la segunda fase reproductiva que es la esporulacin. La

reproduccin de esquizontes o merontes puede ocurrir por fisin binaria o mltiple, en cuyo caso se forma un plasmodio. ste es el resultado de divisiones nucleares repetidas sin que haya citoquinesis en las clulas involucradas.

Fig. 4. Desarrollo intracelular de Encephalitozoon bieneseu (arriba) y E. intestinales (descripcin abajo). Descripcin de la Fig. 4. Fase 1- la forma infecciosa de microsporidios es la espora resistente y puede sobrevivir por largos perodos de tiempo en el ambiente. Fase 2- la espora expulsa su filamento polar e infecto la clula husped. Fase 3- la espora inyecta el esporoplasma infeccioso en la clula husped eucaritica a travs del filamento polar. Fase 4- dentro de la clula el esporo-plasma entra en una multiplicacin intensa ya sea por merogonia (divisin binaria) o esquizogonia (divisin mltiple). Fase 5- este desarrollo puede ocurrir en contacto directo con el citoplasma husped como en E. bieneusi, o dentro de una vacuola llamada vacuola parasitfora como en E. intestinalis. Libre en el citoplasma o dentro de la vacuola, el microsporidio desarrolla esporas maduras por una esporogonia. 6- durante la esporogonia se forma una pared gruesa alrededor de la espora que es responsable por la resistencia a un ambiente adverso. Cuando las esporas aumentan en nmero y llenan el citoplasma de la clula husped, se rompe la membrana celular y se liberan las esporas. Estas esporas maduras pueden infectar nuevas clulas husped y continuar el ciclo. Estos plasmodios pueden dividirse en otros ms pequeos (plasmotoma) o en clulas indivi-duales por fisin mltiple. Eventualmente, al final de la esquizogonia o merogonia, el patgeno entra en esporogonia da origen a esporontes. Estos se dividen hasta llegar a la fase final de la esporogonia que son los esporoblastos. El nmero de divisiones en los esporontes depende de la especie y vara de una esporogonia bisprica (donde dos esporoblastos se forman como en Nosema) a una polisprica (cuando se forman tipos diferentes de esporas como en Vavria). La esprogonia se puede llevar a cabo en contacto directo con el citoplasma del husped, o dentro de una membrana que se origina del husped llamada vacuola parasitorfora, o en una membrana que origina el propio patgeno y que recibe el nombre de vacuola esporfora. La esporogonia en algunos gneros como Amblyospora involucra meiosis y

origina ocho esporas en una vacuola esporfora. La morfognesis de la espora es el ltimo evento en la esporulacin y se inicia con la transformacin de esporontes en esporoblastos y la polarizacin de los organelos para producir esporas maduras (Hendrick et al. 1991). La mayora de los microsporidios se han descrito sobre la base de slo un tipo de espora, usualmente la espora ambiental. Hazard y Weiser (1968) descubrieron una especie de Nosema sp. y otra de Thelohania sp., infectando diferentes tejidos de un mosquito, con lo que demostraron que cada patgeno produca ms de un tipo de espora. El tipo Nosema era responsable de la transmisin vertical, y lo nico que se saba acerca de las esporas tipo Thelohania era que ellas slo infectan larvas de mosquitos. Las esporas Thelohania infectaron coppodos como huspedes intermediarios, de los que emergi un tercer tipo de espora que complet el ciclo al infectar larvas de mosquitos. Desde entonces, se han identificado varios huspedes intermediarios para varios microsporidios de mosquitos, que exhiben un ciclo de vida que incluye dos generaciones de mosquitos y el coppodo como intermediario, y por lo tanto tres tipos distintos de esporas (Fig. 5). Es interesante aclarar que en el pasado estas esporas pertenecan a diferentes gneros de microsporidios. Aunque los nicos microsporidios para los cuales existen huspedes intermediarios, han sido identificados a partir de mosquitos (Amblyospora, Parathelohania), esta situacin puede ser ms comn. Nosema necatrix y Thelohania diazoma fueron considerados por tener infecciones duales en larvas de lepidpteros. Finalmente se comprob, que haba dos tipos de esporas en Vairimorpha necatrix, desarrollndose en los tiempos adecuados en el mismo husped (Fowler y Reeves 1974). La espora del tipo Nosema parece ser responsable por la transmisin al husped original, con cierta duda respecto a la funcin de las meiosporas. As basndose en pocos ciclos conocidos se pueden hacer algunas generalizaciones, pero lo que ahora ya se sabe es que muchos microsporidios son capaces de producir ms de un tipo de espora y que stas juegan un papel especfico en el ciclo vital. Amblyospora californica (Fig. 5) es un ejemplo de un ciclo de desarrollo complejo en el que dos generaciones de mosquitos y un coppodo son necesarios para completarlo (Becnel 1992). En este ciclo heteroxeno se pro-ducen dos tipos de esporas en la progenie del mosquito hembra infectado: esporas binucleadas en las larvas que darn origen a hembras y que infectan a otras larvas, y las meiosporas que resultan de las larvas determinadas para originar machos, y stas slo pueden infectar a coppodos. Este ciclo es un ejemplo de excelente adaptacin del patgeno porque le permite sobrevivir en la ausencia de insectos, ms el mejoramiento que ocurre en su pool gnico por el proceso de meiosis.

6.11 Ciclos de Desarrollo Los ciclos de desarrollo se pueden ver en preparaciones de los especmenes infectados, con tincin de Giemsa y observados al microscopio de contraste de fase. Los patrones en la divisin celular, son variables entre los microsporidios y tiles para la identificacin. Eventualmente se produce una nueva generacin de esporas, y dependiendo de la especie, puede ser del mismo tipo que inicio la infeccin o de otro, que es estructuralmente diferente incluyendo la funcin. A continuacin se presenta una lista de los tipos ms comunes de esporas que existen en este grupo de entomopatgenos.

Fig. 5. Ciclo biolgico heterxeno y polimrfico de Amblyospora californica en el mosquito Aedes aegypti y un coppodo como husped intermedio.

6.11.1 Esporas Externas. A menudo llamadas esporas ambientales; stas son producidas en grandes nmeros y liberadas del husped para infectar a otro. stas poseen una pared gruesa y son resistentes a una variedad de factores ambientales. Hay varios subtipos: a. Esporas diplocariticas (binucledas). Son producidas asexualmente a partir de esporontes diplocariticos y usualmente infectan oralmente (per os) a otros miembros de la especie en donde se formaron. b. Esporas uninucleadas. Son formadas por reproduccin sexual a partir de esporontes uninucleados. stas infectan a huspedes distintos a aquellos donde se formaron. c. Esporas de disociacin. Se originan de estructuras diplocariticas por disociacin de la fase diplocaritica al inicio de la esporogonia. Se conocen slo en mosquitos y transmiten al patgeno horizontalmente. d. Meiosporas. Se forman a partir de la fase diplocaritica por meiosis. En mosquitos ellas slo infectan coppodos como husped intermediario. Se observan comnmente en paquetes de ocho esporas, llamadas octosporas. e. Esporas uninucleadas. Se forman asexualmente en un husped intermediario; estas esporas son incapaces de infectar al husped donde se formaron y las nicas conocidas hasta ahora son de coppodos e infectan mosquitos.

6.11.2 Esporas Internas. Este tipo se produce usualmente en pequeos nmeros; tienen pared delgada y germinan dentro del husped en el cual se desarrollan. a. Esporas tempranas. Recientemente llamadas esporas primarias, son diplocariticas que aparecen despus de una infeccin oral a partir de las esporas ambientales. Germinan inmediatamente despus de la maduracin, an dentro del husped para diseminar la infeccin en el organismo infectado. b. Esporas uninucleadas. Aquellas que germinan en el ovario para infectar a los huevos. En mosquitos, este tipo se origina a partir de la unin de gametos, con los ncleos permaneciendo apareados en fase diplocaritica en las divisiones siguientes. En algunas especies, estas esporas ocurren repetidamente de generacin en generacin a partir de huspedes hembras por transmisin vertical.

6.12 Patologa, Sntomas y Rango de Husped En general, las microsporidiosis, resultan en infecciones crnicas que progresan lentamente hacia la muerte. Los efectos patolgicos y sntomas se expresan a nivel de anormalidades en los tejidos y rganos, malformaciones, cambios de color y desarrollo lento en los insectos enfermos, hasta cambios etolgicos. Los dos tejidos comnmente infectados son el cuerpo graso y el epitelio mesentrico. En larvas de insectos acuticos, las infecciones se observan a travs de la cutcula transparente, como manchas color porcelana en el cuerpo graso de segmentos torxicos y abdominales, o en las clulas epiteliales. Los segmentos pueden verse deformados por la acumulacin de grandes cantidades de esporas, adems de que estas infecciones son comunes en el cuerpo graso que aparece lobulado en las zonas cercanas a o en los ciegos gstricos, y tambin en los tbulos de Malpighi. En insectos de cuerpo esclerotinizado, se tienen que hacer disecciones para poder ver estos sntomas. Fuertes infecciones pueden inducir la aparicin de manchas o puntos melanizados en la cutcula que se ve hinchada o entumecida por las reacciones del sistema inmune del husped. Las larvas, pupas y adultos infectados, son ms pequeos que los insectos sanos de la misma edad. Los adultos, pueden mostrar alas deformes y tener movimientos lentos, pero su mayor susceptibilidad se exhibe al acortarse su longevidad y fecundidad. Nosema muscidifuracis cuando infecta al parasitoide pteromlido Muscidifurax raptor, reduce en un 50% la longevidad y hasta en un 90% la progenie de este parasitoide comercial al atacar larvas de moscas (Geden et al. 1995). Edhazardia aedis redujo en un 98% la capacidad reproductiva del mosquito Aedes aegypti. A veces se produce una secuencia de sntomas acorde a los diferentes tipos de esporas como sucede en Amblyospora sp., donde la infeccin se inicia en los ciegos gstricos y de ah se disemina a los oenocitos o cuerpo graso, en la medida que progresa el ciclo del patgeno. Ya se mencion que la asociacin ntima entre el patgeno y la (s) clula (s) husped se llama xenoma y segn Weiser (1976) existen dos tipos en insectos: el sincisial y el neoplsico. El primero resulta de la fusin de las clulas husped con un plasmodio grande multinucleado del patgeno, cuyos ncleos no son numerosos sino que estn hipertrofiados. Un ejemplo de

este es el patgeno A. bracteata en larvas del simlido Odagmia omata. El xenoma neoplsico es una hiperplasia celular inducida por el patgeno y hay de dos categoras: en una, la hiperplasia contiene clulas donde cada una tiene un parsito y la clula husped se llama xenocito. El nmero original de clulas se puede incrementar de 20 a 30 veces debido a la infeccin, como ocurre en larvas de Simuliidae infectadas por Janacekia debaisieux (Weiser 1976). La otra categora de xenoma neoplsico es del tipo quiste-Glugea, comnmente reportado en peces (Canning y Hazard 1986). Aqu el ncleo de la clula husped est hipertrofiado y aparece ramificado o fragmentado en numerosos ncleos pequeos. Este xenoma puede crecer hasta 13 mm de tamao, y este xenoma ha sido observado en un microsporidio nuevo reportado en la langosta migratoria. Se ha asumido que esta categora de xenoma es una adaptacin mutualstica porque protege al patgeno de sistema inmune del husped, pero tambin lo limita a infecciones localizadas dentro del husped. El lector puede consultar a Brooks (1988) para una revisin muy completa acerca del rango de huspedes de microsporidios con fines de control de plagas. Sin embargo, los microsporidios que ms se han estudiado con este enfoque han sido Nosema algerae y N. locustae. Es importante aclarar que N. locustae es el nico microsporidio aprobado por la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA) en EUA para aplicarse como bioplaguicida contra saltamontes. Este patgeno es exclusivo de Ortptera, donde infecta a casi 90 especies de saltamontes, pero no infecta a otros insectos como la abeja Apis mellifera, o lepidpteros como Agrotis ipsilon y Helicoverpa zea, ni a vertebrados. Por el contrario, N. algerae infecta horizontalmente a cuatro familias de insectos y dos especies de trematodos, y aunque por inyeccin puede infectar ratones, en realidad no es un riesgo para vertebrados homeotermos. Existe un alto grado de especificidad de husped en Amblyospora connecticus, un patgeno del mosquito Aedes cantator y del husped intermediario, el coppodo Acanthocyclops vernalis. De 25 especies pertenecientes a cuatro gneros de mosquitos, slo cuatro especies de Aedes fueron infectadas al presentar desarrollo vegetativo del patgeno, pero slo en Aedes epactius hubo produccin de esporas binucledas y en ninguno se observ transmisin transovrica (Andreadis 1989). Tambin en el caso de Edhazardia aedis, este patgeno puede infectar y producir esporas binucleadas en ocho de 20 especies de mosquitos evaluados, pero la transmisin transovrica slo ocurre en su husped natural, el vector del dengue A. aegypti (Becnel y Johnson 1993). Respecto a la persistencia de la espora en el medio ambiente: la viabilidad depende de la especie, la espora en la mayora de los microsporidios no dura ms de un ao, la sobrevivencia es mayor cuando la espora est asociada a heces fecales, cadveres secos o en ambientes hmedos expuestos a temperaturas de 06 C, la mayora de los microsporidios tienen esporas que no sobreviven a temperaturas de laboratorio ms de 23 meses, la deshidratacin es inmediatamente letal para los patgenos de huspedes acuticos, la temperatura mayor de 35 C reduce fuertemente la viabilidad de la espora, las esporas desprotegidas son inactivadas por exposicin directa a luz solar en minutos o pocas horas, cualquier sustrato que proporcione humedad y proteccin contra la luz solar, prolongara la viabilidad de la espora, y la presencia de otros microorganismos normalmente es nociva.

6.13 Transmisin En general, los microsporidios entericos se diseminan horizontalmente va heces fecales durante toda la vida del insecto infectado (Weiser 1961). Sin embargo, en aquellos que infectan el cuerpo graso, la liberacin de esporas se lleva a cabo slo despus de que muere el husped y su cuerpo se desintegra, como en dpteros acuticos (Becnel 1994). Tambin puede ocurrir por medio de regurgitacin de esporas en larvas de lepidptero infectadas (Wilson 1958) y tambin va canibalismo, cuando una larva sana devora a otra infectada o su cadver. Este proceso es usual en los insectos gregarios como en la langosta, donde Nosema locustae es un patgeno natural (Henry 1981). En himenpteros sociales como hormigas, tambin por medio del canibalismo, el patgeno Burenella dimorpha se dispersa en las colonias de Solenopsis geminata en los trpicos (Jouvenaz 1981). Las obreras se infectan al romper las pupas muertas y as infectan a las larvas de cuarto instar al alimentarlas por regurgitacin. Slo en este estadio se produce la infeccin ya que los ms jvenes se alimentan de lquidos. Los microsporidios tambin son transmitidos por medio de la oviposicin en himenpteros parasitoides (Brooks 1993). Es comn que las esporas estn sobre el ovipositor e infecten al husped cuando ocurre la estructura es introducida en el cuerpo del husped. Tambin algunos parasitoides infectan transovricamente a su progenie como en el caso de Nosema heliothiodes y el parasitoide Campoletis sonorensis sobre el H. zea (Brooks 1973). La transmisin vertical transovrica es la ms importante es muchos microsporidios polimr-ficos que infectan mosquitos, tales como Amblyospora, Culicospora y Edhazardia. La hembra infectada tiene al patgeno en sus oocitos y as su progenie larval queda infectada. En el caso del microsporidio monomrfico Nosema, que infecta a lepidpteros, colepteros e himenp-teros, existe transmisin transovrica, pero aqu las fases vegetativas o esporas se incorporan a los oocitos durante su formacin, es decir, durante la oogenesis. La misma espora funciona como fase de resistencia y es responsable por transmisin horizontal y vertical (Tanada y Kaya 1993).

6.13.1 Control de Microsporidios en Colonias de Insectos Louis Pasteur, observ que Nosema bombycis se transmite verticalmente de la madre a la progenie va huevos, as separ individualmente las hembras en la progenie y seleccion nuevas colonias derivadas de las hembras no infectadas. Hoy todava se usa este mtodo para eliminar microsporidios que se transmiten verticalmente en colonias insectiles. En los casos de infeccin vertical, transovum, las esporas se pueden destruir esterilizando la superficie con una solucin de cloro. En el caso de colonias de mosquitos, slo se requiere eliminar los adultos muertos y lavar los huevos con agua para mantener las colonias de Anopheline libres de N. algerae. Lo anterior se lleva a cabo con los siguientes pasos: Aislar individualmente las hembras grvidas en frascos esterilizados.

