INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiei n viaa omului, n toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au fcut progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuiri favorabile i cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat. Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumtate de secol s-a fcut, n principal, pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organisme unicelulare. Odat cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dac noiunile acumulate anterior erau valabile i dac existau i alte procese specifice modului complex de organizare. Cunoscndu-se comportamentul organismelor simple, cercettorii au nceput s se gndeasc la cultura pe medii artificiale a unor poriuni de plante sau chiar celule. Problema care a aprut a fost aceea a meninerii viabilitii acestor celule, de la prelevarea de pe planta mam pn la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe pn la regenerarea (refacerea) unei noi plante. Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput fr succes, dar apoi totul s-a clarificat. n 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeaz substanele ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar, iar primele ncercri de culturi de esuturi au fost fcute n 1902, de ctre Haberland, din nefericire, fr rezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule i esuturi ncep s apar din anul 1922, cnd Knudson reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar Robbins obine prima cultur de esut de rdcin n condiii artificiale. Pe baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conine informaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, n anul 1952 Morel i Martin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelor meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere de viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze. n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rat de multiplicare ntr-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiionale de nmulire vegetativ, evitnduse i degenerarea soiurilor din cauza infeciilor virale, transmisibile prin nmulire vegetativ. n anul 1962, dup muli ani de studii i ncercri, Murashige i Skoog, au reuit s elaboreze un mediu de cultur considerat ca fiind de baz , care cu mici modificri poate fi utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de esuturi. Reuita experienelor lui Coking n 1960 privind izolarea enzimatic a protoplatilor din mezofil foliar, a fcut posibil obinerea unor populaii mari de protoplati iar apoi producerea de hibrizi somatici. Anul 1966 este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura de explante vegetale in vitro. Aceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea de tehnici eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu ajutorul protoplatilor, odat cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmitori de gene izolate) s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc. Att pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite n special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetic.

CAPITOLUL I 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I APLICABILITATE

1.1.1 Definiie n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi sau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n momentul n care explantul crete. Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur. Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evolua formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organelor aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o plant identic cu planta mam. Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare de specializare al acelor celule. Astfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate care constituie esuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul c ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierd capacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. Rmn, ns, anumite zone n care activitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noi celule. Aceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuol mic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cu denumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime a plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini. 1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure substanele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele condiii: -prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor;

-asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limitele optime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopul urmrit; -stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea corespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecia materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt utilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari. Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim: -asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, prin care n circa 6 luni se pot obine 1 milion de plante; -se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce i productiv; -necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe vertical pe 3-5 nivele suprapuse; -obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturi generative (cu n cromozomi); -d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n condiii normale sunt imposibil de obinut; -selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori; -se evit efectul sezonier de pepinier; -se pot obine semine artificiale; -se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire; -asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de cultur; -asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care, deocamdat rmn s fie nmulite tradiional. Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n mas a plantelor, cum ar fi: -necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabile activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare; -necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro; -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie; -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la metodele cunoscute de multiplicare; -exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii soiurilor;

-riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unele specii.

1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE EXPLANTELOR CULTIVATE IN VITRO

LA

NIVELUL

Explantele inoculate pe medii aseptice i vor relua activitatea metabolic, se vor integra noilor condiii de via, i vor reamorsa procesele fiziologice vitale i vor ncepe un nou ciclu de via. n dependen de mediul de cultur, de natura inoculilor, de seria de operaiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculri, de condiiile de cultur i de scopul urmrit, dup dediferenierea celulelor i regenerarea de noi celule, evoluia acestora poate fi dirijat. Inoculii pot fi meninui ntr-o stare primar de organizare cum ar fi: culturi de celule n suspensie (fr a intervenii formarea de agregate celulare) sau de calus, ori pot fi induse procese de citodifereniere, de morfogenez sau organogenez. 1.2.1 Diferenierea Celulele meristematice, divizndu-se continuu, dau natere la noi i noi celule care, treptat, cresc i sufer o specializare morfofiziologic ce poart numele de difereniere. n procesul de difereniere se pierd caracterele citologice i fiziologice de tip embrionar specifice celulelor meristematice, evolundu-se spre caliti proprii specializrii funcionale a diferitelor tipuri de esuturi sau organe n alctuirea crora celulele mature vor intra. n primele faze de difereniere se remarc o modificare ultrastructural i funcional a celulelor, fenomen denumit citodifereniere. Pe msura diferenierii, volumul celulei crete, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma devine pelicular i parietal, se extinde vacuomul care mpinge citoplasma i nucleul la periferia celulei. Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, n funcie de rolul ndeplinit de celule. Odat cu avansarea proceselor de difereniere peretele celular poate suferi modificri secundare de genul depunerilor de celuloz, lignin, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care conduc treptat la o ngreunare a comunicrii intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim). Celulele odat difereniate nu se mai divid. Celulele care compun un esut sau organ nu posed acelai ritm de cretere i se afl sub un permanent endocontrol fitohormonal. Substanele elaborate de celule pot difuza nspre celulele nvecinate exercitnd un anumit rol n dezvoltarea acestora fenomen denumit inducie, i care st la baza interrelaiilor dintre esuturi, ce servesc la organizarea acestora n formaiuni funcionale, respectiv la organogenez. Dup difereniere i generarea de noi celule se ajunge la situaia n care celulele neoformate tind s se reorganizeze structural i funcional suferind o citodifereiere, histodifereniere, cu organizarea de esuturi (histogenez), de organe (organogenez) i n final regenerarea unei noi plante. Diferenierea celular in vitro nu este foarte variat, unele funcii sunt reduse sau simplificate n timp ce altele sunt amplificate. 1.2.2 Dediferenierea celular Dediferenierea const n transformarea progresiv a celulelor din starea de celul specializat n celul meristematic, rectignd aptitudinea de a se divide.

Dediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific sau n cazul traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. Procesul de dedifereniere este complex i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular. n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii generatori de noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor de restituie. n caz de traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unor substane cu rol esenial n inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere. Deci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lor fiziologic i vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele de regenerare. Aptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpul plantelor i chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc un organism, existnd diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celule aparinnd aceluiai organ sau chiar esut. Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un mod de via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural i funcional n celule meristematice, apte de multiplicare. Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarte inegal rspndit la specii, organe i esuturi variate. Fazele de dedifereniere celular pot fi caracterizate astfel: 1.prima faza de dedifereniere: -amorsarea proceselor de dedifereniere; -producerea dediferenierii celulelor pn la dobndirea caracteristicilor citologice specifice unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemntoare ca aspect i structur cu cambiul. 2.a doua faz de dedifereniere: - dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de meristem primar; -generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante; -generarea, prin proliferarea celulelor dedifereniate, a unui calus neorganizat, structurat omogen. La nivelul acestui esut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni. 1.2.3 Regenerarea Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-i reface oricare parte le-a fost distrus. Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, esuturilor sau celulelor vegetale se exploateaz la maxim capacitatea regenerativ a celulelor explantelor, respectiv se pune n valoare manifestarea integral a totipotenialitii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. Din celule somatice sau obinut plante diploide, iar din celule generative, prin androgenez i ginogenez, sau regenerat plante haploide. Ca i n cazul dediferenierii celulare, se poate spune c i n regenerare exist o mare variabilitate n ceea ce privete reactivitatea celular, capacitatea regenerativ este manifestat sau nu de ctre o celul vegetal sau de un grup de celule n funcie de numeroi factori endogeni i exogeni. Factorii endogeni ce joac un rol esenial n regenerare sunt: vrsta celulelor, gradul de difereniere, capacitatea de a se dediferenia, coninutul n hormoni, natura balanei hormonale i echipamentul enzimatic. Factorii exogeni implicai n regenerare

sunt:traumele i natura acestora (stresul datorat introducerii unui explant n cultura in vitro), precum i condiiile de mediu. Totipotena este deinut de ctre fiecare celul a plantelor dar exprimarea sa aparine numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic n a rspunde la variai stimuli i care, n condiii specifice, pot da natere la tulpini, rdcini sau embrioni. Numrul celulelor dintr-o populaie cultivat in vitro care-i exprim potenialul organogen sau embriogen se afl sub controlul mai multor factori. Specia. Exist specii la care regenerarea are loc n special prin organogenez i specii care regenereaz prin embriogenez, dar i specii care pot regenera att lstari ct i embrioni in vitro. Genotipul. S-a constatat c nu toate soiurile aparinnd unei specii cultivate au potenial regenerativ. Astfel, s-au evideniat genotipuri culturabile, ce au permis o regenerare uoar din orice tip de esut, dar i genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a fcut cu mare dificultate i cu rezultate slabe. Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante genereaz calus regenerativ. La altele ns obinerea plantelor in vitro este condiionat de utilizarea anumitor explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenele foarte tinere i microsporii genereaz calusuri regenerative. Vrsta explantelor. Calusurile iniiate din esuturi tinere regenereaz mult mai bine dect cele provenite din explante mature. n embriogeneza somatic direct, exprimarea totipotenei depinde de stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurg embriogeneza direct celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei i sinergidele. Ali factori care influeneaz regenerarea sunt: starea fiziologic a plantei donor, compoziia mediului de cultur, vrsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea i calitatea luminii, stresul (biotic sau abiotic). 1.2.4 Morfogeneza in vitro ntruct la culturile in vitro morfogeneza prezint aspecte particulare, specifice acestui tip de cultur, vom adopta termenul de morfogenez n sens larg iar n acest context, vom descrie procesele de morfogenez sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza i embriogeneza. Bibliografia existent pn n prezent subliniaz dependena capacitii morfogenetice de natura explantelor; pe de alt parte sunt numeroase referiri bibliografice care evideniaz relaia care exist ntre genotip i competena morfogenetic a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a considerat ca factor decisiv n meninerea capacitii morfogenetice, starea fiziologic i de dezvoltare a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiioneaz regenerarea i reacia explantului , altfel spus un rspuns morfogenetic corespunztor a fost obinut numai atunci cnd explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai avansate n dezvoltare, fa de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen. Morfogeneza la culturile in vitro este influenat, n mare msur de anumii factori: -coninutul endogen n fitohormoni i aportul exogen de regulatori de cretere; -srurile minerale prezente n mediul de cultur (mai ales natura sursei de azot); -natura i concentraia glucidului din mediul de cultur; -prezena n substrat a unor compui organici, n special al unor aminoacizi; -prezena, natura i concentraia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate n mediu sau existente n atmosfera din recipientele de cultur;

