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ANALYSE BACTRIOLOGIQUE DES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI

DJAMAL

DIFFERENTES METHODES DANALYSE

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES ALIMENTS


Buts de lanalyse? Paramtres recherchs? Dnombrement des microorganismes? Dfinition des germes recherchs?

Buts de lanalyse?
Rechercher et dnombrer les micro-organismes:

Qualit marchande
Germes qui provoquent laltration de laliment. Saveur, odeur

Qualit hyginique Germes potentiellement pathognes qui provoquent l'intoxication alimentaire.

3 groupes de germes recherch


Germes capables daltrer la qualit marchande de laliment.
Moisissures et Pseudomonas

Germes potentiellement pathognes pour le consommateur.


Salmonella ,Listria

Tmoins de contamination fcale.


Coliformes

Dnombrement des micro-organisme

Interprtation des rsultats


Plan 2 classes

2 plans sont dsigns


Plan 3 classes

pour faire lanalyse bactriologique des aliments?

Rfrentiels
Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF EN ISO 6887-1 relative la suspension mre et dilutions dcimales;1.rgle gnrale. Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF ISO 7218 :rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

La prise dessai:
(exemple: fromage, viande.). B -cas de produit liquide (exemple: lait pasteuris, jus..).

A - cas de produit solide

A- Cas de produit solide


Peser dans un sachet strile 3 25 gr du produit analyser aseptiquement.
25 gr

La 1re pese servira au contrle bactriologique. La seconde servira la recherche des Salmonella. La troisime servira la recherche de Listria.

BALANCE

a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:


Verser le TSE dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser Broyer laliment 6 8 minutes Verser le contenu dans le flacon de TSE

BROYEUR
STOMACHER
DE TYPE
225 ml

TSE

(suspension mre) 10

b- La prise dessai pour la recherche des Salmonella et des Listria.


Verser lEau Peptone Tamponne(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listria) dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser Broyer laliment 6 8 minutes Verser le contenu dans les flacons respectives

BROYEUR DE TYPE STOMACHER


225 ml 225 ml

Eau Peptone tamponne

Bouillon Fraser

B Cas de produit liquide:


a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:
Faire un mlange de 3 5 units du produit analyser
Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris

+1
Suspension mre

b- La prise dessai pour les recherches des Salmonella et des Listria


Prlever 225 ml de la Suspension mre
5
ml

25 ml

25 ml

+1
FRASER

Eau peptone tamponne

Listria

Salmonella

PRPARATION DES DILUTIONS DCIMALES


a - cas de produit solide b - cas de produit liquide

a - Cas de produit solide:


Introduire 1 ml de la suspension 10 dans 9 ml de TSE. Mlanger, puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE.

1 ml

1 ml

1 ml

10

9 ml de TSE

10

10
Suspension mre

b - Cas de produit liquide:


Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE Mlanger, puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE, mlanger, puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10

1 ml 1 ml
10

1 ml
9 ml de TSE
10

1 ml
9 ml de TSE
10

+1
suspension Solution mre mre

PARAMETRES RECHERCHES
Recherche et dnombrement des microorganismes totaux (Flore msophile) Recherche et dnombrement des levures et moisissures Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli Recherche et dnombrement des Anarobies Sulfito Rducteurs 37C Recherche et dnombrement de Clostridium Perfringens 46C Recherche et dnombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles Recherche de Listria

1er JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Dfinition de la Flore Msophile Arobie Totale

Dfinition:
La Flore Msophile Arobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d'valuer le nombre d'UFC (Unit Formant une Colonie) prsentes dans un produit. Ce dnombrement se fait 30C ce qui permet de dnombrer trois grands types de flore: la flore thermophile, temprature optimale de croissance 45C; la flore msophile, temprature optimale de croissance entre 20C et 40C; la flore psychrophile, temprature optimale de croissance 20C.