Despus de la oviposicin, disecar las hembras y examinar los huevos para buscar sntomas de infeccin. Criar slo la progenie de hembras no infectadas y hacer inspecciones para sntomas. Destruir todas las descendencias de hembras infectadas. Destruir la colonia contaminada y esterilizar todo lo que se use en la nueva colonia sana. Ahora bien, si el 100% de las hembras estn infectadas, es necesario esterilizar la superficie de los huevos con hipoclorito de sodio cuya concentracin debe ser ajustada de acuerdo a la susceptibilidad de los huevos. El blanqueador comercial contiene ~ 5% por lo que se recomienda iniciar con un 2%. Eclosionar huevos y criar larvas individualmente. Examinar cada hembra despus de oviposicin por si presenta infeccin y proceder como arriba. No usar drogas antimicrosporidiales. Si se tiene una infeccin de un microsporidio que se transmite horizontalmente, se puede con-trolar esterilizando todo el equipo usado en la cra. Todos los adultos u otros insectos muertos deben ser separados de los huevos, y stos deben ser lavados con agua destilada. Las esporas adheridas a la superficie de los huevos se pueden matar con una solucin de cloro al 5%. En la mayora de los casos se puede observar, que la concentracin y el tiempo de exposicin matan al microsporidio sin daar a los huevos. Las prcticas clsicas de limpieza en un laboratorio de bacteriologa son efectivas para prevenir la contaminacin. Todo el material cercano a los microsporidios debe ser esterilizado por calor o sumergido en cloro. Las esporas resistentes a la desecacin son difciles de matar al evaporarse el etanol antes de matar al patgeno. Si los procedimientos mencionados no funcionan, la enfermedad se puede controlar con algunos frmacos, que pueden ser peligrosos porque frecuentemente inhiben la produccin de esporas enmascarando la infeccin. Es comn observar que la infeccin recurre cuando cesa el tratamiento. El Benomil ha sido efectivo contra microsporidiosis en colonias de insectos. Las Fumagilina se usan comnmente para controlar a Nosema apis en las colonias de abejas. Se ha evaluado el Buquinolate para tratar infecciones en cangrejos con cierto xito (Overstreet 1975). Algunos huspedes toleran temperaturas ms altas que sus parsitos microsporidios y se pue-den desinfectar exponindolos a temperaturas elevadas hasta eliminar la infeccin. Este procedimiento fue usado contra microsporidiosis del gusano europeo del maz, Ostrinia nubilalis. Colmenas de abejas fueron curadas de N. apis (Cantwell y Shimanku 1969), larvas de Choristoneura fumiferana fueron sanadas de Nosema fumiferanae, y el pteromlido parasitoide Muscidifurax raptor tambin fue desinfectado del mismo patgeno (Geden et al. 1995) con el mismo mtodo. De cualquier manera la mortalidad del husped es alta porque la temperatura es cercana a la letal superior para el husped. Los huevos de Plutella xylostella son ms resistentes al fro que las fases vegetativas de los microsporidios que lo infectan. Las microsporidiosis se pueden eliminar exponiendo los huevos a 4 C durante 10-12 das, adems de esterilizarlos. Las esporas del patgeno de mosquitos, Edhazardia aedis se mueren en uno o dos das de exposicin a 5 C. Sin embargo, las fases vegetativas en las larvas y huevos son ms resistentes al fro (Undeen et al. 1993).

6.14 Conclusiones Las gregarinas entomoparsitas conocidas hasta ahora exhiben baja patogenicidad, a excepcin de algunas neogregarinas. Slo tienen un impacto de debilitamiento en el husped. Su posible uso como agentes de biocontrol depende de tres aspectos: alta especificidad de husped, reacciones defensivas inmunolgicas en el husped, y carecen de merogonia en el husped (excepto las neogregarinas). Por lo tanto, su uso en control microbiolgico de insectos plaga o vectores, depende de que las investigaciones se enfoquen en: estudiar la patogenicidad de las eugregarinas en huspedes no naturales, determinar el rango de huspedes para las neogregarinas conocidas, y llevar a cabo estudios de campo, sobre todo en los trpicos, para buscar especies nuevas de neogregarinas que parasiten insectos plaga u otros insectos nocivos, dado el pobre conocimiento que se tiene de este grupo de entomoparsitos. Es recomendable llevar a cabo estudios para buscar infecciones por microsporidios en larvas de especies de mosquitos tropicales; es factible encontrar especies nuevas o interesantes por su virulencia. Especial nfasis debe ponerse en especies de Aedes miembros de la comunidad Phytotelmata en bromeliceas de bosques en zonas protegidas; ah el material colectado puede albergar nuevas especies con potencial para el control de Aedes aegypti y A. albopictus.

6.15 Literatura Citada bro A. 1974. The gregarine infection in different species of Odonata from the same habitat. Zool Scr 3: 111120. bro A. 1976. The mode of gregarine infection in zygoptera (Odonata). Zool Scr 5: 25275. Andreadis TG. 1989. Host specificity of Ambyospora connecticus (Microsporida: Amblyosporidae), a polymorphic microsporidian parasite of the brown saltmarsh mosquito, Aedes cantator (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 26: 140-145. Altizer SM & Oberhauser KS. 1999 . Effects of the protozoan parasite Ophryocystis elektroscirrha on the fitness of monarch butterflies Danaus plexippus. J Invertebr Pathol 74: 7688. Balbiani G. 1882. Sur les microsporidies ou sporospermies des articules. C A Acad Sci 95 : 1168-1171. Becnel JJ & y Johnson MA. 1993. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). J Am Mosq Control Assoc 9: 269-274. Becnel JJ. 1994. Horizontal transmission and subsequent development of Amblyospora californica (Microsporida: Amblyosporidae) in the intermediate and definitive hosts. Dis Aquat Org. 13:17-28.

Beier JC & Craig Jr GB. 1985. Gregarine Parasites of Mosquitoes. In: Laird M & Wiles JW (eds.) Integrated Mosquito Control Methodologies, Vol. 2, Biocontrol and Other Innovative Components, and Future Directions. Academic Press. Bigliardi E, Selmi MG, Luperti P, Corona S & Gatti SS. 1996. Microsporidian spore wall: ultrastructural findings on Encephalitozoon hellem exospore. J Eukaryot Microbiol 43:181186. Bhoopathy S. 1996. Intestinal parasites of some cockroaches. J Ecobiol 8:51-53. Boucias DG & JC Pendland. 1998. Principles of Insect Pathology. Kluwer Academic Publishers. New York. Brooks WM. 1973. Protozoa host-parasite pathogen interrelationship in some recent advances in insect pathology. Entomol Soc Am Misc Publ 9: 105-111.

Brooks WM. 1988. Entomogenous Protozoa. In: Ignoffo CM & Mandava NB (eds.) CRC Handbook of Natural Pesticides, Vol. 5, Microbial Insecticides, Part A, Entomogenous Protozoa and Fungi. CRC Press, Boca Raton. USA. Brooks WM & Jackson JJ. 1990. Gregarines to control insect pests. In: Pinnock DE (ed.) Procedings of the Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. Adelaide, Australia, 20-24 August 1990. Department of Entomology, University of Adelaide, Adelaide, Australia. Brooks WM. 1993. Host-Parasitoid-Pathogen Interactions. In: Beckage NE, Thompson SE & Federici BA (eds.) Parasites and Pathogens of Insects, Vol. 2: Pathogens. Academic Press, San Diego, CA. Cali A & Takvorian PM. 1994. Developmental Morphology and Life Cycles of the Microsporidia. In: Wittner M & Weiss LM (eds.) Microsporidia and Microsporidiosis. ASM. Washington, D. C. Canning CU. 1964. Observations on the life history of Mattesia trogodermae sp. n., a Schizogregarine parasite of the fat body of the kharpra beetle, Trogoderma granarium Everts. J Insect Pathol 6: 305 317. Canning EU & Hazard EI. 1982. Genus Pleistophora Gurley, 1983: an assemblage of at least three genera. J Protozool 29: 39-49. Cantwell GE & Shimanku H. 1969. Heat treatment as a means of eliminating Nosema and increasing production. Am Bee J 109: 52-54. Carreo RA, Martn DS & Basta JR. 1999. Cryptosporidium is more closely related to the gregarines than the coccidian as shown by phylogenetic analysis of apicomplexan parasites inferred using small subunit ribosomal RNA gene sequences. Parasitol Res 85: 899 904.

Carroll WJ. 1956. History of the hemlock looper Lambdina fiscellaria fiscellaria (Guen.) (Lepidoptera: Geometridae) in Newfoundland and notes on its biology. Can Entomol 88: 587599. Chen WJ, Wu ST, Chow CY & Yang CH. 1997. Sporogonic development of the gregarine Ascogregarina taiwanensis (Lien and Levine) (Apicomplexa: Lecudinidae) in its natural host Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 44: 326 331. Clopton RE & Gold RE. 1996. Host specificity of Gregarina blattarum von Siebold, 1839 (Apicomplexa: Eugregarinida) among five species of domiciliary cockroaches. J Invertebr Pathol 67: 219 223. Clopton RE. 2002. Phylum Apicomplexa Levine, 1970: Order Eugregarinorida Leger, 1900. In: Lee JJ, Leedale G, Paterson D & Bradbury PC (eds.) Illustrated Guide of Protozoa, 2nd ed. Society of Protozoologist, Lawrence, Kansas, USA. Corbel JC. 1968. Gregarines nouvelles ou mal connues dinsects Orthopteres. Annales de Parasitologie Humaine et Comparee 43: 291-320. Corliss JO. 2000. Karl G. Grell and the mid 20th century renaissance of Protozoology in Germany. Protist 151: 81-94. Cox FEG. 1991. Systematics of Parasitic Protozoa. In: Kreier JP & Baker JR (eds.) Parasitic Protozoa, 2nd Ed. Vol. I. Academic Press, Inc. San Diego, CA. Dougherty MJ, Ward RD & Maroli M. 1991. Methods of reducing Ascogregarina chagasi parasitaemia in laboratory colonies of Lutzomyia longipalpis. Proceedings of the First International Symposium on Phlebotomine Sandflies, Rome, 4-6 September 1991. Parasitologia-Roma 33: Suppl. 1, 185-191. Dunkel FV & Bousch GM. 1968. Biology of the gregarine Pyxinia frenzeli in the black carpet beetle, Attagenus megatoma. J. Invertebr Pathol 11: 281-288. Fowler JL & Reeves EL. 1974. Spore dimorphism in a microsporidan isolate. J Protozool 21:538-542. Frixione E, L Ruiz, J Cerbon & Undeen AH. 1997. Germination of Nosema algerae (Microspora) spores: Conditional inhibition by D2O, ethanol, and Hg2+ suggests dependence of water influx upon membrane hydration and specific transmembrane pathways. J Eukaryot Microbiol 44: 109-116. Grant V. 1963. The Origin of Adaptations. Columbia University Press, New York. Geden CJ, Long SJ, Rutz DA & Becnel JJ. 1995. Nosema disease of the parasitoid Muscidifurax raptor (Hymenoptera: Pteromalidae): prevalence, pattern of transmission, management and impact. Biological Control 5: 607-614. Harry OG. 1970. Gregarines : Their effect on the growth of thye desert locust (Schistocerca gregaria). Nature 225 : 964-966.

Hazard EI & Weiser J. 1968. Spores of Thelohania in adult female Anopheles: Development and transovarial transmission, and redescriptions of T. legeri Hesse and T. obesa Kudo. J Protozool 15:817-823. Hendrick RP, Groff JM & Baxa DV. 1991. Experimental infections with Nucelospora salmonis n. g., n. s.: an intracellular microsporidium from Chinook salmon (Oncorhynchus tshawitscha). Am Fish Soc Newl 19:5. Jouvenaz DP. 1981. Percoll: An effective medium for cleaning microsporidian spores. J Invertebr Pathol 37: 319. Henry JE. 1981. Natural and applied control of insects by protozoa. Ann Rev Entomol 26: 4979. Johny S, Muthukumaravel K, Rhagu S, Muralirangan MC, Sanjayan KP. 1999. Geographical distribution of cephaline gregarines (Apicomplexa: Protozoa) in relation to grasshoppers (Orthoptera: Acrididae) in Tamil Nadu, India. Int J Ecol Environ Sci 25: 201207. Johny S, Muralirangan MC & Sanjayan KP. 2000. Parasitization potential of two cephalogregarines, Leydana subrammani Pushkala and Muralirangan and Retractocephalus dhawanii sp. Nov. on the tobacco grasshopper Atractamorpha crenulata (Fab.). J Orthoptera Res 9: 67-70. Keeling PJ & Fast NM. 2002. Microsporidia: biology and evolution of highly reduced intracellular parasites. Ann Rev Microbiol 56: 93-116. Keohane EM & Weiss LM. 1998. The Structure, Function, and Composition of the Microsporidian Polar Tube. In: Wittner M & Weiss LM (eds.) Microsporidia and Microsporidiosis. Washington, D. C. ASM. Kudo R. 1954. Protozoology. 4th Ed. Charles C. Thomas, Springfield. Ill. Leong KLH, Kaya HK, Yoshimura MA & Frey DF. 1992. The occurrence and effect of a protozoan parasite, Ophryocystis elektroscirrha (Neogregarinida: Ophryocystidae) on overwintering monarch butterflies, Danaus plexippus (Lepidoptera: Danaidae) from two California winter sites. Ecol Entomol 17: 338342. Levine ND. 1979. New genera and higher taxa for septate gregarines (Protozoa, Apicomplexa). J Protozool 26: 532-536. Levine ND. 1985. Phyllum II. Apicomplexa Levine, 1970. In: John JL, Seymour HH & Eugene CB (eds.) An Illustrated Guide to the Protozoa. Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas. Levine ND. 1988. The Protozoan Phylum Apicomplexa. Vol. I. Chemical Rubber Company Press Inc., Boca Raton, Florida. Lipscomb D. 1991. Broad Classification: The Kingdoms and the Protozoa. In: Kreier JP & Baker JR (eds.) Parasitic Protozoa. Academic Press, Inc. San Diego, CA.

Lucarotti CJ, Leclerc TL, & Clopton RE. 1998. Incidence of Leiydana canadensis (Apicomplexa: Eugregarinida) in Lambdina fiscellaria fiscellaria larvae (Lepidoptera: Geometridae). Can Entomol 130: 583-594. Lucarotti CJ. 2000. Cytology of Leidyana canadensis (Apicomplexa: Eugregarinida) in Lambdina fiscellaria fiscellaria larvae (Lepidoptera: Geometridae). J Invertebr Pathol 75: 117 125. McLaughlin RE & Myers J. 1970. Ophryocystis elektroscirrha sp. n. a neogregarine pathogen of the monarch butterfly Danausplexippus (L.) and the Florida queen butterfly Danaus gilippus berenice Cramer. J Protozool 17: 300305. Mtnier G & Vivars CP. 2001. Molecular characteristics and physiology of microsporidia. Microbes Infect 3: 407-415. Munstermann LE & Wesson DM. 1990. First record of Ascogregarina taiwanensis (Apicomplexa: Lecudinidae) in North American Aedes albopictus. J Am Mosq Control Assoc 6: 235-243. Muralirangan MC, Sanjayan KP & Johny S. 2000. Augmentation of Native Gregarine Parasites for the Management of Grasshoppers of Agroecosystem. In: Narasimhan S, Suresh G & Wesley D (eds.) Innovative Pest and Disease Management in Horticultural and Plantation Crops: Technology Improvement, Validation and Transfer. Allied Publishers Limited, Chennai, India. Nageli K. 1857. Uber die neue Krankerheit der Seidenraupe und verwandte Organismen. Bot Ztg 15: 220-224. Ormieres R, Louis C & Kuhl G. 1971. Mattesia oryzaephili n. sp. neogregarine parasite dOryzaephilus surinamensis L., (Colept. Cucujidae): Cycle et action pathogene. Bull Soc Zool 96: 547 556. Overstreet RM. 1975. Buquinolate as a preventive drug to control microsporidiosis in the blue crab. J Invertebr Pathol 26: 213-216. Patil CC, Amoji SD & Neelgund YF. 1985. Studies on cross infection of cephaline gregarines of tenebrionid insects. Archiv fur Protistenkunde 129: 179-182. Pushkala K & Muralirangan MC. 1997. Impact of Gregarina subramani, a new gregarine species on the biology of the grasshopper, Eyprepocnemis alacris alacris (Serville). The Entomologist 116: 165-171. Pushkala K, Muthukumaravel K, Johny S, Muralirangan MC & Sanjayan KP. 2000. Two new species of cephaline gregarines from grasshoppers (Insecta: Orthoptera) of Tamil Nadu, India: Retractocephalus dhawani sp. N. (Eugregarinidae: Dactylophoridae). J Orthoptera Res 9: 57-66. Purrini K & Keil H. 1989.Ascogregarina bostrichidorum n.sp. (Lecudinidae, Eugregarinida), a new gregarine parasitizing the larger grain borer, Prostephanus truncatus Horn (1878) (Bostrichidae, Coleoptera). Archiv fur Protistenkunde. 137: 165-171.

Reyes-Villanueva F. 2001a. Effects of the gregarines Ascogregarina culicis (Ross) and Ascogregarina taiwanensis (Lien and Levine) (Apicomplexa: Lecudinidae) upon their corresponding hosts, Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) when both species are under larval competition. Ph. D. Dissertation. University of Florida, Gainesville, FL, 78 pp. Reyes-Villanueva F, Becnel JJ & Butler JF. 2001b. Morphological traits for distinguishing extracellular gamonts of Ascogregarina culicis and Ascogregarina taiwanensis in Aedes aegypti and Aedes albopictus. J Invertebr Pathol 77: 227 229. Reyes-Villanueva F, Becnel JJ & Butler JF. 2003. Susceptibility of Aedes aegypti and Aedes albopictus larvae to Ascogregarina culicis and Ascogregarina taiwanensis (Apicomplexa: Lecudinidae) from Florida. J Invertebr Pathol 84: 47-83. Rowton ED & Munstermann LE. 1984. Electrophoretic Differences in the Isoenzymes of two Mosquito Gregarines, Ascogregarina barretti and A. geniculati. J Parasitol 70: 63-67. Sandfort J, Hannemann A, Gelderblom H, Stark K, Owen RL & Ruf B. 1994. Enterocytozoon bieneusi infection in an immunocomputent patient who had acute diarrhea and who was not infected with the human immunodeficiency virus. Clin Infect Dis 19: 514516. Schrevel J & Philippe M. 1993. The Gregarines. In: Kreier JP (ed.) Parasitic Protozoa, 2nd Ed, Vol. 4. Academic Press, Inc. San Diego, CA. Sleigh MA. 1989. Protozoa and Other Protists. In: Bulla LA & Chang TC (eds.) Comparative Pathobiology, Vol 1. Biology of the Microsporidia. Plenum Press. New York. Sprague V & Becnel JJ. 1999. Checklist of Available Generic Names for Microsporidia with Type Species and Type Hosts. In: Wittner M & Weiss LM (eds.) Microsporidia and Microsporidiosis. Washington, D. C. ASM. Sprague V, Becnel JJ & Hazard EI. 1992. Taxonomy of Phylum Microspore. Crit Rev Microbiol 18: 285-395. Stejskal M. 1972. Gregarine des abeilles au Venezuela. Bull Apicole 8: 17 26. Sulaiman I, Saaidah A, Somasundram V & Aliza AR. 1993. Infection of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) with Ascogregarina species. Trop Biomed 10: 35-39. Tanada Y & Kaya HK. 1993. Insect Pathology. Academic Press. San Diego, CA. Takvorian PM & Cali A. 1994. Enzyme histochemical identification of the Golgi apparatus in the microsporidian, Glugea stephani. J Eukaryot Microbiol 41: 63S 64S. Tseng M. 2004. Sex-specific response of a mosquito to a parasites and crowding. Proc R Soc Lond B (Suppl.) 271: S186-S188.

