SOUTHERN

BLOT

Prsent par:

La technique de Southern blot est une mthode dhybridation molculaire. Baptise du nom de son inventeur, le biologiste britannique Edwin Southern. Permet de visualiser nimporte quelle fraction du gnome condition davoir une sonde squence hybridant spcifiquement avec la squence analyser.

OBJECTIF

Visualiser un fragment du gnome (ADN) dont on possde une sonde.

PRINCIPE DE LA TECHNIQUE

1-Prparation

de l'ADN tudier - Digestion ou fragmentation de lADN. - Sparation des fragments. - Dnaturation et neutralisation de l'ADN - Transfert de l'ADN sur une membrane - Fixation covalente de l'ADN sur la membrane

2- Prhybridation 3- Hybridation 4- Lavages 5- Autoradiographie

1- Digestion ou fragmentation de lADN Couper l'ADN en fragments de diffrents tailles enzymes de restrictions environ 106 fragments Ceci facilite lidentification des squences spcifiques Les fragments sont maintenant facilement spars par l'lectrophorse sur gel.

2-Sparation des fragments par lectrophorse sur gel Agarose ou polyacrylamide Sparation des fragments en fonction de leur tailles La coloration au B.E.T permet - contrler la qualit de lADN - contrler la migration - contrler la digestion enzymatique Visualisation sous UV.

2-Sparation des fragments par lectrophorse sur gel

 3-Dnaturation

et neutralisation de l'ADN

1- Dnaturation

Le gel dlectrophorse est tremp dans une solution alcaline (NaOH) permettre la dnaturation de lADN bicatnaire. Le gel est immerg dans une solution neutralisante empcher la renaturation de lADN avant dajouter la sonde.

2- Neutralisation

4-Transfert de l'ADN sur une membrane

Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou en nylon) est place sur le gel. Une pression est applique au gel (une pile de serviettes de papier et par un poids) permettre le dplacement de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarit

TRANSFERT DE L'ADN SUR UNE

MEMBRANE

PRPARATION DE L'ADN TUDIER

5- Fixation covalente de l'ADN sur la membrane

fixation de l'ADN sur la membrane par : - Cuisson ou chauffage 80C (mb. nitrocellulose). - Exposition au UV (mb. nylon) fixer de manire permanente l'ADN sur la membrane.

2- PRHYBRIDATION

Saturer les sites de fixation de la membrane restes libres. - Pr incuber la membrane avec un ADN htrologue ( ADN de sperme de saumon).

3- HYBRIDATION

La membrane est mise en contact avec une sonde spcifique de la squence d'ADN recherche. La sonde doit tre marque (incorporation de radio-isotopes, par "tiquetage" de la molcule avec un fluorophore ) et dnature. La temprature d'hybridation soit ~65C.

4- LAVAGES

la sonde en excs est limine de la membrane par une srie lavages.

5- AUTORADIOGRAPHIE

L'hybridation est visualise sur un film

autoradiographique.

Aprs dveloppement, il y aura les taches fonces sur le film partout o la sonde lie.

5- AUTORADIOGRAPHIE

Schma gnral de la technique

UTILISATIONS DU SOUTHERN BLOT

Identification des mutation, dltions, et rarrangements des gnes. Prvision de certains cancers. Diagnostic de HIV-1 et des maladies infectieuses Tests paternit et en mdecine lgale.

RFRENCES
http://www.univrouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot. html http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbi och/POLY.Chp.9.9.html http://highered.mcgrawhill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535 ::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Sout hern%20Blot Biochimie gntique, biologie molculaire

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