Rfrentiels
Norme NF 08 051 relative au dnombrement des micro organismes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats Norme NF V 08 002:Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour les examens microbiologiques Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Milieu utilis:
Glose PCA
(Plate Count Agar)
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions


1 ml
ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10

10

10

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite

Couler la glose PCA 15 ml refroidie 45C Mlanger et laisser solidifier


A PC

PC A CA

10

10

10

Couler une deuxime couche de glose blanche 5 ml Laisser solidifier


G GE ELOS OSE B LA N LA C H HE

10

10

10

SE GE LO ANCH E BL

Incuber les boites couvercle en bas 72 3h 30C

Incuber 72h 30C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Dfinition des coliformes totaux:

Dfinition :
Les coliformes totaux sont des bactries en forme de btonnet arobies ou anarobies facultatives possdant lenzyme - galactosidase permettant lhydrolyse du lactose 35C avec production de gaz Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella et Serratia

coliformes thermotolrant ou coliformes fcaux

Dfinition:

Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44C

Dfinition d Escherichia coli

Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de
coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects

Milieu utilis:
VRBL:
glose au cristal

Violet et au Rouge neutre Bilie Lactose


(autres que les produits laitiers)

DESOXYCHOLATE 1
(pour les produits laitiers)
AZIZI DJAMAL

Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30C Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016) Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Rfrentiels
Norme NF V 08-051:dnombrement des coliformes par comptage des colonies,mthode de routine. Norme NF V 08-017:dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016) Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique Norme XP V 08-102:rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats:cas des dnombrements en milieu solide Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Inoculer 2 sries de boites avec 1 ml des diffrentes dilutions 1 ml


1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10 10

10 10

10 10

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite

Couler une couche de glose de dsoxycholate 1

ou VRBL 15 ml, refroidie la temprature 451 C


Y- E OXAT S DE OL

CH 1

Mlanger et laisser solidifier

D E C S HO OXY L 1ATE

e Couler une 2m couche de glose blanche ou de dsoxycholatee 1 ou de VRBL 4ml. Laisser solidifier
glose blanche

glose blanche

2 Co 4 -4 lifo 8h rm es 4 4 fc C au x

Co4-48 lifo h rm es 37C tot aux

Incuber une srie de boites 24-48 h 37C pour la recherche des coliformes totaux Incuber lautre srie 44 C pour la recherche des coliformes thermo tolrants et Escherichia coli

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Milieu utilis:
Glose Baird Parker

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

DEFINITION:
microorganismes de forme sphrique cooci Gram positif halophiles c'est--dire cultivent en prsence de 5 % de NaCl possdent une catalase
(se multiplier dans des salaisons, ou en surface de poissons
sals. Certaines espces psychrotrophes se dveloppent

Rfrentiels
Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S. aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos de Baird Parker Norme NF V 08 057 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C 1: technique avec confirmation des colonies Norme NF V 08 057 2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C 2: technique sans confirmation des colonies Norme NF ISO 6888 -2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S. aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos au plasma de lapin et au fibrinogne Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Prparation du milieu Baird Parker


Ajouter au milieu de base Baird Parker 15 ml de la solution jaune duf au tellurite de potassium

15 ml

de

JAUNE
DOEUF
TELLERUTE de POTASSIUM

au

Glose BAIRD PARKER

Couler la glose dans des boites de ptri et conserver +4C

Inoculer les boites avec 0,1 ml des diffrentes dilutions


1
ml

ml

ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

10

10

10

taler les gouttes laide dune pipette rteau

10

10

10

Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h 2 37C

Incuber 48h 2 37C 1re lecture 24h 2

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

les levures et les moisissures


Ce sont des champignons

les levures: les moisissures:


Sont des micro-organismes filamenteux qui sont dissmins par lmission de spores

la forme la plus frquente est ovalaire ou sphrique la forme unicellulaire est prdomi

Rfrentiels
Norme XP V 08 059 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C Norme NF ISO 7954 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Milieu utilis:
Sabouraud au Chloramphnicol

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Ensemencer les boites comme lindique le schma


