UNIVERSIDAD ANDRES BELLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR PROFESORES: Macarena Kayser

Francisco A. Duarte Olave

TRABAJO PRCTICO N 5: Organizacin Subcelular

Seccin: Bio 131-18 Integrantes: Carolina Cruz Amandy Espinoza Ignacio Fandez Randy Oate

Introduccin
Los seres vivos nos encontramos formados por pequeas estructuras bsicas. Estas son las clulas, las unidades morfolgicas y funcionales ms bsicas y fundamentales de la materia viva. Existen dos tipos, unas ms simples y primitivas llamadas clulas procariontes que forman dos dominios en la naturaleza, denominados Eubacterias y Archaea y nos muestran lo ms esencial de la vida. Y otras clulas llamadas Eucariontes que son mucho ms complejas y con una estructura mucho ms organizada y que pueden vivir una independiente de otras clulas o se pueden encontrar en agrupaciones, formando organismos multicelulares. Estas tienen propiedades fundamentales, que en conjunto y organizadas, cumpliendo con funciones especializadas como metabolismo, flujo de informacin gentica, homeostasis, etc. para el correcto trabajo de los complejos sistemas que nos forman. Permitiendo as, el sustento de las necesidades ms bsicas y vitales en cada organismo. Los principales mtodos utilizados para el estudio de las clulas se encuentran basados en la microscopia, la cual es una herramienta esencial para examinar tales estructuras, que con el pasar de los aos y los avances de la ciencia se ha ido complementando con nuevas tecnologas para estudios ms acabados. Habitualmente pueden conseguirse diferentes tipos celulares a partir de la disgregacin de los tejidos en los que se encontraban, purificarse y obtener como resultado diferentes tipos celulares individuales que pueden ser cultivadas y desarrollarse fuera de estos. Ms an, podemos fraccionar stas clulas y aislar cada uno de sus orgnulos hasta tener muestras puras de ellos; como tambin de los constituyentes macromoleculares que se encuentren. Esto ltimo puede ser realizado mediante un proceso llamado centrifugacin el cual permite obtener estructuras subcelulares sin perder las funciones que los caracterizan; comienza con la disgregacin de una muestra que tiene diferentes maneras de realizarse: shock osmticos, vibraciones ultrasnicas o moliendo las clulas en homogenizadores mecnicos. Provocando el rompimiento de las membranas y consiguiendo un homogenizado o lisado que luego es sometido a repetidas centrifugaciones con velocidades gradualmente mayores que fraccionarn los extractos celulares en sus componentes. Con este tratamiento se ir separando cada tipo de organelo segn el tamao y densidad que tenga; donde mientras menor sea el tamao del componente subcelular mayor ser la fuerza centrfuga requerida para conseguir la sedimentacin. Posteriormente los pellets obtenidos pueden complementarse a marcadores moleculares que reaccionan frente a enzimas o molculas propias de cada compartimiento subcelular. Para ahondar mucho ms en las propiedades y caractersticas de las clulas presentamos el actual informe; donde nos dedicaremos al anlisis de las clulas eucariontes, a partir de muestras realizadas en el laboratorio donde se aplic la tcnica, ya mencionada, enfocada en la identificacin de estructuras internas de la clula, conociendo de forma mucho ms cercana orgnulos como tambin constituyentes macromoleculares, y tales resultados han sido comparados y 1 complementados con otras fuentes cientficas. Obejtivos: Entender y aplicar el mtodo de fraccionamiento celular como tambin identificar organelos celulares con tincin y sin tincin. Entender las reacciones de los marcadores celulares y por ultimo aprender a utilizar el objetivo de inmersin.
Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introduccin a la Biologia Celular 2004, Editorial Panamericana, 2 edicin, Estados Unidos. Pp. 147-174
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Materiales y mtodos Primero se recibi un homogenizado filtrado de hgado de Rattus Norvegicus realizado por las docentes previamente. Luego se procedi a la homogenizacin mecnica ( usando un aparato llamado ultra turax). Luego de realizado el homogenizado se prosigui a filtrar la muestra 2 veces y mezclarla con Buffer IBC para la proteccin de organelos. Todo esto, manteniendo los materiales a 4 C. Ya obtenido el filtrado se reparti 10 ml del filtrado a cada grupo en un tubo falcon para una centrifugacin de 10 minutos. . Luego de realizada la primera centrifugaci se obtuvo el pellet 1 (P1) correspondiente a nucleos sedimentados, el P1 de dejo en 1 ml de buffer IBC en hielo para el anlisis. El sobrenadante del P1 se transfiri a otro tubo falcon y se centrifugo por 25 minutos obteniendo un sedimento mezclado con 1 ml de buffer IBC, obteniendo de esta manera el pellet 2 (P2), correspondiente a la fraccin mitocondrial. El sobrenadante del P2 se transfiri a un tercer tubo falcon obteniendo asi la fraccin microsomal (S2). En la actividad numero 1 se observaron mediante microscopios las muestras de P1 y P2. Esto se realizo colocando una gota de cada muestra usando una micropipeta para despus colocarle encima un cubreobjeto. Cada pellet se observo sin tincin y con tincin de azul de tripan con un amento objetivo de 40x. En la actividad b) de la actividad 1, se trato de la identificacin de la enzima Succinato desidrogenasa en distintas muestras. Este experimento se realizo colocando distintas especies en 4 tubos de ensayos para despus colocarlos 15 minutos en bao maria a 37 C y su posterior evaluacin. Por ultimo la actividad numero 2 se trato en la observacin de una muestra permanente de higo de Rattus Norvegicus usando el obetivo de inmersin, observndolo en diferentes aumentos.