Undeen AH, Elgazzar LM, Vander Meer RK & Narang S. 1987. Trehalose levels and trehalose activity in germinated and ungerminated spores of Nosema algerae (Microspora: Nosematidae) spores. J Invertebr Pathol 50: 230-237. Undeen AH & Epsky ND.1990. In vitro and in vivo germination of Nosema locustae (Microsporidia: Nosematidae) spores. J Invertebr Pathol 56: 371-379. Undeen AH, Johnson MA & Becnel JJ. 1993. The effect of temperature on the survival of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae), a pathogen of Aedes aegypti. J Invertebr Pathol 61: 303-307. Undeen AH & Vander Meer RK. 1994. Conversion of intrasporal trehalose into reducting sugars during germination of Nosema algerae (Protista: Microspora) spores: a quantitative study. J Eukaryot Microbiol 41: 129-132. Undeen AH & Vavra JI. 1997. Research Methods for Entomopathogenic Protozoa. In: Lacey LA (ed.) Manual of Techniques of Insect Pathology. Academic Press. Vavra J. 1965. Etude au microscope lectronique de la morphologie et du dvelopment de quelques microsporidies. C R Acad Sci 261: 3467-3470. Vavra J & Becnel JJ. 1999. Structure of the Microsporidia. In: Wittner M and Weiss LM (eds.) Microsporidia and Microsporidiosis. Washington, D. C. ASM. Vivier E. 1975. The microsporidia of the Protozoa. Protistology 11:345-361. Walsh Jr, RD & Gallaway CS. 1969. The fine structure of the gregarine Lankesteria culicis parasitic in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J Protozool 16: 536 545. Watson ME. 1915. Some new gregarines parasites from Arthropoda. J Parasitol 2: 27-36. Weidner E, Findley AM, Dolgikh V & Sokolova J. 1999. Microsporidian Biochemistry and Physiology. In: Wittner M & Weiss LM (eds.) Microsporidia and Microsporidiosis. Washington, D. C. ASM. Weiser J. 1961. Die mikrosporidien als parasite der insekten. Monog Angew Entomol 17: 1149. Weiser J. 1976. Staining of the nuclei of microsporidian spores. J Invertebr Pathol 28: 147149. Whittaker RRH. 1959. On the broad classification of organisms. Quart Rev Biol 34: 210 226. Wright JH & Craighead EM. 1922. Infectious motor paralysis in young rabbits. J Exp Med 36: 135-149. Wu WK & Tesh RB. 1989. Experimental infection of Old and New Worldphlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) with Ascogregarina chagasi (Eugregarinorida: Lecudinidae). J Med Entomol 26: 237 242.

Zuk M. 1987. The effect of the gregarine parasite, body size, and time. Behavioral Ecol & Sociobiol 21: 65-72.

VII. El Uso de Hongos Entomopatgenos Contra Aedes aegypti

Filiberto Reyes-Villanueva1, Ernst-Jan Scholte2 y Mario A. Rodrguez-Prez3
1, 3

Instituto Politcnico Nacional. Centro de Biotecnologa Genmica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elas Pia. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, Mxico. Email: frv65@hotmail.com. Email: mrodriguez@ipn.mx 2 Plant Protection Service, Geertjesweg 15, P.O. Box 9102, 6700 EH Wageningen, the Netherlands.

7.1 Introduccin
Los primeros trabajos sobre hongos entomopatgenos se reportaron en 1835, a partir de las observaciones de A. Bassi sobre la muscardina blanca (Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin) del gusano de la seda Bombix mori L., y con el hongo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, el cual uso Metchnikoff para el control de Anisoplia austriaca (Herbst). (McCoy et al. 1988). La mayor parte de los hongos de insectos existen en asociaciones pasivas como comensales o como saprofitos. Un pequeo nmero de stos son agentes causales de enfermedades y deben ser capaces de adherirse y penetrar el husped. Para este proceso, el hongo debe romper las barreras de proteccin del exoesqueleto y una vez dentro debe evadir los sistemas de defensa y propagarse extensivamente, tornando al insecto en un foco de infeccin para otros insectos sanos (Boucias y Pendland 1998). 7.2 El Proceso de Infeccin Las conidias de los hongos entomopatgenos se agrupan de acuerdo a sus caractersticas en hidrofbicas e hidroflicas. La cubierta externa de las conidias hidrofbicas como los de Nomurea rileyi, M. anisopliae y B. bassiana, es la estructura inicial donde ocurre la interfase adhesin con la epicutcula del insecto (Boucias et al. 1984). Debido a las diferencias en composicin de aminocidos, la hidrofobicidad en la cutcula rgida (esclerotinizada), se ha estimado significativamente mayor que en las cutculas flexibles (Andersen 1979). Ensayos con tratamientos fsico-qumicos han demostrado la resistencia natural de esta cubierta, sin embargo, tales tratamientos reducen el nmero de conidias que se adhieren a la cutcula y la viabilidad de las mismas. La cubierta externa tambin acta como un antisecante y adhesivo, que protege a las conidias de los polifenoles txicos presentes en la cutcula, lo que le confiere una actividad enzimtica. La funcin primaria de muchas enzimas de los Deuteromicetos, es hidrolizar la capa de cera epicuticular, proporcionar los nutrientes requeridos para la formacin del tubo germinativo y propiciar la penetracin (Boucias y Pendland 1991). El primer tejido del husped con el cual la mayora de los micopatgenos se ponen en contacto, es la epicutcula. sta tiene una doble funcin: por un lado, es el sustrato en el cual las conidias se fijan, y por el otro, proporciona las seales qumicas necesarias para la orientacin y formacin del tubo germinativo que va a penetrar. La topografa superficial como las propiedades qumicas de la cutcula del husped, juegan un papel en el proceso de fijacin del hongo. De acuerdo con Fargues (1984), la adhesin con la epicutcula del hospedero est dividida en tres etapas: Adsorcin (fenmeno pasivo), consolidacin de la

adhesin, y germinacin de la espora con crecimiento del tubo germinativo sobre la superficie cuticular, hasta la penetracin (fenmeno activo). La adsorcin de las conidias a la cutcula, es un proceso no especfico, mediado por interacciones electrostticas e hidrofbicas (Quintela y McCoy 1998). La cutcula que se encuentra en las regiones intersegmentales, se caracteriza por la presencia de cantidades elevadas de protenas cidas y de muchas protenas glicolizadas, que contienen ms protenas que la cutcula rgida (Cox y Willis 1985). La manosa y la N-acetil-glucosamina son los principales azcares asociados con la glicolizacin de las protenas de la cutcula flexible, sin embargo, an no se sabe si estas diferencias reflejan variacin de epicutculas o se debe a los procesos de formacin en la procutcula (Boucias y Pendland 1991). Adems de las protenas estructurales, se ha detectado una variedad de actividad enzimtica; aparte de las quitinasas, tambin estn las fenoloxidasas, esterasas, fosfatasas, fosforilasas y peroxidasas. 7.3 Germinacin de las Esporas Se requieren de fuentes de carbono, nitrgeno y energa para la formacin del tubo germinativo; la habilidad del hongo para utilizar estos elementos est en funcin de su agresividad y virulencia, expresada en la cantidad de esporas requeridas para matar al insecto y en el tiempo de germinacin y penetracin despus de su adhesin a la cutcula. Aunque algunas evidencias indican que ciertos aislados de hongos como B. bassiana, pueden germinar en agua (Lefebvre 1934), la mayora sugiere que ellos necesitan la adicin de nutrientes, como son las fuentes de carbono y de nitrgeno. Se ha observado que ocurren crecimientos masivos sobre N-acetil-glucosamina o slo glucosamina, lo que indica que estos componentes pueden ser usados por el hongo como nicas fuentes nutritivas (C 2 y N2) y energa. Resultados similares se encontraron con M. anisopliae (St. Leger et al. 1991). De los compuestos que se han detectado sobre la superficie de la cutcula del insecto, se encuentran cidos grasos de cadena larga, lanolina (ceras) e hidrocarburos de aceites ligeros; stos pueden ser utilizados por B. bassiana como fuentes energticas. La habilidad lipoltica de los hongos entomopatgenos sobre la cutcula, puede darles algunas ventajas sobre otros hongos. Las esporas de M. anisopliae y Beauveria spp., llevadas por el aire, son favorecidas en su germinacin y crecimiento al adicionar lpidos al medio de cultivo no estril (Schaerffenberg 1964). Hay poca informacin sobre la disponibilidad de los nutrientes en la superficie de la cutcula de los insectos. Se sabe que las conidias de M. anisopliae germinan lentamente sobre algunas regiones de la cutcula de la palomilla Cossus cossus (Hamm), tratadas previamente con solventes de lpidos, en tanto que en la cutcula intacta, el hongo crece rpidamente; mientras que los compuestos solubles en ter de la superficie de la cutcula de la langosta del desierto Schistocerca gregaria, estimulan la germinacin de M. anisopliae (Veen 1968). Una germinacin exitosa no slo requiere de la asimilacin de los nutrientes utilizables, sino tambin de la tolerancia a algunos componentes txicos presentes. Evidencias indirectas de la presencia de substancias inhibidoras, se desprenden de estudios donde se eliminan (por medios qumicos o mecnicos), los lpidos epicuticulares, lo cual aumenta la patogenicidad del hongo o permiten la germinacin e invasin de otros hongos (Pekrul y Grula 1979). Charnley (1997) utiliz extractos de lpidos de la cutcula del gusano de seda Bombix mori L. y del barrenador del tallo Chilo simples (Zincken), los cuales resultaron tener accin fungicida y fungitxica, dependiendo de su concentracin. Los ms activos fueron los cidos grasos saturados de cadena media, como el cido cprico y el caprlico. Las esporas estn en riesgo durante el perodo de exposicin sobre la cutcula, previo a su germinacin, por lo que

no es sorprendente que la hipervirulencia en ciertos mutantes, como los de M. anisopliae patgenos del mosquito Culex pipiens, est correlacionada con la velocidad de germinacin (Al-Adroos y Seifert 1980). 7.4 Principales Hongos Patgenos de Insectos Se han reportado ms de 700 especies de hongos entomopatgenos pero slo 10 se han desarrollado para control de insectos (Hajek y St. Leger 1994). Se han documentado una gran variedad de biologas desde patgenos oportunistas que pueden sobrevivir saprofticamente en la ausencia de huspedes vivos, hasta un parasitismo obligatorio. Para la mayora de los hongos el acceso al husped es va cutcula e involucra interacciones bioqumicas complejas entre el husped y el hongo, antes de que ocurra la germinacin, penetracin, crecimiento, y reproduccin del hongo. Los ciclos de hongos parsitos obligatorios como las especies de Coelomomyces involucran huspedes intermedios, mientras que los hongos imperfectos (Deuteromycotina: Hyphomycetes) exhiben los ciclos ms simples al carecer de reproduccin sexual y tener un rango ms amplio de huspedes (Scholte et al. 2004). Muchos entomopatgenos como los Entomophtorales pueden causar epizootias que regulan las poblaciones de insectos en campo. Sin embargo, en el control biolgico clsico el mtodo ms comn es mediante aplicaciones inundativas, y aqu los entomophtorales son de difcil manejo porque sus conidias primarias son de corta vida y esto es un fuerte obstculo para desarrollar mtodos efectivos de produccin de esporas de resistencia. Por otro lado, los hongos Hyphomicetos o Imperfectos tienen actividad contra una gama ms amplia de insectos y es el grupo principal que ofrece potencialidad para ser usados contra insectos nocivos, porque se pueden producir en substratos baratos y tiene vidas de anaquel ms largas (Hajek y St. Leger 1994). Existe un complejo de interacciones entre factores ambientales y biticos para iniciar o inhibir el desarrollo de epizootias por hongos. Estos factores son susceptibilidad a la radiacin solar, microbios antagonistas, comportamiento del husped, condiciones fisiolgicas, edad, vigor y edad del patgeno, y condiciones apropiadas de humedad, temperatura y umbrales de inoculo (Ferron 1985). Por lo tanto, el uso exitoso de los hongos entomopatgenos como agentes de biocontrol depender del uso del propgulo correcto (conidias o micelio), formulados de una manera ptima y aplicados en la dosis y tiempo apropiados. La programacin depender de la presencia de huspedes disponibles y condiciones ambientales favorables, ms la ausencia de productos qumicos. Esto tambin es mejorable con otras tcnicas o medidas como el uso de semioqumicos. Por ejemplo, el uso de atrayentes en las trampas para que concentren los insectos y se contaminen con las esporas, no slo matar a los insectos sino que permitir la autodiseminacin del hongo hacia hbitats difciles como agua y suelo (Lacey et al. 2001). Existen muchos reportes en la literatura respecto a enemigos naturales que se han usado en el biocontrol de mosquitos. No obstante, son muy contados los hongos que se han empleado para el control del vector del dengue, Aedes aegypti. En un artculo reciente se incluy una revisin muy completa sobre este tpico (Scholte et al. 2004), el cual recomendamos al lector que desee tener informacin ms detallada. En general, los hongos ms usados contra mosquitos Culicidae son el Oomiceto Lagenidium giganteum, el cual incluso ya se maneja comercialmente. Tambin el Chytridiomiceto Coelomomyces y los Deuteromicetos Culicinomyces, B. bassiana y M. anisopliae, contra larvas de varias especies de mosquitos,

incluyendo A. aegypti. En base al artculo de Scholte et al. (2004) aqu se har una resea de los hongos ms relevantes versus el vector del dengue. 7.5 Hongos Contra Larvas de Mosquitos Segn la nomenclatura de la 9 edicin del diccionario de los hongos (Kirk et al. 2001), las especies ms trascendentes histricamente versus A. aegypti se mencionan a continuacin: Los hongos acuticos (Phylum Oomycota) crecen vegetatitavemente como saprofitos sobre plantas y son parsitos facultativos de larvas de mosquito. Entre ellos destacan Leptolegnia chapmanii, el cual fue encontrado originalmente en larvas de Ochlerotatus triseriatus en Louisiana en 1971 (Seymour & Briggs 1984). Este hongo result muy patognico (100% de mortalidad) para larvas de primero y segundo instar de A. aegypti a las 24 h postexposicin. Otra especie interesante es Lagenidium giganteum, el cual es cosmopolita e infecta principalmente larvas de Culex y Anopheles. El ciclo biolgico comprende larvas de mosquitos y coppodos como huspedes, y la fase infecciosa esta en las zoosporas biflageladas que se adhieren a la cutcula larval para adherirse y penetrar al husped, mientras que la fase sexual esta en las oosporas que se forman dentro del husped. A nivel de laboratorio el hongo infecta y mata al 99% de larvas tempranas de A. aegypti pero en campo no ha resultado prometedor para este vector, principalmente por la corta vida de las zoosporas (no ms de 48 h) como obstculo de formulacin. Sin embargo, un formulado a base de micelio en fermentacin si mata al 40 60% de larvas de Culex tarsalis y Anopheles freeborni en cultivos de arroz en California (Kerwin et al. 1986). El Phylum Chitridiomycota, que tambin son saprobios sobre materia orgnica o suelo en cuerpos acuticos, tienen zoosporas flageladas y quitinosas, y slo en el orden Blastocladiales existe el gnero entomopatgenos Coelomomyces. Este gnero contiene ms de 70 especies que son entomoparsitas obligatorias y con un ciclo muy complejo formado por generaciones alternas sexuales (gametoftica) y asexuales (esporoftica). El gnero infecta slo dpteros acuticos y es generalista para huspedes. La fase de resistencia durante perodos secos o fros es el esporangio a partir de hifas diploides dentro del husped, y que son liberadas al ambiente a partir de los cadveres. Este esporangio pasa por meiosis y produce meiosporas uniflageladas infecciosas para los coppodos u ostrcodos en donde ocurre la fase haploide o gametofitica en el hemocele. Para ms detalle leer a Scholte et al. (2004). Al igual que L. giganteum, este hongo no tiene potencial para usarse contra A. aegypti y an ms por problemas de formulacin debido a la fase que requiere la presencia de los microcrustceos. Respecto al Phylum Zygomycota, donde estn las Clases Trichomycetes y Zygomycetes con micelio cenoctico y sin esporas flageladas, no hay especies relevantes para el control de A. aegypti. Slo esta Entomophtora culicis que como todos los de este Phylum, infecta primariamente adultos, y con reportes muy escasos para infecciones de A. aegypti en laboratorio. Dentro de este Phylum se encuentra la Clase Deuteromycetes (= Hyphomycetes), la cual es la ms importante en patologa de insectos. Contiene a los entomopatgenos ms relevantes para el control de insectos nocivos al hombre, tanto en el mbito agrcola como en el mdico-veterinario. Estos hongos tambin llamados anamrficos incluyen a los gneros ms importantes para el control de mosquitos vectores y son: Culicinomyces, Beauveria, Metarhizium y Tolypocladium (Scholte et al. 2004). De los cuatro gneros, Culicinomyces es curioso porque infecta larvas de mosquitos va oral, a diferencia de los dems en donde la infeccin es cuticular. En Cuilicinomyces clavisporum, las conidias son ingeridas por las larvas y germinan en el tubo

digestivo para de ah perforarlo a nivel de estomodeo o proctodeo pero no en mesenteron, e invadir el hemocele. Este hongo es un parsito facultativo de una gran variedad de dpteros incluyendo mosquitos (Legner 1995) aunque en campo no se ha reportado infectando a A. aegypti. En el laboratorio se ha observado que aislados Australianos de C. clavisporum son ms virulentos para A. aegypti que los aislados Americanos (Cooper y Sweeney 1982). Problemas para formular las conidias, ms el hecho de que stas germinen solas en agua haciendo que el hongo no sea residual, han desmotivado la investigacin de su potencial en biocontrol del vector del dengue. Dentro de los Deuteromycetes, se encuentra Beauveria con las especies B. bassiana y B. brongniartii. Es un hongo que infecta slo va cuticular y comnmente se ha aislado de un rango muy amplio de insectos a nivel mundial, pero tampoco se ha reportado infectando a A. aegypti en campo ni en laboratorio. Si es infeccioso para adultos de A. aegypti en laboratorio (Fig. 1), causando el 100% de mortalidad en una exposicin de 5 das (Clark et al. 1968). El hongo posee un arsenal de varias toxinas como la Beauvericina, Bassianina, Tenelina y otras de B. bassiana, y la Oosporeina de B. brongniartii. La Beauvericina A y B (Destruxinas) causan hasta el 86% de mortalidad larval en A. aegypti a las 48 h postexposicin a la dosis de 20 g/ml (Grove y Pople 1980). Las desventajas es que se necesitan dosis altas de conidias contra larvas y adems germinan solas; para adultos las conidias requieren una humedad relativa de al menos 94% para germinar pero una formulacin en aceite podra mejorar su eficacia contra adultos. Finalmente esta el hongo Metarhizium anisopliae el cual contiene cuatro variedades (Driver et al. 2000), dos de las cuales son las ms importantes: M. anisopliae va. acridum (antes llamado M. flavoviridae) muy comn en Homoptera, y M. anisopliae var. anisopliae, ms conocido simplemente M. anisopliae. Este hongo infecta a ms de 200 especies de artrpodos e insectos, incluyendo mosquitos (Scholte et al. 2004). Una vez que las conidias germinan y el tubo germinal perfor la cutcula, las hifas hemocelmicas producen una variedad de toxinas como Destruxinas, Swansinonas y Citocalasina C, que matan al husped despus de un perodo de incubacin de 4 16 das, dependiendo del husped de que se trate (Strasser et al. 2000). El husped muere finalmente por intoxicacin, inanicin, obstruccin fsica por el hongo en hemocele y deshidratacin, entre otras causas.