1

0,2 ml ml

0,2 ml
TEMOIN DILUANT

ml

0,2 ml

ml

0,2 ml
TEMOIN MILIEU

ml

10

10

10

Ne pas ensemencer la boite tmoin

taler les gouttes laide dune pipette rteau

Tmoin diluant

10

10

10

Incuber les boites de Sabouraud au Chloramphnicol couvercle en haut

Incuber 3 5 jours 25C Lecture tous les jours

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Rfrentiels
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Milieu utilis:
Glose Viande Foie

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Chauffer 100C pendant 5;puis refroidir rapidement leau de robinet :


10- 10-

15 mn 75C 10 mn 80C

100C

Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions

10-

10-

10-

10-

Couler 15 ml de la glose VF additionne d1ampoule de Sulfite de Na et 1 ampoule dAlun de Fe

10-

10-

10-

10-

Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier

10-

10-

10-

10-

Incuber 48 h 37C

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

SALMONELLA
Entrobactrie Bacilles Gram ngatif, Mobile (ciliature pritriche), Aro-anarobie facultatif, Oxydase Fermentative du glucose, Lactose

flagelles

Responsable de toxi-infection alimentaire

Rfrentiels
Norme NF V 08 6- 052 relative la mthode de routine pour la recherche des Salmonella. Norme EN 12824 relative la recherche des Salmonella Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

A- Cas de produit solide


Peser dans un sachet strile 25 gr du produit analyser aseptiquement.

25 gr

BALANCE

Verser lEau Peptone Tamponne dans le sachet strile contenant 25 gr de produit Broyer laliment Verser le contenu dans le flacon dE.P. Tampon

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

Eau Peptone tamponne

flacon

de 225 ml

B - Cas de produit liquide


25 ml
1
ml

Prlever 25 ml de la Suspension mre

Introduire dans 225 ml dEau Peptone Tamponne

(+1) +1

Eau

Peptone tamponne

tape de pr- enrichissement

Incuber la solution ensemence dEau Peptone Tamponne

Eau Peptone tamponne

INCUBER 16- 20h 37C

e 2m JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

e r

Lecture

24h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Lecture des coliformes totaux


Glose VRBL

Dnombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150

Colonies rouges

Colonies rouges

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150
Appliquer cette formule: c

Lecture et interprtation:

1,1 x d
c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re e dilution et c = nombre de colonies de la 2m dilution retenues). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue N = nombre de coliformes totaux / gr ou ml

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Lecture des coliformes totaux et fcaux


Glose dsoxycholate 1
(produits laitiers)

Exposer la boite sous radiation UV Lecture immdiate dans une chambre noire Dnombrer les colonies fluorescentes

Lampe UV

Dnombrer les colonies rouges fluorescentes qui poussent en masse , noter les dilutions et les tempratures correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150
Colonies fluorescentes

Colonies rouges

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150 Appliquer cette formule: c N 1,1 x d c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re dilution et c = nombre de e colonies de la 2m dilution ) d : le taux de dilution de la 1re boite retenue N = nombre de coliformes totaux ou coliformes fcaux / gr ou ml

Lecture et interprtation:

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Recherche et dnombrement dEschrichia Coli

Repiquer 3 5 colonies caractristiques sur le milieu Ure Indole

Coliformes thermotolrants

Ensemencer le milieu Ure Indole

Incuber le milieu Ure Indole ensemenc 24 h 37C

UREE

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture des staphylocoques


1re lecture

Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes Colonies Colonies non caractristiques (halo) caractristiques

rincuber les boites 48 h

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture des ASR


1re lecture
16h dincubation

Dnombrer les colonies qui poussent en profondeur

1 cm
10- 10-
10-

10-

rincuber 48 h 37C

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

tape denrichissement

ENSEMENCER UN BOUILLON SFB: 100 ml


Additionn de 20 disques de slnite SFB
Eau Peptone tamponne

D/C

Flacon dEau Peptone pr enrichie

Incuber 18 24h 37 C

e 3m JOUR DES TRAVAUX PRATIQUES

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

e m

Lecture

48h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 30 et 300

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30C

Lecture des coliformes fcaux(E. coli)

Lecture du milieu Ure Indole


KOVACS KOVACS

Production dindole = formation dun anneau rouge.

indole -

indole +

E.Coli: ure Indole +

Lecture et interprtation
Formule: a = b x A c

b : Nombre de colonies caractristiques indole + c : Nombre total de colonies caractristiques sur la boite A : Nombre de colonies caractristiques repiqus a : Nombre dEscherichia Coli identifis par boite

Retenir 2 dilutions successives

( plus fortes

dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150.