En la actividad 1-b) se compararon diferentes muestras para reconocer la presencia de mitocondrias a travs de la enzima Succinato Succinato SDH

Fumarato + 2H+ + 2e-

Las muestras utilizadas son mostradas en la tabla N1

Tabla N 1 N 1 2 3 4 Tubo Blanco fraccin nuclear fraccin mitocondrial fraccin microsomal Succinato 0,1M 1ml 1ml 1ml 1ml Azul de metileno 2gotas 2gotas 2gotas 2gotas Agua destilada 1ml 1ml 1ml 1ml fraccin nuclear 1ml 1ml 1ml fraccin fraccin mitocondrial microsomal

Actividad N 2: Observacin de un corte de hgado de Rattus norvegicus (Berkenhout) utilizando el objetivo de inmersin. En esta actividad observamos una muestra de un corte de hgado de Rattus norvegicus, la cual partimos observando con el objetivo de 4X para enfocar la parte a observar de la muestra, luego antes de poner el objetivo de inmersin, pusimos cuidadosamente una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos de la muestra observada y tras esto procedimos a poner el objetivo de 100X de manera en que quedara inmerso en el aceite para obtener un aumento de 1000X (ya que el aumento del ocular es de 10X) y regulando el enfoque con el micromtrico, poder observar claramente la muestra.

Resultados Actividad 1: Obervacion de pellets obtenidos con y sin tincin

-Muestra: Ncleos Centrifugados -Tincin: Sin tincin. -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.

Resultados: Se observan nucleos en suspensin, tambin se observ una burbuja de grandes proporciones.

-Muestra: Ncleos Centrifugados -Tincin: Con tincin azul de tripan -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.

Resultados: Se logran diferenciar ptimamente los ncleos, pero la solucin acuosa se ve

transparente. Se Pueden divisar movimientos de las estructuras y se puede diferenciar una notable distincin en su coloracin. Mediante el ADN, que es la macromolcula que se tie con el azul de Tripn, podemos diferenciar los ncleos. Pudimos identificar tambin restos de tejidos que se diferencian de los ncleos.

-Muestra: Mitocondria Centrifugados -Tincin: Sin tincion -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.

Resultados: Se aprecia la muestra enriquecida en mitocondrias.

-Muestra: Mitocondria Centrifugados -Tincin: Con tincin azul de tripan -Aumento Ocular: 10X. -Aumento Objetivo: 40X. -Aumento Total: 400X.

Resultados: Aun no se puede lograr ver la mitocondrias con claridad ya que este coloide no puede colorarlo y solo se aprecia los ncleos por una mala separacin del pellet con el sobrenadante, como se puede apreciar en la figura Actividad 1-b): Evaluacin del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares Despus de sacar los tubos de ensayo del bao Mara no se logro tener ninguna diferencia aparente ya que las muestras quedaron tal cual lo aviamos dejado. Este resultado puede ser debido a que la concentracin fue muy pequea y/o una mala manipulacin de separacin de las subunidades, por no incolorarce la muestra de mitocondrias.

Imagen de los tubos usados en la actividad. La rotulacin corresponde al numero de tubo correspondiente a la tabla adjuntada en materiales y mtodos.

Actividad N 2: Observacin de un corte de hgado de Rattus norvegicus (Berkenhout) utilizando el objetivo de inmersin.
Al comparar la imagen obtenida con el objetivo de 40X con la obtenida con el objetivo de 100X, este ultimo nos permiti visualizar clulas que con un aumento menor no era posible visualizar, pudimos observar claramente marcados de color rosa las clulas del hgado, con sus respectivos ncleos marcados de un color morado.