Fig. 1. Aedes aegypti adulto infectado con Beauveria bassiana, y con micelio blanco esporulado. Desde hace tiempo existen reportes en la literatura respecto al efecto del hongo sobre larvas de A. aegypti (Roberts 1970, Daoust et al. 1982). La virulencia de los aislados se incrementa de 1.6 a 2.5 veces despus de que se pasa por mosquitos; slo para tener una idea, en estudios de campo contra larvas de Culex pipiens, se encontr que dosis de 300 a 600 mg de conidias/m2 en charcas, redujeron las poblaciones en 91 y 94% (Roberts 1974). 7.6 Hongos Contra Adultos de los Vectores del Dengue Respecto a la susceptibilidad en adultos, en laboratorio y campo se ha encontrado que Culex quinquefasciatus y Anopheles gambiae s.s. fueron afectados por conidias en aceite con un TL50 (tiempo letal medio) de 4 6 das (Scholte et al. 2003). Los adultos fueron atrados a un cartn impregnado con las conidias y con una solucin de sacarosa al 6%. Los mosquitos fueron expuestos a las dosis de 1.6 x 105 1.6 x 108 de conidias/m2, y los machos de ambas especies murieron ms rpido, mientras que para ambos sexos el 100% de mortalidad se encontr al da 7 para A. gambiae s.s. y para el da 6 en C. quinquefasciatus (Scholte et al. 2003). Para A. gambiae s.s. el TL50 fluctu entre 3 y 5 das para conidias secas y de 6 a 9 das para formulacin en aceite de girasol (Cuadro 1 y 2). En el 2005 se llevo a cabo el primer experimento de campo usando hongos contra mosquitos vectores, y este fue el estudio de Scholte et al. (2005) en Tanzania, frica. Impregnaron conidias de M. anisopliae sobre una manta negra de algodn la cual colocaron en el techo de las viviendas y lograron una infeccin de 23% en Anopheles gambiae s.s., y una disminucin en 75% la transmisin de la malaria. Estos resultados son aparte de los efectos negativos que la micosis ejerce sobre la fecundidad y capacidad de ingestin sangunea del vector. Lo anterior pone de manifiesto el potencial de estos hongos en control vectorial, porque en entomologa mdica no se requiere matar a la poblacin de insectos como ocurre en el caso de una plaga agrcola. Una mortalidad no espectacular puede hacer que el hongo trunque los ciclos de transmisin viral y que haya vectores sin que se presente la enfermedad que transmiten. Uno de los efectos ms visibles de una micosis es la deshidratacin de los tejidos del husped. La falta de agua en los tejidos puede evitar que el virus del dengue se replique y que finalmente no llegue a infectar glndulas salivales; esto es que se interrumpa la incubacin extrnseca y esto puede suceder antes de los 10 das que en promedio dura este periodo. En un estudio de laboratorio ms reciente pero ya sobre los vectores del dengue, Scholte et al. (2007), evaluaron a M. anisopliae vs Aedes aegypti y A. albopictus. Aplicaron el hongo a una dosis de 1.6 x 1010 conidias/m2 sobre una manta de color negro como sitio de reposo para los adultos en jaulas. Reportaron una mortalidad de 87 2.65% en A. aegypti y de 89.3 2.2% en A. albopictus. La longevidad de mosquitos infectados se redujo significativamente en comparacin a los sanos. El TL50 fue de 3.1 0.32 % y 4.1 0.3 % das para machos y hembras de A. aegypti, respectivamente. Los valores de la TL50 para mosquitos sanos vario desde 17.7 0.4 das para hembras y hasta 19.7 0.6 das para machos de A. albopictus. Estos resultados indicaron que ambas especies de mosquitos son altamente susceptibles a la infeccin con este hongo.

Cuadro 1

Cuadro 2

El segundo estudio, tambin muy reciente, sobre hongos contra vectores del dengue, fue conducido en Brasil (De Paula et al. 2008). Evaluaron cuatro aislados de M. anisopliae y tres de Beauveria bassiana, y de ellos, tres del primero y uno del segundo fueron seleccionados en la primera etapa. La dosis fue de 1 x 109 conidias ml-1 (= 5 x 106 conidias/cm2) por aislado en papel filtro confinado por 48 h con 50 hembras de A. aegypti en frascos pequeos de plstico (12 x 7 cm), y tambin impregnando telas de algodn (30 x 20 cm) de color negro dentro de jaulas grandes (115 x 70 x 75 cm) con la misma dosis en espray (=2.2 x 107 conidias/cm2) durante un periodo de 7 dias. Para los bioensayos con papel filtro, los tres aislados ms virulentos fueron dos de M. anisopliae con un TL50 de 3dias y uno de B. bassiana con 5 das, respectivamente. Para las jaulas, el 70% de los mosquitos tratados murieron, contra 20% de mortalidad en el control; el TL50 fue de 4 das y las hembras control duraron hasta 30-40 das. Este estudio conducido por investigadores Brasileos es de gran relevancia ya que demostr que M. anisopliae es capaz de reducir la sobrevivencia de una poblacin del vector del dengue hasta un 30% en siete das despus de la exposicin al hongo. Esto significa que si es factible que la micosis trunque la incubacin extrnseca del virus en el vector. En nuestro laboratorio llevamos a cabo un bioensayo (en prensa en una revista cientfica) sobre hongos contra adultos vectores del dengue, para evaluar la virulencia de tres aislados de M. anisopliae vs hembras de A. aegypti (Fig. 2).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10

Saltillo META-SIN Aislado Control-Saltillo

% sobrevivencia

ControlMETA-SIN ControlAislado

11

16

21

26

31

36

41

46

Fig. 2. Curvas de sobrevivencia de Aedes aegypti expuestas a una concentracin de 6 x Tiempo (das) 109 conidias secas m-1 de tres aislados de M. anisopliae durante 48 h. Smbolos: ver texto (Filiberto Reyes-Villanueva, Alfonso Garza Hernndez y Patricia Tamez-Guerra, indito 2009). Los aislados fueron un formulado granulado comercial (META-SIN) como control positivo, otro (Saltillo) que fue encontrado originalmente infectando Diabrotica spp. en campo y que se aisl en medio de papa-dextrosa-agar (Dr. Sergio Snchez-Pea) y un tercero llamado Aislado pero que es el Saltillo despus de ser pasado por A. aegypti. Como se puede observar, el aislamiento Aislado aumento su virulencia alrededor de 2 veces ya que su TL50 fue de cerca de 15 das antes de ser pasado por el mosquito (original) y se acort hasta 7 das despus de ser pasado por el husped. Aunque la virulencia de estos aislados de M. anisopliae del noreste de Mxico, es aceptable, es baja en comparacin a los aislados Africanos y Brasileos ya descritos. No obstante, su efecto sobre la competencia vectorial no se puede subestimar.

Fig. 3. Una hembra de Aedes aegypti muerta por la micosis de Metarhizium anisopliae adquirida al copular con un macho impregnado con 6 x 108 conidias ml-1 (Foto de Alfonso Garza Hernndez).

En un segundo estudio nuestro, ahora para estimar el efecto del aislado Saltillo ya pasado por el mosquito (Aislado), pero adquirido va cpula, sobre fecundidad y sobrevivencia de A. aegypti, encontramos que la fecundidad en hembras se redujo en 70% en comparacin a las del control. Es decir, que las hembras que se infectaron (Fig. 3) al copular con machos impregnados con una dosis de 1 x 108 conidias ml-1, exhibieron una media de huevos de 23.3 6.42/hembra, mientras que la media de las del testigo fue de 76.32 1.50 huevos. Cuadro 3. TL50 y tasas de esporulacin en 20 hembras vrgenes expuestas a un macho virgen de Aedes aegypti, previamente expuesto a 6 x 108 conidias ml-1 de un aislado original (Saltillo) y el mismo despus de pasarse por A. aegypti (Aislado) de M. anisopliae (Filiberto Reyes-Villanueva, Alfonso Garza Hernndez y Patricia TamezGuerra, indito). Aislado Saltillo Saltillo (Control) Aislado Aislado (Control) 7.7 Conclusiones Ambos sexos de Aedes aegypti y A. albopictus son muy susceptibles a Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. Ambos hongos pueden aplicarse directamente cuando los mosquitos se posan sobre superficies de papel filtro o telas de algodn, previamente impregnadas con conidias secas o en formulaciones de aceites vegetales (de girasol). M. anisopliae es el ms prometedor al existir aislados que matan al 50% de la poblacin expuesta de mosquitos en tres das. M. anisopliae tambin se puede diseminar en una poblacin de hembras vrgenes, al copular con machos impregnados con conidias, a una dosis mnima de 6 x 10 8 conidias ml-1. Estas micosis adquiridas va copula ocasionan una reduccin del 70% en fecundidad de las hembras, y el 50% mueren en menos de 10 das despus de copular con machos impregnados. Exposicion (horas) 48 48 48 48 TL50 ES 14.21 0.86 24.5 0.86 9.56 0.69 28.26 0.52 % Esporulacion 38.3 0 26.7 0 0.001 X2 P < 0.05 0.001

7.8 Literatura Citada Al-Adroos KY & Seifert AM. 1980. Polysaccharide and protein degradation, germination and virulence against mosquitoes in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. J Invertebr Pathol 36: 29-34. Andersen SO. 1979. Biochemistry of insect cuticle. Annu Rev Entomol 24: 29-61.

Boucias DG & Pendland JC. 1998. Principles of Insect Pathology. Kluwer Academic Publishers. New York. Boucias DG & Pendland JC. 1991. Attachment of Mycopathogens to Cuticle. In: Cole GT & Hoch HC (eds.) The Initial Event of Mycoses in Arthropod Hosts. Plenum Publishing Corporation. Boucias DG, Brasaemle DL & Nation JL. 1984. Lipid composition of the Entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi. J Invertebr Pathol 43: 254-258. Clark TB, Kellen WR, Fukuda T & Lindgren JE. 1968. Field and laboratory studies of the pathogenicity of the fungus Beauveria bassiana to three genera of mosquitoes. J Invertebr Pathol 11: 17. Cooper R & Sweeney AW. 1982. The comparative activity of the Australian and United States strains of Culicinomyces clavosporus bioassayed in mosquito larvae of three different genera. J. Invertebr Pathol 40: 383-387. Cox DL & Willis JH. 1985. The cuticular proteins of Hyalophora cecropia from different anatomical regions and metamorphic stages. Insect Biochem 15: 349-362. Daoust RA, Ward MG & Roberts DW. 1982. Effect of formulation on the virulence of Metarhizium anisopliae conidia against mosquito larvae. J Invertebr Pathol 40: 228-236. De Paula AR, Brito ES, Pereira CR, Carrera MP & Samuels RI. 2008. Susceptibility of adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) to infection by Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana: prospects for Dengue vector control. Biocontrol Sci & Technol 18: 1017-1025. Driver F, Milner RJ & Trueman JWH. 2000. A taxonomic revision of Metarhizium based on a phylogenetic analysis of rDNA sequence data. Mycological Res 104: 134-150. Fargues JF. 1984. Adhesion of the Fungal Spore to the Insect Cuticle in Relation to Pathogenicity. In: Roberts DW & Aist JR (eds.) Infection Processes of Fungi. Rockefeller Foundation Conference Report. Ferron P. 1985. Fungal Control. In: Kerkut GA & Gilbert LI (eds.) Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Pergamon Press. Oxford. Grove JF & Pople M. 1980. The insecticidal activity of Beauvericin and the enniatin complex. Mycopathologia 70: 103-105. Hajek AE & St. Leger RJ. 1994. Interactions I fungal pathogens and insect hosts. Annu Rev Entomol 39: 293-322. Kerwin JL, Simmons CA & Washino RK.1986. Oosporogenesis by Coelomomyces giganteum in liquid culture. J Invertebr Pathol 47: 258-270. Kirk PM, Cannon PF, David JC & Stalpers JA. 2001. Dictionary of the Fungi, 9th edition. CABI Publishing.

Lacey LA, Frutos R, Kaya HK & Vails P. 2001. Insect pathogens as biological control agents: do they have a future? Biological Control 21: 230-248. Lefebvre CL. 1934. Penetration and development of the fungus Beauveria bassiana in the tissues of the corn borer. Annals of Botanic. 48: 441-452. Legner EF. 1995. Biological control of Diptera of medical and veterinary importance. J Vector Ecol 20: 59-120. McCoy CW, Samson RA & Boucias DG. 1988. Entomogenous Fungi. In: Ignoffo CM & Mandava NB (eds.) Handbook of Natural Pesticides. Vol. V. Microbial Insecticides. Part. A. Entomogenous Protozoa and Fungi. CRC Press. Boca Raton, FL. Pekrul S & Grula EA. 1979. Mode of infection of the corn earworm (Helithis zea) by Beauveria bassiana as revealed by scanning electron microscopy. J Invertebr Pathol 34: 238-247. Quintela ED & McCoy CW. 1998. Conidial attachment of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the larval cuticle of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae) Treated with Imidacloprid. J Invertebr Pathol 72: 220-230. Roberts DW. 1970. Coelomomyces, Entomophtora, Beauveria, and Metarhizium as parasites of mosquitoes. Miss Publ Ent Soc Am 7: 140-145. Roberts DW. 1974. Fungal Infections of Mosquitoes. In: Aubin A, Belloncik S, Bourassa JP, LaCoursiere E & Pellissier M (eds.) Le Controle des Moustiques/Mosquito Control. Presses de lUniversite du Qubec. Schaerffenberg B. 1964. Biological and environmental conditions for the development of mycoses caused by Beauveria and Metarhizium. J Insect Pathol 6: 8-20. Scholte EJ, Njiru BN, Smallegang RC, Takken W & Knols BGJ. 2003.Infection of malaria (Anopheles gambiae s.s.) and filariasis (Culex quinquefasciatus) vectors with the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Malaria Journal 2:29. Scholte EJ, Knols BGL, Samson RA & Takken W. 2004. Entomopathogenic fungi for mosquito control: a review. J Insect Sci 4: 19. Scholte EJ, Ng'habi K, Kihonda J, Takken W, Paaijmans K, Abdulla S, Gerry F. Killeen GF and Knols BGJ. 2005. An Entomopathogenic Fungus for Control of Adult African Malaria Mosquitoes. Science 308: 1641 1642. Scholte EJ, Knols BGL, Samson RA & Takken W. 2007. Infection of adult Aedes aegypti and Aedes albopictus mosquitoes with the Entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Acta Tropica 30: 45-57. Seymour RL & Briggs JD. 1984. Occurrence and control of Aphanomyces (Saprolegniales: Fungi) infections in laboratory colonies of larval Anopheles. J Am Mosq Control Assoc 1: 100102.

St. Leger RJ, Charnley AK & Cooper RM. 1991. Kinetics of the digestion of insect cuticles by a protease (Pr1) from Metarhizium ansiopliae. J Invertebr Pathol 57: 146-147. Strasser H, Vey A & Butt TM. 2000. Are there any risks in using Entomopathogenic fungi for pest control, with particular reference to the bioactive metabolites of Metarhizium, Tolypocladium and Beauveria species? Biocontrol Sci & Technol 10: 717-735. Veen KH. 1968. Recherches sur la Maladi, due Metarhizium anisopliae chez criquet pelerin. Med Land Wageningen 68: 1-77.