-prezena n substrat a unor extracte complexe, de origine biologic, sau a crbunelui activ; -factorii fizici (lumina, temperatura). Deci lumina, temperatura, potenialul osmotic al mediului, starea fizic a acestuia, tipul vaselor de cultur sunt factori care pot influena n sens negativ morfogeneza. Nu se cunoate nc dac morfogeneza este influenat i n ce msur, de substanele introduse iniial n mediul de cultur sau de ctre complexul ionic, format n substrat, ca o consecin a autoclavrii, sau n ce msur schimbrile intervenite n compoziia mediului, sub aciunea inoculilor, afecteaz morfogeneza. 1.2.4.1 Organogeneza in vitro Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie ntreag de fenomene biologice, aflate n antecedena momentului explantrii esuturilor. Pn n momentul explantrii esuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, mpreun cu sistemul crora le aparineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte n care diferitele cerine fiziologice au fost satisfcute, mai mult sau mai puin. Dintre aceste cerine amintim raportul endogen n fitohormoni i coninutul endocelular n nutrieni, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu sruri minerale. De modul n care au fost asigurate aceste cerine, prealabile explantrii, vor depinde, n mare msur, reacia explantelor, capacitatea regenerativ i mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivai din acestea. Aspectele menionate au fost foarte clar relevate, mai ales n cazul studiilor de embriogenez somatic i de nrdcinare a tulpinilor recalcitrante n a genera rdcini adventive. De exemplu, pentru inducerea nrdcinrii tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurt durat, a lor cu soluie nutritiv, coninnd 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpin nu a nrdcinat dac tulpinile au fost pstrate, pe o durat lung de timp, n acest mediu; rdcinie s-au difereniat i au crescut numai dup ce explantele caulinare au fost scoase i reinoculate pe un alt mediu, lipsit de auxin (Teixeira, 1981). Din cele prezentate, s-a putut reine faptul c factorul endogen este dominant n obinerea unei anumite reacii i c pe lng operarea unei modificri n condiiile de incubare ale inoculilor, alegerea explantului constituie factorul determinant n evoluia acestora in vitro, n procesele de morfogenez. A.Rizogeneza in vitro Un anumit fragment explantat se comport, n linii mari, ca un minibuta. El difer de un buta normal, ntruct cel clasic deine bogate rezerve endogene, are muguri i eventual frunze. Mugurii i frunzele pot i dup desprinderea fragmentului de planta mam s sintetizeze anumii compui hormonali. Explantul ns, din cauza dimensiunilor sale reduse i a detarii sale, nu mai beneficiaz de susineri pe care s le primeasc de la muguri sau de la frunze i rmne n totalitate dependent de mediul de cultur. n acest caz factorul genetic, mrimea explantului vrsta plantei mam, starea fiziologic a celulelor pe care le deine, sunt tot atia factori care concur la evoluia ulterioar a inoculului. Uneori, ns, in vitro, se produce o pierdere a capacitii rizogene, mai ales ca urmare a practicrii unor repicri (subculturi) succesive. Se pune problema pstrrii sau a redobndirii capacitii rizogene. Factorii care condiioneaz meninerea acesteia i mai ales, cei care cauzeaz pierderea aptitudinii rizogene sunt n mic msur cunoscui.

Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slab sau n urma unei perioade scurte de aciune (600 luci mai puin de o or/zi). Temperatura optim pentru rizogenez este aceea de 26 oC. Uneori, ns, se recomand practicarea unei alternane ntre o temperatur sczut (5-15 oC) i ridicat, n prezena luminii, a auxinei i a unui mediu bogat n glucide. n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. Rdcinile se formeaz la polul radicular al explantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat la polul foliar. Aportul de auxin, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. n concentraii optime auxina stimuleaz rizogeneza. B.Caulogeneza in vitro Formarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centri vegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de exemplu, multiplicarea sau reconstituirea unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic. Inducerea caulogenezei, a formrii de mugurai i tulpinie, la nivelul inoculilor cultivai in vitro, este stimulat de prezena n mediul de cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie menionat i faptul ca formarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii celor dou categorii de fitohormoni. Reuita formrii mugurailor presupune nu doar prezena celor dou tipuri de fitohormoni, ci i a realizrii unui anumit raport al crui eficien este variabil n funcie de specie, de proveniena i natura inoculului. Se poate spune deci, c nu este important doar raportul fitohormonal, ci i natura i concentraia compuilor utilizai ca regulatori de cretere. Uneori, se poate declana caulogeneza reducnd concentraia de auxin. Alteori, cel mai mare numr de mugurai este atins atunci cnd se folosesc concentraii relativ ridicate de citochinin. Dar nu exist reguli general valabile. Adeseori fiecare experien reprezint un caz aparte, iar reacia explantelor, la balana hormonal din substrat, variaz mult, n dependen de tipul materialului vegetal. La calus, n inducerea caulogenezei, se obin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea succesiv a acestuia, ntr-o prim etap, pe un mediu fie cu o concentraie foarte ridicat de 2,4D, fie n prezena unei auxine mai slabe ca eficien, dar administrat n concentraie mare, asociat eventual cu o citochinin, n concentraie moderat. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport sczut n auxin i cu un coninut ridicat n citochinin, ar putea conduce cu succes la declanarea procesului de nmugurire. Factorii externi (lumina, temperatura, calitile fizice ale mediului) sunt controversai n ceea ce privete efectele lor asupra caulogenezei. Aciunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor i de etapele parcurse anterior. Cu toate c numeroase specii necesit o anumit fotoperioad pentru inducie floral, n general se apreciaz c formarea de mugurai este independent de fotoperioad. Temperatura recomandabil pentru desfurarea optim a proceselor de caulogenez este aceea de 25 oC. Folosirea alternativ a mediilor lichide i a celor solide poate exercita un efect benefic asupra producerii proceselor de morfogenez. Astfel, la orhidee, se cunoate c meninerea protocormilor n stare submers favorizeaz multiplicarea acestora, dar este inhibat organogeneza. Trecerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declaneaz organogeneza. Dac dup o perioad de meninere a protocormilor pe mediu agarizat (cteva sptmni) se submerseaz protocormii, prin acoperirea lor cu soluie nutritiv diluat, sau cu ap distilat steril, se reuete o stimulare a proceselor de organogenez (Cachi, 1983). La monocotiledonate capacitatea caulogen este mai moderat. Aptitudinea cerealelor de a forma muguri in vitro este foarte variabil. Adeseori aceast capacitate, la nivelul

