COLORACIN VITAL 1. Objetivo: Reconocer y diferenciar las bacterias gram positivas y negativas. 2.

Marco teorico: Bacterias Una bacteria es un organismo formado por una sola clula, de pequeo tamao. La estructura celular bacteriana es procaritica y se caracteriza porque su regin nuclear, nucleoide, no est rodeada de membrana, consta de una sola molcula de DNA y su divisin no es mittica. Carece de estructuras citoplsmicas, por lo que los ribosomas estn repartidos por el citoplasma y le confieren un aspecto granular. Adems, el citoplasma puede contener grnulos o inclusiones con material de reserva de lpidos, glucgeno, azufre, etc. La pared celular rodea a la membrana citoplasmtica y da forma, rigidez y resistencia a la clula; tambin puede contener peptidoglicano y lipopolisacridos, compuestos que nicamente se encuentran en estos microorganismos. La estructura y la composicin de la pared dividen a la mayora de las bacterias en dos grupos: grampositivas y gram-negativas. Ciertas especies de bacterias producen en su interior estructuras especiales denominadas endosporas y la mayora de las especies tienen una morfologa celular caracterstica: pueden ser esfricas, bacilares, helicoidales, con forma de coma e incluso cuadradas. Unas son mviles y otras no; algunas obtienen energa de los compuestos orgnicos; otras, mediante fotosntesis, y las hay que utilizan compuestos inorgnicos, como azufre o hierro, como fuente de energa. Aunque la mayora se multiplican a temperaturas medias, hay algunas que crecen a -20 C y otras se desarrollan en ambientes de 110 C. Tambin la funcin de las bacterias en la naturaleza es muy diversa: unas especies son patgenas para el hombre y otras lesionan a las plantas. Un grupo de especies bacterianas interviene en la degradacin de la materia, manteniendo el ambiente y la atmsfera en un equilibrio que permite la vida, y distintas especies participan en la produccin de alimentos y bebidas fermentadas, as como en la obtencin de productos qumicos. Entre las distintas bacterias cabe mencionar a los Mycoplasmas, que carecen de pared; los flagelos, que intervienen en la movilidad; las fimbrias, que favorecen la fijacin de bacterias sobre las superficies, y la cpsula, que tambin tiene funciones de adherencia. Para realizar una clasificacin preliminar de las bacterias se utiliza su tamao (de 1 a 20 Jim o ms), forma (esferas, bastoncillos, espirales) y disposicin espacial (clulas aisladas, en cadenas y formando cmulos)- morfologas microscpicas y macroscpica-; mientras que su clasificacin definitiva se refiere a sus propiedades fenotpicas y genotpicas. BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Las paredes celulares gram-negativas son ms complejas (tanto desde el punto de vista estructural como qumico) que las de las clulas grampositivas. Desde el

