PRODUCCIN INDUSTRIAL DE ENZIMAS

Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

La primera enzima producida industrialmente fue la amilasa fngica takadiastasa, empleada en USA como agente farmacutico (para los desrdenes intestinales) en 1894. El proceso patentado de Otto Roehm procesos de lavandera para todos y cualquier tipo de tejidos mediante adicin de enzima trptica se anunciaba en 1915. En 1969 el 80% de todos los detergentes de lavandera contenan enzimas, fundamentalmente proteasas. Junto a stas se empezaron a utilizar en la industria de los detergentes enzimas adicionales como lipasas, amilasas, pectinasas y oxidorreductasas. En 1971 y debido a la existencia de alergias entre los trabajadores de la industria de produccin as como entre los consumidores, se redujo drsticamente el uso de proteasas en detergentes. Solamente cuando se desarrollaron tcnicas especiales, como la microencapsulacin, pudieron ser producidas preparaciones de proteasas carentes de riesgo para los trabajadores y los consumidores. Actualmente en Europa el 95% de los detergentes de lavandera contienen proteasas (subtilisinas). En la actualidad se producen comercialmente los siguientes enzimas: 1.- Enzimas utilizados en la industria como amilasas, proteasas, catalasas, isomerasas y penicilina acilasas. 2.- Enzimas utilizadas con propsitos analticos como la glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muraminidasa y colesterol oxidasa. 3.- Enzimas utilizadas en medicina como la asparraginasa, proteasas, lipasas y estreptoquinasa. Estas tres reas de aplicacin requieren niveles variables de calidad y cantidad. En base a toneladas, las ms importantes son las enzimas industriales que se producen en fermentadores de 120 m3, mientras que en las enzimas producidas para propsitos anliticos o mdicos se utilizan fermentadores de planta piloto.

Todos los enzimas producidos en grandes cantidades, salvo la glucosa isomerasa y la invertasa, son extracelulares.

La Ingeniera enzimtica
Resumen La ingeniera de enzimas es una realidad. La variedad de aplicaciones para una enzima es tal que se han desarrollado conocimientos diferentes para su aprovechamiento. Desde su obtencin a partir de fuentes naturales hasta su diseo minucioso, las tcnicas de obtencin varan notablemente, as como sus diversas formas de empleo y la variedad de procesos en los cuales ofrecen ventajas muy grandes. Introduccin Las enzimas, los llamados, catalizadores de la vida, son sustancias de alta especificidad que permiten que las reacciones biolgicas, normalmente poco probables, se realicen y permitan el continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podra decirse que son las molculas dadoras de vida, que han permitido la evolucin de las especies a lo largo de los aos. Pese a estar presentes desde el origen de la vida, su conocimiento se reduce a tan solo algunos siglos. Uno de los primeros desarrollos de este tipo se dio hacia la finalizacin los siglos XVIII. Se descubri la accin qumica de ciertas sustancias en la digestin, as como ciertos extractos sacarificantes. A finales del siglo XIX Buchner obtuvo una solucin liquida, extrada de levaduras, que cumpla la misma funcin fermentativa. Con esto se pudo inferir que un agente qumico concreto realizaba tales cambios dentro de los microorganismos(1) El nombre de enzima es de origen griego(en:dentro + zyme: fermento), y su uso es relativamente reciente, apenas desde la primera mitad del siglo XX(2). Bsicamente, una enzima es una molcula de proteica cuya estructura le permite ligarse a una clase especfica de compuestos(sustratos) modificarlos, permaneciendo ella con la misma estructura una vez se ha finalizado la unin con los sustratos. Por ello, desde el punto de vista estricto, es un catalizador, ya que no se consume durante la reaccin y al final de ella permanece invariable, tal y como se alimento al inicio. Las enzimas cumplen una gran variedad de funciones biolgicas. La formacin de protenas, carbohidratos y lpidos es un ejemplo. Son a la vez degradados y reconstruidos por otras reacciones enzimticas, produciendo energa a una velocidad adecuada para el organismo, sin el gasto energtico que exigen los mtodos qumicos de laboratorio. Se dividen en diferentes grupos, mencionados a continuacin(1). 1. Oxido-reductasas: Sus funciones estn bsicamente relacionadas con las reacciones de oxido reduccin de los organismos. Se encuentran muy comnmente en reacciones metablicas. Existen dos subgrupos principales dentro de ellas: Las Deshidrogenasas y las Oxidasas.

2. Transferasas: Las enzimas de este tipo permiten el cambio de grupos especficos de una molcula a otra. Su nomenclatura se basa en el sustrato que emplean y en el aceptor final. 3. Hidrolasas: Este grupo de enzimas permite romper molculas de alto peso molecular, hacindolas reaccionar con molculas de agua. Con este mtodo pueden romper enlaces peptdicos, glicosdicos o estricos. La mayora de enzimas gstricas son de este tipo. 4. Isomerasas: Realizan modificaciones en una molcula, cambiando su conformacin molecular, ya sea como ismero ptico, funcional o de otro tipo. 5. Liasas: Estas molculas rompen enlaces carbono-carbono, carbono-oxgeno, carbono-nitrgeno y carbono-azufre. 6. Ligasas: Permiten la unin de dos molculas, valindose de la energa obtenida por la degradacin de ATP. Generalmente crean enlaces carbono-carbono, carbonooxgeno, carbono-nitrgeno y carbono-azufre. Con toda esta gama de posibilidades que ofrecen las enzimas, su uso se ha hecho frecuente y, por lo tanto, el desarrollo de nuevos procesos que permitan que la actividad de estas enzimas se optimice. Es por ello que tres campos importantes se han identificado dentro de la ingeniera de enzimas: La elaboracin, la puesta a punto y el diseo. La Elaboracin Uno de los primeros desarrollos que se iniciaron para las enzimas fue su obtencin y purificacin. Se conocan especies cuyas estructuras permitan que, al estar en contacto con el sustrato, lograsen elaborar una amplia variedad de productos, beneficiosos y tiles para el hombre. Con el descubrimiento de Buchner, mencionado anteriormente, se abri la puerta para la obtencin de nuevas tecnologas. Empleando distintos mtodos de purificacin es posible obtener altas concentraciones enzimticas, que permiten una mejor comercializacin de la enzima para usos industriales.

La industria de carnes es la fuente principal de las enzimas derivada del pncreas, estmago e hgado de los animales. Las enzimas de fuentes microbiolgicas (Bacterias, Hongos y levaduras) se producen en la industria de la fermentacin. (3) Tabla 1 ejemplifica algunas de las fuentes de enzimas.

Tabla 1:Fuentes de enzimas diversas Enzima a-amilasa Lisosima Fosfolipasa Tripsina Fuente Pncreas bovino-porcino Albmina de huevo Pncreas porcino Pncreas bovino-porcino

Quimiotripsina Pepsina Renina b- amilasa Peroxidasa Papaina Amilasa Penicilinasa Invertasa Celulasa Pectinasa

Pncreas bovino-porcino Mucosa porcina Bovinos Grano de cebada Raz de rbano Leche de papaya Bacillus Subtilis, Aspergillus Nger, Aspergillus cryzae Bacillus Subtilis S. Cerevisiae, Aspergillus cryzae Aspergillus Nger, Trichoderma sp. Clostridium sp.

Bsicamente, para estas industrias los cultivos celulares son la mejor opcin en cuanto a elaboracin de enzimas. Una vez estos cultivos celulares se encuentran maduros, se procede a la cosecha de los mismos. Para la industria de elaboracin de enzimas es necesario entonces el desarrollo de tecnologas y procesos de separacin eficientes, que den lugar a enzimas de alta pureza y que a la vez obtengan mejores rendimientos de enzima por sustrato empleado. Para extraer las enzimas de las clulas que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; tcnicas mas modernas tales como el ultrasonido, auto lisis y congelamiento- descongelamiento se emplean tambin. Uno de los mtodos de purificacin de enzimas es la cristalizacin de las mismas. Primero se cambia el pH, con lo que se retiran algunas protenas, o se emplean solventes orgnicos que separen diversas protenas(1). A veces se emplean tambin columnas de cromatografa que permiten la obtencin de distintos sueros, con diferentes concentraciones de enzimas. Una vez se obtienen estos licores, se cristalizan en repetidas ocasiones, lo que da como resultado un cristal enzimtico de buena actividad especifica.

La puesta a punto

Qu hacer una vez las enzimas han sido purificadas? Una vez esto ha ocurrido, stas se encuentran listas para su comercializacin, en la cual sern empleadas en diversos procesos. Generalmente estos procesos pueden realizarse por otras vas distintas a la enzimtica, pero dadas las caractersticas de las enzimas su eficiencia es alta y sus condiciones de operacin bastante aceptables. Las aplicaciones de las enzimas son diversas, y, por lo tanto, desarrollos en la ingeniera del proceso son necesarios para cada uno de los casos particulares. Las aplicaciones de las enzimas son (3):

Alimentos: Las enzimas se emplean en la industria alimenticia desde hace mucho tiempo. El cuajo del queso o el empleo de extracto de papaya son ejemplos. En la actualidad, se emplean frecuentemente en la industria alimentaria. Ejemplos de ello son la lactasa y el cuajo (mezcla de hidrolasas para la casena lctea) en la industria lctea, las hemicelulasas, fitasas, lipasas, lipoxigenasas, proteasas, lactasas e isoamilasas en la industria panaria(4), amilasas en las cerveceras, pectinasas en la elaboracin de jugos, amilasas, isoamilasas e isomerasas en la industria de jarabes glucosados y fructosados, hidrolasas para degradar rafinosa en la refinacin azucarera, glucosa oxidasas en la degluconizacin del huevo y papainas y bromelinas en los ablanda carnes(3).

