LAPORANPRAKTIKUM GENETIKAMOLEKULAR

HIBRIDISASISOUTHERN

KHAIRULANAM P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAHPASCASARJANA INSTITUTPERTANIANBOGOR 2009

0

HIBRIDISASISOUTHERN
PENDAHULUAN Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak.HibridisasisouthernbiasadigunakanuntukmelacakadanyaDNAyangsesuaidenganpelacak, misalnyauntukmengetahuiintegrasitransgendidalamorganismetransgenik.Berdasarkanprinsipnya, hibridisasi southern dapat dibagi ke dalam 4 tahap, yaitu : (1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa atau nilon); (2) pelabelan pelacak; (3) prehibridisasi dan hibridisasi; dan (4) deteksi hasil hibridisasi. Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan melalui beberapa cara, yaitu (1) penetesan DNA (dot blot) langsungdimembran;(2)fiksasiDNAbakterireplika(plasmidrekombinan)dimembran;(3)fiksasiDNA fage rekombinan dari satu replika plak di membran; dan (4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnyatelahdimigrasikandenganelektroforesis)kemembran.Membranyangdipergunakanuntuk memfiksasi DNA biasanya menggunakan membran nilon karena lebih kuat daripada membran nitroselulosa.DotblotdanhibridisasiterhadapDNAreplikahanyadapatdigunakanuntukmendeteksi keberadaan DNA tetapi tidak dapat mengetahui ukurannya. Sebaliknya, hibridisasi southern terhadap DNAyangdifiksasikemembrandengancaratransfermelaluimetodesouthern(southernblotting)dapat diketahuiukuranDNAtargetnya(SuharsonodanWidyastuti,2006). Pelacak dapat diperbanyak melalui beberapa metode sebagai berikut : perbanyakan plasmid yang dilanjutkan dengan isolasi fragment DNA yang diinginkan melalui elusi atau dengan PCR dengan menggunakan primer yang spesifik. Berbagai bahan dan cara telah dikembangkan untuk melabel pelacak.PadadasarnyabahanuntukmelabelDNApelacakdapatdibagikedalamduakelompok,yaitu (1)bahanradioaktif(radioisotop)seperti 32P, 33P, 3H;dan(2)bahannonradioaktifsepertidigoxigenin, biotin, ECL, dan alkalin fosfatase (AlkPhos). Radioisotop sangat sensitif untuk digunakan dalam hibridisasi southern, tetapi membutuhkan fasilitas yang canggih dan keamanan yang harus dijaga denganketat.Olehkarenaitupemilihanbahannonradioisotopmenjadisangatmenarikkarenadampak lingkungannya lebih ringan dibandingkan dengan menggunakan bahan radioisotop walaupun sensitifitasnyalebihrendahdibandingkandenganbahanradioisotop(SuharsonodanWidyastuti,2006).