Appliquer cette formule: a

= d : le taux de dilution correspondant la 1re dilution retenue.

1,1 x d Nombre dEscherichia Coli identifis.

N = nombre dEscherichia Coli /gr ou


ml

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture et identification des staphylocoques pathognes


e - 2m lecture 48h - tests de confirmation

Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes Colonies Colonies non caractristiques (halo) caractristiques

15 X 150 pour 2 dilutions successives

Recherche de la catalase puis de la coagulase


COAGULASE

CATALASE

Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie

Apparition de bulles dair.


Observation loeil nu ou au microscope

Raction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cur cervelle

BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h 37C

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37OU 46C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Lecture des ASR


e 2m lecture

48h dincubation

Dnombrer les colonies noires qui poussent en profondeur

1 cm
10- 10-
10-

10-

Dnombrer les colonies caractristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamtre

ASR

colonie

Calcul:
e ( x 1 + x 2 ) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2m dilution

C= 2 Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r e = 2m e = 3m e = 4m tube tube tube tube

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape disolement
glose hektoen

Isoler par des stries :


Ensemencer une boite de glose Hektoen partir du bouillon SFB
Additionn de 2 disques de slnite

10 ml
Anse de platine
SFB
D/C
SFB D/C

Incuber 18- 24h 37C

18-24 h 37C

e 4m JOUR DES TRAVAUX PRATIQUES

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

e m

Lecture

72h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 30 et 300

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30C

Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 30 c 300 Appliquer cette formule: c 1,1 x d 1 2 1 2 c : c + c (c = nombre de colonies de la 1re dilution et c e = nombre de colonies de la 2m dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

/ gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Identification des staphylocoques pathognes

b- recherche de la coagulase libre:


0,1 ml

BOUILLON COEUR CERVELLE

Plasma de lapin
0,3 ml

Incuber 24h 37C


1re lecture aprs 6h dincubation

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape didentification
repiquage sur TSI

Lecture de la boite Hektoen


Colonies ayant un contour rgulier Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la glose Hektoen Colonies typiques

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI


Stries Anse de platine

faire une piqre centrale.

Isoler par des stries

Incuber 24h 37C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture des levures et moisissures

levures

Aspergillus fumigatus culture sur glose Sabouraud

moisissures

Candida albicans culture sur glose Sabouraud

Dnombrer les levures et moisissures et noter la dilution correspondante

LEVURES

MOISISSURES

AZIZI - IPA - 2004

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES LAITS T PRODUITS LAITIERS

Calcul: c x 5 x inverse de la dilution

e 5m JOUR DES TRAVAUX PRATIQUES

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Identification des staphylocoques pathognes


lecture de la staphylocoagulase

Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial

Plasma de lapin coagul

Raction

Lecture et interprtation: a =b

FORMULE :
A A

= nombre de colonies caractristiques repiques = nombre de colonies non caractristiques nc repiques b = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase + b = nombre de colonies non caractristiques nc repiques coagulase + c = nombre total de colonies caractristiques par boite c = nombre total de colonies non caractnc ristiques par boite

A c c

x c + b xc nc c AAAAAAAAAAA

nc

nc

Lecture et interprtation
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: N = a V x 1,1 x F
a = a 1+ a (a = nombre 2 1 de staphylocoques coagulase + 2 la 1re de dilution retenue et a = nombre de staphylocoques e coagulase + de la 2m dilution retenue.

Lecture et interprtation
N

/gr ou ml

1,1 x d a : La somme des colonies

d :

Le taux de dilution de la 1re dilution retenue

NB: retenir 2 boites de dilutions successives


contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.