VIII. La Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Transmisores del Dengue

Othn Javier Gonzlez Gaona1 y Adriana E. Flores-Surez2
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Instituto Tecnolgico de Ciudad Victoria, Licenciatura en Biologa, Laboratorio de Zoologa. Blvd. Emilio Portes Gil N 1301 Pte. C.P. 87010. Ciudad Victoria, Tamaulipas, Mxico. E-mail: othonjavier@hotmail.com.mx 2 Universidad Autnoma de Nuevo Len, Facultad de Ciencias Biolgicas, Laboratorio de Entomologa Mdica, Apdo. Postal 391, , San Nicols de los Garza, N. L. 66450, Mxico. E-mail: adrflores@gmail.com.mx

8.1 Introduccin El dengue y su variante clnica, que se manifiesta como dengue hemorrgico, son enfermedades que cada vez van cobrando mayor importancia en la salud pblica de los pases de Amrica. Sus vectores Aedes aegypti y A. albopictus han encontrado condiciones ambientales que favorecen su presencia prcticamente por todas latitudes, facilitando con ello la diseminacin de los virus, ocasionando que el mortal dengue hemorrgico se est haciendo gradualmente endmico en Amrica Latina y el Caribe (Dorta et. al. 2005). Los programas de lucha con miras a la erradicacin de los vectores, por lo general basan el control en la aplicacin de insecticidas, que usualmente se hace de manera desorganizada sobre recipientes que podran destruirse o recogerse, mientras que para la eliminacin de adultos se asperjan excesivamente a ultrabajo volumen (UBV) y en reas donde no debera hacerse (PAHO 1994). Ello conlleva a la contaminacin del ambiente, al incremento en los riesgos de intoxicaciones ya que las aplicaciones a UBV tienen ms impacto en las poblaciones humanas que en las del mosquito (Horstfall 1975, citado por Gubler 1989), adems de gastar los escasos recursos con los que cuentan los programas de lucha contra el vector. El problema se puede agravar, debido al desarrollo de la resistencia a los insecticidas. La presin de seleccin que ejercen stos sobre las poblaciones de vectores, ha dado lugar al desarrollo generalizado de la resistencia en muchas especies y por consiguiente a la prdida de efectividad de los productos aplicados. La resistencia de A. aegypti a temefs y malatin se ha difundido por todo el Caribe y en algunos pases de Amrica Central y Sudamrica, adems de la resistencia a fenitrotin reportada en otros pases (Dorta et. al. 2007, OPS 1995). Tambin se han encontrado casos de resistencia cruzada para piretroides, rganofosforados y carbamatos (Flores et. al. 2005). El riesgo de un escenario donde no exista insecticida efectivo, cuando se presenten brotes epidmicos para controlar una emergencia, es elevado. Debido al papel que juegan los insecticidas en el control de los vectores del dengue y las implicaciones que tiene, ms el empleo de estas molculas de manera desmedida e irracional, es que se aborda este tema de la resistencia. El modo de accin, el metabolismo y los mecanismos de resistencia de los insecticidas, que se emplean en el control de los mosquitos, son aspectos que debern considerarse para que el uso de esta herramienta de control pueda formar parte de una estrategia de manejo integrado de los vectores.

8.2 El Control Qumico de Larvas Desde la II Guerra Mundial se han empleado larvicidas para controlar vectores, y estos han cambiado selectivamente segn sus caractersticas y exigencias para su uso en salud pblica. Se han aplicado DDT, BHC y ciclodienos, Organoclorados que actualmente son de uso prohibido o restringido. De los rganofosforados que se han utilizado, se cuenta entre otros: malatin, fentin, fenitrotin, clorpirifos, pirimifos metil y temefos, este ltimo de los ms utilizados, por sus caractersticas deseables para un larvicida (Dorta et. al. 2005, Annimo 1991). De los Carbamatos se menciona al propoxur y bendiocarb. Los piretroides, que es uno de los grupos de insecticidas orgnico-sintticos ms recientes, se han aplicado: permetrina, cipermetrina, ciflutrina, deltametrina, -aletrina, -fenotrina y lamdacialotrina. (Roberts 1985, Arredondo et. al. 1993, Shono et. al. 1991, Peairs y Cranshaw 2008, Flores et. al. 2005). De los insecticidas microbiales estn: Bacillus thuringiensis israeliensis y B. shaericus, el primero es una bacteria especfica para mosquitos y simulidos. De los reguladores del crecimiento se cuenta con: metopreno, diflubenzuron, novaluron y piriproxifn (Peairs y Cranshaw 2008; Tompson 1992; WHO 2006).

8.3 Control Qumico de Adultos La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) aval, desde los aos 60s, el uso del malatin, el cual ha sido sustituido por otros organofosforados y piretroides. Las aplicaciones normalmente se hacen mediante rociados residuales peridomiciliares y en el interior de las viviendas, y en casos de la aparicin de brotes epidmicos, como medida de emergencia se realizan aplicaciones generalizadas. Algunos de los organofosforados que se reportan en el control de mosquitos adultos son: clorpirifos, diclorvos, triclorfn, fentin, fenitrotin, pirimifs-metil. Del grupo de piretroides estn: bioresmetrina, ciflutrina, cipermetrina, cifenotrina, d,d-trans-cifenotrina, D-fenotrina, etofenprox, cialotrina, permetrina, deltametrina, resmetrina y fenotrina (Thompson 1992, Vejar 1994, WHO 2006, Peairs y Cranshaw 2008).

8.4 El Modo de Accin de los Insecticidas que se Aplican Contra Mosquitos Una vez que el insecticida ha logrado penetrar al cuerpo del insecto, deber translocarse hasta llegar a su sitio de accin o blanco, o puede seguir otra ruta que lo puede llevar a acumularse en tejidos, biotransformarse, metabolizarse o ser excretado. Los insecticidas sintticos como piretroides, organofosforados y carbamatos son neurotxicos pero afectan de diferente manera al sistema nervioso.

8.4.1 Piretroides Especficamente, los piretroides actan sobre el sistema nervioso central o en los axones motores y sensores de neuronas del sistema perifrico, se ligan a una protena de los canales de sodio en el nervio. Normalmente esta protena abre, induce el estmulo en el nervio, y cierra para poner fin a la seal nerviosa. Los piretroides se adhieren a esta entrada impidiendo el cierre normal, por lo que los iones entran al axn en descargas repetidas, para

causar excitacin y eventualmente parlisis, es decir una continua estimulacin nerviosa (Miller y Adams 1982, Valles y Koehler 2003, Ware y Withacre 2004). No se han encontrado problemas de carcinognesis o mutagnesis con estas molculas y son relativamente seguras para mamferos y extremadamente txicas para artrpodos. Tienen coeficiente de toxicidad negativo con respecto a la temperatura, es decir, son ms txicos a bajas temperaturas. Los efectos de intoxicacin se manifiestan mediante una serie progresiva de sntomas, que incluyen hiperactividad, ataxia, convulsiones y eventualmente parlisis. La velocidad con que los sntomas se desarrollan depende de: el qumico aplicado, el modo de aplicacin y la temperatura. La deltametrina y cipermetrina, que son esteres -cyano-3-fenoxibenzil, no exhiben el sntoma de excitacin; en cambio desarrollan un estado letrgico y ataxia, que preceden a una condicin descrita como parlisis flcida (Adams y Miller 1980). La aletrina y tetrametrina afectan al insecto ocasionando una rpida y normalmente reversible parlisis a la cual se le llama efecto knockdown segn Sawicki (1962, mencionado por Miller y Adams 1982). La velocidad de accin o eficiencia knockdown esta relacionada con la polaridad de la molcula (Briggs et al. 1974). Los piretroides ms polares tienden a ser mejores agentes knockdown. Se argumenta que la porcin caracterstica (coeficiente octanolagua) de los piretroides gobierna su velocidad de transporte al sitio de accin en el sistema nervioso. La accin potencial de los piretroides sobre el sistema nervioso central y perifrico va a tener una respuesta neurofisiolgica que va a variar de acuerdo al tipo de nervio, al compuesto aplicado y a la temperatura (Miller y Adams 1982).

8.4.2 Organofosforados y Carbamatos En los insectos, los efectos de los organofosforados (OFs) estn confinados al sistema nervioso central (SNC), especficamente en las uniones o sinapsis neurona-neurona; ah inhiben ciertas importantes enzimas, particularmente acetilcolinesterasa o colinesterasa verdadera (AChE). Esta enzima tiene un sitio activo compuesto de dos subunidades: un lugar aninico conferido por el grupo carboxilo del cido asprtico o el glutmico; esta parte es la que inicialmente atrae al OF. Un lugar estertico caracterizado por el grupo hidroxilserina, por medio de una interaccin nucleoflica atrae al fsforo reactivo (P) de la molcula de insecticida y se forma un complejo que precede a la separacin de una fraccin hidroxilada, quedando la enzima fosforilada. De esta manera la enzima est inactivada, bloquendose la degradacin del neurotransmisor acetilcolina. La enzima se concentra en el sitio de sinapsis y promueve la hiperexcitacin del SNC. Los signos de intoxicacin incluyen agitacin, hiperexitabilidad, espasmos, convulsiones y parlisis. La fosforilacin de la acetilcolinesterasa es persistente, la reactivacin puede tomar horas o das (Ware y Withacre 2004, Bloomquist 1999). La mayora de los OFs que se aplican contra mosquitos (temefos, clorpirifos, fentin y fenitotrin y pirimifos metil) son fosforotioatos o molculas que tienen un azufre ligado al fsforo (P=S) por lo que, el organismo, al tratar de destoxificarse lo conduce va citocromo P450 monoxigenasa a una desulfuracin oxidativa, cambiando esta fraccin a P=O, lo cual hace al metabolito ms txico. Caracterstica por la que son eficientes en el control (Bloomquist 1999). Los carbamatos se comportan de manera idntica que los OFs en los sistemas biolgicos, pero tienen dos diferencias principales. Algunos son potentes inhibidores de la aliesterasa (son esterasas alifticas miscelneas cuyas funciones exactas no son conocidas) y su selectividad algunas veces es ms pronunciada contra la AChE de diferentes especies. En

otros, la inhibicin de la AChE es reversible. Cuando la AChE es inhibida por un carbamato, se dice que est carbamilada. En insectos, los efectos de los OFs y los carbamatos son principalmente el envenenamiento del sistema nervioso central, porque la unin neuromuscular de los insectos no es colinrgica, como lo es en los mamferos. Las nicas sinapsis colinrgicas que se conocen en los insectos estn en el sistema nervioso central. Se cree que la transmisin en la unin qumica neuromuscular de los insectos es el cido glutmico.

8.4.3 Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis El uso de este insecticida microbial se ha incrementado en las ltimas dcadas, dada su eficacia, y a que no ocasionan problemas de contaminacin en el ambiente, as como su selectividad relativa. sta es una variedad de bacteria especifica para mosquitos y simulidos, que tiene como ingrediente activo la endotoxina delta que se produce por fermentacin del Serotipo H-14 de este microorganismo. La endotoxina delta son cristales compuestos por varias protenas (protoxinas), que son sintetizadas durante la esporulacin. Despus de que las larvas ingieren los cristales, stos reaccionan con el pH y las enzimas digestivas, formando subunidades activas que se ligan a sitios de receptores especficos en el epitelio del tubo digestivo, alterando la permeabilidad inica para formar canal catin o poro. El movimiento de iones a travs del poro perturba los gradientes de potasio y el pH, y ocasiona la lisis del epitelio, paraliza al intestino y ocasiona finalmente la muerte del insecto. Este proceso se lleva a cabo en un perodo de 2 a 12 horas (Garca et. al. 1980, Annimo 1988). Para ms detalles consulte el captulo IV de estas memorias.

8.4.4 Insecticidas Reguladores del Crecimiento El metopreno, es una molcula que semeja a la hormona juvenil (HJ) de los insectos, se aplica contra mosquitos, para controlar los estados larvales del segundo al cuarto. Es lipoflica sesquiterpenoide que contiene grupos epoxi y metil steres (Ware y Withacre 2004). Es sintetizada y secretada por la corpora allata y tiene varias funciones en la vida del insecto. Tiene actividad morfogentica, al actuar junto con la hormona de la muda (ecdisona) para suprimir la diferenciacin del adulto y mantener los caracteres inmaduros del desarrollo. En algunos rdenes tiene un efecto gonadotrfico en la formacin del vitelo en hembras adultas y para el desarrollo de glndulas accesorias en machos. En otros casos, la aplicacin de HJ a los huevecillos, en las primeras etapas, impide el desarrollo de larvas viables. En algunas especies, el tratamiento a hembras adultas con HJ ocasiona la puesta de huevos sin embrionar. El crecimiento de larvas inmaduras requiere de HJ, pero a medida que la metamorfosis avanza, la produccin de hormona tiende a declinar. La presencia de HJ al pasar de inmaduro a adulto, puede causar la muerte al trastornar los cambios que se dan en esa etapa (Henrick 1982). Los modos de accin de la HJ no estn bien entendidos y los diversos efectos que se conocen, sugieren que no son iguales en todos los casos. Algunos modos generales de accin son: La interferencia en parte final del desarrollo larval y la emergencia del adulto, dando como resultado individuos intermedios entre larva-pupa, pupa-adulto, individuos con rganos reproductores defectuosos o embriognesis anormal. La morfologa anormal y las consecuencias en el desarrollo son irreversibles y frecuentemente letales para el insecto blanco. La actividad biolgica de un juvenoide es usualmente medida nicamente a un tiempo especfico durante un estado sensitivo en el ciclo de vida del insecto;

evaluaciones ms detalladas a ms de una generacin pueden revelar efectos imperceptibles y retardados (Henrick 1982). En el grupo de las benzoilreas, estn el diflubenzurn y el novalurn, estas molcula acta sobre los estados larvales de los insectos, inhibiendo o bloqueando la sntesis de la quitina, la cual es una parte vital e indestructible de su exoesqueleto. Las molculas de Nacetilglucosamina, que son los monmeros de la quitina, no pueden polimerizarse en presencia del diflubensuron. Las larvas se ven afectadas por la ruptura de la malformada cutcula, o pueden morir por hambre. Las larvas de mosquitos se controlan con tan solo 1.0 g. del difubenzurn por acre de superficie de agua (Ware y Whitacre 2004, Bloomquist 1999, Thompson 1992). El piriproxifn es un compuesto pirideno, que retarda el crecimiento de las larvas, interrumpe la metamorfosis normal, causando la muerte de las larvas y pupas. Adems es usado como insecticida de contacto y veneno estomacal

8.5 Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Aunque se reconocen varios tipos de resistencia, la resistencia fisiolgica o bioqumica es la de mayor relevancia para los fines del manejo de plagas. Los insecticidas ejercen sobre la poblacin, contra la cual se aplican, una presin de seleccin en la que sobreviven o son seleccionados, aquellos individuos que poseen algn mecanismo que impide o bloquea la accin txica del insecticida. La OMS define resistencia como el desarrollo de una habilidad en una cepa de algn organismo a tolerar una dosis de un txico que probara ser letal para la mayora de los individuos en una poblacin normal de la misma especie. La resistencia es una caracterstica gentica heredable cuya frecuencia incrementa en la poblacin como un resultado directo a los efectos selectivos de un insecticida. Este fenmeno ha tenido mayor impacto en el control de mosquitos que en otros grupos de insectos, dado que estos dpteros han estado sujetos a aplicaciones qumicas intensivas, directas e indirectas, desde que aparecieron los insecticidas orgnico-sintticos (Georghiou 1980). Para entender la evolucin de la resistencia a insecticidas es necesario conocer los procesos que ocurren y que son seleccionados en los individuos resistentes. La variacin gentica y fenotpica que afecta la resistencia se presenta en algunos individuos de la poblacin como resultado de mutacin o duplicacin gentica, modificando algn aspecto fisiolgico, morfolgico o de comportamiento en el fenotipo normal. Estos cambios en el fenotipo usualmente aumentan el proceso de detoxificacin, reducen la sensibilidad del sistema nervioso o bien, incrementan la capacidad de los insectos de evadir el contacto con el txico. Cuando el insecticida es aplicado, los individuos con dichas mutaciones tienen una ventaja considerable sobre los individuos ms susceptibles en la poblacin, teniendo mayor probabilidad de sobrevivir al tratamiento con insecticidas, y en promedio, contribuyen con ms descendencia en la siguiente generacin. Como resultado, la frecuencia del gen que confiere resistencia aumentar en la poblacin al paso del tiempo (Hemingway y Ranson 2005). En 1946, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) inicio el control qumico con el DDT para la erradicacin de Aedes aegypti. Slo un ao despus, se reportaron los primeros casos de resistencia en poblaciones de esta especie (Brown 1986). A pesar de ello, para 1972, A. aegypti ya haba sido erradicado en buena parte de los pases en donde se reportaba. Sin