punto de vista estructural, una pared celular gram-negativa contiene dos capas situadas en el exterior de la membrana citoplsmica. Inmediatamente por fuera de la membrana citoplsmica se encuentra una delgada capa de peptidoglicano que representa tan slo un 5% a 10% del peso de la pared celular. Adems, la pared celular gram-negativa no contiene cidos teicoicos ni lipoteicoicos. En la parte externa de la capa de peptidoglicano se halla la membrana externa, la cual es exclusiva de las bacteriasgramnegativas. La zona comprendida entre la superficie externa de la membrana citoplsmica y la superficie interna de la membrana externa se conoce como espacio periplsmico. Este espacio es un compartimento que contiene diversas enzimas hidrolticas importantes para la degradacin y metabolizacin por la clula de las macromolculas de gran tamao. Habitualmente, estas enzimas son proteasas, fosfatasas, lipasas, nucleasas y enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono. En el caso de las especies bacterianas gram-negativas patgenas, muchos de los factores de virulencia lricos (p. ej., colagenasas, hialuronidasas, proteasas y betalactamasa) se encuentran en el espacio periplsmico. Adems, este espacio contiene tambin componentes de los sistemas de transporte de azcares, as como otras protenas de unin que facilitan la captacin de diferentes metabolitos y otros compuestos. Asimismo, algunas de estas protenas de unin pueden formar parte de un sistema quimiotctico encargado de percibir el entorno extracelular. Tal como se ha mencionado anteriormente, las membranas externas son caractersticas de los procariotas gram-negativos. La membrana externa forma una especie de rgido saco de lona alrededor de la bacteria. La membrana externa mantiene la estructura bacteriana y constituye una barrera impermeable a molculas de gran tamao (p. ej., protenas como la lisozima) y molculas hidrfobas. Tambin ofrece proteccin frente a condiciones ambientales adversas (p. ej., el sistema digestivo del organismo anfitrin, un factor importante en los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae). La membrana externa posee una configuracin asimtrica y es una bicapa lipdica que difiere de cualquier otra membrana biolgica por la estructura de su zona externa. Sin embargo, la zona externa est formada fundamentalmente por una molcula anfiptica (es decir, con terminaciones tanto hidrfobas como hidrfilas) denominada lipopolisacrido (LPS). Con excepcin de las molculas de LPS presentes en el proceso de sntesis, la zona externa de la membrana externa es la nica localizacin donde aparecen molculas de LPS. El LPS tambin es conocido como endotoxina y constituye un potente estimulador de las respuestas inmunitarias. El lipopolisacrido se encarga de activar a los linfocitos B y de inducir la liberacin de interleucina-1, interleucina-6, factor de necrosis tumoral y otros factores por parte de los macrfagos, las clulas dendrticas y otras clulas. El lipopolisacrido provoca tambin la aparicin de fiebre e, incluso, shock. Tras la liberacin de grandes cantidades de endotoxina al torrente circulatorio tiene lugar la llamada reaccin de

Schwartzman(coagulacin intravascular diseminada). El lipopolisacrido se libera tanto hacia el medio como hacia el entorno intercelular del organismo anfitrin a partir de las bacterias presentes. Asimismo, las bacterias pertenecientes al gnero Neisseria se desprenden de grandes cantidades de un compuesto afn, el lipooligosacrido (LOS), que tambin provoca la aparicin de fiebre y sntomas graves. Aunque la gama de protenas presentes en las membranas externas de los gramnegativos es limitada, algunas de ellas se encuentran a una concentracin elevada, con lo que el contenido proteico total es superior al que existe en la membrana citoplsmica. Muchas de estas protenas atraviesan toda la bicapa lipdica, por lo que se habla de protenas transmembrana. Un grupo de ellas recibe el nombre de porinas puesto que forman poros que permiten la difusin a travs de la membrana de molculas hidrfilas de menos de 700 Da de peso. Aunque el canal de la porina permite el paso de metabolitos y antibiticos hidrfilos de pequeo tamao, acta como barrera frente a antibiticos hidrfobos o de gran tamao, as como frente a protenas como la lisozima. Igualmente, la membrana externa contiene protenas estructurales y molculas receptoras para los bacterifagos y otros ligandos. La membrana externa se conecta a la membrana citoplsmica a travs de unas zonas de adhesin y, por otra parte, se une al peptidoglicano por medio de una lipoprotena. Esta lipoprotena se une al peptidoglicano por un enlace covalente y tambin se ancla a la membrana externa. Las zonas de adhesin proporcionan una va membranosa para el paso de los componentes recin sintetizados de la membrana externa hacia esta. La membrana externa se mantiene mediante enlaces catinicos divalentes (Mg+2 y Ca+2) formados entre los fosfatos de las molculas de LPS y por interacciones hidrfobas entre el LPS y las protenas existentes. Estas interacciones producen una membrana rgida y fuerte que puede verse afectada por la accin de antibiticos (p. ej., polimixina) o mediante la eliminacin de los iones de magnesio y calcio (quelacin con cido etilendiamino-tetraactico [EDTA] o tetraciclina). La alteracin de la membrana externa debilita a la bacteria y favorece el paso de molculas hidrfobas de gran tamao. La adicin de lisozima a clulas con una membrana externa alterada produce unos esferoplastos que, al igual que los protoplastos, son sensibles a los cambios osmticos. BACTERIAS GRAMPOSITIVAS Una bacteriagrampositiva posee una pared celular gruesa que, consta de varias capas y est formada principalmente por peptidoglicano (150 a 500 A) que rodea la membrana citoplsmica. El peptidoglicano es un exoesqueleto en forma de malla con una funcin semejante a la del exoesqueleto de los insectos. Sin embargo, y a diferencia de esta ltima estructura, el peptidoglicano de la clula es lo suficientemente poroso como para permitir la difusin de los metabolitos a la membrana plasmtica.