Lecture et interprtation
Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre


Si c = 0 N< 1 D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape didentification
identification biochimique

Aspect de Salmonella sur TSI


H2S + Gaz Pente Rouge Culot Jaune H2S TSI Gaz

TSI

TSI Pente Rouge Culot Noir

+ Gaz +
H2S

Pente Rouge Culot Jaune

Autres Salmonella

S.Typhi

S.Paratyphi A

Ensemencer une mini-galerie biochimi


CITRATE DE SIMMONS

TEMOIN LDC

ONPG UREE

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENREES ALIMENTAIRES Milieu utilis:
Bouillon Giolitti cantoni

Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:

10-

10-

10-

Couler 15 ml du bouillon Giolitti Cantoni additionn d1ampoule et de Tellurite de K

10-

10-

10-

Incuber 48 h 37C

Faire la 1re lecture:

10-

10-

10-

Reincuber 48 h 37C

Faire la 2Me lecture


Tubes +
10- 10- 10-

Tubes -

Isoler les tubes + sur la glose Chapman

Isoler par des stries


Ensemencer sur boites de glose Chapman partir de chaque bouillon de Giolitti Cantoni +

Anse de platine

24 48h 37C

Faire une raction de la catalase partir de tout type de colonies ayant pousses

Raction de la catalase:
Pipette Pasteur Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie

.
Apparition de bulles dair

Observation lil nu ou au microscope.

Raction de la coagulase
ensemencer un bouillon cur cervelle

Si catalase +
BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h 37C

b- recherche de la coagulase libre


0,1 ml

Plasma de lapin
BOUILLON COEUR CERVELLE

0,3 ml

Incuber 24h 37C


1re lecture aprs 6h dincubation.

Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial

Plasma de lapin coagul

Raction +

Lecture et interprtation

Nombre de staphylocoques pathognes /gr ou ml =

1 x inverse de la dilution

Calcul:
e ( x 1 + x 2 ) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2m dilution

C= 2 = Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r e = 2m e = 3m e = 4m tube tube tube tube

RECHERCHE DES LISTERIA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

La prise dessai pour la recherche de Listria


a - cas de produit solide:
Verser le bouillon Fraser dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml
Fraser Bouillon

b cas de produit liquide:


25 ml
5
ml

Prlever 25 ml de la

Solution mre

+1
FRASER

Listria

PREPARATION DU BOUILLON FRASER


a Reconstituer le supplement Fraser :
11.25 ml 11.25 ml

SUPPLEMENT

ETHANOL

FRASER

EAU DISTILLEE STERILE

Acriflavine + Acide nalidixique + citrate de fer ammoniacal

b- additionner le supplment

0,1ml 2.25 ml

SUPPLEMENT

FRASER

BOUILLON FRASER

BOUILLON

FRASER

PREPARATION DE LA GELOSE PALCAM 5 ml 2,25 ml

EAU
DISTILLEE

Supplment

PALCAM

STERILE

Glose
PALCAM

Sulfate de polymyxine B + Ceftazine + Acriflavine

1re tape:
Enrichissement primaire
Incuber le bouillon ensemenc FRASER 18-24h 30C

BOUILLON

FRASER

INCUBER 18-24h 30C

e 2m tape:

Enrichissement secondaire sur milieu Fraser en tube 1er Isolement sur glose Palcam 0,1ml

BOUILLON

FRASER

BOUILLON

FRASER

Enrichissement I
Incuber 24h 37C Incuber 24-48h 37C

FRASER

PALCAM 1

e 3m tape:
e 2m isolement sur la glose Palcam Lecture de la boite Palcam 1

BOUILLON

FRASER

Incuber 24-48h 37C

PALCAM 1

PALCAM 2

Colonies caractristiques de Listria sur la glose Palcam

Identification du genre Listria:


Coloration de gram Catalase

Bacilles gram +

Catalase +

Identification de lespce:
ensemencer une galerie biochimique

ENSEMENCER UNE GALERIE BIOCHIMIQUE.