Discusin Actividad 1-a) Los resultados obtenidos en la primera 1 actividad fueron los esperados ya que fue posible realizar de manera correcta la centrifugacin de la homogenizacin del hgado de Rattus Norvegicus obtenindose pellet de ncleos, mitocondrial y microsomal adems de sus respectivos sobrenadante. En la actividad 1b los resultados obtenidos fueron los esperados ya que fue posible ver el pellet de ncleos con tincin de azul de tripan de manera correcta en un objetivo de 40x. En cambio con el pellet de mitocondrias con tincin de azul de tripan, estos no pudiendo ser observados de manera clara ya que este coloide no pudo colorarlo y solo fue posible observar algunos restos de ncleos debido a una mala separacin del pellet con el sobrenadante. Segn las actividades realizadas se logro comprender las etapas de la fragmentacin subcelular en la cual debe se a grandes rasgos debe romperse las membranas celulares para lograr la separacin de los organelos de la clula, para su luego la separacin mediante la tcnica del centrifugado donde se aumenta la fuerza de gravedad y se acelere la sedimentacin segn la densidades de los diferentes compuestos, como por ejemplo los ncleos son los primeros organelos en sedimentar ya que poseen el mayor peso, y los ribosomas son las ultimas en sedimentar debido a su peso bajo molecular, que en esta actividad no se extrajo de manera pura ya que mantuvo en la sobrenadante microsomal ya que se obtuvo en una tercera centrifugado mitocondrias como pellet final. Las actividades realizadas y sus resultados esperados, no fueron conseguidas por nosotros ya que despus de la fragmentacin y la centrifugacin fueron separados de mala manera por el estudiante a cargo, no siguiendo los pasos a seguir adecuadamente2 Actividad 1-b) En la primera centrifugacin que se llevo a cabo se obtuvo un sedimento que corresponde a trozos de membrana y a los ncleos de las clulas del hgado de rata, esto se debe a que el ncleo es el organelo mas pesado de la clula. Luego el sobrenadante que se volvi a centrifugar a una velocidad ms alta se extrajo otro pellet que corresponde a la fraccin mitocondrial. Esto es producto del menor peso de las mitocondrias con respecto al ncleo. Estas muestras de pellet fueron aisladas y se agrego Buffer IBC para mantener aislados los organelos. Las muestras se mantienen durante todo el proceso en un medio frio (4C) con el fin de minimizar la activacin del dao generado por las fosfolipasas y proteasas.

Universidad Andrs Bello, Gua N5: Organizacin Subcelular, Curso Bio 131-18, Biologa Celular 2011

En este procedimiento se observaron cuatro tubos, los cuales contenan distintas soluciones con el fin de evaluar el fraccionamiento. La solucin de Succinato Deshidrogenasa se usa para identificar mitocondrias ya que el Succinato, protena que interviene en el ciclo de Krebs, caracterstico de las mitocondrias, al estar en reaccin con la Succinato deshidrogenasa, esta ultima cataliza la deshidrogenacin del Succinato y lo convierte en Fumarato, un alqueno. En una muestra rica en mitocondrias y tincin de azul de metileno, lo cual en un principio es de color azul, al entrar en contacto con el succinato a una temperatura de 37C, que es la temperatura corporal de un ratn y la temperatura en la cual las mitocondrias actan con mayor eficiencia, al haber pasado 45 minutos se observa que la muestra se torna transparente producto de la reaccin del Succinato de las mitocondrias y la Succinato deshidrogenasa que se agreg a la muestra. En los tubos que preparamos para observacin se observ cambios positivos solo en el tubo 3, lo cual era de esperar debido a que era una preparacin rica en mitocondrias. El uso de vaselina liquida en los tubos se debe a que el azul de metileno reducido puede fcilmente ser oxidado por oxigeno del aire, y recobrar su coloracin azul intensa, es por esto que se cubre el medio de reaccin con la vaselina para que la reaccin se lleve a cabo en ausencia de oxigeno. Actividad 2 El mayor aumento obtenido se explica porque A diferencia del aire, el aceite de inmersin3 tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio del cubre objetos y Al colocar aceite de inmersin entre el lente frontal del objetivo (diseado para usarse con aceite de inmersin) y el cubre objetos, el rango angular de los rayos difractados capturados por los lentes se incrementan y, en efecto, incrementa el aumento y resolucin del objetivo permitindonos visualizar muestras mas pequeas. Las clulas del hgado que observamos se llaman hepatocitos4, participan de la biosntesis proteica, y del almacenamiento de carbohidratos (glucgeno) y protenas, tambin de la sntesis del colesterol, fosfolpidos y sales biliares. Cumplen tambin una funcin de desintoxicacin, modificacin y excrecin de sustancias exgenas, y el inicio de la secrecin de bilis.

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http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/hepatocitos.html

Bibliografa 1-Alberts, Bray, Hopkins, Jhonson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Introduccin a la Biologia Celular 2004, Editorial Panamericana, 2 edicin, Estados Unidos. Pp. 147-174 2-Universidad Andrs Bello, Gua N5: Organizacin Subcelular, Curso Bio 131-18, Biologa Celular 2011 3-http://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_aceite_de_inmersion.htm 4-http://medicinafarmacologia.blogspot.com/2009/12/hepatocitos.html