Detergentes: Los detergentes emplean distintas enzimas, del grupo de las proteasas y lipasas especialmente, con el fin de eliminar suciedad de tipo orgnico. Las enzimas son empleadas desde los aos 60 en estos detergentes, y en la actualidad se emplean en la mayora de estos productos.

Tratamiento de residuos: El tratamiento de desechos es uno de los mejores campos de accin de las enzimas. Existen enzimas capaces de degradar sustancias altamente txicas, y por lo tanto sus aplicaciones pueden verse en el tratamiento de aguas, tal como la descomposicin de compuestos fenlicos a partir de peroxidasas obtenidas de la cola de caballo (3 y 7) o de residuos slidos orgnicos, con la degradacin de celulosa, lignina y otros materiales de alto peso molecular presentes en gran cantidad en esta fraccin de los residuos. Otras aplicaciones van en la biorremediacin, emplendose por ejemplo en derrames de petrleo, con enzimas capaces de degradas hidrocarburos.

Industria mdica y farmacutica: Las aplicaciones de enzimas en las industrias mdica y farmacutica es muy grande. Pueden mencionarse la modificacin de la insulina porcina para su consumo humano, la obtencin de antibiticos semisintticos, la obtencin de aminocidos N Acetilados y el anlisis de compuestos presentes en algn fluido. Tambin se observan aplicaciones de las enzimas en la sntesis de esteroides (3).

Las enzimas, dentro de los procesos, pueden emplearse en medio libre o inmovilizadas. Cada uno se emplea dependiendo del proceso para el cual se emplea. En cuanto al sistema inmovilizado, se emplean diversos medios atrapantes, tales como Vidrio, Slica gel, Bentonita, Almina, Celulosa, Almidones, Agarosa, Carragenina, Colgeno, Poliacrilamida, Nylon o Alcohol polivinilico. Dentro de las ventajas que se ofrecen estn la fcil recuperacin de las enzimas, lo que permite su reutilizacin, la posibilidad de generar procesos continuos y un mejor control de las enzimas. Ciertas desventajas tambin se dan, bsicamente por la inhibicin de los grupos activos de la

enzima dentro del soporte o la alteracin de la estabilidad de la enzima, ocasionada por el mismo soporte.

Un ejemplo de usos de las enzimas puede ser el siguiente dado en Rusia en los ltimos aos(5): desarrollo de enzimas blanqueadoras y celulolticas para la industria papelera, enzimas destructoras de pesticidas, proteinazas en terapias cardiovasculares.

El Diseo

Los sistemas enzimticos pueden modificarse actualmente. En los ltimos el concepto de ingeniera de enzimas (enzyme engineering) es muy comn, y ampliamente utilizado. Consiste bsicamente en la modificacin de enzimas, acrecentando sus capacidades catalticas, modificando sus estructuras con el fin de hacerlas mas productivas o mas controlables. Se define como la mutacin de protenas, cuyo fin es esencialmente modificar la actividad de la enzima, su pH ptimo o su estabilidad (6). Con este fin, se cambian secuencias de la enzima, pasando desde un solo aminocido hasta una secuencia completa.

El diseo especfico de enzimas abre nuevas es infinitas posibilidades. Permitira fcilmente obtener enzimas que virtualmente sean capaces de realizar cualquier tipo de proceso que se realice por va qumica. Podran perfectamente crearse sistemas enzimticos capaces de degradar polmeros cuya estructura no permita anteriormente su degradacin.

Variados desarrollos se han dado con el diseo especfico de enzimas, y entre ellos pueden mencionarse los siguientes:

y y

Desarrollo de enzimas capaces de degradar sulfuros en los combustibles fsiles a mayor velocidad. (8) Enzimas semisintticas con mejores propiedades que sus madres, empleando modificaciones meramente qumicas, tales como cambios en los centros catalticos. (9) Desarrollo de Enzimas termoestables, especialmente amilasas, aunque tambin otras como glucanasas y oxidasas (10)

Un nuevo futuro La ingeniera de enzimas ha ampliado sus limites, pasando de la mera separacin de las mismas a partir de biomasa hasta el diseo cuidadoso y minucioso de enzimas con

propiedades muy diversas, ya sea por mtodos de mutagnesis o diseos milimtricos. En el futuro, ser posible obtener enzimas cuyas caractersticas permitan el reemplazo de procesos qumicos convencionales por procesos biotecnolgicos, con enzimas adaptadas para resistir altas temperaturas, niveles de acidez o basicidad altos o incluso sistemas no acuosos que, en la actualidad, inactiva completamente la enzima.

V. METODOS GENERALES PARA LA OBTENCIN INDUSTRIAL DE ENZIMAS

1. Durante siglos las enzimas fueron utilizadas, formando parte de clulas o extractos crudos de materiales vegetales, animales y microbianos. As sucedi en forma totalmente emprica, sin conocerse su modo de accin, ni el porqu de su actividad cataltica en la industria de la fermentacin como en la cerveza, vino, pan y queso. An suele emplearse una enzima til producida por una bacteria, una levadura o un trozo de tejido, sin siquiera extraerla de las clulas. Por ejemplo, el Acetobacter aceti puede servir para oxidar el alcohol y convertirlo en cido actico sin purificar antes la oxidasa del alcohol. La levadura fermenta el azcar y lo convierte en alcohol sin que se efecte la extraccin del complejo cimasa; las muchas otras enzimas que contiene la levadura no estorban la reaccin, a causa de que tienen otras actividades especificas. 1.1. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria alimentara, de mtodos de aislamiento y purificacin y el diseo de reactores enzimticos, que permiten su aplicacin en diversos procesos, ha evolucionado en forma considerable y ha dado origen a un rea interdisciplinaria conocida hoy da como "ingeniera enzimtica", como nuevo enfoque de la biotecnologa (13, 15). Hoy se ha logrado obtener enzimas ms puras, que tienen las siguientes ventajas sobre los productos de fermentacin: - accin ms especifica en su funcin cataltica; - actividad predecible y controlable, y - es posible utilizar concentraciones ms elevadas del substrato. 1.2. Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de alimentos son de diferente origen: a) Vegetal: Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya, ricino y frutas ctricas; del germen de trigo se extrae la alfa-amilasa. Las proteasas se obtienen de la papaya, del higo, de la pia y la peroxidasa, del rbano picante; b) Animal: La renina, pepsina, tripsina, quimotripsina, catalasa y lipasa pancretica son de origen animal; c) Microbiano: Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus, orycae y niger y del Bacillus subtilis han demostrado ser de gran uso en la industria alimentara. 2. ELABORACIN DE ENZIMAS (19). 2.1. Elaboracin de enzimas de origen animal o vegetal. Si se trata de enzimas de origen animal la simple trituracin de algunos tejidos especializados, como el pncreas o el hgado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuacin con un solvente adecuado como agua, acetona fra

(-20C ), glicerina o una solucin salina. En forma parecida se procede con los tejidos vegetales, previamente sometidos a trituracin o disrupcin (rotura). Tambin puede partirse de los jugos de expresin de los respectivos tejidos, cuya estructura celular se destruye por autolisis, plasmolisis (18) o por congelacin, la cual revienta las paredes celulares. 2.2. Elaboracin de enzimas de origen microbiano (16,17). Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos por aquellas que resultan de la aplicacin de cultivos de microorganismos seleccionados, que generan la enzima especifica. La produccin de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 das en el caso de una fermentacin discontinua por lotes ("batch"). Adems, se puede incrementar el rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por va gentica cepas mutantes, en las cuales la produccin de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa original (15,74). De este modo procesos de seleccin, adaptacin y mutacin han mejorado considerablemente la produccin de enzimas a partir de microorganismos. Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las clulas microbianas para su extraccin como es necesario en las enzimas intracelulares de biosntesis. 2.3. La elaboracin de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas: 2.3.1. Seleccin de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization Research Branch o de otro organismo o instituto reconocido. 2.3.2. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como medio de cultivo varan naturalmente segn la enzima por elaborar y pueden ser de los siguientes orgenes (10) a) Materias azucaradas o amilceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y afrechos de trigo, arroz o maz; b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, casena, gelatina y afrechos de extraccin de semillas oleaginosas; c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea; d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados de levadura, sales minerales con inclusin de elementos trazas y eventualmente vitaminas. Fuera de la composicin del medio constituyen parmetros importantes que deben controlarse en el cultivo, las condiciones ptimas del caso, en cuanto a temperatura, pH, aereacin (para suministrar el oxgeno necesario y evitar exceso de calor de reaccin), y velocidad de agitacin. En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentacin se distingue entre los cultivos en superficie de medios lquidos o semislidos, usndose ya sea sartenes o tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente ms usados, mediante tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partculas suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulacin) (10, 17). 2.3.3. Terminada la incubacin del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con el resto de las clulas y los componentes slidos del medio de cultivo por filtracin o centrifugacin. El liquido

resultante, generalmente an bastante heterogneo, puede utilizarse directamente como preparado enzimtico; Pero, generalmente, se somete a una purificacin y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal.

3. PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.

3.1. Sin perjuicio que un preparado enzimtico puede consistir en el mismo extracto o caldo fermentado que slo se somete a una clarificacin y concentracin (preparado liquido) o desecacin (preparado slido) se recurre tambin a mtodos de aislamiento y purificacin de enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos: 3.2. Adsorcin selectiva con hidrxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas las protenas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o solucin salina y luego s eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solucin salina, por ejemplo, de fosfato. 3.3. Por precipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a cierto pH y a elevada concentracin inica o por solventes orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal ms usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad de la solucin. 3.4. Dilisis por gradientes de concentracin a travs de membranas semipermeables. 3.5. Ultrafiltracin por aspiracin o presin a travs de membranas de porosidad fina como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura (15). 3.6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidn, agar o dextrano. 3.7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna con intercambiadores inicos, geles o tamices moleculares. Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensin, cataforesis y electrodilisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas. 4. El control de todas estas etapas en su forma ms rigurosa, es necesario para asegurar el mximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimticos obtenidos. 5. ENZIMAS INMOVILIZADAS (1, 20, 21). El enorme nmero de reacciones catalizadas por enzimas y la especificidad de las enzimas individuales significa que stas son potencialmente de gran valor industrial. Sin embargo, su costo se agudiza al aplicarlas como reactivos en forma soluble, pues se produce su prdida, una vez utilizadas. Aunque la enzima por regenerarse en el proceso podra usarse muchas veces, su separacin a partir de la mezcla de reaccin no es econmicamente factible. De all que ha significado un avance importante la posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes inertes, reteniendo as gran parte de su actividad cataltica original. Como las reacciones enzimticas se

desarrollan en medio acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua, pero tan hidrfila que garantice un buen contacto con el medio de la reaccin. Su aplicacin se basa en sus interesantes propiedades: a) Son trmicamente ms estables que las enzimas nativas y ms resistentes a la autolisis; b) Al final de una reaccin catalizada enzimticamente, la enzima enlazada puede separarse por simple centrifugacin o filtracin, sin necesidad de agregar un reactivo de inactivacin o precipitacin; c) Una vez recuperada, la enzima enlazada puede volver a usarse las veces que se desea, sin prdida sustancial de actividad despus de un simple lavado con soluciones tampones acuosas y permitiendo realizar as procesos enzimticos continuos. Por lo tanto, se usan tambin para aislar y purificar enzimas, al separarlas de inhibidores especficos. 5.1. Los mtodos para la inmovilizacin de enzimas comprenden las siguientes tcnicas (l, 20) a) Por adsorcin de la protena enzimtica por la superficie de una matriz de soporte como silicagel, carbn, aluminio, vidrio poroso o poliaminas. La unin es relativamente dbil, pudiendo destruirse por cambios en el pH, la temperatura o la concentracin inica; pero puede estabilizarse si la enzima ya adsorbida se somete a un entramado con glutaraldehdo (vase bajo d) como lo es un soporte de resina a base de fenol y formaldehdo luego entramada con aldehdo glutrico (72). b) Por enlace inico en que la molcula de la enzima, cargada electrostticamente es de carcter polianinico o policatinico. Tambin aqu la unin es relativamente dbil, pues la carga de la protena enzimtica es pequea en relacin a su masa; sin embargo, puede intensificarse al asociarla a una adsorcin. c) Por enlace covalente entre la enzima y el soporte insoluble a travs de los diferentes grupos funcionales, capaces de reaccionar, de las enzimas, como , -COOH, -SH, y -OH. Portadores pueden ser sustancias inorgnicas, como silicagel, caoln, apatita, vidrio poroso, aluminio, hierro; orgnicas, como celulosa, almidn, dextrano, colgeno, agar y, especialmente, polmeros como de la carboximetil-celulosa, succinil-amino-hexil-celulosa, anhdrido maleico entramado, poliamidas, poliuretanos y poliacrilaminas. Este enlace es bastante estable y puede realizarse a veces en forma directa con el soporte, despus de una eventual modificacin de grupos funcionales, capaces de reaccionar con la enzima, o bien se intercala todava entre la enzima y el portador una molcula intermedia ("spacer") para que la enzima mantenga mayor movilidad y con ello una mayor actividad cataltica. As, en el caso de la carboximetil-celulosa transformada en su azida para su pre-activacin, forma unin covalente por un enlace amida entre el soporte y el grupo epsilon de la lisina contenida en el polipptido de la enzima o el grupo amino libre de un aminocido terminal. En el caso del anhdrido maleico entramado, la unin covalente de la enzima se produce por aminolisis del grupo anhdrido sin preactivacin. d) Por entramado transversal (cross-linking), una forma especial de enlace covalente en que las molculas enzimticas se enlazan entre si mediante reactivos bi- o polifuncionales, como el dialdehdo glutrico, di-isotiocianato o cido disulfnico. Su inconveniente es el difcil contacto del substrato con la molcula enzimtica, situada en el interior del polmero macromolecular resultante. Tambin suele asociarse una adsorcin con un enlace covalente y un entramado.

e) Por recubrimiento en que las enzimas mismas no se inmovilizan, sino que se limita su espacio de reaccin, recubrindolas con una membrana polmera, natural o sinttica, que sea semipermeable; es decir, permeable para el substrato y el producto de la reaccin, pero impermeable para las molculas enzimticas. El recubrimiento puede suceder por una envoltura con una matriz, por ejemplo, de , una separacin por ultrafiltro o por una inclusin de la enzima en microcpsulas, permeables al substrato, de bajo peso molecular (73). Factores como dimetro de poro del soporte de adsorcin y carga del soporte y del substrato son parmetros que influyen, segn el procedimiento elegido, en la cintica de las enzimas inmovilizadas. 5.2. La enzima as inmovilizada presenta las ventajas de un catalizador slido y es separada fcilmente de la mezcla de reaccin. En algunos casos, especialmente cuando la matriz de soporte es de carcter inico, las propiedades de la enzima inmovilizada pueden ser diferentes de aquellas que presenta la forma soluble. No cabe duda que estas tcnicas de inmovilizacin de enzimas, iniciadas a comienzos de la dcada del 60, conducirn a exitosos procesos industriales en el campo de la catlisis industrial por enzimas. Una de las posibilidades ms prometedoras en esta rea es la de crear sistemas multienzimticos inmovilizados al unir ms de un tipo de enzima en la matriz, como glucoamilasa y glucosa-isomerasa para transformar almidn en fructosa. Es interesante hacer notar, al respecto, que en la naturaleza las endoenzimas, es decir aquellas que operan dentro de las clulas, estn habitualmente inmovilizadas por fijacin sobre membranas o sobre partculas slidas en suspensin (20). La lactasa fngica para desdoblar la lactosa de leche y suero y la glucosa isomerasa para la obtencin de fructosa, son buenos ejemplos del empleo actual de enzimas inmovilizadas en tecnologa de alimentos.

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/par te04/01.html

BIOTECNOLOGA ENZIMTICA Y BIOTRANSFORMACIONES DE INTERS INDUSTRIAL

Descripcin:

Las enzimas, como catalizadores biolgicos, poseen una serie de caractersticas muy interesantes para la Industria: tienen una elevada especificidad, trabajan en condiciones suaves, son fcilmente accesibles y no alteran el medio ambiente. Por todas estas razones, estos biocatalizadores se estn utilizando en la industria alimentaria, de detergentes, productos qumicos, farmacuticos y de diagnstico. En muchos casos, los procesos enzimticos han demostrado ser muy competitivos y eficaces a gran escala. Nuestra tecnologa ofrece la posibilidad de realizar una biotransformacin con el objetivo de obtener el producto que interesara al cliente.

Cmo funciona?:

Fig. 1: proceso de obtencin de enzimas

Las enzimas se obtienen de microorganismos (bacterias, hongos o levaduras) seleccionados por screening y, posteriormente, cultivados por fermentacin (en matraz o reactor). A partir de los caldos de cultivo se procede a la purificacin de la enzima que cataliza la reaccin de inters. La purificacin se lleva a cabo mediante tcnicas cromatogrficas y se utilizan tcnicas de concentracin. Una vez purificada, se procede a su caracterizacin estructural mediante tcnicas electroforticas, MALDI-TOF, ultracentrifugacin analtica, estudios de espectroscopa. La caracterizacin funcional se realiza mediante estudios de estabilidad y actividad frente al pH y la temperatura, as como estudios de especificidad de sustrato y determinacin de los mecanismos cintico y qumico y de estabilidad en las condiciones de trabajo. Los datos obtenidos permiten abordar estudios de ingeniera de protenas mediante tcnicas de mutagnesis dirigida, con vistas a su utilizacin industrial en biorreactores enzimticos. Por otra parte, se procede al aislamiento, clonacin y secuenciacin del gen que codifica la enzima, lo que permite su obtencin en grandes cantidades as como llevar a cabo estudios de ingeniera de protenas. Si la clonacin e hiperexpresin en Escherichia coli falla por peculiaridades del genoma o

necesidad de procesamientos postraduccionales, se utilizan otros sistemas de clonacin y expresin puestos a punto en nuestro laboratorio, disponemos de sistemas de clonacin y expresin en Streptomyces lividans y Pichia pastoris. Tanto la enzima salvaje como la enzima clonada y los posibles mutantes con propiedades notablemente mejoradas se inmovilizan para su posterior recuperacin y reutilizacin en el proceso. La inmovilizacin se lleva a cabo mediante diferentes metodologas adaptadas al proceso industrial: atrapamiento en geles, microencapsulacin, reticulado con reactivos bifuncionales, adsorcin y unin covalente a soportes inorgnicos u orgnicos. A continuacin se procede a la optimizacin del proceso de inmovilizacin con el fin de obtener un biocatalizador de aplicacin industrial. Por ltimo se determinan las condiciones ptimas del proceso biocatalizado: determinacin del pH y temperatura ptimas, estabilidad frente a pH y temperatura, determinacin de parmetros cinticos y reutilizacin en reacciones sucesivas.
Ventajas:

Mediante los sistemas de expresin desarrollados se puede obtener cualquier enzima de inters industrial y/o farmacolgico en grandes cantidades, con lo que los costes del proceso se abaratan. La novedad radica en la disposicin de sistemas no convencionales de clonacin y expresin que permiten producir enzimas y otras molculas que no se pueden obtener utilizando E. coli, como es el caso de las producidas por Actinomicetos, microorganismos fuente de una gran variedad de compuestos de inters industrial y/o farmacolgico. La inmovilizacin es una tecnologa que permite la obtencin de derivados enzimticos ms estables que la enzima en solucin, y que pueden ser reutilizados varias veces. Tambin permiten el diseo de reactores de fcil manejo y control. La novedad es la utilizacin de soportes activados que permiten la inmovilizacin covalente multipuntual de las enzimas, lo que supone un incremento muy notable de su estabilidad, as como el mantenimiento de la actividad tras sucesivos ciclos puesto que no se produce su desorcin. Las enzimas son biocatalizadores muy especficos, presentan una elevada actividad cataltica y actan a temperaturas moderadas y presin atmosfrica. Adems, las reacciones en medios orgnicos presentan numerosas ventajas frente a los medios acuosos: aumentan la solubilidad de algunos reactivos, los productos se pueden aislar con mayor facilidad, la estabilidad enzimtica puede estar incrementada, no hay contaminacin bacteriana, etc. El poder producir enzimas en gran cantidad y disponer de ellas en una forma estable y reutilizable reducira los costes de produccin de cualquier proceso, que al utilizar estos biocatalizadores no generara las sustancias qumicas contaminantes que suelen acompaar a los procesos qumicos. Esto no slo abaratara los costes de produccin por no tener que aplicar mtodos de descontaminacin, sino que adems el proceso en s mismo supone una mejora medioambiental.