calusului, se pierde n timp, pe msura practicrii unor subcultivri succesive (mai ales la gru). 1.2.4.2 Embriogeneza somatic Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celular i de histogenez finalizate cu formarea unui embrion se numete embriogenez. Indiferent de tipul embriogenezei, punctul de plecare n formarea viitoarei plante este o unic celul. Embriogeneza somatic este fenomenul prin care din celule somatice iau natere embrioni. Aadar dintr-o celul a sporofitului, pe cale sexuat se pot genera embrioni care se aseamn foarte mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicrii repetate a unei celule somatice i nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative. Embriogeneza somatic in vitro a fost semnalat la morcov de ctre Steward i colab. (1958) i de ctre Reinert (1958, 1959). n inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adugarea n mediul de cultur a laptelui din nuc de cocos datorit citochininelor naturale, aflate din abunden n acest produs natural. Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogenez somatic s-a reuit o cotitur n cercetrile de embriologie experimental. Astfel, s-a putut stabili: -capacitatea embriogen este coninut n fiecare celul, aparent banal i c aceast aptitudine nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare; -embrionul n formare are un anumit grad de autonomie i nu este strict dependent de prezena unui anumit mediu constituit din albumen, aa cum este cazul la embrionul zigotic; -att embrionul zigotic, ct i cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute n embriogeneza clasic i anume: celula generatoare d natere la un masiv celular care, treptat sufer o succesiune de transformri denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpil sau torpedo. n embriogeneza somatic prin izolarea i detaarea explantelor se realizeaz eliberarea celulelor din intercorelaiile fiziologice n care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul plantei, moment n care se rup nu numai legturile trofice i fitohormonale avute, ci se sisteaz i eventuala prezen a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimic controlau i blocau dezvoltarea haotic a celulelor unui organism. 1.2.5 Habituaia sau anergismul Habituaia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se refer la totalitatea schimbrilor ereditare survenite spontan, la un moment dat, n raport cu cerinele de aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacie, de rspuns, a materialului biologic, la anumii fitoefectori, regulatori de cretere sau vitamine, prezeni n mediul de cultur. Habituaia nu se refer numai la reacia inoculilor n raport cu fitohormonii exogeni, ci privete o gam mai larg de probleme, unele dintre ele nencadrate nc n aceast categorie de manifestri fiziologice. Astfel, explantul detaat, lipsit de punctul vegetativ (dominana apical), trece prin transformri particulare, specifice noii stri fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980). Mecanismul habituaiei este nc necunoscut. Se tie doar c, exist anumii factori de mediu care favorizeaz instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) i temperaturile ridicate.

1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor i tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser (Gautheret, 1980). Se apreciaz c, n cazul acestui fenomen, n anumite condiii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare, nlocuindu-se aerul din ele. n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. Ele sufer transformri morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. Aspectul general este degenerat. Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celulele difereniate n cele dou esuturi, palisadic i lacunar. Meristemele lstarilor vitrificai sunt mai mici dect la cei normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin. S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau se reduce foarte mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraiei de agar la 11,1% reduce vitrificarea (Orlikowska, 1985). Concentraii mai mari de 0,8% de agar duc ns la scderea ratei de multiplicare i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.

CAPITOLUL II 2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO

Tehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la aceeai premiz: posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu (temperatur, lumin, compoziia mediului de cultur, pH, umiditate) necesari fragmentului de plant inoculat n condiii artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce ntr-o anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari (micropropagarea). Tehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui numr de probleme: -meninerea unui explant viabil i activ din punct de vedere vegetativ; -permiterea creterii normale a unui explant reprezentat de o structur organizat (meristem, vrf de cretere sau mugure); -inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe sau embrioni somatici; -inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor explante formate din celule difereniate (fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.) rezultnd o nou organizare tisular; -inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus. Aceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de cretere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. Aceste substane par a determina orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima atenie atunci cnd se ncearc explicarea unor fenomene fiziologice.

2.1.1 Regulatorii de cretere Existena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut. Numeroase lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu leau putut identifica dect mult mai trziu. Primii fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa auxinelor, n jurul anului 1934, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii 50. Aceste trei tipuri de regulatori de cretere exercit o aciune stimulativ asupra metabolismului celular. Exist i substane cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat n anul 1965 i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. De asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor. Aceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. Exist i fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali, prezentnd o aciune fiziologic similar. Toate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de cretere i au anumite caracteristice comune: -acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt toxice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide; -acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de balana hormonal stabilit ntre ei; -intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de aciune astfel nct noiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonat. O diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali const n faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminai suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor practice. 2.1.1.1 Auxinele Auxinele au fost descoperite n urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae. Numele de auxine provine din grecescul auxein a crete, determinnd elongarea celulelor (auxesis cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul de celule). Este un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C10H9O2N cunoscut sub numele de acid - indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul - indolil acetic A. Proprietile fiziologice ale auxinelor

Auxinele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de concentraiilor i de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva din efectele lor s-a putut concluziona c: -exercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz creterii plasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. Apoi rezistena peretelui scade i celula crete n lungime; -modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descrcare de ioni de H+, determinnd o cretere a aciditii responsabil de diminuarea rezistenei peretelui celular i o absorbie de ioni de K+; -influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza ARN-ului ribozomal (ribozomii particip la sinteza proteinelor); -stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial (acest tip de aciune a determinat insuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus; -acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimb n reglarea nivelului de auxin cel puin la nivelul vaselor conductoare; -acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particular asupra fenomenelor de dominan apical; -determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor; -au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale destinate comerului de flori tiate; Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a auxinei deoarece concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funcie de concentraia celorlali fitoregulatori. Modul de aciune al auxinelor. Nu se poate da un rspuns precis, dar cercetrile n domeniu au evideniat existena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii: -n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacie n concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon; -n funcie de afinitatea receptorului pentru auxin unii sunt angrenai mai repede dect alii. Au fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici se poate extinde ideea existenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni. B. Auxinele n plante Toate plantele sintetizeaz auxine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere. Auxinele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce nseamn c auxinele sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez. Astfel, auxinele sunt prezente ntr-o concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor. C. Auxinele sintetice De cnd au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora, care au generat n celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirm

existena receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenai mai puin de activitatea auxinenzimelor , vor putea avea un efect prelungit n plante. Printre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt: -acidul.indolil butiric (AIB); -acidul naftalen acetic (ANA Fig.2) i derivaii si: acidul naftooxiacetic (ANOA) i naftilacetilamida (NAD); -acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen -acetic n practic, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puin toxice dar i mai puin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de aciunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dac implic un risc mai mare de toxicitate. n aplicaiile agricole, compuii auxinici sunt folosii pentru cicatrizarea rnilor rezultate n urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea cderii frunzelor sau a fructelor pn la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic. i n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane urmrindu-se n principal efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe care acestea le genereaz. 2.1.1.2 Giberelinele Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evideniat nainte ca acestea s fie identificate. Primele observaii (1926) au fost fcute pe plante de orez atacate de o ciuperc (Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult elongate i frunze clorotice. Extractul apos din ciuperc a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenei unei substane responsabile de aceste efecte. Prima giberelin identificat a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat n 1939 i numit giberelina A). Aceast prim descoperire a fost urmat de descoperirea altor gibereline pn cnd n plante i n ciuperci au fost identificate n total aproximativ cincizeci de gibereline. Acetia sunt toi compui endogeni. n practic, giberelinele folosite sunt extracte purificate. Cea mai folosit giberelin este GA3 (Fig.3) i mai puin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau GA7. Este posibil ca n urmtorii ani s fie folosite gibereline sintetice, avnd n vedere c primele gibereline sintetice au fost obinute prin anii 80.