embargo, en ese mismo ao, la resistencia al DDT fue reconocida como un problema serio y la campaa termin antes que la meta de erradicacin fuera alcanzada (Brown y Pal 1971). Los problemas de resistencia han continuado a pesar del uso de nuevos grupos de insecticidas. Alrededor de cien especies de mosquitos han generado resistencia a uno o ms insecticidas (Hemingway y Ranson 2000). El control de la malaria y dengue han incluido algunos organoclorados (BHC, DDT), organofosforados (metil-paratin, temefs, malatin y clorpirifos), carbamatos (propoxur y carbosulfn) y piretroides (resmetrina, permetrina, fenotrina) (Ayesa et al. 2006). Algunos casos de resistencia en larvas de mosquitos son los que reportan: Lowe et. al. (1980) encontraron que la resistencia aumento164 veces a temefs en Anopheles albimanus; Boike et al. (1985) en Florida, EUA, registraron en Culex quinquefasciatus resistencia a temefs (de 1.9 a 28.4X), malatin (de 1.8 a 6.4X), naled (de 1.1 a 5.3X), fentin (de 1.9 a 8.7X) y clorpirifos (de 1.3 a 8.2). Asimismo, en Italia, Severini et al. (1993) encontraron tolerancia al clorpirifos (de 4.5 a 122.7X) y al temefs (de 1.7 a 83.3X) en C. pipiens. En America Latina, Bisset et al. (2001) detectaron resistencia a temefs, clorpirifos y pirimifos metil en larvas de A. aegypti de varias localidades de Venezuela y Cuba. Igualmente, Georghiou y Lagunes (1991) registraron 114 especies de mosquitos de varias partes del mundo con resistencia a uno o ms insecticidas, las especies fueron de los siguientes gneros: 62 de Anopheles, 21de Aedes, 24 de Culex, 2 de Psorophora, 1 de Armigeres, 1 de Culiseta, y 3 de Mansonia. Esta cantidad de especies de mosquitos resistentes constituye ms del 20% de todos los casos registrados en artrpodos. Una poblacin de mosquitos resistentes a un insecticida especfico, puede retornar a un cierto nivel de susceptibilidad por medio de dos formas: 1) al seleccionar una raza resistente con un insecticida de diferente modo de accin o ruta metablica, 2) al dejar de seleccionar una raza resistente por varias generaciones (Georghiou y Metcalf 1963, Kepler, et al. 1964). La resistencia de amplio espectro a organofosforados, o la resistencia especfica para malatin estn presentes en las principales especies vectoras del gnero Anopheles (Hemingway y Ranson 2000), Culex (Hemingway y Karunaratne 1998) y tambin en A. aegypti (Georghiou et al. 1987; Vaughan y ffrench-Constant 1998, Rawlins 1998). A pesar de que el uso del BHC, dieldrn y DDT fue restringido desde hace muchos aos, la resistencia a estos insecticidas es persistente y sigue dispersada en poblaciones de mosquitos vectores (WHO 1998). Actualmente existe un debate sobre la continuacin del uso de este insecticida; la presin pblica debido a los efectos adversos del DDT hacia el ambiente, exige su retiro del mercado. Por otro lado, el retiro del DDT en las campaas de control de vectores en pases del tercer mundo, ha sido relacionado con el aumento en la incidencia de la malaria en pases de frica. (Roberts et al.1997). Ambos puntos de vista estn siendo cautelosamente evaluados, antes de tomar una decisin definitiva sobre el uso de este insecticida. La resistencia a varios grupos de piretroides se ha dispersado ampliamente en culcidos y anofelinos (Chandre et al.1998, 1999). La resistencia cruzada entre piretroides y DDT en Anopheles gambie ha generado una gran preocupacin, ya que los piretroides son el nico grupo disponible para la implementacin de la estrategia ms eficaz para controlar la malaria: la impregnacin de telas mosquiteras para dormir. En diversas poblaciones de A. aegypti tambin se ha reportado resistencia cruzada con el DDT (Hemingway et al. 1989, Brengues et al. 2003), y a otras molculas de organofosforados y carbamatos, pero el tipo de resistencia

compartida con estos grupos, se debe a mecanismos metablicos (Rodrguez et al. 2002, Flores et al. 2005, 2006). Respecto a la resistencia al Bacillus thuringiensis israelensis, se ha sugerido que se debe al continuo uso de este producto en condiciones de campo. Diversos investigadores han determinado en condiciones de laboratorio incrementos de tolerancia. Backer y Ludwig (1993), reportaron que se encontr un incremento de tolerancia a Bti de 5 a 7 veces, a las 32 generaciones de Culex quinquefasciatus, la cual desapareci en tres generaciones sin seleccionar. Con esa misma especie se encontraro tolerancia aumentada 11 veces, despus de seleccionar por 32 generaciones (Becker y Ludwig, 1993). Es indudable que se requiere una continua presin de seleccin con Bti para que se desarrolle tolerancia en laboratorio; sin embargo, a decir por Backer y Ludwig (1993), a nivel de campo es difcil que esto suceda, dado que despus de evaluar reas tratadas y no tratadas por 10 aos con Bti, contra Aedes vexans, no encontraron diferencias significativas; segn ellos la susceptibilidad se debe a: a) el corto perodo de exposicin de las larvas a la toxina; b) por el nico y complejo modo de accin del Bti y c) por la variabilidad gentica de la poblacin. Por otra parte se trata de especies diferentes, lo que puede marcar la diferencia en la susceptibilidad.

8.6 Mecanismos de Resistencia Segn Georghiou (1965), la resistencia puede ser de tres tipos: por comportamiento, morfolgica y fisiolgica; esta ltima se tiene una base bioqumica y es la ms estudiada. Los insectos adquieren resistencia de dos formas: Una por adicin de un mecanismo de proteccin y la otra por insensibilidad en el sitio de accin. Para fines de manejo, algunos autores agrupan los tipos en mecanismos metablicos y no metablicos. El primer grupo abarca los mecanismos que involucran cambios enzimticos y el segundo a aquellos que promueven cambios en sensibilidad del sitio activo, en la taza de penetracin, almacenamiento o excrecin, y en el comportamiento de los insectos. Para Soderlund y Bloomquist (1990), los mecanismos de resistencia se dividen en cuatro categoras: penetracin reducida, comportamiento, metabolismo elevado e insensibilidad del sitio blanco. Por lo general, estos mecanismos no son especficos y confieren resistencia cruzada a otros txicos de estructura similar y en muchos casos, a compuestos qumicamente no relacionados. La penetracin reducida es el mecanismo menos entendido. La mayora de los formulados de insecticidas han sido diseados para penetrar el insecto a travs de la cutcula. Algunos insectos han desarrollado cutcula ms gruesa o cutculas alteradas que reducen el grado de penetracin de los insecticidas (Apperson y Georghiou 1975). Por s sola, la penetracin reducida confiere un bajo nivel de resistencia, sin embargo, en combinacin con otros mecanismos de resistencia, puede potencializar la resistencia en forma no aditiva. Por otro lado, al disminuir el grado con el cual el insecticida alcanza su sitio blanco, permite que otro mecanismo pueda detoxificar ms efectivamente al insecticida. Un mecanismo de resistencia por comportamiento fue identificado en moscas que evaden cebos tratados con malatin. Por otro lado, los insecticidas como el DDT y la permetrina inducen cambios de comportamiento en los insectos, por ejemplo reducen la proporcin de entrada de mosquitos hacia las casas, incrementan la proporcin de escape o salida de las casas o bien, inducen un cambio en los tiempos de picadura (Lines et al. 1987, Mbogo et al. 1996). An se desconoce si estas respuestas pueden ser consideradas como resistencia, ya que muchos otros factores pueden estar afectando al comportamiento de los insectos.

La resistencia metablica es el resultado del incremento en la expresin de genes codificadores de enzimas que metabolizan a los principales xenobiticos. Tres familias de enzimas han sido involucradas en la resistencia a los cuatro grupos de insecticidas (OCs, OFs, MCs y piretroides), sin embargo, su rol exacto an no ha sido determinado. Las monoxidasas del citocromo-P450, glutatin-s-transferasas (GST) y carboxyl-esterasas son familias de enzimas que catalizan un gran rango de reacciones de detoxificacin. stas constituyen la primera defensa enzimtica contra los xenobiticos, son responsables de reti-rar muchos productos de desecho del metabolismo, juegan roles esenciales en rutas biosin-tticas y estn envueltas en la comunicacin qumica (Scott 1995). La actividad elevada de las enzimas detoxificativas ha sido asociada con la resistencia a insecticidas en un gran rango de especies de insectos plaga. Las esterasas usualmente estn envueltas en la resistencia a organofosforados, carbamatos y en menor proporcin a piretroides. Las monoxidasas estn involucradas en el metabolismo de piretroides y en la activacin o detoxificacin de insecticidas organofosforados y en menor proporcin de metilcarbamatos. La DDT-dehidroclorinasa fue reconocida recientemente como una glutatin-stransferasa en la mosca domstica Musca domestica, posteriormente fue demostrado que esta enzima tiene un rol comn en anofelinos y mosquitos Aedes (Hemingway et al. 2004). La resistencia por insensibilidad del sitio blanco se debe a mutaciones sencillas no silenciosas en genes estructurales. Para que ocurra la seleccin de mutaciones, el aminocido resultante debe reducir la unin del insecticida, sin causar una prdida de la funcin primaria del sitio blanco. Por lo tanto, el nmero de substituciones probables de aminocidos resulta muy limitada y comnmente pueden encontrarse las mismas mutaciones asociadas a la resistencia en taxas muy divergentes. El grado en que se afecta la funcin debido a la mutacin resistente, puede reflejarse en la viabilidad de los individuos resistentes en la ausencia de seleccin. Este costo en la viabilidad tiene importantes implicaciones en la persistencia de la resistencia en el campo. Los genes de los principales sitio blancos: canales de sodio (para), receptores del cido amino-butrico (GABA) y acetilcolinesterasa (AchE), han sido clonados y sus secuencias han sido comparadas entre insectos resistentes y susceptibles. Algunas mutaciones han sido asociadas con resistencia a insecticidas, aunque en muchos casos no se ha dilucidado el mecanismo de resistencia a nivel molecular.

8.6.1 Carboxyl-Esterasas Las carboxyl-esterasas son un grupo amplio de enzimas capaces de metabolizar una gran variedad de substratos mediante la hidrolizacin de los enlaces ster en presencia de agua. Las esterasas pueden clasificarse en base a su preferencia por los substratos o naftol (NA y NA), a sus patrones electroforticos o bien, por su secuencia nucletidica. Muchos insecticidas contienen enlaces ster, por lo cual, se espera encontrar que el principal mecanismo de resistencia en cepas de insectos resistentes se deba a la actividad intensificada o sobreproduccin de esterasas. En general, los insecticidas organofosforados y metilcarbamatos actan como inhibidores de esterasas, ya que tienen una alta afinidad por las enzimas, pero son substratos pobres. En los insectos resistentes, existe una mayor frecuencia de la interaccin esterasa-insecticida, evitando que el insecticida alcance su sitio blanco (la acetilcolinesterasa). Cuando las esterasas estn presentes en el misma proporcin molar que el insecticida, estas son capaces

de secuestrar efectivamente a los insecticidas e hidrolizarlos lentamente (Scott 1995). El papel de las esterasas como mecanismo de resistencia puede ser inferido mediante tres formas: 1) deteccin de niveles elevados de productos de la hidrlisis de insecticidas en estudios de metabolismo en insectos resistentes, 2) sinergismo de la toxicidad del insecticida en insectos resistentes mediante el uso de inhibidores de esterasas no txicos, tales como TPP (0,0,0-trifenil fosfato), DEF (S,S,S-tributil fosforotritioato) o IBP (0,0-bis(1-metiletil)sfenilmetil posforotioato), 3) deteccin de niveles altos de actividad de esterasas generales (Brogdon, 1989), usando substratos simples y ensayos espectrofotomtricos de homogenizados o tejidos de insectos, o bien, por electroforesis y tincin de geles (Hemingway y Karunaratne 1998). La sobreproduccin de esterasas es una respuesta evolutiva contra la presin de seleccin por insecticidas organofosforados y carbamatos; su presencia se ha documentado en numerosas especies de artrpodos, incluyendo mosquitos, garrapatas, afidos y cucarachas. El papel de las esterasas en la detoxificacin de los piretroides ha sido poco estudiado, existen varios reportes de la actividad intensificada de esterasas en poblaciones de mosquitos resistentes, entre stas Anopheles gambiae, A. albimanus y Culex quinquefasciatus y Aedes aegypti (Rodrguez et al. 2001, Flores et al. 2005, 2006), sin embargo, los genes involucrados an son desconocidos. Algunos estudios han demostrado que las esterasas tienen baja actividad cataltica sobre algunos piretroides, sugiriendo que los elevados niveles de esterasas presentes en cepas resistentes a piretroides, podra deberse a una preseleccin con organofosforados (Rodrguez et al. 2002). La principal causa de la excesiva sntesis de esterasas en insectos resistentes, se debe a la amplificacin de genes dentro del genoma, aunque tambin la transcripcin sobreregulada y expresin gentica alterada han sido documentadas. El mecanismo de resistencia metablica estudiado con ms detalle en vectores de enfermedades, es el sistema de estera-sas elevadas en Culex. En este mosquito, la sobreproduccin de enzimas se debe a la amplificacin de uno o ms genes de esterasas, variando entre 20 a 250 copias en el genoma (Mouches et al. 1990, Callaghan et al. 1998). Existen varios alelos de esterasas asociados con la resistencia, sin embargo, el genotipo ms comn es la coamplificacin de dos genes de esterasas: est y est. Alrededor del 90% de las poblaciones resistentes de Culex presentan un genotipo est2/est2 (Coleman et al. 2002) aunque otras combinaciones han sido identificadas, por ejemplo la cepa Cyprus tiene entre 40 y 60 copias de los genes est-5 y est-5, mientras que la cepa TEM-R de California solo presenta amplificacin en el locus est-1. Se ha encontrado muy poca variacin en la cintica de inhibicin entre los distintos alelos de esterasas, por lo cual la ventaja selectiva del genotipo est-2/est-2 podra estar ligada a un tercer gen (aldehdo oxidasa) que se coeleva solamente con este fenotipo (Hemingway et al. 2000a). Los genes homlogos a las esterasas amplificadas en el mosquito Culex, han sido identificados en la misma proximidad y orientacin en A. gambiae, pero se desconoce si estn involucrados en la resistencia a piretroides, ya que las esterasas son inefectivas contra los piretroides en este mosquito (Ranson et al. 2000). Los elevados niveles de esterasas no siempre son el resultado de la amplificacin gentica. La sobre-expresin de la est-1 en la cepa Barriol de Cx. pipiens del Sur de Francia, se podra deber a cambios en algn elemento regulatorio no identificado y no a la amplificacin del gen est-1. Las esterasas amplificadas pueden tambin ser expresadas en diferentes niveles, por ejemplo, existe cuatro veces ms est que est en Cx. quinquefasciatus resistente, a pesar de que los genes estn presentes en una proporcin 1:1. Aun as, estos mecanismos no han sido identificados a nivel gentico o molecular en poblaciones naturales de mosquitos (Hemingway et al. 2000).

Por otro lado, algunas especies de Anopheles tienen un mecanismo que confiere resistencia especfica al malatin e involucra a carboxilesterasas con alta actividad hidroltica. En A. stephensi, tres esterasas con actividad carboxilesterasa contra malatin han sido aisladas y caracterizadas; sin embargo, la alteracin gentica que genera estos cambios cualitativos no han sido identificados en poblaciones de mosquitos de campo. Datos de otros artrpodos resistentes al malatin, sugieren que una o dos mutaciones de aminocidos en estas enzimas podran ser responsables de este tipo de resistencia.

8.6.2 Monoxidasas del Citocromo-P450 Las monoxidasas del citocromo-P450 son una familia de enzimas encontrada en la mayora de organismos, incluyendo a los insectos. Estas enzimas actan en el metabolismo de xenobiticos y tienen un rol en el metabolismo endgeno. Las enzimas P450 se unen al oxgeno molecular y reciben electrones del NADPH para introducir una molcula de oxgeno en el substrato. Las monoxidasas tienen un amplio rango de substratos, pero en general, estas enzimas metabolizan substratos lipoflicos para producir molculas con mayor solubilidad en agua, o bien con grupos funcionales que permiten las reacciones de conjugacin promoviendo la excrecin (Berge et al. 1998). Las monoxidasas P450 estn involucradas en el metabolismo de todos los insecticidas, permitiendo la detoxificacin a travs de la hidroxilacin aliftica del DDT, deshidroxilacin aromtica del carbaryl y propoxur, y la epoxidacin de ciclodienos, o bien, permitiendo la activacin de los organofosforados a travs de reacciones de oxidacin. La gran diversidad de monoxidasas se debe a la existencia de mltiples isoformas de P 450, varios patrones de expresin y un amplio espectro de substratos (Scott 1995). La elevada actividad de las monoxidasas ha sido asociada con la resistencia a piretroides en A. stephensi, A. subpictus, A. gambiae y C. quinquefasciatus (Brogdon et al. 1989). El principal mtodo para identificar este mecanismo de resistencia se basa en bioensayos con insecticidas, utilizando inhibidores de las monoxidasas del citocromo-P450 (butxido de piperonilo). La reduccin en la magnitud de la resistencia observada constituye la primera pista de la presencia de este mecanismo y su confirmacin requiere de estudios bioqumicos comparando cepas resistentes y susceptibles. En la mayora de los casos donde se ha correlacionado la actividad elevada de las monoxidasas-P450 con la resistencia a insecticidas, se ha identificado el rol de los genes Cyp pertenecientes a la familia Cyp6. La enzima Cyp6D se sobreproduce en una cepa de Musca domestica resistente a piretroides debido a la transcripcin regulada; por otro lado, la Cyp6A se ha asociado con la resistencia a organofosforados en la misma especie (Feyereisen et al. 1995). En A. gambiae y C. quinfefasciatus se han identificado la sobreexpresin de uno o varios genes pertenecientes a la familia Cyp6 asociados con la resistencia a piretroides (Nikou et al. 2003, Gong et al. 2005). Otros genes pertenecientes a las familias Cyp4, Cyp12 y Cyp9 han sido observados en cepas resistentes a insecticidas en diferentes especies de insectos. Recientemente, 17 cDNAs que codifican oxidasas Cyp4 han sido identificadas en A. albimanus y 111 genes P450 han sido identificados en A. gambiae, sin embargo, an se

desconoce si estas familias de oxidasas juegan algn papel en la resistencia del mosquito (Ranson et al. 2002).