Dnde se ha desarrollado?:

Esta tecnologa se desarrolla en el Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular I de la Facultad de Ciencias Biolgicas. El equipo investigador posee una amplia experiencia en las metodologas descritas y ha trabajado con diferentes enzimas (celulasas, lipasas, D-aminocido oxidasa, penicilin acilasas) de aplicacin industrial. La investigacin del grupo tiene como objetivo las enzimas implicadas en procesos industriales.
Y adems:

Se buscan empresas de la industria alimentaria, de detergentes, productos qumicos, farmacuticos y de diagnstico que deseen obtener grandes cantidades de un biocatalizador concreto en biorreactores enzimticos, en un proceso de bajo coste econmico. El grupo de investigacin de Biotecnologa Enzimtica de la UCM ofrece su experiencia y sus conocimientos para realizar un estudio completo y optimizar enzimas de inters industrial: produccin, aislamiento, purificacin y caracterizacin de las enzimas a partir de microorganismos productores; aislamiento, clonacin y secuenciacin de los genes que las codifican; hiperexpresin en microorganismos hospedadores; ingeniera de protenas e inmovilizacin de las enzimas y optimizacin de las condiciones de trabajo en biorreactores enzimticos. El grupo puede desarrollar cualquier enzima para empresas interesadas en obtener biocatalizadores para cualquier campo de aplicacin.
http://www.ucm.es/info/otri/complutecno/fichas/tec_cacebal1.htm

TECNOLOGIA ENZIMATICA 9.1 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria qumica. Son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presin, pH, etc. Son catalizadores muy especficos: pueden modificar un nico substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos ismeros de una mezcla racmica de un compuesto quiral, Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un nico enlace o un nico grupo funcional en una molculas que tenga varias posiciones modificables. A pesar de esas excelentes propiedades catalticas, las enzimas han ido evolucionando a travs de los siglos para cumplir mejor las necesidades fisiolgicas de los seres vivos y no

para ser utilizadas en sistemas qumicos industriales. As, las enzimas son catalizadores solubles, generalmente muy inestables y que sufren inhibiciones por substratos y productos. Adems, las enzimas muchas veces no poseen todas las propiedades ideales (actividad, selectividad, etc) cuando queremos que catalicen procesos distintos de los naturales (por sntesis en lugar de hidrlisis), sobre substratos no naturales, en condiciones experimentales no convencionales (en disolventes orgnicos no-txicos). 9.2 TECNOLOGIA ENZIMATICA MODERNA A mediados de los aos 50, la tecnologa de las enzimas vivi su poca de gran esplendor, creciendo a un ritmo desenfrenado. El progreso de la bioqumica ha derivado en una mejor comprensin de la gran variedad de enzimas presentes en las clulas vivas, as como un mejor conocimiento acerca de su modo de accin. Por ejemplo, su eficacia se puede aumentar extrayndolas de los microorganismos y mantenindolas aisladas. Las enzimas purificadas a travs de este sistema no pierden sus propiedades; al contrario, estas preparaciones "sin clulas" devienen incluso ms eficaces. "A comienzos de 1970 la tecnologa enzimtico comenzaba a entrar en periodo de desarrollo industrial, dirigido a la produccin de aminocidos y azcares a partir de glucosa isomerizada. En aquel momento, los mercados Europeos y Americanos se encontraban dominados por la comercializacin de las enzimas proteolticas utilizadas en la industria de los detergentes, pero existian grandes expectativas sobre el mercado de enzimas aplicadas a la industria alimentara, al cual se le auguraba un crecimiento importante (Dunnill, 1980; Lewis y Kristiansen, 1985). En 1981 el mercado mundial del azcar se valor en 200 millones de dlares y en 1985 la oficina de Valores Tecnolgicos de USA lo cifraban en 250 millones. La interpretacin mas clara es el mercado para las enzimas utilizadas en la industria ha crecido espectacularmente a lo largo de los aos 1970, y que este crecimiento ha sido paralelo al desarrollo de un gran nmero de aplicaciones a la industria alimentara. Se puede esperar en el futuro que el mercado experimente un aumento cuando las enzimas comiencen a utilizarse en procesos de produccin de la industria qumica."(1) En poca ms reciente se ha visto que puede utilizarse diversos tejidos vegetales y homogenados tisulares, obtenidos de distintas fuentes, como alternativas a las clulas microbianas y a las enzimas purificadas. Por consiguiente, la conclusin evidente es que existen una serie de preparaciones biocatalticas para resolver una situacin concreta, entre las cuales debe realizarse una eleccin. Por tanto, es conveniente considerar los criterios que debe manejarse en la eleccin del biocatalizador. 9.3 INDUSTRIAS TRADICONALES Y ENZIMAS ASOCIADAS Las aplicaciones industriales tradicionales se refieren a la produccin de una transformacin til por alguna enzima, bien sea natural o aadida intencionalmente. Entre las que podemos citar:

Fermentacin.- "La fermentacin alcohlica es un ejemplo conocido de los procedimientos en que se efectan alteraciones enzimticas, tanto cuando se agrega alguna enzima como cuando se aade algn microbio vivo (levadura). Primero se calienta el grano amilceo para gelatinizar el almidn, y luego se aade malta ( que contienen enzimas diastsicas) para convertir el almidn en azcar fermentable (maltosa). Si el producto que se desea obtener es alcohol, se agrega entonces levadura. El empleo de amilasa en forma de malta es indudablemente la mayor aplicacin industrial que tiene las enzimas, pero no es del todo conocida la accin de estas amilasas. La elaboracin de vinagre con alcoholes es un proceso enzmico producido por un microbio vivo (Acetobacter aceti). Como el alcohol es oxidado y convertido en cido actico con oxgeno de la atmsfera. Aislada de las bacterias, la enzima cataliza igualmente la oxidacin, pero es mucho ms econmico valerse de la clula viva intacta."(2)

Curticin.-" Primero se quitan a las pieles el pelo y el exceso de carne y luego se ponen en remojo para que se hinchen y se vuelvan ms o menos porosas y permeables a las sustancias curtientes. El primer remojo se ha efectuado siempre mediante la accin enzimtica. Cuando se observ que la hinchazn era producida parcial o totalmente por enzimas protealtina impura. La cantidad de material enzimtico que se usa en la industria de curtidura representa probablemente la mayor aplicacin industrial de las enzimas despus de la industria de fermentacin."(3)

Fabricacin de queso.- "La operacin ms importante en la fabricacin de queso es la coagulacin de la casena de la leche, que luego se trata para convertirla en queso. Se puede coagular la casena mediante la adicin de cido o de enzimas quesos se fabrica coagulada la casena con rennina, esta probablemente tiene una accin proteoltica muy dbil que continua en el queso. La rennina produce un cogulo elstico del que se exprime fcilmente el suero. No es la nica portenasa que se usa en la elaboracin del queso, pues tambin se emplea mezclas de rennina con pepsina. Asimismo se ha usado la papana, y en este caso al parecer se asegura la protelisis durante el aejamiento del queso. En los pases balcnicos se emplea jugo de higos ( que contiene gran proporcin de enzimas proteolticas ficina). Para preparar el cogulo. La diferentes enzimas coagulantes hacen variar notablemente la naturaleza del queso."(4) Elaboracin de pan.- An se discute el papel que desempean en la fabricacin del pan las enzimas que se hallan en la harina. La harina cruda contiene cantidad relativamente pequea de muchas enzimas, incluso una protena del tipo de la papana, que segn creen algunos reblandece la masa. Al igual que todas las enzimas del tipo de la papana, la proteinasa de la harina es inactivada por la oxidacin. La harina de trigo contiene tambin pequeas cantidad de -amilasaE y gran proporcin de -amilasaF -amilasa. La adicinE amilasa a la harina, generalmente en forma de harina de trigoEde la malteado, ocasiona aumento de volumen de la hogaza. La amilasa agregada hidroliza parte del almidn y lo convierte en maltosa, con lo cual suministra mas azcar para que fermente la levadura y origina la generacin de mayor cantidad de dixido de carbono-amilasa que yaF. La existe

en la harina coopera probablemente en el proceso mediante la desintegracin amilasa.Ede las dextrinas formadas por la
y