 ALATDANBAHAN Alat PCR,Elektroforesis,GelDock,Shaker,UVtransiluminator,vacuumdanmesinhibridisasi Bahan Fagerekombinan,Film,Probe METODE SouthernBlotting Dilakukan elektroforesis DNA di dalam 0,8% gel agarose tanpa ethidium bromida (dengan penandaberatmolekulDNA).Kemudian,DNAdiwarnaidenganmerendamgelyangmengandungDNA di dalam larutan ethidium bromida (0,5 mg/ml), pada wadah yang terlindung cahaya selama 2030 menit. DNA divisualisasikan di atas lampu transiluminator UV, dan dibuat foto gel untuk mengetahui posisipenandaukuranDNA.Kemudian,gelhasilelektroforesisdirendamdenganlarutandepurinasi0.25 MHClselama10menitdandigoyangdengankecepatan10rpm,laludibilasdenganakuades.Kemudian geldirendamdalamlarutandenaturasi(0.5MNaOH)sebanyak500ml,digoyangselama2025menit, padakecepatan10rpm,lalugeldibilasdenganakuades.Lalugeldirendamdalamlarutannetralisasi(1.5 MNaCl;0.5MTrisHClpH7.21mMEDTA)sebanyak500mldigoyangselama15menit,lalugeldibilas dengan akuades. Membran nylon Hybon N+ disiapkan sesuai dengan ukuran gel yang kemudian membrantersebutdipotongsalahsatuujungnyauntukmengetahuiorientasimembrandandiberilabel dengan pensil. Membran nylon dibasahi dengan 2X SSC dan diletakkan di atas alat vacuumgene (Pharmacia). Gel diletakkan di atas membran, ditambahkan 20X SSC hingga tergenang dan diatasnya ditutupdenganplastic.Geldivakumdengan60mBarselamakuranglebih3jam.Membrandiambildan dimasukkankedalamalatcrosslinkeruntukmenfiksasiDNAdimembranpada1200x100mJoule/cm2: 1menit.Membransiapuntukdilakukanhibridisasisouthernblot. PelabelanProbe 20ulcrosslinkersolutiondiencerkandenganditambahkan80ulair.DNA(atauRNA)diencerkan untuklabelsampaikonsentrasi10ng/uldenganairyangberbeda.Diambil10ulsampelDNA(yangtelah diencerkan) dan masukkan ke eppendorf, kemudian didenaturasi dalam water bath 100C selama 5 menit.Eppendorfdidinginkandiesselama5menit,laluspindown.10ulbufferreaksiditambahkanke dalamependorf,laludimix.Kemudianditambahkan2ullabelingreagen,laludimix.Ditambahkan10ul crosslinkersolution,laludimix,kemudiandispindown.kemudiandilakukandiiInkubasi37Cselama30 2

 menit. Probe dapat digunakan langsung atau dapat disimpan di es paling lama 2 jam (untuk penyimpananyanglebihlama,probeyangsudahdilabeldapatdisimpandalamlarutan50%(v/v)pada 15Cs.d.30Csampai6bulan. Prehibridisasi Larutan buffer prehibridisasi dibuat dengan melarutkan NaCl 0,5 M dan 5 % (b/v) blocking reagent ke dalam larutan hibridisasi dan dikocok dengan magnetic stearer selama 1 jam pada suhu ruang. Membran dimasukkan ke dalam tabung hibridisasi dengan posisi yang mengandung DNA pada bagian dalam gulungan dan ditambahkan SSC 3x sebanyak 5 ml tanpa menyebabkan terbentuknya gelembungudaraantaradindingtabungdenganmembran.LarutanSSC3xdibuangdanditambahkan15 20mllarutanbufferprehibridisasikedalamtabung.Lakukanprehibridisasiselama1jam padasuhu 42C. Hibridisasi Larutan buffer prehibridisasi di dalam tabung ditambahkan dengan DNA pelacak yang sudah dilabel dengan menggunakan pipet mikro. Tabung eppendorf tempat DNA pelacak yang sudah dilabel dibilasdenganlarutanprehibridisasisupayaseluruhpelacakdapatmasukkedalamlarutan.Hibridisasi dilakukanpadasuhu42C. Washing Larutan pembilas pertama dipanaskan pada suhu 42C di dalam oven hibridisasi, dilakukan 2 kali. Membran diambil dari dalam tabung dan dimasukkan dalam wadah yang berisi larutan pembilas keduamenggunakanpinsetberujungtumpul.Wadahdiletakkandiatasshakerdandigoyangselama5 menit pada suhu ruang, dilakukan 2 kali. Larutan pembilas kedua dalam wadah di ganti dengan yang barudandiinkubasikankembaliselama5menitpadasuhuruang. DeteksiSinyal Larutandeteksisinyaldibuatdenganmencampurkandetectionreagent1dandetectionreagent 2 (1:1) sebanyak 0,125 ml/cm2. Wrapping plastik disiapkan diatas permukaan kaca yang rata dan diteteskandenganlarutandeteksi.Kelebihanlarutanpembilaskeduadibuangdanpermukaanmembran yangmengandungDNAdisentuh(direndam)keatastetesancairanpendeteksi,selanjutnyadiinkubasi selama1menit.Kelebihanlarutandeteksidibuangdanmembrandibungkusdenganwrappingplastik. 3