Esculine VF

Mannitol Mobilit

Bouillon Nitrate

Clark et Lubs

Ure

TSI

Incuber 24h 37C

Lecture de la galerie biochimique


Mobilit + Nitrate Glucose + H2S GazEsculine + Ure IndoleTDA VP + RM +
Mannitol Mobilit Bouillon Nitrate

Esculine

Clark et Lubs

Ure

TSI

Clark et Lubs

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS PAR COMPTAGE DES COLONIES A 37 C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

Milieu utilise:
Tryptone Sulfite Cyclosrine

Rfrences
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions


1 ml 1 ml 1 ml 1

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

ml

10

10

10

104

Couler la glose TSC 15 ml. Mlanger et laisser solidifier

TSC

TSC

10

10

10

10 4

Couler une deuxime couche de glose TSC 10 ml, refroidie 47 2C. Laisser solidifier

TSC

TSC

10

10

10

10 4

Incuber 20 2h 37C dans une atmosphre riche en CO . 2

Jarre

Dnombrer les colonies noires caractristiques qui poussent en profondeur

Ensemencer de 1 3 colonies suspectes sur le bouillon Thioglycolate .

BOUILLON

glycolate

THIO

Incuber 20 2h en anarobiose 37C

Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose Sulfite + cloche partir du bouillon Thioglycolate 2 gouttes

LACTOSE SULFITE

BOUILLON

glycolate

THIO

Incuber 24 2h en anarobiose

Voir un dgagement de gaz dans la cloche et un prcipit noir au fond du tube

Gaz
LACTOSE SULFITE

Dpt noir

Lecture et interprtation
Formule: a = b x c A b : Nombre de colonies caractristiques + c : Nombre total de colonies caractristiques A : Nombre de colonies caractristiques repiqus a : Nombre de Clostridium Perfringens identifis

Lecture et interprtation
N

/gr ou ml

1,1 d a : La somme des colonies

+.

d :

Le taux de dilution de la 1re dilution retenue

NB: retenir 2 boites de dilutions successives


contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORME S THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Mthode en milieu liquide


(VBL + Cloche)

Vert brillant Bouillant Lactos


a - Test de prsomption
AZIZI DJAMAL

Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30C Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30C Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016) Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais

Introduire 1ml des diffrentes dilutions dans chaque tube. Chasser le gaz prsent dans les cloches avant lincubation

1 ml

1 ml

1 ml

10 10 10

10 10 10

10 10 10

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

Incuber 24 - 48h 37C

Lecture des coliformes totaux 37C


Aspect d un tube de milieu VBL + cloche positif

Acidification du milieu

Gaz +

Noter le nombre de tubes positifs 37C et se rfrer la table de NPP


10 10 10 10 10 10 10 10 10

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

++
2

+
2

++ +
3

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET Eschrichia coli


b- Test de confirmation

coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux

Dfinition:

Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44C

Dfinition d Escherichia coli

Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects

Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un autre tube de VBL et un tube dEau Peptone Exempt dIndole
2 gouttes 2 gouttes

Eau Peptone Exempt DIndole

VBL VBL

Chasser le gaz prsent dans la cloche avant lincubation. Incuber 24h 44C

VBL

Eau Peptone Exempt DIndole

-voir acidification du milieu VBL et le dgagement de gaz dans la cloche. -Ajouter le milieu Kovacs au tube dEau Peptone Exempt dIndole et voir la formation dun anneau rouge.

Anneau 2 gouttes de Kovacs


Eau Peptone Exempt DIndole

rouge

Gaz +
VBL

Acidification du milieu

Noter le nombre de tubes positifs pour chaque srie de dilutions et se rfrer la table de NPP

10 10 10 10 10 10

1010 10 10 10 10

10 1010 10 10 10

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

+
2

+
1

+
2

On utilise la formule mathmatique suivante. Appliquer cette formule: c N = V m x (n1 l + 0,1n 2 ) x d1 1) 2 dilutions successives (plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit compris : 30 c 300. 2) 3) Boite contenant un nombre suprieur 0. Boite ne contenant aucune colonie Ne = 1/ D