El peptidoglicano es un elemento clave para la estructura, la replicacin y la supervivencia de las clulas en las condiciones normalmente hostiles en las que proliferan las bacterias. Durante una infeccin, el peptidoglicano puede interferir en la fagocitosis y estimular diversas respuestas inmunitarias, como procesos pirognicos (es decir, que inducen la aparicin de fiebre). El peptidoglicano puede degradarse mediante el tratamiento con lisozima. La lisozima es una enzima presente en la mucosidad y las lgrimas del ser humano que tambin producen las bacterias y otros microorganismos. Esta enzima es capaz de degradar el esqueleto de glicano del peptidoglicano. Sin el peptidoglicano, la bacteria sucumbe a las grandes diferencias de presin osmtica existentes a uno y a otro lado de la membrana citoplsmica y experimenta un fenmeno de lisis. La eliminacin de la pared celular produce un protoplasto, el cual experimenta un proceso de lisis a no ser que se estabilice osmticamente. La clula grampositiva puede poseer tambin otros componentes, como los cidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacridos complejos (generalmente denominados polisacridos C). La protena M de los estreptococos y la protena R de los estafiloco-cos tambin se asocian al peptidoglicano. Los cidos teicoicos son unos polmeros hidrosolubles de fosfatos de poliol que estn unidos al peptidoglicano mediante enlaces covalentes y son fundamentales para la viabilidad celular. Los cidos lipoteicoicos poseen un cido graso y se encuentran unidos a la membrana citoplsmica. Estas molculas son antgenos de superficie frecuentes que diferencian los serotipos bacterianos y favorecen la fijacin a otras bacterias y a receptores especficos localizados en la superficie de las clulas de los mamferos (adherencia). Los cidos teicoicos constituyen unos sealados factores de virulencia. Los cidos lipoteicoicos son expulsados hacia el medio circundante y al medio intercelular del organismo anfitrin y, aunque dbiles, son capaces de desencadenar respuestas inmunitarias semejantes a las de las endotoxinas. Se llaman bacterias grampositivas a las que no poseen una membrana externa para proteger el citoplasma bacteriano, tienen una gruesa capa de peptidoglicano y presentan cidos teicoicos en su superficie. As mismo presentan una mayor resistencia a los antisepticos. Desde el punto de vista morfolgico encontramos en esta clasificacin, cocos y bacilos. La pared celular de las bacterias Gram positivas Sus principales caractersticas son: y y y y La red de murenaesta muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas Los aminocidos implicados varan de una especie a otra. La constitucin del esqueleto es caracterstica de la especie y constituye una buen parmetro taxonmico Es frecuente la presencia de los aminocidos L-diaminopimlico o de lisina

y y

Los poliscaridos estn unidos por enlaces covalentes (en el caso de tenerlos) Su contenido proteico es bajo. En ella se encuentran cidos teicoicos

La pared celular de las bacterias Gram negativas y y y y y y La red de murena presenta una sola capa La constitucin del saco de murena es igual en todas las bacterias Gram negativas. Contiene siempre nicamente meso-diaminopimlico Nunca contiene lisina No se encuentran puentes interpeptdicos. Se encuentran grandes cantidades de lipoprotenas y lipopolisacridos que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. Para mantener la estabilidad de las capas de lipopolisacridos es necesario el in Ca++. En las bacterias Gram negativas la capa de murena puede ser atacada por la lisozima cuando se las trata con EDTA (Etilen-diamino-tetractico). Este agente, al quelar el Ca++ libera una parte de los lipopolisacridos y permite la accin de la enzima. Hasta ahora no han podido demostrarse cidos teicoicos