 MembrandiletakkandalamkasetdenganpermukaanyangmengandungDNAmenghadapatas.Dalam ruang gelap dengan menggunakan lampu bercahaya merah (red safe light) film autoradiografi ECL seukuran membran diletakkan di atas membran dan dipress di dalam Film Cassette, dilakukan dalam keadaan gelap pada suhu kamar selama 4 jam. Film diangkat dari Film Cassette dan dicuci dengan larutan developer dalam keadaan gelap pada suhu kamar selama 5 menit. Film dicuci dengan larutan fixerdalamkeadaangelappadasuhukamarselama5menit.Filmdibilasdenganairpadasuhukamar selama5menit.Filmdikeringanginkanpadasuhukamar.Sinyalyangterdapatpadafilmdiobservasi. HASILDANPEMBAHASAN Hasil HibridisasisoutherndilakukanpadagenDNAyangterbentukdalampitayangterdapatpadagel agarose hasil dari elektroforesis. Pada gambar 1, terdapat pita DNA dari gen hasil transformasi yang telahdiamplifikasiyangkemudianDNAdaripitainilahyangakandihibridisasi. 4 Gambar1.Gelagarosehasilelektroforesispadapemeriksaangenhasiltransformasi

 Padagambar2,diketahuibahwapitaDNAyangadapadagelagaroseberhasildihibridisasiyang kemudiandarihasiliniakandilakukandeteksisinyaldenganmenggunakanpelacakDNA.Padadeteksi sinyaltidakterbentukpitapadafilm. Pembahasan Gambar2.Hasil hibridisasi DNA dari gel agarose hasil elektroforesis

Hibridisasi southern sangat berguna dalam penentuan keberadaan gen. walaupun teknik PCR dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan suatu gen atau DNA, tetapi hibridisasi southern tetap dibutuhkan karena dengan teknik ini dapat diketahui panjang gen yang ada di dalam suatu organisme. Selain itu hibridisasi juga dapat digunakan untuk kajian keragaman molekuler, seperti RLFP dan RAPD. Penapisan terhadap suatu pustaka untuk mengisolasi gen, baik pustaka genom maupun pustaka cDNA, memerlukan teknik hibridisasi southern. Konfirmasi hasil isolasi suatu gen atau DNA juga dilakukan menggunakan teknik hibridisasi southern (SuharsonodanWidyastuti,2006). Pada prinsipnya terdapat dua cara pemblotan DNA. Pertama adalah pemblotan dengan sistem kapiler yang sudah dipakai sejak lama. Kedua adalah pemblotan dengan sistem vakum yang banyak dipakai belakangan ini karena relative lebih cepat dan mudah. Terbukti pada percobaan kali ini hibridisasi southern dengan menggunakan vakum berhasil, seperti yang terlihat pada gambar 2,meski lebih cepat. Hibridisasi berhasil dilakukan, ditunjukkan dengan adanya pita yang ada pada membran nylon hybond N+ yang juga telah diberipelacak(SuharsonodanWidyastuti,2006).
5

 Berdasarkan informasi yang diperoleh, dari percobaan deteksi sinyal, tidak diperoleh bercak

hitam pada film. Tidak adanya bercak hitam pada film dikarenakan tidak timbulnya cahaya dimana cahaya tersebut dapat timbul apabila substrat yang berupa enzim (alkalin phosphatase) yang telah diberi label (detection reagent) berekasi membentuk komplemen dengan DNA hasil hibridisasi yang telahdiberipelacak(probe).Berdasarkanhasiltersebutdiketahuibahwahibridisasidarihasiltransfeksi tidakmenghasilkansinyalpadafilmxray. Tidakterdapatnyasinyal(dot)padafilmXRaytidakberartitidakterdapatnyagentarget,namun

perlu dilakukan dengan waktu yang lebih lama pada tahap deteksi sinyal ketika membran hasil hibridisasi ditempelkan dengan film sehingga memungkinkan untuk alkalin phosphatase bereaksi denganDNAyangadapadamembran. KESIMPULAN

1. Hibridisasi southern berhasil dilakukan dengan metode blotting menggunakan vakum. 2. Sinyal DNA hasil hibridisasi tidak dapat dideteksi karena tidak tercetak pada film.
DAFTARPUSTAKA

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI DIKNAS, Bogor.