8.6.3 Glutatin-s-Transferasas Las glutatin-s-transferasas (GSTs) son enzimas dimricas multifuncionales que juegan un rol en la detoxificacin de un gran rango de xenobiticos. Las enzimas catalizan el ataque nucleoflico del glutatin reducido (GSH), en los centros electroflicos de los compuestos lipoflicos. Mltiples formas de estas enzimas han sido reportadas en mosquitos, mosca domstica, drosoflidos y mosca de las ovejas. Se sugiere que las GSTs juegan un rol en la resistencia, ya que muchos estudios han mostrado que los homogenizados de insectos resistentes a insecticidas presentan altos niveles de actividad de estas enzimas. El principal rol de las GSTs en la resistencia a insecticidas en mosquitos, es el metabolismo del DDT a productos no txicos (DDE), aunque tambin tienen un rol secundario en la resistencia a organofosforados. La resistencia al DDT basada en GSTs es muy comn en varias especies de anofelinos, reflejando el fuerte uso de este insecticida para el control de la malaria durante varias dcadas. Las glutatin-s-transferasas pertenecientes a las clases Delta y Epsilon han sido identificadas en insectos y se han asociado con la resistencia a insecticidas en mosquitos y otras especies. En Aedes aegypti al menos dos grupos de GSTs se encuentran en altos niveles en insectos resistentes al DDT (Lumjuan et al. 2005), mientras que en A. gambiae un gran nmero de GSTs se encuentran elevadas y algunas de ellas pertenecen a la clase-1 de GSTs. Las GSTs en Aedes aegypti y A. gambiae de insectos resistentes se sobre expresan en forma constitutiva . Las GSTs-2 de A. aegypti se sobre expresan en todos los tejidos a excepcin de los ovarios. La secuencia de la clase II de GSTs de A. gambiae ha sido publicada y las principales clases de GST II en A. aegypti se ha clonado y secuenciado. En esta ltima especie, GST-2 es sobre expresada en la cepa GG resistente a DDT, y se piensa que la mutacin resistente ocasiona la interrupcin de un represor; esta mutacin evita la funcin normal del represor llevando a niveles elevados la enzima GST-2 en mosquitos resistentes (Ranson et al. 2002). Las GSTs de la clase I son codificadas por una extensa familia de genes en A. gambiae, M. domestica y Drosophila melanogaster. La organizacin genmica en estas tres especies es sorprendentemente diferente. En D. melanogaster ocho genes divergentes sin intrones y se encuentran en un segmento de DNA de 14 kb. En A. gambiae, mltiples genes de la clase GST-1 se encuentran agrupados en un slo sitio genmico (cluster). La mayora de los genes contienen uno o ms intrones, uno de estos genes, aggst-1, tiene un empalme alternativo produciendo cuatro transcriptos distintos de mRNA. La organizacin de la familia de genes GST-1 es muy similar en insectos resistentes y susceptibles en A. gambiae, sugiriendo que el mecanismo de resistencia basado en GSTs es probablemente causado por un regulador cis-trans. Los productos de estos genes difieren en su habilidad para metabolizar al DDT y algunos de estos genes son regulados para activar el metabolismo en mosquitos resistentes (Enayati et al. 2005).

8.6.4 Acetilcolinesterasa Insensible Los organofosforados y carbamatos tienen su sitio blanco en la acetilcolinesterasa (AchE). La AChE hidroliza al neurotransmisor excitatorio acetilcolina en la membrana postsinptica

del nervio. La AChE de los insectos tiene una especificidad de substrato intermedio entre la AChE de los vertebrados y la butiril-colinesterasa. La forma molecular predominante en insectos es un dmero globular anfiflico que se une a la membrana mediante una ancla glipoflica. Alteraciones en la AChE en insectos resistentes a organofosforados y carbamatos resulta en una reduccin o inhibicin en la sensibilidad de la enzima por estos insecticidas. En Culex pipiens, la AChE-1 y AChE-2 difieren en su especificidad de sustrato, sensibilidad inhibitoria y el patrn de migracin electrofortico. Solo la AchE-1 parece conferir resistencia a insecticidas (Raymond et al. 1986). Hasta la fecha, se han identificado dos genes Ace con esta actividad. La nica acetilcolinesterasa clonada en C. pipiens es la Ace2, la cual no est involucrada en la resistencia a insecticidas y adems se encuentra ligada al sexo. Por otro lado, el gen Ace1 es autosmico y confiere resistencia a insecticidas. Los vertebrados tienen dos tipos de colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa. En D. melanogaster solo un gen Ace que codifica una colinesterasa ha sido clonado. Distintas substituciones de aminocidos en los genes Ace de Drosophila y M. domestica podran causar resistencia, siempre y cuando los residuos asociados a la resistencia se localicen cerca o dentro del sitio activo de la acetilcolinesterasa. Hasta ahora, no ha sido registrada la resistencia basada en AChE en Anopheles stephensi, y debido a que ninguno de los casos de resistencia registrada han estado ligados al sexo, se sugiere que estos genes no representan el sitio blanco del insecticida. El anlisis detallado del perfil de inhibicin de la acetilcolinesterasas de Aedes aegypti sugiere que existe un slo locus AChE en esta especie. En este caso, la resistencia basada en alteraciones de la acetilcolinesterasa podra estar ligada al sexo. Los genes AChE han sido clonados en los mosquitos A. aegypti y A. stephensi, aunque ambos genes estn ligados al sexo (Anthony et al. 1995). Cinco mutaciones puntuales asociadas con la resistencia a organofosforados y carbamatos han sido identificadas en el gen de la acetilcolinesterasa en D. melanogaster (Mutero et al. 1994) y estudios dirigidos por mutagnesis del AChE ligado al sexo de A. aegypti, han demostrado que estas mutaciones tambin confieren resistencia en mosquitos (Vaughan et al. 1997). Las alteraciones en la AChE tienen un costo de viabilidad muy severo en las poblaciones de C. pipiens en el sur de Francia, probablemente causado por la reduccin en la actividad de AChE de la enzima mutada comparada al tipo silvestre. Sin embargo, en Drosophila se ha propuesto que la presencia de mltiples mutaciones que confieren bajos niveles de resistencia podran ser una respuesta a la seleccin de mutaciones con mayor viabilidad en esta enzima (Ming et al. 2004).

8.6.5 Receptores GABA La resistencia a dieldrn fue registrada en 1950, sin embargo, la participacin de los receptores GABA en este tipo de resistencia fue demostrada hasta 1990. El receptor GABA en los insectos es un canal de iones de cloro heteromultimrico, con funcin de inhibir la neurotranmisin en el sistema nervioso central del insecto y en uniones neuromusculares. El receptor GABA de los insectos est implicado como un sitio de accin para piretroides, ivermectinas y ciclodienos. Algunos estudios muestran que los insectos resistentes a ciclodienos son resistentes a los insecticidas picrotoxina y fenilpirazole, y que el efecto de la ivermectina en neuronas cultivadas puede revertirse con el pretratamiento con picrotoxina,

sugiriendo que estos insecticidas interactan con el ionforo de cloro asociado con el receptor GABA de insectos. Los receptores GABA pertenecen a una superfamilia de receptores de neurotransmisores que incluyen a los receptores nicotnicos de la acetilcolina. Estos receptores estn formados por oligomerizacin de cinco subunidades alrededor del canal central de iones de sodio. Cinco distintas subunidades han sido clonadas a partir de vertebrados. Hasta la fecha slo tres subunidades han sido clonadas en D. melanogaster, pero stas no entran en la clasificacin de subunidades GABA de los vertebrados (ffrench-Constant et al. 1993). Se ha encontrado que una sustitucin de alanina a serina en el dominio que envuelve al canal del receptor GABA, confiere resistencia a ciclodienos tales como el dieldrn. La mutacin fue identificada por primera vez en Drosophila, y desde entonces ha mostrado estar en un amplio rango de insectos resistentes a dieldrn, incluyendo A. aegypti (ffrench-Constant et al. 1994). La nica variacin en insectos resistentes es que el residuo sustituido cambia a glicina en vez de serina. A pesar de que se ha detenido el uso de insecticidas ciclodienos para agricultura y salud pblica, los alelos resistentes pueden ser encontrados en relativamente altas frecuencias en poblaciones de insectos en campo.

8.6.6 Canales de Sodio El rpido efecto de derribe que caracteriza a los insecticidas DDT y piretroides, es ocasionado por la activacin persistente de los canales de sodio. Esta activacin se debe a la forma en que los insecticidas se unen al poro del canal, prolongando el mecanismo de inactivacin dependiente de voltaje. La reduccin en la sensibilidad del canal de sodio dependiente de voltaje a la unin de los insecticidas es la causa del fenotipo resistente conocido como kdr presente en varias especies de insectos. Debido a que el canal de sodio es el sitio blanco del DDT y piretroides, muchos estudios en la dcada de los 80s y 90s se enfocaron en esta protena. El canal de sodio dependiente de voltaje de los insectos, es una protena transmembranal que contiene alrededor de 2,108 aminocidos plegados en cuatro dominios homlogos e hidrofbicos (dominio I, II, III y IV), separados por uniones hidroflicas. Cada dominio se compone de seis segmentos transmembranales (s1-s6). Diversas especies de insectos resistentes al DDT y piretroides presentan alteraciones en el gen del canal de sodio. La asociacin entre la resistencia kdr con modificaciones en el canal de sodio fue confirmada mediante estudios de unin de neurotoxinas y mediante estudios de mapeo gentico. En estos ltimos, se identific una sola mutacin en el dominio II segmento transmembranal 6 (DIIS6), asociada con la resistencia tipo kdr en Musca domestica (Williamson et al. 1993). La mutacin kdr consisti en un cambio de nucletidos de adenina a timina en el residuo Leucina1014, confiriendo un cambio de aminocidos de leucina (Leu) a fenilalanina (Phe). Posteriormente, la misma mutacin fue identificada en varias especies de mosquitos, tales como A. gambiae, A. stephensi, A. sacharovi y C. pipiens (Martnez-Torres et al. 1998, Enayati et al. 2003, Martinez-Torres et al. 1999, Luleyap et al. 2002). Otras mutaciones en el segmento DIIS6 se han identificado. Una nueva mutacin de T-A en el residuo Leu1014 de A. gambiae y C. pipiens (Ranson et al. 2000, Luleyap et al. 2002) confiere una substitucin a serina, sin embargo, estas cepas fueron ms resistentes al DDT que a los piretroides.

Por otro lado, algunos insectos dpteros (mscidos) con el fenotipo super kdr, adems de contener la mutacin Leu1014Phe, presentaron una segunda mutacin (Met918Thr) que ocurre en el puente de unin de los segmentos transmembranales 4 y 5, del dominio II (Williamson et al. 1996). Se ha sugerido que la segunda mutacin intensifica el fenotipo kdr en cepas de moscas resistentes, sin embargo, esta mutacin no ha sido identificada en poblaciones de moscas de campo, ni en mosquitos vectores. En forma interesante, las alteraciones del canal de sodio asociado con la resistencia, son mucho ms variables que las alteraciones identificadas en los receptores GABA, sin embargo, se siguen limitando a un pequeo nmero de regiones en la protena. La mayora de las alteraciones de la protena del canal de sodio ocurren en una regin que forma parte de la cobertura del canal de sodio (DIIS6). Se ha sugerido que los canales de sodio alterados permiten una rpida disociacin del insecticida, confiriendo resistencia a los efectos txicos del insecticida (Soderlund y Knipple 2003). La mutacin leucina-fenilalanina en anofelinos puede detectarse mediante pruebas diagnstico-moleculares basadas en PCR, para discriminar entre individuos homocigotos susceptibles, homocigotos resistentes y heterocigotos (Martnez-Torres et al. 1998). Debido a que la resistencia kdr es semirecesiva o completamente recesiva, la capacidad de identificar organismos heterocigotos es de vital importancia para la deteccin temprana y manejo de resistencia en campo. Actualmente existe una tendencia a investigar la resistencia a piretroides mediante PCR en regiones donde otras mutaciones kdr han sido encontradas, sin embargo, cambios en otras regiones podran estar asociados a la resistencia.

8.7 Resistencia kdr en el Mosquito Aedes aegypti La resistencia tipo kdr (knockdown resistance) es un mecanismo de resistencia seleccionado por insecticidas piretroides y DDT. La forma, para detectar este mecanismo es mediante bioensayos, donde los insectos son expuestos a DDT o piretroides en conjunto con inhibidores de enzimas o sinergistas, tales como PBO y DEF, para descartar resistencia por mecanismos enzimticos. El primer reporte de resistencia tipo kdr en A. aegypti, ocurri en Tailandia en 1975, despus de la falla en una campaa de control utilizando bioresmetrina. Los estudios genticos de una cepa seleccionada de esta poblacin, demostr la presencia de un solo factor de resistencia a piretroides (Rpy) presente en el cromosoma III. Este factor fue incompletamente dominante en herencia (Soderlund y Bloomquist 1990). Este mecanismo de resistencia ha sido reportado en diversas poblaciones del mosquito transmisor del dengue A. aegypti hacia una variedad de insecticidas piretroides. Un estudio reciente, identific siete mutaciones en el dominio II, segmento transmembranal S6 del canal de sodio en cepas de A. aegypti resistentes a permetrina. Ninguna de estas mutaciones corresponde al residuo 1014 presente en otros dpteros, sin embargo, si en cercana proximidad a esta regin. Una de estas mutaciones ocurre en la primera posicin del codn Iso1011, donde un cambio de adenina a guanina (A-G) ocasiona una substitucin del aminocido de isoleucina por metionina (Met); esta mutacin fue encontrada en cepas resistentes a permetrina de Amrica del Sur (Brengues et al. 2003). Una segunda mutacin asociado a la resistencia kdr en mosquitos de Tailandia fue identificada en el aminocido Val1016, donde una substitucin de nucletidos de timina a

guanina (T-G) en la segunda posicin del codn, ocasiono un cambio de aminocido de valina (silvestre) a glicina (Brengues et al. 2003, Prapanthadara et al. 2002). Otro caso fue una mutacin de nucletidos de guanina a adenina en la primera posicin del codn 1,016 del gen para, confiri una substitucin de valina a isoleucina (Val,1,016Iso). Esta sustitucin fue encontrada en el dominio II, segmento transmembranal 6. La frecuencia del alelo mutante Iso1,016 fue detectada en cerca de 16 poblaciones de A. aegypti de varios pases de Amrica. Adems, la seleccin con piretroides de una cepa de Islas Mujeres, Mxico y Santiago de Cuba, Cuba, result en un incremento en la frecuencia del alelo Iso1,016 despus de varias generaciones de seleccin (Saavedra et al. 2007).

8.8 Conclusiones La resistencia a los insecticidas es un fenmeno que est ampliamente documentado para los mosquitos transmisores del dengue: Aedes aegypti y A. albopictus, y en la medida que crezca el nmero de poblaciones tolerantes y resistentes a los insecticidas que se usan en el control, se pone en riesgo la salud de millones de personas en el mundo. Para el combate de los mosquitos en etapas larvales, se han empleado DDT, BHC y ciclodienos; Organoclorados que actualmente son de uso prohibido o restringido. Del grupo de organofosforados que se han utilizado son: malatin, fentin, fenitrotin, clorpirifos, pirimifos metil y temefos, este ltimo es de los ms utilizados, por sus caractersticas deseables como larvicida. En cuanto a Carbamatos se menciona al propoxur y bendiocarb, y para piretroides son la permetrina, cipermetrina, ciflutrina, deltametrina, -aletrina, fenotrina y lamdacialotrina. De los insecticidas microbiales estn: Bacillus thuringiensis israeliensis y B. shaericus, y de los reguladores del crecimiento, se reporta al metopreno. En el combate a los adultos, desde los aos 60s se haba venido usando el malatin, mismo que ha sido sustituido por otros organofosforados y piretroides. Del primer grupo se cuentan el clorpirifos, diclorvos, triclorfn, fentin, fenitrotin, pirifs-metil. Del grupo de piretroides estn la permetrina, deltametrina, resmetrina, fenotrina y lamdacialotrina. Los sitio blancos donde actan los principales grupos toxicolgicos de insecticidas orgnicosintticos, que se aplican contra mosquitos son: canales de sodio (para) en piretroides, receptores del cido aminobutrico (GABA) en ciclodienos, y acetilcolinesterasa (AchE) en organofosforados y carbamatos. Los mecanismos de resistencia pueden ser: penetracin reducida, comportamiento, metabolismo elevado e insensibilidad del sitio blanco. La resistencia metablica o fisiolgica tiene una base bioqumica y es la ms estudiada. Los insectos adquieren resistencia de dos formas: una por adicin de un mecanismo de proteccin y la otra por insensibilidad en el sitio de accin. Por lo general, estos mecanismos no son especficos y confieren resistencia cruzada a otros txicos de estructura similar y en muchos casos, a compuestos qumicamente no relacionados. En los piretroides, los mecanismos de resistencia identificados son: metabolismo del insecticida por oxidasas (monoxidasas del citocromo P450) y esterasas, insensibilidad en el sitio de accin o kdr y penetracin reducida.

En organofosforados, los principales mecanismos de resistencia son: metabolismo por monoxidasas, glutation transferasas, esterasas y carboxiesterasas. En este grupo de insecticidas, las reacciones metablicas de activacin pueden deberse a la accin de oxidasas que ocasionan una desulfuracin oxidativa al cambiar P=S por P=O; en OFs que tienen grupo tioter, la oxidacin metablica de los sulfuros conduce a la formacin de sulfxidos y sulfonas. En el caso de las carboxiesterasas, stas hidrolizan la fraccin carboetoxi del metabolito del malatin, malaoxn, dando como resultado metabolitos solubles en agua; esto ocurre en mamferos, es por ello que el malatin es relativamente seguro para este grupo de animales, mas no para algunos insectos.