"Proteinasas.- Son sustratos de las poteinasa todas las protenas excepto las queratinaass. La hidrlisis es ordinariamente muy lenta. Las proteinasas desintegran tambin pptidos sencillos, pero de ordinario con mucha lentitud. Los productos superiores de degradacin de las protenas son descompuestos rpidamente. Los aminocidos pueden ser liberados por accin proteoltica. Renina.- Se halla en el cuarto estmago de las terneras. Su accin proteoltica, si la tiene, es muy dbil. Es un poderoso agente coagulador de la leche ( pH ptimo aproximadamente 5.4) Papana.- Se halla en el ltex del fruto verde de la papaya. Es tpica de muchas enzimas vegetales como la ficina de la leche de higuern, la asclepana del vencetsigo y la bromelina del anans. Una de sus caractersticas es su contenido de grupos SH, de que parece depender la actividad de la enzima. Por oxidacin ligera se vuelve inactiva, pero es reactivada por agentes reductores, como la cistena, HCN y otros, incluso los grupos SH en las protenas que estn siendo digeridas por las enzimas parcialmente activas. La papana es relativamente resistentee con el calor, y empleada a temperaturas de 50 a 60C, es muy rpida la protelisis. La enzima coagula fcilmente la leche. Los microorganismos vivos son atacados rara vez por las proteinasas, pero la papana ataca ciertos parsitos intestinales (scaris) vivos. Descompone la hipurilamida con desprendimiento de amoniaco. Carbohidrasas.- Descomponen residuos de azcares de carbohidratos superiores. -AmilasaE.- Se hallan en las glndulas salivales, el pncreas, hongos, bacterias y la malta, que las contienen en abundancia. Descomponen los almidones y el glucgeno en dextrinas y disocian lentamente las dextrinas en maltosa y cantidad mnima de glucosa. Destruyen la estructura en cadenas ramificada del almidn (amilo pectina) y el glucgeno. Con el tempo pueden efectuar la destruccin casi total del almidn. -amilasa de malta requiere calcio y puede ser una protenaELa -amilasa animal necesita cloruro.Eclcica. La -amilasaF.- Se halla en las plantas superiores, los granos la producen en abundancia. La enzima de los granos descomponen totalmente la amilasa y la convierte directamente en maltosa, tambin descompone la amilo pectina ( la porcin de cadena ramificada del almidn) y el glucgeno, pero su accin se detiene donde se ramifica la cadena de hidratos de carbono. Cuando se rompe las cadenas ramificadas -amilasa),Ede hidratos de carbono entre las ramas ( en presencia de -amilasa ataca los fragmentos de cadena recta as formados.Fla De esta manera, las dos enzimas juntas hidrolizan ms rpidamente el almidn que cualquiera de ellas por separado."(5)

y y

9.4 APLICACIONES INDUSTRIALES En relacin con las enzimas, la tecnologa moderna contribuye al ahorro. Por ejemplo, permite la utilizacin del excedente de suero derivado de la fabricacin del queso. La lactosa transforma el azcar del suero en una mezcla de glucosa y galactosa con un sabor ms dulce. As, se refina el producto y se concentra en una especie de jarabe cuyo sabor recuerda el de la miel, con lo que las aplicaciones en el sector de la confitera industrial se

hacen innumerables. Se usan tambin muchos otros tratamientos de las enzimas en la produccin de edulcorantes modernos. Por ejemplo, EE.UU. se puede constatar que el jarabe del almidn de maz tiene un alto contenido en fructosa, razn por la cual ha llegado a eclipsado a la sacarosa. Las enzimas presentan muchsimas aplicaciones. Con los procedimientos modernos de fabricacin de alimentos, benefician tanto a los sectores industriales como a los consumidores. Sus caractersticas especficas permiten a los industriales ejercer un control de calidad ms estricto. Con un menor consumo de energa y unas condiciones de tratamiento ms ligeras, su eficacia favorece el entorno. Pueden utilizarse para tratar los desechos biolgicos resultantes de la fabricacin de alimentos, puesto que las propias enzimas son biodegradables. Mediante una rpida absorcin natural, las enzimas son el tpico ejemplo de "tecnologa verde".

9.4.1 Alimentos La utilizacin emprica de preparaciones enzimticas en la elaboracin de alimentos es muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la elaboracin de quesos desde la prehistoria, mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el zumo de la papaya. Sin embargo, hasta 1897 no qued totalmente demostrado que los efectos asociados a ciertos materiales biolgicos, como el cuajo o las levaduras pudieran individualizarse en una estructura qumica definida, llamada enzima, aislable en principio del organismo vivo global. Desde hace unas dcadas se dispone de enzimas relativamente puros y con una gran variedad de actividades susceptibles de utilizarse en la elaboracin de alimentos. Los progresos que estn realizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de los enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con la actividad deseada aprecios razonables. Los enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de sntesis y degradacin que tienen lugar en ellos. La utilizacin de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas, adems de las de ndole econmica o tecnolgica. La gran especificidad de accin que tienen los enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes ms lbiles del alimento. Desde el punto de vista de la salud, puede considerarse que las acciones enzimticas son, en ltimo extremo, naturales. Adems los enzimas pueden inactivarse fcilmente cuando se considere que ya han realizado su misin, quedando entonces asimilados al resto de las protenas presentes en el alimento. Para garantizar la seguridad de su uso deben tenerse en cuenta no obstante algunas

consideraciones: en aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos no deben ser patgenos ni sintetizar a la vez toxinas, antibiticos, etc. Los microorganismos ideales son aquellos que tienen ya una larga tradicin de uso en los alimentos (levaduras de la industria cervecera, fermentos lcticos, etc.). Adems, tanto los materiales de partida como el procesado y conservacin del producto final deben ser acordes con las prcticas habituales de la industria alimentara por lo que respecta a pureza, ausencia de contaminantes, higiene, etc. Los enzimas utilizados dependen de la industria y del tipo de accin que se desee obtener, siendo ste un campo en franca expansin. A continuacin se mencionan solamente algunos ejemplos.
y

Industrias lcteas

"Como se ha indicado, el cuajo del estmago de los rumiantes es un producto clsico en la elaboracin de quesos, y su empleo est ya citado en la Iliada y en la Odisea. Sin embargo, el cuajo se obtuvo como preparacin enzimtica relativamente pura solo en 1879. Est formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jvenes. Estos enzimas rompen la casena de la leche y producen su coagulacin. Desde los aos sesenta se utilizan tambin otros enzimas con una accin semejante obtenidos a partir de microorganismos o de vegetales. Actualmente empieza a ser importante tambin la lactasa, un enzima que rompe la lactosa, que es el azcar de la leche. Muchas personas no pueden digerir este azcar, por lo que la leche les causa trastornos intestinales. Ya se comercializa leche a la que se le ha aadido el enzima para eliminar la lactosa. "(6)
y

Panadera

En panadera se utiliza la lipoxidasa, simultneamente como blanqueante de la harina y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la que se aade es usualmente como harina de soja o de otras leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la accin de la levadura, se aade amilasa, normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos pases se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la adicin de malta altera algo el color del pan. La utilizacin de agentes qumicos para el blanqueado de la harina est prohibida en Espaa. A veces se utilizan tambin proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este tratamiento es importante en la fabricacin de bizcochos.
y

Cervecera

A principios de este siglo (1911) se patent la utilizacin de la papana para fragmentar las protenas presentes en la cerveza y evitar que sta se enturbie durante el almacenamiento o la refrigeracin, y este mtodo todava se sigue utilizando. Este enzima se obtiene de la papaya. Un enzima semejante, la bromelana, se obtiene de la pia tropical.

Un proceso fundamental de la fabricacin de la cerveza, la rotura del almidn para formar azcares sencillos que luego sern fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en la malta, que pueden aadirse procedentes de fuentes externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta permita transformar aun ms almidn del que contiene. Cuando esto es as, las industrias cerveceras aaden almidn de patata o de arroz para aprovechar al mximo la actividad enzimtica. - Fabricacin de zumos A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean turbios y demasiado viscosos, producindose tambin ocasionalmente problemas en la extraccin y en su eventual concentracin. Esto es debido a la presencia de pectinas (Vase pgina...), que pueden destruirse por la accin de enzimas presentes en el propio zumo o bien por enzimas aadidas obtenidas de fuentes externas. Esta destruccin requiere la actuacin de varios enzimas distintos, uno de los cuales produce metanol, que es txico, aunque la cantidad producida no llegue a ser preocupante para la salud.
y

Fabricacin de glucosa y fructosa a partir del maz

Una industria en franca expansin es la obtencin de jarabes de glucosa o fructosa a partir de almidn de maz. Estos jarabes se utilizan en la elaboracin de bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostera, etc. en lugar del azcar de caa o de remolacha. La forma antigua de obtener estos jarabes, por hidrlisis del almidn con un cido, ha sido prcticamente desplazada en los ltimos 15 aos por la hidrlisis enizmtica, que permite obtener un jarabe de glucosa de mucha mayor calidad y a un costo muy competitivo. De hecho, la CE ha limitado severamente la produccin de estos jarabes para evitar el hundimiento de la industria azucarera clsica. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro azcar ms dulce, utilizando el enzima glucosa-someraza, usualmente inmovilizado en un soporte slido.
y

Refinado de azcar

"La extraccin de la sacarosa, a partir de la melaza de la remolacha azucarera puede complicarse por la presencia de rafinosa, un trisacrido que previene la cristalizacin. Para incrementar la recuperacin del azcar y mejorar el proceso, la rafinosa puede degradarse enzimticamente. El resultado de esta degradacin es doble; por un lado favorece la cristalizacin y, adems, produce -galactosidaEsacarosa como uno de los productos de la hidrlisis. La enzima es producida por el hongo Morteirella vinaceae raffinosutilizer y puede ser empleada convenientemente para inmovilizar los residuos micelares que producen este organismo. La reaccin hidroltica se efecta a pH superior a 5 para evitar la inversin de la sacarosa catalizada por el medio cido. Algunas veces, se requiere un tratamiento similar en el proceso de obtencin a partir de la caa de azcar, donde el almidn es hidrolizado antes de la cristalizacin mediante -amilasa."(7)Eel uso de

Otras aplicaciones

Los enzimas se utilizan en la industria alimentara de muchas otras formas, en aplicaciones menos importantes que las citadas anteriormente. Por ejemplo, en la fabricacin de productos derivados de huevos, las trazas de glucosa presentes, que podran oscurecerlos, se eliminan con la accin combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y la catalasa. Por otra parte, la papana y bromelana, enzimas que rompen las protenas, se pueden utilizar, fundamentalmente durante el cocinado domstico, para ablandar la carne. Algunas enzimas, como la lactoperoxidasa, podran utilizarse en la conservacin de productos lcteos. 9.4.2 Detergentes Entre otros aditivos importantes que se encuentran en los detergentes estn las enzimas, los cuales por lo general son sustancias de naturaleza protenica, que se encargan de catalizar las reacciones en los seres vivos. La tecnologa de enzimas en los detergentes se desarroll a partir de la dcada de los aos 60, como una herramienta ms de stos para atacar ciertos sustratos (generalmente proticos) especficos. Las ms comunes son las llamadas proteasas, las cuales degradan restos de protenas; y las lipasas que pueden atacar restos de sustratos lpidos que son los que comnmente se adhieren a la ropa y a ellas se les adhieren el resto de la suciedad como polvo, restos de otros compuestos orgnicos etctera. Los detergentes que contienen enzimas se les llama detergentes biolgicos.