Segn se cuenta el descubrimiento de la lisozima tuvo lugar cuando las lagrimas de un nio (que estaba en el laboratorio donde trabajaba Fleming), caen en un tubo y aclaran una suspensin Micrococcuslysodeikticus, que, hoy se sabe, es la bacteria mas sensible a la lisozima, masiii.... Este hecho esta un poco menos difundido que la novelesca historia de la espora de Peniciliumque entro por la ventana del laboratorio de Fleming, cayo en una placa de Petri y al crecer puso de manifiesto la accin bactericida del antibitico que llamo penicilina....(Florey y Chain en Oxford la aislaron, dieron las pautas de su produccin industrial y al hacerlo pusieron en marcha la era de los antibiticos, por ello, Fleming , Florey y Chain recibieron el premio Nobel en 1945 ) La lisozima descubierta en 1922, es una enzima que rompe el enlace beta glucosdico de la murena. Se la encuentra en el lquido lagrimal, secreciones nasales y en la clara de huevo. Tambin se la ha aislado de bacterias y bacterifagos. La accin de la lisozima se pone en evidencia por un aclaramiento rpido de una suspensin bacteriana, Micrococcuslysodeikticus ya se lisa con 1 ug de lisozima / ml. Para lisar otras bacterias p.eBacillusmegaterium se necesitan 50 ug / ml . La capa de murena de muchas bacterias Gram negativas solo es atacada por la lisozima cuando se aade EDTA (Etilen-diaminotetractico).

El mecanismo de lisis es el siguiente: la destruccin de la pared celular deja al protoplasma de las bacterias rodeado nicamente por la membrana celular ("protoplasto"), lo cual convierte a la bacteria en un organismo extraordinariamente sensible a las variaciones de tonicidad del medio, esta es la base del fenmeno de aclaracin que tiene lugar luego de la accin de la lisozima, cuando la solucin es hipotnica. 3. Materiales y y y y y Microscopio electrnico. Laminillas Laminas Cultivo vivo de bacterias Set gram o Cristal de violeta o Lugol o Alcohol acetona o Safranina

4. Procedimiento. Procedimiento de coloracin Gram o o o Cristal de violeta: agregamos unas gotas a la muestra y dejamos un minuto, lavamos. Lugol: agregamos unas gotas, y dejamos reposar 30 segundos, lavamos Alcohol acetona: agregamos unas gotas, dejamos reposar un minuto y lavamos, si la muestra esta transparente se deja de lo contrario nuevamente se realiza este paso. Safranina: colocamos unas gotas y dejamos reposar por 30 segundos, lavamos y lo dejamos secar para llevarlo al microscopio.

Primera muestra- estaphylococus raspamos un poco de piel Hacemos el frotis en la lamina Dejamos secar y coloreamos con el set gram Segunda muestra- Bacilo de koch La muestra ya perparada la colocamos al microscipio y observamos Tercera muestra- gonococus La muestra ya perparada la colocamos al microscipio y observamos

5. Observaciones/resultados

Por qu las gram negativas se tien de color rojo y las gram positivas de azul? Esa caracterstica es debida a diferencias en la composicin qumica de sus psaredes celulares, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

6. Conclusiones Aprendimos a diferenciar bacterias gram positivas y negativas, gracias a la coloracin gram. Las bacterias gram negativas se tien de rojo. Las gram positivas se tien de azul Mayormente los cocos son gram positivos Mayormente los vacilos son gram negativos

7. recomendaciones actuar con mucho cuidado, con respecto a la utilizacin de materiales y de muestras, se sebe tratar con sumo cuidado los microscopios. Realizar los procedimientos correctamente para no tener inconvenientes ni fallas en los resultados.