8.9 Literatura Citada Adams ME & TA Millar. 1980. Neural and behavior coorrelates of pyrethroid and DDTtype poisoning in the house fly Musca domestica. Pestic. Biochem. Physiol. 13, 137-147. Annimo. 1991. Entomologa con nfasis en Vectores. Secretaria de Salud. Vol. I-II, S.S.S.D.G.M.P.-O.P.S. Annimo. 1988. Vectobac: Una alternativa biolgica para el control de mosquitos y moscas negras. Bol. Tec. Abbott Laboratorios. E.U.A. Anthony N, T Rocheleau, G MoceliN, L Hwa-Jung & R ffrench-Constant. 1995. Cloning, sequencing and functional expression of an acetylcholinesterase gene from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. FEBS Letters. 368: 461-465. Arredondo JJI, MH Rodrguez, DN Bown & EG Loyola. 1993. Indoor low-volume insecticide spray for the control of Anopheles albimanusin southern Mexico. Village-scale trials of bendiocarb, deltametrina and cyflutrin. J. Am. Mosq. Control Assoc. 9: 210-220. Ayesa P, LC Harrington & JG Scott. 2006. Evaluation of Novel Insecticides for Control of Dengue Vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 43: 55-60. Backer N & M Ludwig. 1993. Investigationson possible resistence in Aedes vexans field populations after 10 year applications of Bacillus thuringiensis israeliensis. J. Am. Mosq. Control Assoc. 9: 221-224. Berge JB, R Feyereisen & M Amichot. 1998. Cytochrome P450 monooxygenases and insecticide resistance in insects. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 353, 1701-1705. Bloomquist JR. 1999. Insecticides: Chemistry www.Redcliffes IPM word textbook Home page. and Characteristics. En linea,

Boike AH Jr, CB Rathburn, KL Lang, HM Masters, TG Floore. 1985. Current status on the Florida Abate monitoring program- susceptibility levels of three species of mosquitoes during 1984. J. Am. Mosq. Control Assoc. 1: 498-501. Brengues C, NJ Hawkes, F Chandre, L McCarroll, S Duchon, P Guillet, S Manguin, JC Morgan & J Hemingway. 2003. Pyrethroid and DDT cross-resistance in Aedes aegypti is correlated with novel mutations in the voltage-gated sodium channel gene. Med. Vet. Entomol. 17: 8794.

Briggs GG, M Elliott, AW Farnham & NF Janes. 1974. Structural aspects of the knockdown piretroids. Pestic. Sci. 5: 643-649. Brogdon GW. 1989. Biochemical Resistance Detection: an alternative to bioassay. Parasitol. Today. 5:56-60 Brown A & WA McAllister. 1998. Insecticide resistance and vector control. Emerg. Infectious Dis. Vol. 4 N 4. Brown AWA. 1986. Insecticide resistance in mosquitoes: a pragmatic review. J. Am. Mosq. Control Assoc. 2:123-140. Brown AWA & R Pal. 1971. Insecticide Resistance in Arthropods. World Health Organization, Geneva, Switzerland. Callaghan A, T Guillemaud, N Makate & M Raymond. 1998. Polymorphisms and Fluctuations in copy number of amplified esterase genes in Culex pipiens mosquitoes. Insect Molecular Biology 7:295-300. Chandre F, F Darriet, M Darder, A Cuani & JMC Doannio. 1998. Pyretrhoid resistance in Culex quinquefasciatus from West Africa. Med. Vet. Entomol. 12:356-366. Chandre F, F Darriet, L Manga, M Akogbeto, O Faye, J Mouchet & P Guillet. 1999. Status of pyrethroid resistance in Anopheles gambiae sensu lato. Bull World Health Organ. 77:230-234. Coleman M, JG Vontas & J Hemingway. 2002. Molecular characterization of the amplified aldehyde oxidase from insecticide resistant Culex quinquefasciatus. Eur. J. Biochem. 269: 768779. Dorta MD, CM Rodrguez, SS Delgado, FD Snchezy, LM Maureen Leyva Silva. 2005. Estado de la resistencia a insecticidas en adultos del mosquito Aedes aegypti del municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba. Rev. Cubana Med. Trop. 57:137-42. Dorta MD, MCI Caldern, SM Leyva & SE Figueredo. 2007. Niveles de susceptibilidad de una cepa de Aedes aegypti procedente de Santiago de Cuba ante los insecticidas lambdacialotrina, cipermetrina y clorpirifos. Rev. Cubana Med. Trop. 59(1) Enayati AA, H Ranson & J Hemingway. 2005. Insect glutathione transferases and insecticide resistance. Insect Molecular Biology. 14: 3-8. Enayati AA, H Vatandoost, H Ladonni, H TownsoN & J Hemingway. 2003. Molecular evidence for a kdr-like pyrethroid resistance mechanism in the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Med. Vet. Entomol. 17:138144. Feyereisen R, JF Anderson, FA Carino, MB Cohen & JF Koener. 1995. Cytochrome P450 in the house fly: Structure, catalytic activity and regulation of expression of CYP6A1 in an insecticideresistant strain. Pestic Sci. 43: 233239.

Ffrench-Constant RH, TA Rocheleau, JC Steichen & AE Chalmers. 1993. A point mutation in a Drosophila GABA receptor confers insecticide resistance. Nature. 363:449451. Ffrench-Constant RH, JC Steichen & F Shotkoski. 1994. Polymerase chain reaction diagnostic for cyclodiene insecticide resistance in the mosquito Aedes aegypti. Med. Vet. Entomol. 8:99-100. Flores AE, W Albeldano-Vazquez, I Fernandez Salas, M H. Badii, H Loaiza Becerra, G Ponce Garcia, S Lozano Fuentes, WG. Brogdon, WC. Black IV & B Beaty. 2005. Elevated -esterases levels associated with permethrin tolerance in Aedes aegypti (L.) from Baja California, Mexico. Pest. Biochem. & Physiol. 82: 66-78. Flores AE, JS Grajales, I Fernandez-Salas, G Ponce-Garcia, MH Loaiza-Becerra, S Lozano, WG Brogdon, WC Black IV & B Beaty.. 2006. Mechanisms Of Insecticide Resistance In Field Populations of Aedes aegypti (L.) from Quintana Roo, Southern Mexico. J. Am. Mosq. Control Assoc. 22: pp. 672677. Garcia R, BA Federici, IA Hall, MS Mulla, CH Shaefer. 1980. Bti a potent new biological weapon. Calif. Agric. 34: 33-34. Georghiou GP, M Wirth, H Tran, F Saume & AB Knudsen. 1987. Potential for organophosphate resistance in Aedes aegypti in the Caribbean area and neighbouring countries. J. Med. Entomol. 24: 290-294. Georghiou GP. 1980. Mosquito resistance to insecticides. Calif. Agric. 34:33-34. Georghiou GP & TA Lagunes. 1991. The occurrence of resistance to pesticides in arthropods. F.A.O. p 85-132. Georghiou GP. 1965. Genetic Studies on Insecticides Resistance. Adv. Pest Control Res. 6: 171. Georghiou GP & RL Metcalf. 1963. Dieldrin susceptibility: partial restoration in Anopheles select with a carbamato. Science. 140: 301-302. Gong M, Yan Gu, X Hu, Y Sun, L Ma, X Li, L Sun, J Sun, J Qian, and C Zhu. 2005. Cloning and Overexpression of CYP6F1, a Cytochrome P450 Gene, from Deltamethrin-resistant Culex pipiens pallens. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 37(5): 317326 Gubler, D. J. 1989. Aedes Aegypti and Aedes Aegypti-borne Disease Control in the 1990s: 49th Franklin Craig Lecture delivered before the American Society of Tropical Medicine & Hygiene, Washington, DC 12/7/88 Publication date: 01/01/1989. MMWR at http://www.cdc.gov/mmwr/mmwrsrch.htm CDC Web Search at http://www.cdc.gov/search.htm Hemingway and Ranson, 2000. Insecticide Resistance in Insect Vectors of Human Disease. Annu. Rev. Entomol. 45:371-391 Hemingway J., Coleman M., M. Paton, L. McCarroll, A. Vaughan and D. DeSilva. 2000a. Aldehyde oxidase is co-amplified with the Worlds most common Culex mosquito insecticide resistance associated esterases. Insect Molecular Biology. (1), 9399.

Hemingway, J. and Karunaratne, S.H.P.P. 1998. Mosquito carboxylesterases: a review of the molecular biology and biochemistry of a major insecticide resistance mechanism. Med Vet Entomol 12: 112. Hemingway, J., R. G. Boddington, and J. Harris. 1989. Mechanisms of insecticide resistance in Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) from Puerto Rico. Bull. Entomol. Res. 79: 123-130 Hemingway, NJ Hawkes, L McCarroll, H Ranson. 2004 The molecular basis of insecticide resistance in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology 34:653-665 Hemingway J and H. Ranson. 2005. Chemical control of Vectors and Mechanisms of Resistance. pp 627-647 in Biology of Disease Vectors (2nd ed) edited by W. C. Marquardt et al.. Elsevier Academic Press. Henrick, A. C. 1982. Juvenil Hormone Analogs: Structure-Activity Relationschips. In Coats, J. R. 1982 Ed., Insecticide Mode of Action. Academic Press, New York . Kepler, W. J.; Klassen, W.; Kitzmiller, J. B. 1964. Revertion of dieldrn-resistance in Anopheles albimanus Wiedemann. Mosq. News 24 (1) : 64-66 Lines, J.D., Myamba, J. and Curtis, C.F., 1987. Experimental hut trials of permethrin-impregnated mosquito nets and curtains against malaria vectors in Tanzania. Med. Vet. Entomol. 1, pp. 3751. Lowe, R. E. Flower, J. E.; Lofren, C. S.; Dame, D. A. Savage, K. E.; Bailey, D. L. 1980. Fiel and laboratoriy assessment of temefs for larval control of Anopheles albimanus in El Salvador and evidence for resistance. Mosq. News. 40 (3) 418-423 Luleyap, H.U., Alptekin, D., Kasap, H., M. Kasap. 2002. Detection of knockdown resistance mutations in Anopheles sacharovi (Diptera: Culicidae) and genetic distance with Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) using cDNA sequencing of the voltage-gated sodium channel gene. J. Med. Ent. 39, 870874. Lumjuan N., McCarroll L., Prapanthadara L., Hemingway J., H. Ranson. 2005. Elevated activity of an Epsilon class glutathione transferase confersDDT resistance in the dengue vector, Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology 35: 861871 Martinez-Torres D., F. Chandre, M. S. Williamson, F. Darriet, J. B. Berg, A. L. Devonshire, P. Guillet, N. Pasteur, D. Pauron, 1998. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Molecular Biology 7:179-184. Martinez-Torres, D., Chevillon, C., Brun-Barale, A., Berge, J.B., Pasteur, N., Pauron, D., 1999. Voltage-dependent Na channels in pyrethroid-resistant Culex pipiens L mosquitoes. Pestic. Sci. 55:10121020. Mbogo, C.N.M., Baya, N.M., Ofulla, A.V.O., Githure, J.I. and Snow, R.W., 1996. The impact of permethrin-impregnated bednets on malaria vectors of the Kenyan coast. Med. Vet. Entomol. 10, pp. 251259. Miller, A. T.; Adams, E. M. 1982. Mode of Action of Pyrethroids. In: Coats, J. R. 1982 Ed., Insecticide Mode of Action. Academic Press, New York .

Ming An Shi,2, Lougarre A., Alies C., Frmaux I., Tang Z. H, J. Stojan and D. Fournier. 2004. Acetylcholinesterase alterations reveal the fitness cost of mutations conferring insecticide resistance. BMC Evolutionary Biology, 4(5). Mouches, C., Pauplin, Y., Agarwal, M., Lemieux, L., Herzog, M.,Abadon, M., BeyssatArnaouty, V., Hyrien, O., De SaintVincent, B.R., Georghiou, G.P. and N. Pasteur. 1990. Characterization of amplification core and esterase B1 gene responsible for insecticide resistance in Culex. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 25742578. Nikou, D., Ranson, H. and J. Hemingway. 2003 An adult specific CYP6 P450 gene is overexpressed in a pyrethroid-resistant strain of the malaria vector, Anopheles gambiae. Gene 318: 91102 OPS. 1995. Dengue y dengue hemorrgico en las Amricas: guas para su prevencin y control. Washington DC: OPS (Publicacin cientfica 548). PAHO. 1994. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: guidelines for prevention and control. Scient. Publ. 548: 29-30. Peairs, F.; Cranshaw, W. 2008 Mosquito Management (Supplement to Fact Sheet 5.526) Department of Bioagricultural Sciences and Pest ManagementColorado State University. http://www.ext.colostate.edu/westnile/mosquito_mgt.html#top#top Prapanthadara, L., Promtet, N., Koottathep, S., Somboon, P.,Suwonkerd, W., McCarroll, L., Hemingway, J., 2002. Mechanisms of DDT and Permethrin Resistance in Aedes aegypti from Chiang Mai, Thailand. Dengue Bull. 26, 185189. Ranson H, Claudianos C, Ortelli F., Abgrall C, Hemingway J, Sharvakhova M, Unger M, Collins F,H, and Rene Freyereisen. 2002. Evolution of Supergene Families Associated with Insecticide Resistance. Science 298: 170-181 Ranson, H., Jensen, B., Vulule, J.M., Wang, X., Hemingway, J., Collins, F.H., 2000. Identification of a point mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Kenyan Anopheles gambiae associated with resistance to DDT and pyrethroids. Insect Mol. Biol. 9:491497 Rawlins, S. C. 1998. Spatial distribution of insecticide resistance in Caribbean populations of Aedes aegypti and its significance. Pan Am. J. Public Health 4: 243251. Raymond, M., Fournier, D., Bride, J.-M., Cuany, A., Berge, J., Magnin, M., and Pasteur, N. 1986. Identification of resistance mechanisms in Culex pipiens (Diptera: Culcidae) from southern France: insensitive acetylcholinesterase and detoxifying oxidases. Journal of Economic Entomology 79: 14521458. Roberts, R. H. 1985. Evaluation of Cyflutrin as a ULV cold aerosol against caged mosquitoes. Jou. Am. Mosq. Control Assoc. 1 (4): 474-476 Roberts, DR., et al.. 1997. DDT, global strategies, and a malaria control crisis in South America. Emerging Infectious Diseases 3: 295.

Rodrguez M, Bisset J, Ruiz M, and A Soca. 2002. Cross-Resistance to Pyrethroid and Organophosphorus Insecticides Induced by Selection with Temephos in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Cuba. J. Med. Entomol. 39(6): 882-888 (2002). Rodrguez, M. M., J. Bisset, D. Molina, L. Lauzan, and Soca A. 2001. Detection of resistance mechanisms in Aedes aegypti from Cuba and Venezuela. J. Med. Entomol. 38: 623-628. Saavedra-Rodriguez K, L. Urdaneta-Marquez, S. Rajatileka, M. Moulton, A. E. Flores, I. Fernandez-Salas, J. Bisset, M. Rodriguez, P. J. Mccall, M. J. Donnelly, H. Ranson, J. Hemingway, W. C. Black IV 2007. A mutation in the voltage-gated sodium channel gene associated with pyrethroid resistance in Latin American Aedes aegypti . Insect Molecular Biology 16 (6):785-798. Severini, C.; Romi, R.; Marinucci, M.; Raymond, M. 1993. Mechanisms of insecticides resistance in field populations of Culex pipiensfrom Italy. Jou. Am. Mosq. Control. 9 (2) : 164-168. Scott J. A.1995. The molecular Genetics of Resistance: Resistance as a Response to Stress. Florida Entomologist. 78 (3): 399-414. Soderlund D. and J. Bloomquist, 1990. Molecular Mechanisms of Insecticide Resistance. pp58-96 en Pesticide Resistance in Arthropods editada por Roush R. T. and Tabashnik B.E.. Routledge Chapman & Hall Inc. Great Britain. Soderlund D.M. and Knipple D.C., 2003. The molecular biology of knockdown resistance to pyrethroid insecticides. Insect Biochem Mol Biol 33, 56357. Shono, Y; Jean-Francois, V.; Saint, Y. J; Ithol, T. 1991. Field evaluation of ULV applications with a mixture of d- allethrin and d-phenothrin for control of Anopheles albimanus in Haiti J. Am. Mosq. Cont. Assoc. 7 (3): 494-495. Thompson, T. W. 1992. Agricultural chemistry. Book 1: insecticidas. Thompson Publications. Vejar, C. G. 1994. Pruebas de campo y laboratorio con temefs, permetrina + s-bioaletrina y Bacillus thuringiensis israelensis en mosquitos (Diptera: Culicidae) en cinco desarrollos tursticos de Mxico y Chapingo, Edo. de Mxico. Valles, S. M.; Koehler, P. G. 2003 Insecticides used in the urban environment: Mode of action. This document is ENY282, one of a series of the Entomology and Nematology Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. Original publication date September 1997. Reviewed May 2003. Visit the EDIS Web Site at http://edis.ifas.ufl.edu. Vaughan, A., and R. H. ffrench-Constant. 1998. Biochemical monitoring of organophosphorous and carbamate insecticide resistance in Aedes aegypti mosquitoes from Trinidad. Med. Vet. Entomol. 12: 318-321.

Vaughan, A., Rocheleau, T. and ffrench-Constant, R. 1997. Site-directed mutagenesis of an acetylcholinesterase gene from the yellow fever mosquito Aedes aegypti confers insecticide insensitivity. Exper Parasit 87: 237244. Ware, W. G; Whithacre, D. M. 2004. In troduction to insecticides Maister Pro Information Resouses, Master Media Wordwide. Willoughby, Ohio. WHO, 1998. Techniques to detect insecticide resistance mechanisms (field and laboratory manual). Geneva, Switzerland. WHO, 2006. Pesticides and their applications for the control of vectors and pest of public health importance. Sixth edition. WHO/CDS/NTD/WHOPES/2006.1 Williamson M.S Denhold I., Bell C. A., A. L Devonshire. 1993. Knockdown resistance (kdr) to DDT and pyrethroid insecticides maps to a sodium channel gene in the housefly (Musca domestica). Mol Gen Genet 240:17-22. Williamson, M.S., Martinez-Torres, D., Hick, C.A., A.L., Devonshire. 1996. Identification of mutations in the housefly para-type sodium channel gene associated with knockdown resistance (kdr) to pyrethroid insecticides. Mol. Gen. Genet. 252, 5160.