Efectos de enzimas activas Como se mencion anteriormente, algunos detergentes contienen enzimas, las cuales atacan sustratos orgnicos especficos. El problema se presenta al usar exceso de estos detergentes, con lo cual se desechan enzimas activas al drenaje, las cuales al llegar a los cuerpos de agua provocarn daos en los seres vivos presentes en stos, por accin directa sobre ellos o sobre los nutrientes que componen su dieta alimenticia. Otros efectos. Entre otros efectos secundarios producidos por los detergentes es que afectan procesos de tratamiento de las aguas residuales, por ejemplo: cambios en la demanda bioqumica de oxgeno y en los slidos suspendidos, efectos corrosivos en algunas partes mecnicas de las plantas, interferencias en el proceso de cloracin y en la determinacin de oxgeno disuelto y algunos aditivos en los detergentes pueden intervenir en la formacin de flculos (agrupaciones de partculas suspendidas). 9.4.3 Energa

Otra actividad que llama a las aplicaciones biotecnolgicas es la produccin de energa, siendo la ventaja de las fuentes orgnicas con respecto a los combustibles fsiles el que las primeras sean renovables. Cada ao crecen unas 200 mil millones de toneladas de biomasa (madera, cereales, etc), de las cuales los humanos usamos slo un 3%. Por lo tanto, este rubro ofrece un enorme potencial que puede ser aprovechado. Un ejemplo clsico de biocombustible es el alcohol obtenido por fermentacin de material rico en azcares y almidn, o de residuos orgnicos varios, incluyendo los forestales. El principal obstculo para la viabilidad de esta propuesta es el costo, puesto que el petrleo sigue siendo ms barato. Sin embargo, los avances tecnolgicos estn permitiendo acortar la brecha. Hay tambin diversos sectores de la industria en los que la adaptacin o sustitucin de procesos qumicos o fsico-qumicos por otros de base biolgica puede contribuir al desarrollo sustentable. Beneficios concretos a escala industrial ya se observan con la introduccin de enzimas en la produccin de celulosa, de textiles y del cuero, entre otros. " 9.4.4 Tratamiento de desechos "Pero es el tratamiento de desechos donde la biotecnologa puede tener un mayor impacto a nivel mundial. Los Estados Unidos gastan US$ 40 mil millones al ao para combatir la polucin que generan los 600 millones de toneladas de desechos industriales. Bacterias, microalgas, levaduras, hongos y plantas han mostrado una notable eficiencia para metabolizar residuos orgnicos, xenobiticos y metales pesados (biorremediacin y fitorremediacin), reduciendo hasta 20 veces el costo involucrado en la incineracin de dichos residuos. Por otra parte, se han hecho grandes avances en el tratamiento de derrames de petrleo con microorganismos. En fin, hay muchas otras reas suceptibles de ser abordadas exitosamente mediante el empleo de diversas biotecnologas. Sin embargo, a pesar de los promisorios resultados obtenidos hasta el momento, persisten an varias limitaciones tcnicas y econmicas que requieren ser resueltas. Por ello, la biotecnologa no debe ser vista como una panacea y en cada caso habr que ponderar sus ventajas con respecto a las tecnologas tradicionales. Al considerar las aplicaciones enzimticas en el tratamiento de los residuos, se debe hacer hincapi entre las situaciones donde el residuo de un proceso es el material crudo y los siguientes, por ejemplo, conversin de almidones, y procesos que ayudan a reducir los costos asociados del tratamiento. Existen un amplio nmero de industrias de procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser posteriormente tratados. La aplicaciones de grupos de enzimas depende de la necesidaddd de hidrolizar polmeros complejos para incrementar su posterior degradacin microbiolgica. Entre los diversos ejemplos se puede incluir el empleo de las lipasas asociadas con cultivos bacterianos para eliminar los depsitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberas que transportan el efluente. Otra enzima degradante de polmeros utilizados de forma similar son las celulosas, proteinasas y amilasas. Una aplicacin particular que puede describirse como tratamiento

de residuos, es el emplio de proteinasas en las preparaciones comerciales de detergentes, denominadas como polvo de lavado biolgico. Adems de estas hidrlisis de materiales polimricos, existen tambin aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos altamente txicos que podran inhibir procesos de tratamiento basado en el empleo microbigico. Un ejemplo especfico es el uso de la peroxidasa de la cola de caballo para iniciar la degradacin de fenoles y aminas aromticas que se presentan en muchas industrias con aguas residuales. "(8) En trminos ms amplio es posible anticipar que los procesos basados en el empleo de organismos construidos genticamente para degradar los compuestos indicados anteriormente, podra representa un proceso mucho ms econmico. 9.4.5 Productos mdicos y farmacuticos Aunque las posibilidades de utilizacin de las enzimas en la medicina y campos relacionados sea potencialmente inmersa, en la actualidad el nmero concreto de aplicaciones es relativamente pequeo. No obstante, los resultados obtenidos con este pequeo nmero de ideas afortunadamente son realmente excitantes y demuestran claramente la capacidad potencial existente en las tcnicas empleadas. Puesto que las aplicaciones mdicas y farmacuticas de las enzimas abarcan un amplio espectro de materias, es conveniente dividirlas en tres reas importantes de inters: terapia enzimtica, uso analtico y productos de compuestos farmaceticos. Cada una de estas reas, auque cubre un gran nmero de aplicaciones, presenta una serie de principios predominantes que son esencialmente para que la utilizacin de las enzimas se realice con xito. A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones mdicas y farmacuticas de las mismas requieren generalmente pequeas cantidades de enzimas muy purificadas. En parte, esto refleja el hecho de que para una enzima sea efectiva slo debe modificarse helelos compuestos de inters contenido en un fluido o tejidos fisiolgicos complejo. Esto contrasta con muchos procesos industriales en los que el medio de cultivo est relativamente bien definido y por, consiguiente, puede utilizarse un extracto enzimtico sin purificar. Adems, si el destino de una enzima o de un producto obtenido por mtodos enzimticos es su administracin a un paciente, resuelta evidente que el preparado debe contener las menores cantidades posibles de material extrao para evitar probables efectos secundarios.
y

Produccin de aminocidos enzimticamente

La produccin de aminocidos mediante tecnologa con enzimas est adaptada convenientemente. Aunque se pueden sintetizar empleando un proceso qumico, se debe sealar que en este caso se obtiene una mezcla de D y L ismeros. Puesto que solamente el L-ismero es biolgicamente activo, la mezcla debe ser separada en sus dos componentes. Este proceso puede llevarse a cabo mediante el empleo de la enzima aminoacilasa. Una vez sintetizado, la mezcla del DL aminocidos se acetila.

En la produccin de otros aminocidos se han incluido tambin una etapa mediada por enzimas, incluyendo a la D-feniglicina, utilizada en la sntesis de penicilina semisinttica, y en el caso del L-triptfano, un aminocido esencial que puede sintetizarse a partir del indol. Estas son dos reas importantes en el desarrollo de esta tecnologa. En trminos de aplicacin a gran escala, la produccin de aminocidos esenciales como suplementos dietticos presenta una importancia particular. Si unas protena celular sencilla queda establecida en los mercados de alimentacin animal y humana, se puede esperar que la demanda para aminocidos esenciales incrementara, ya que muchas protenas microbianas son deficitarias en algunos de estos residuos cruciales.
y

Tratamientos teraputicos con enzimas.-" El fundamento de esta forma de terapia es simplemente la administracin de una enzima concreta a un paciente, esperando con optimismo que produzca una progresiva mejora en el mismo. El problema principal relacionado con este mtodo es que las respuestas defensivas del organismo inactive o eliminen los compuestos extraos incorporados. En consecuencia cualquier tratamiento que utilice la administracin de una enzima, bien por va sangunea o por cualquier otra, debe tener en cuenta este posible inconveniente."(9) Organos artificiale.- "Para sustituir algunas funciones del rin y el hgado se han desarrollado rganos artificiales que contienen enzimas. Una lesin renal crnica se trata con hemodilisis peridica, a menos que sea posible el transplante del rgano. El hgado es un rgano multifuncional y sera imposible conseguir un sustituto artificial con la tecnologa disponible actualmente. Sin embargo, s puede reproducirse una funcin importante del hgado: la desintoxicacin. A partir de clulas hepticas se pueden obtener varias enzimas microsomales capaces de llevar a cabo la desintoxicacin de una gran variedad de compuestos."(10)