Fig.3 Acidul giberelic Toi aceti compui au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate i poziia substituenilor n nucleu. A. Proprietile fiziologice ale giberelinelor Proprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posed aceleai gibereline. Principalele proprieti ale acidului giberelic sunt: -acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate spectaculoase (ex: s-au obinut plante de varz cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge talii normale n urma aplicrii de GA3, n general varietile pitice nu reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie (cu 15 pn la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate (ex: la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe); -n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor, care, n absena acestora, prezint un aspect globular; -stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea -amilazei, o enzim cu rol n transformarea amidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un receptor. Giberelinele acioneaz, de asemenea, n prezena auxinelor, i sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor; -acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce necesit temperaturi sczute pentru a nflori, astfel nct n prezena giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute (morcov). La alte specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor (sfecl). Aceste contradicii n aparen au o explicaie simpl: n plantele prezentate mai sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra procesului de nflorire. Astfel, giberelinele, i exercit doar rolul de stimulatori ai elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale; -acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin, prun; -exercit o aciune complex asupra germinrii seminelor sau pornirii n vegetaie a mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice (temperaturi sczute) nu permit acest lucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor la Hydrangea; -n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. Par a se opune fenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop, acionnd ns

asupra meristemelor apicale sau axilare i asupra butonilor florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora. B. Giberelinele n plante Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o distribuie inegal. Unele gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n ciuperci i unele n ambele grupe (acizii giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afl i acioneaz mai multe tipuri de gibereline. Locurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte tinere, n mugurii foliari i florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n embrioni. Giberelinele circul liber prin plant fr existena unei polariti fiind asociate deseori zaharurilor, eliberndu-se n situsurile int. 2.1.1.3 Citochininele Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra esuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut faptul c adiia de lapte de nuc de cocos n mediile artificiale de cultur are un efect favorabil asupra multiplicrii celulare i n lstrire. Cercetrile ce au ncercat s descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelor i n 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substan activ numit chinetina. Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compui endogeni: -zeatina (Fig.4) -izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt: chinetina (Kin Fig.4) (6furfurilaminopurina) i benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b) Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cu zaharuri. A. Proprietile fiziologice ale citochininelor Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care: -au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. n acest proces citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fr aciunea auxinelor, cele dou complementndu-se reciproc. Auxinele favorizeaz duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor; -au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind ns antagonice rizogenezei;

-exercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sinteza proteinelor, prin rolul ce-l joac n compoziia ARN-ului de transfer i protejnd metaboliii de aciunea enzimelor hidrolitice. Acest efect determin ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic; -exercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea axilar; Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitro deoarece au permis obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. Proprietile citochininelor permit rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere. B. Citochininele n plante Prima citochinin endogen a fost identificat n 1963 n embrioni imaturi de porumb, de unde i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina (IPA), descoperit puin mai trziu n plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conin citochinine sintetizate n special n rdcini i n embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determin atragerea substanelor nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creterea n dimensiuni a tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor endogene localizate n aceste organe. Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr polaritate. Se presupune ca ele circul ntr-o form inactiv i c rmn localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca n cazul aplicaiilor pe frunze. 2.1.1.4 Etilena Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n ncperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de cretere nu a fost evideniat pn n momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz n plante. Etilena se afl n plante n cantiti infime i poate fi produs de toate prile acesteia.

Fig.5 Etilena Principalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt: -determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosit la nceput pentru coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire; -accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit atunci cnd se urmrete recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini; -induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosit n horticultur; -modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o exercit asupra polaritii transportului auxinelor; -are aciune favorabil asupra tuberizrii. Aceste proprieti au unele puncte comune cu auxinele (nflorirea Bromeliaceaelor, corelaii de cretere) iar unele antagonice (cderea frunzelor i fructelor, tuberizarea).

Aciunea antagonic a etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia i circulaia lor. Aplicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcut progrese doar dup descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetreaz esuturile, unde se elibereaz etilena. Toate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai mare se sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite. 2.1.1.5 Inhibitori ai creterii Multe substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substanele endogene enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

A. Inhibitorii fenolici Inhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i intervine n multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca inhibitori ai reaciilor metabolice. Ei intervin n inducerea strii de laten a mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii acestora urmat de stoparea total a acesteia. Nu se tie exact rolul i mecanismul lor n inducerea strii de laten. n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n mediul de cultur, unde se oxideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea n unele medii de cultur se utilizeaz substane anti-oxidante sau adsorbani pentru a detoxifia mediul. Exist cteva exemple referitoare la folosirea substanelor fenolice n cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la altoii de mr. B. Acidul abscisic Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat n 1965 i de atunci a fost descoperit n toate plantele. Acest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat cnd o plant este supus unor condiii stresante (lipsa apei, rnire, cldur excesiv). Existena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic. ncetinirea activitii plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres sunt trectoare i poate induce starea de laten sau chiar decesul plantei atunci cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic Proprietile acidului abscisic sunt similare celor ale compuilor fenolici. Astfel, cele mai importante proprieti ale acidului abscisic sunt:

-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor; -determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu, ceea ce poate influena nchiderea stomatelor; -acioneaz asupra nfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurt cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula nflorirea (Plumbago). n cazul n care plantele de zi scurt sunt supuse unor condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora. Aplicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaii pot conduce la supoziia c nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este prea simpl pentru explicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic. Acidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie de speciile folosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte diferite i greu de interpretat. Concluzii Regulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul vieii acestora, dar prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se schimb n cursul diferitelor stagii fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeai etap fiziologic. Variaia continu n plante a coninutului n regulatori de cretere determin problemele legate de alegerea momentului de recoltare a explantului. Tehnicile de cultur in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai importante sunt auxinele i citochininele. Raportul citochininauxin influeneaz procesele fiziologice din explante, determinnd evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de concentraia celor doi fitohormoni. Astfel, dup Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi: -dac raportul auxine citochinine este mare, se induce rizogeneza; -dac raportul este subunitar se induce lstrirea, explantele tind spre o funcionare caulogenic; -dac raportul este apropiat de unitate, explantele au tendina s genereze formaiuni calusare. Aceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac exist variaii n funcie de tipul de explant i mai ales n funcie de specia luat n cultur. Pe lng aceti fitoregulatori principali exist i ali regulatori de cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar n cele mai multe cazuri acetia au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i de a reproduce un individ ntreg similar plantei donor. Aceast capacitate denumit totipotena celular, indic faptul c fiecare celul deine toate informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi, proprietate ce este tot mai mult exploatat n culturile in vitro. Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru moment, s se foloseasc n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile avanseaz, cu att numrul acestora va crete. Este mai uor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil s reacioneze n condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare clonal mai mult sau mai puin semnificativ n funcie de rspunsul obinut. Micropropagarea face posibil obinerea

de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam, ns uneori este i surs de variabilitate genetic atunci cnd explantul este supus anumitor condiii. nainte de a decide criteriile de selecie ale unui explant este necesar cunoaterea evoluiei fiziologice ce va ajuta la nelegerea diferenelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plant atunci cnd este detaat de planta mam. 2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante n contextul reproducerii sexuate se poate preciza, ntr-o manier simplist, c ciclul de via al unei plante se mparte n patru stadii principale. A. Embriogeneza Embriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid. Oul astfel format este protejat de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se organizeaz la nceput ntr-o mas sferic (faza globular a embrionului), apoi se dezvolt forme simetrice reprezentnd cotiledoanele rudimentare (faza cordiform a embrionului dicotiledonat) dup care se dezvolt structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula i radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu ncepe diferenierea celular. Specializarea celulelor este nc foarte puin datorat unei funcionri programate i mai mult datorit unui program genetic ce se va pstra i n celulele mature ce n anumite condiii se vor comporta similar unor celule gametice, dnd natere unor organe sau embrioni, de aceast dat somatici. n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii celulare. Se presupune c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar i cu mediul de cultur, determin un schimb de semnale biochimice, ce moduleaz funcionarea fiecrei celule. n contextul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine ca urmare a dou cauze: pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei (fiecare celul are acelai echipament informaional genetic), n care acioneaz programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit poziionrii specifice a celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. Aceste structuri filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul. Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele sunt depozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce intrarea embrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate, putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din mediul nconjurtor. B. Stadiul vegetativ Cnd condiiile externe sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminele germineaz i din embrion ia natere o nou plant. De creterea plantelor sunt responsabile dou tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular, ce determin creterea prii subterane a plantei. Meristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte extern, epiderma de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. ntr-o seciune transversal se poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus, nconjurat de un inel de celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. Diviziunea ncepe de la inelul iniial: zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior n parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcionare ritmic programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuie

corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii) i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i clasificarea plantelor se bazeaz aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentat mai sus privitoare la diferenierea celulelor n interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar celei privitoare la meristeme. La nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n endospermul seminei, primele frunzulie, deseori conturate n interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de frunze juvenile. Planta crete i devine capabil s se hrneasc singur, rdcinile transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu regulatorii de cretere. n schimb, rdcinile primesc de la frunze substane nutritive bogate n glucozide, vitamine i de asemenea n regulatori de cretere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical Corelaiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecrei plante (arbore, tufi, tulpini ntortochiate sau mprtiate, etc). Aceast arhitectur poate fi modificat prin curarea de uscturi sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de cretere. n contrast frunzele i menin forma.

Fig.8 Meristem radicular

Aceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n general, informaii despre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab de fenomene de cretere relative dect de motenirea genetic. Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la cteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele perene. n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. Aceast succesiune, care reflect adaptarea plantei la climatul mediului nconjurtor, este determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile condiiilor de mediu (temperatur, lumin, secet, umiditate, etc). Plantele ce intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. Atunci cnd revin condiiile favorabile (latena mugurilor este indus de obicei de temperaturile sczute) rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene. C. Stadiul reproductiv Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea meristemului caulinar. Inelul iniial nceteaz progresiv s mai funcioneze i se observ c celulele centrului latent intr n diviziune activ iniiind formarea florii sau a inflorescenei. Diferenierile ncep la margini unde se formeaz staminele i prile fertile ale plantei: staminele i pistilul. Florile angiospermelor sunt considerate lstari modificai constituite dintr-un ax central i anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele i pistilul). Aceste nou program este la fel de precis ca i precedentul i se presupune c mecanismele de difereniere sunt similare. Instalarea strii generative este progresiv i la nceput poate fi reversibil, n unele condiii este posibil s se revin la starea vegetativ. Modificrile modului de aciune pot fi controlate fie de plant i n aceste condiii variaiile climatice nu au nici un efect, fie de variaiile climatice (temperatur, lumin, umiditate), caz n care planta percepe aceste variaii i drept rspuns emite stimuli ce vor direciona meristemul spre stadiul reproductiv. La unele specii, existena un timp ndelungat a condiiilor nefavorabile de mediu poate duce la mpiedicarea nfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu n viaa unui meristem, asigurnd prin fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. Aceast caracteristic permite plantei s supravieuiasc mai muli ani (Saintpaulia, cerenelGeum urbanum, cpun, etc). Dac aceste meristeme sunt induse artificial s nfloreasc, plantele nfloresc i mor comportndu-se asemeni unei plante anuale. Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor florale nu sunt concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i alte substane. Se pot cita cteva modele de culturi in vitro, n care, variind componentele mediului de cultur i proporia fitoregulatorilor de cretere s-au putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive. D. Stadiul de senescen Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele, rdcinile nu mai hrnesc planta n mod normal, schimburile de substane nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. La speciile perene, aceast etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii plante, ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic i etilena, alturi de alii).

Aceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii unei plante ne permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor. Astfel, interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor vegetative i regenerative. Alt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit plantelor s recunoasc mediul nconjurtor i variaiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea s se adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. n cursul deplasrii lor fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice existente n plante. Aceste interaciuni sunt de aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de cretere evolueaz continuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului nconjurtor al celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. Datorit acestui fapt, la recoltarea unui explant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i de mrimea i natura fragmentului excizat. 2.2.2 Selecia explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei mam n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor explantele pot reaciona diferit la condiiile culturii in vitro. n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivit de explante, potenialul de adaptabilitate al explantelor la condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta plantei mam. n cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizai din ovul i inoculai pe mediul de cultur dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ normal i complet. Aceast tehnic prezint un interes sczut atunci cnd se are n vedere micropropagarea (potenialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu excepia cazului strict de autogamie). Pe de alt parte, aceast tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. n unele cazuri, de ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot fi avortai sau mor imediat n ovul, aceast tehnic permite creterea i dezvoltarea normal a acestor embrioni. esuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din explante btrne. n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut. Dup germinarea n stadiul juvenil, esutul prelevat prezint un rspuns favorabil in vitro i este sursa multor succese n domeniu. Odat cu naintarea n vrst a plantei donor, potenialul de cultur in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminueaz. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene, i n mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este msurabil, cu excepia arborilor aduli. n acest stadiu, totui, pentru multe specii, iniierea culturii doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul tnr acetia au o capacitate rizogenic ridicat. Exist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i arboricole: -una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i arboricole. n acest caz lstarii par a avea caracteristici juvenile i nrdcineaz mai repede (de exemplu la nuc i eucalipt). La aceste specii esuturile de origine ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorit faptului c se afl n apropierea rdcinilor; -a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i arboricole tropicale i a coniferelor. Aceast tehnic permite rejuvenilizarea i obinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din smn. Altoiul

crete i este apoi nlturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire. La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuli ce se formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a meristemului la vi de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizarea observat este deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie. ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmatice sau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii de noi celule. Mecanismele exacte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure. Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul de funcionare al meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro. Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen, dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete. 2.2.3 Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se poate distinge un stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi. De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. Primvara organele cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul auxinelor, giberelinelor i citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se sintetizeaz inhibitorii creterii. De aceea, nu e surprinztor faptul c explantele, prelevate de la aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe acelai tip de mediu. De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n anumite faze de vegetaie, n special dac sunt excizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de auxin este maxim. La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizrii se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cu temperaturi sczute, unui regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern n vederea stimulrii rizogenezei. 2.2.4 Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor Dup determinarea stadiului i perioadei optime explantele pot fi prelevate. Dup tipul de organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in vitro se pot lua n considerare dou cazuri:

1.Explantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor, apexurilor caulinare, meristemelor i apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniierea unei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme, genernd cu uurin, n condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dac mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantului i conduce la dediferenierea celulelor, genernd calus. Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este tehnica cel mai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii. Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie a tipului de cretere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care corelaiile de cretere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu erecte. Unele cercetri au evideniat faptul c aceast memorie aparine celui mai apropiat internod de lng meristem. 2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin, frunze, flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic. Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei sunt capabile s urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. Dar, n acest caz, diferenele ntre specii sunt uriae. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile s regenereze din toate prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obinute doar din fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuindu-se iniierea culturii de esuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane. n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar i tulpini tinere. 2.2.5 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ct explantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant i mediul de cultur va avea o influen limitat. n cazul explantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n sensul dorit se face mai uor, deoarece explantul este receptiv la substanele din mediul de cultur, i anume la regulatorii de cretere existeni. Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favoriza creterea, sau n cazul diferenierii axilare, va bloca creterea apical. Pentru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni foarte mici, exist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii foliare. Sub aceast mrime supravieuirea explantului este foarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor. Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulri uoare a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 i 7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri de rezultate: unele explante s-au vetejit, iar altele au format doar rdcini. Fr ndoial, n

ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai important rol, pe cnd n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii endogeni. Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical, parenchim medular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal. esuturile corticale i cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. Parenchimul medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit mduv de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine i citochinine. Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerrii spre stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse. Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RSPUNSUL EXPLANTELOR N CULTUR

Prima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro este meninerea viabilitii (pe lng problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, dup fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact direct cu mediul de cultur, fenomen datorat oxidrii substanelor fenolice sintetizate n mediu, oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant i mediul de cultur. Nu toate speciile prezint fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parial rezolvat prin imersia explantelor ntr-o soluie antioxidant (soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat dup fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur a unor substane adsorbante sau detoxificante, cum ar fi crbunele activ (1 pn la 4 g/l) sau polivinilpirolidon (5 pn la 10g/l). Odat rezolvat aceast problem este necesar orientarea explantului, n funcie de natura sa, n direcia dorit de operator. 2.3.1 Explante cu structur rudimentar Explantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode. Prima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur a fitohormonilor din clasa auxinelor i/sau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga i citochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic. Dup iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante s rmn de dimensiuni mici, deoarece dac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic existena unui dezechilibru ntre substanele minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. Dup formarea calusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o ran) se formeaz prima frunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe dou medii succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutire). Al doilea mediu, mbogit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), servete ca mediu de nrdcinare (Actinidia, mr, numeroase specii lemnoase).