Aplicaciones Analticas.- "En la medicina moderna, el anlisis de las distintas muestras fisiolgicas tiene un papel clave y, dentro del mismo el uso de las enzimas(tanto en forma libre como inmovilizadas) constituyen un aspecto muy destacado. Los tipos de aplicacin de las encimas al anlisis se pueden dividir en dos granes grupos. El primero de ellos recije aquellos mtodos que miden directamente un compuesto, mientras que el segundo lo hace con aquellos que utilizan una enzima para amplificar otra respuesta (por ejemplo inmunoencarios con enzimas acopladas)."(11) Antibiticos semi-sintticos.- Las penicilinas semisintticas son los principales productos farmacuticos obtenidos por tecnologa enzimtico. El mtodo de fermentacin tradicional permite producir la bencil-penisilna (penisilina g) como la fenoximetilpenisilina (penisilina b) y en el pasado estos dos antibiticos con gran xito. Sin embargo, estos compuestos presentan limitaciones en su eficacia contra ciertas bacterias patgenas

Esteroides.-" Los esteroides se utilizan en un gran nmero de preparados farmacuticos (por ejemplo la pldora contraceptiva y los antinflamatorios), por lo que los procesos

empleados en la produccin de estas sustancias presentan una considerable importancia econmica."(12)

9.5. FUENTES DE ENZIMAS Las fuentes de enzimas pueden ser de tipo vegetal, animal y microbiana.
y y

Las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las porteasas, carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azcares de carbohidratos superiores, a-amilasas y b-amilasa Entre las enzimas de tipo animal estn las esterasa ( Lipasa se produce en la mucosa gstrica, el pncreas y las semillas de ricino, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales seo, muscular, tripsina y quimotripsina se produce en el pncreas y , pectasas ) Las enzimas del tipo microbiano provienen de. Bacterias, hongos.

9.6. MECANISMO DE BIOSISTESIS DE ENZIMAS La degradacin de compuestos requiere enzimas. Los agentes que afectan a la presencia o actividad de las enzimas afectan tambin al crecimiento de los organismos. Las enzimas constitutivas se producen estn presentes o no los substratos (ej. glicolisis). Las enzimas inducibles slo se producen cuando los substratos estn presentes. El control de enzimas es por medio de actividad o sntesis. Generalmente, el control de actividad de las enzimas es por encendido o apagado de las enzimas y est asociado con enzimas alostricas durante la inhibicin de feedback:V Cuando los productos en una va aumentan, ellos mismos producen feedback a la primera enzima de la va y cierran la sntesis de los productos finales e intermedios.

Vas ramificadas Feedback acumulativo: ni F ni H pueden reducir separadamente por completo la actividad de e1, posiblemente cada uno puede lograr una reduccin parcial pero juntos pueden pararla totalmente.

Feedback secuencial: F y H provocan feedback en e4 y e6 respectivameante provocando la acumulacin de D. D entonces produce feedback sobre e1.

Feedback multivalente: ni F ni H por separadoproducen efecto alguno en e1 pero juntos tienen actividad inhibitoria.

Pero tambin puede darse un control de la sntesis de enzimas a nivel gentico (opern). Induccin El gen regulador sintetiza un represor activo. En ausencia de substrato (inductor), el represor activo se une al operador e impide a la ARN polimerasa unirse al promotor para la transcripcin del mRNA. Si el substrato est presente se une al represor activo que se inactiva y permite la transcripcin del mRNA. Represin del producto final El gen regulador sintetiza un represor inactivo. Si hay poca cantidad de producto final el represor inactivo no se une al operador y permite la transcripcin del mRNA. Si el producto

final es abundante se une al represor inactivo que se activa y ahora el represor activo se une al operador y previene la transcripcin del mRNA.

9.7 MANEJO DE LA BIOSISNTESIS DE ENZIMAS El criterio de viabilidad econmica de un proceso esta estrechamente reacionado con las normas legislativas que rigen tanto par las operaciones que los componen como para la pureza del producto final. Muchas restricciones legales se refieren a materias de seguridad que afectan, por un lado, a la maquinaria utilizada en el proceso y, por otro, a los planes posteriores con el producto. Eientemente a la hora de calcular los costos de un proceso, deben tenerse en cuenta los destinados a cubrir los requisitos legales correspondientes. En el caso de materiales biolgicos existen varias reas que presentan u riesgo potencial de efectos nocivos.
y y y y

Microbiologia Toxicidad qumica Toxicidad relacionada con la actividad de las encimas Reacciones alrgicas

9.7.1 Manipulacin gentica El inters de los explotadores agrcolas y los empresarios del sector alimentario por las cosechas modificadas genticamente se explica debido a todo el potencial econmico y ecolgico que se ha demostrado. Sin duda alguna, la biotecnologa desempea una funcin muy importante en una produccin y preparacin de vveres duradera de cara al futuro. Sin embargo, aunque los especialistas han admitido que la modificacin gentica de las plantas es un mecanismo econmico y ecolgico para la produccin de alimentos, el gran pblico no deja de darle vueltas al tema de la seguridad de los productos. La industria de la biotecnologa es consciente de esta reticencia. Es la razn por la cual favorece hoy el dilogo con las diferentes partes interesadas, en particular sobre las cuestiones siguientes:
y y y

Son seguros los alimentos que contienen organismos modificados genticamente? Los genes introducidos en las plantas pueden trasmitirse al medio ambiente? Es posible que la transferencia de genes de un organismo a otro provoque alergias en el ser humano?

La manipulacin gentica es "la introduccin de genes extraos en una clula"; siendo esta clula generalmente un embrin; o sea el producto del huevo fecundado. Recurdese que se llama "huevo" o "cigoto"; cuando la clula sexual femenina, el vulo, es fecundado por la clula sexual masculina, el espermatozoide. La fecundacin se realiza en el aparato genital femenino, ms especficamente, en las trompas uterinas (en el ser humano, se produce en la parte superior de las trompas). Este nuevo huevo o cigoto no tiene al principio, un solo ncleo, sino dos, uno es el proncleo del espermatozoide, y otro, es el proncleo del vulo que lo conformaron (luego stos se unirn para formar el ncleo del huevo). Dicho huevo se extrae del aparato genital, y fuera del mismo, se le introduce material gentico, que son fragmentos de A.D.N. contenidos en los genes. El lugar especfico donde se realiza esta inoculacin es, en el proncleo masculino del huevo. Al introducir material gentico extrao, se pretende producir nuevos caracteres hereditarios que no estaban en el material gentico original. La ingeniera gentica consiste en la manipulacin del cido desoxirribonucleico, o ADN. En este proceso son muy importantes las llamadas enzimas de restriccin producidas por varias especies bacterianas. Las enzimas de restriccin son capaces de reconocer una secuencia determinada de la cadena de unidades qumicas (bases de nucletidos) que forman la molcula de ADN, y romperla en dicha localizacin. Los fragmentos de ADN as obtenidos se pueden unir utilizando otras enzimas llamadas ligasas. Por lo tanto, las enzimas de restriccin y las ligasas permiten romper y reunir de nuevo los fragmentos de ADN. Tambin son importantes en la manipulacin del ADN los llamados vectores, partes de ADN que se pueden autorreplicar (generar copias de ellos mismos) con independencia del ADN de la clula husped donde crecen. Estos vectores permiten obtener mltiples copias de un fragmento especfico de ADN, lo que hace de ellos un recurso til para producir cantidades suficientes de material con el que trabajar. El proceso de transformacin de un fragmento de ADN en un vector se denomina clonacin, ya que se producen copias mltiples de un fragmento especfico de ADN. Otra forma de obtener muchas copias idnticas de una parte determinada de ADN es la reaccin de la polimerasa en cadena, de reciente descubrimiento. Este mtodo es rpido y evita la clonacin de ADN en un vector. La terapia gnica consiste en la aportacin de un gen funcionante a las clulas que carecen de esta funcin, con el fin de corregir una alteracin gentica o enfermedad adquirida. La terapia gnica se divide en dos categoras. La primera es la alteracin de las clulas germinales, es decir espermatozoides u vulos, lo que origina un cambio permanente de todo el organismo y generaciones posteriores. Esta terapia gnica de la lnea germinal no se considera en los seres humanos por razones ticas. El segundo tipo de terapia gnica, terapia somtica celular, es anloga a un trasplante de rgano. En este caso, uno o ms tejidos especficos son objeto, mediante tratamiento directo o extirpacin del tejido, de la adicin de un gen o genes teraputicos en el laboratorio, junto a la reposicin de las clulas tratadas en el paciente. Se han iniciado diversos ensayos clnicos de terapia gentica somtica celular destinados al tratamiento de cnceres o enfermedades sanguneas, hepticas, o pulmonares. La ingeniera gentica tiene un gran potencial. Por ejemplo, el gen para la insulina, que por lo general slo se encuentra en los animales superiores, se puede ahora introducir en clulas

bacterianas mediante un plsmido o vector. Despus la bacteria puede reproducirse en grandes cantidades constituyendo una fuente abundante de la llamada insulina recombinante a un precio relativamente bajo. La produccin de insulina recombinante no depende del, en ocasiones, variable suministro de tejido pancretico animal. Otra aplicacin importante de la ingeniera gentica es la fabricacin de factor VIII recombinante, el factor de la coagulacin ausente en pacientes con hemofilia. Casi todos los hemoflicos que recibieron factor VIII antes de la mitad de la dcada de 1980 han contrado el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o hepatitis por la contaminacin viral de la sangre utilizada para fabricar el producto. Desde entonces se realiza la deteccin selectiva de la presencia de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C en los donantes de sangre, y el proceso de fabricacin incluye pasos que inactivan estos virus si estuviesen presentes. La posibilidad de la contaminacin viral se elimina por completo con el uso de factor VIII recombinante. Otros usos de la ingeniera gentica son el aumento de la resistencia de los cultivos a enfermedades, la produccin de compuestos farmacuticos en la leche de los animales, la elaboracin de vacunas, y la alteracin de las caractersticas del ganado. Riesgos Mientras que los beneficios potenciales de la ingeniera gentica son considerables, tambin lo son sus riesgos. Por ejemplo, la introduccin de genes que producen cncer en un microorganismo infeccioso comn, como el virus influenza, puede ser muy peligrosa. Por consiguiente, en la mayora de las naciones, los experimentos con ADN recombinante estn bajo control estricto, y los que implican el uso de agentes infecciosos slo se permiten en condiciones muy restringidas. Otro problema es que, a pesar de los rigurosos controles, es posible que se produzca algn efecto imprevisto como resultado de la manipulacin gentica.

En ingeniera gentica, los cientficos utilizan enzimas de restriccin para aislar un segmento de ADN que contiene un gen de inters por ejemplo, el gen que regula la produccin de insulina. 2. Un plsmido extrado de su bacteria y tratado con la misma enzima de restriccin puede formar un hbrido con estos extremos 'pegajosos' de ADN complementario.3. El plsmido hbrido se reincorpora a la clula bacteriana, donde se replica como parte del ADN celular.4. Se pueden cultivar un gran nmero de clulas hijas y obtener sus productos genticos para el uso humano.

9.8 CINETICA DE LA BIOSISNTESIS DE ENZIMAS "Aunque las leyes generales de la catlisis debieran ser vlidas para las enzimas, el hecho de que stas sean sustancias complejas, de alto peso molecular, de tamao coloidal y de composicin difcil de precisar, impide la aplicacin de dichas leyes de una manera estricta; por ejemplo, su tamao coloidal puede causar fenmenos de adsorcin o diversas reacciones debidas a sus numerosas cargas elctricas. No obstante, los factores que afectan la velocidad de la reaccin enzimtica son los ya sealados a propsito de las reacciones qumicas en general, como la temperatura y las concentraciones de las sustancias reaccionantes que, en este caso particular, son la enzima el sustrato. Adems intervienen el PH medio donde se realiza la reaccin, la presencia de los productos de la reaccin, y otros factores secundarios como las radiaciones y los efectos xido reductores."(14) 9.9 PRODUCCION DE ENZIMAS A GRAN ESCALA "La produccin de encimas para empleo industrial y como alimento se ha desarrollado en forma independiente en diversas industrias. La fuente original de enzimas de cereales, principalmente de las distintas clases de malta, es la industria de la malta de cebada. Las proteasas de las plantas, como la papaina, bromalaeina y ficina, que se emplean en los estados unidos son de omportancin, y generalmente los importadores tienen poco control sobre las condiciones del proceso de produccin."(15) La industria empacadora de carnes es la fuente principal de las enzimas derivada del pncreas, estmago e hgado de los animales. Finalmente, las enzimas de fuentes

microbiolgicas: Bacterias, Hongos y levaduras, se producen en la industria de la fermentacin. Los procesos microbianos en los que el hombre controla las condiciones del desarrollo microbiolgico, se llaman fermentaciones."(15) 9.9.1 Medios de fermentacin Las fermentaciones con clulas libres constituyen todava el mtodo mas utilizado. Su manipulacin es relativamente fcil, y, en algunos casos no requiere un medio de cultivo estril. Ya que las clulas se producen con la misma rapidez con la que son eliminadas del reactor, existe una sntesis constante de nuevo catalizado. De esta forma, y suministrando al reactor condiciones apropiadas para el crecimiento, la fermentacin puede transcurrir en un estado estacionario en el que la eficiencia cataltica no cambia. Adems, a partir de la degradacin catablica de los nutrientes, la clula que crece activamente es capaz de suministrar la energa necesaria para la sntesis. Sin embargo, el mayor nmero de reacciones requeridas para el metabolismo significa tambin aumento de probabilidades para la formacin de productos secundarios no deseados. Este hecho, junto con la produccin de un exceso de biomasa, limita el rendimiento del medio del cultivo y, por consiguiente la economa del proceso. La clulas inmovilizadas pueden considerarse como un estado intermedio entre la fermentacin, la clulas libres y las enzimas inmovilizadas. En algunos casos las clulas se destruyen antes de inmovilizarlas y se utiliza un solo componente enzimtico, por lo que, en ellos, la distincin entre clulas y encimas inmovilizadas constituye una cuestin puramente semntica. 9.10 RECUPERACION DE LAS ENZIMAS La presencia de sustancias ppticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtencin de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo as el rendimiento de la extraccin. El desarrollo de la tecnologa enzimtica ha permitido la preparacin de enzimas pectinolticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pcticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparacin de enzimas pectinolticas estables, mediante tcnicas de inmovilizacin por adsorcin en geles de alginato de calcio, estudiando las caractersticas de los biocatalizadores inmovilizados en comparacin con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificacin de zumos de pltano y de kiwi, estudiando adems la posibilidad de reutilizacin de las enzimas. En relacin a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de

alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles ms elevados de actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilizacin, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilizacin de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicacin de las enzimas a un biorreactor, que contena una solucin de pectina, confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solucin. Como tendencia general la eficacia de las enzimas inmovilizadas segua el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneracin de las perlas de alginato con Cl2 Ca y su reactivacin con una nueva solucin de enzima, permita reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentracin enzimtica, se reducan los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilizacin de las enzimas inmovilizadas en los zumos de pltano y kiwi se vea limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilizacin del soporte de inmovilizacin por efecto de los componentes del zumo, lo cual poda reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilizacin aplicado. (v) Por ltimo, con vistas a la aplicacin biotecnolgica de ese estudio, podra concluirse que la inmovilizacin de enzimas pectinolticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilizacin. Reduciendo los costes finales del proceso sin prdida apreciable de la calidad y cualidades organolpticas de los zumos tratados.

La presencia de sustancias pcticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtencin de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo as el rendimiento de la extraccin. El desarrollo de la tecnologa enzimtica ha permitido la preparacin de enzimas pectinolticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pcticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparacin de enzimas pectinolticas estables, mediante tcnicas de inmovilizacin por adsorcin en geles de alginato de calcio, estudiando las caractersticas de los biocatalizadores inmovilizados en comparacin con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificacin de zumos de pltano y de kiwi, estudiando adems la posibilidad de reutilizacin de las enzimas. En relacin a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles ms elevados de actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilizacin, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilizacin de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicacin de las enzimas a un biorreactor, que contena una solucin de pectina, confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solucin. Como tendencia general la eficacia de las enzimasinmovilizadas segua el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneracin de las perlas de

alginato con Cl2 Ca y su reactivacin con una nueva solucin de enzima, permita reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentracin enzimtica, se reducan los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilizacin de las enzimas inmovilizadas en los zumos de pltano y kiwi se vea limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilizacin del soporte de inmovilizacin por efecto de los componentes del zumo, lo cual poda reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilizacin aplicado. (v) Por ltimo, con vistas a la aplicacin biotecnolgica de ese estudio, podra concluirse que la inmovilizacin de enzimas pectinolticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilizacin. Reduciendo los costes finales del proceso sin prdida apreciable de la calidad y cualidades organolpticas de los zumos tratados.

CONCLUSIONES
1. Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que cumplen muchos requicitos para impulsar nuevas industrias qumicas. 2. La tecnologa enzimtica tiene mltiples aplicaciones, como fabricacin de alimentos, los progresos que estn realizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar el desarrollo cada vez mayor del uso de las enzimas.

3. La utilizacin de enzimas en los alimentos presentan una serie de ventajas, adems de las de ndole econmico y tecnolgico. 4. Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de accin que se desee obtener.

5. Las fuentes de enzimas pueden ser de origen vegetal, animal o microbiano. 6. se puede manipular genticamente, la biosntesis de enzimas para optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas normas.

. La produccin de enzimas a gran escala tiene su principal aplicacin en la industria de la fermentacin.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
y

Citas bibliogrficas 1. P Gaseosa y J. Hube, tecnologa de las enzimas, Editorial acribas. S.A., Segunda Edicin, Zaragoza Espaa, 1990., Pas 3. 2. Kira, Raymond, Enciclopedia de Tecnologa Qumica, Tomo VI, primera Edicin, Editorial Uteha, Espaa 1962., paj. 1006. 3. IBID (2), Paj. 1007 4. IBID (2) Paj. 1007 5. IBID (2). Paj. 1008, 1009, 1010. 6. IBID (1), Paj. 104 7. IBID (1) Paj 106 8. IBID (1) Paj 108, 109. 9. IBID (1), Paj. 74 10. IBID (1) paj. 76 11. IBID (1) paj 81 12. IBID (1) paj 86 13. IBID (2) paj. 1111 14. Perry, Manual del Ingeniero Qumico, sexta Edicin,Tomo VI, Editorial McGrawHill, 1992., paj 27-2015. IBID (2) paj. 1014.

y y

Bibliografa P Gasesa y J. Hubble, tecnologa de las enzimas, Editorial acribis. S.A., Segunda Edicin, Zaragoza Espaa, 1990. Perry, Manual del Ingeniero Qumico, sexta Edicin,Tomo VI, Editorial McGraw-Hill, 1992. Kirk, Raymond, Enciclopedia de Tecnologa Qumica, Tomo VI, primera Edicin, Editorial Uteha, Espaa 1962. Ocano, Enciclopedia de la Ciencia y La tecnologa Tomo V, ediciones Ocano, Barcelona 1980. Url http:://www.icp.csis.es/biocatlisis/web3lineas.html http:www.mty.itesm.mx/data/cd/html http//www.unav.es/memoria/8-99/ingenieria.html

y y

y y y y