A doua metod const n blocarea creterii apexului caulinar favoriznd regenerarea i dezvoltarea lstarilor laterali (axilari), caz n care mediul de cultur este adiionat cu citochinin (de la 1 la 10mg/l). Lstarii regenerai pot fi izolai i crescui pe mediu pentru cretere, fr hormoni sau cu acid giberelic n concentraie mic. n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultur pentru nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu auxine. Utilizarea acestui tip de explante este important deoarece asigur posibilitatea efecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate. 2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de esut Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr o organizare structural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpin, frunze, rdcini) sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct). Celulele ce rspund la cultura in vitro trebuie s treac prin procesul de dedifereniere, adic sa se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. Acest tip de reversie este mai uor de obinut la celulele vegetale i mai greu la cele animale. Observaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin n procesul dediferenierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se mrete, citoplasma devine mai dens. Dup realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a auxinelor. n al doilea stadiu, numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu vacuole mici i nucleu voluminos. Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o mas meristematic ce se va dezvolta ntrun nou individ. Observnd un explant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele ce ncep s se divid i s se dediferenieze. Dac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i deci tot explantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o poziie precis, de exemplu la Begonia rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilor glandulari. n general celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, n special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. Aceste celule se vor organiza ntr-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia i Saintpaulia. La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus (calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule. Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i explantele organizate, doar c se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul. Al doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogenez somatic. Acest fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene. Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur de compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare. n multe cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv (Fig 9).

n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii ajung n stadiul globular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion capabil s genereze o plantul (Fig 10). Pentru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii de cultur. Primul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor. Uneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are loc diluia fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regenerai din calus Utilizarea explantelor difereniate este foarte avantajoas deoarece sursa de explante este nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. n funcie de rspuns, aceste explante prezint unele dezavantaje la nivel genetic. n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i exist probabilitatea ca celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) n stadiul globular, b) n stadiul cordiform, c) genernd o plantul n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz n care, datorit ritmului intens de diviziune celular numeroase celule pot prezenta modificri la nivel genetic (modificri cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificri citoplasmatice). Aceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri a fost chiar folosit pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii calusului pe medii adecvate fitohormonal i chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creterea

probabilitii mutaiilor. Dup fragmentarea calusurilor i inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat c printre plantulele neoformate unele prezentau modificri morfologice evidente mai ales citoplasmatice. n consecin, de fiecare dat cnd propagarea unei specii necesit trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calitii genetice a plantelor obinute. Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au pornit de la explante difereniate au permis nelegerea modului de aciune al fitoregulatorilor de cretere, a cror echilibru n mediul de cultur este determinant pentru orientarea celulelor s funcioneze ntr-un ritm ales de operator, innd cont de echilibrul endogenic. Nu se tie nici n prezent care este modalitatea de a determina exact concentraia i balana hormonal atunci cnd se apeleaz la fitoregulatori exogeni, dar pe de alt parte, acetia din urm permit cercettorilor manipularea materialului biologic n sensul dorit. Aceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n realizarea multor aplicaii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a nceput s fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III 3.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE CELULE I ESUTURI VEGETALE
ncperile destinate cultivrii in vitro a explantelor vegetale trebuie s fie: luminoase, lipsite de igrasie, s prezinte instalaii de iluminare, canalizare, curent electric, toate n perfect stare de funcionare. Orice defeciune poate perturba desfurarea normal a lucrrilor efectuate n acest laborator. n toate compartimentele laboratorului trebuie asigurat o curenie perfect, praful i murdria constituind surse de infecii. Toate operaiunile, cum ar fi: repartizarea mediilor de cultur, prelevarea, dimensionarea i inocularea explantelor vegetale se realizeaz n condiii aseptice. O condiie esenial n reuita unei culturi in vitro const n realizarea unei asepsii perfecte, att a materialului biologic ct i a mediului de cultur. n cazul n care aceast asepsie nu este asigurat, n mediul de cultur pot aprea infecii microbiene i fungice n circa 2-5 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietilor substratului de cultur, eliberarea de toxine, modificarea pH-ului i astfel dezvoltarea explantelor este inhibat. 3.1.1 Organizarea spaiilor ntr-un laborator de culturi in vitro Laboratorul de culturi in vitro trebuie s cuprind mai multe ncperi, grupate n funcie de lucrrile care se execut n ele, n dou zone: -zona nesteril cuprinde: spltorul, camera de distilare a apei, laboratorul de preparare a mediilor, laboratorul de testare a infeciilor, camera pentru sterilizarea sticlriei i a mediilor de cultur, camera de cretere, camera frigorific, camera de aclimatizare, ser i solarii; -zona steril este constituit dintr-o camer sau incint steril. Dimensionarea ncperilor i dotarea lor cu aparatur depinde de specificul muncii prestate (cercetare, producie sau miniproducie).

A. Zona nesteril 1.Spltorul Destinaie: este ncperea n care are loc splarea sticlriei i recipientelor destinate culturilor in vitro. Aceast ncpere trebuie s fie organizat astfel: -s fie prevzut cu ciment pe jos i cu canalizare n pardoseal; -splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, n funcie de volumul de munc existent n laborator; -s fie dotat cu o chiuvet cu ap cald i rece, suporturi pentru uscarea sticlriei, dulapuri pentru depozitarea sticlriei, couri pentru gunoi; -poate s fie dotat i cu un distilator pentru ap. Modul de splare: -se pregtete sticlria care urmeaz a fi splat; -se elimin resturile de mediu i resturile vegetale din vasele de cultur; -mediile de cultur cu agar se colecteaz i se arunc la gunoi; -n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte de a fi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator; -se pune sticlria la nmuiat n ap cald cu detergent, n bazinele destinate splrii; -se efectueaz splarea propriu-zis folosind perii utilizate n splarea sticlriei; -se cltete sticlrie n ap de robinet i apoi n dou reprize de ap distilat; -se aeaz sticlria pe suporturile speciale destinate uscrii acesteia. Se consider sticlria curat atunci cnd la suprafaa acesteia nu mai ader nici o pictur de ap. 2.Camera pentru sterilizare Destinaie: este locul n care se efectueaz sterilizarea mediilor de cultur, a apei distilate i a vaselor de cultur. Organizare: -trebuie s fie prevzut cu pardosea din ciment i instalaie de canalizare, sa fie racordat la reeaua de gaze, conectat la curent electric i s posede o surs de ap; -este dotat cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate; trebuie s existe dou tipuri de autoclave: unul conectat la reeaua de curent electric (fig. 1) iar cellalt avnd ca surs de energie gazul metan; sterilizarea vaselor cu mediu de cultur se realizeaz n casolete metalice sau couri de srm; -n unitile cu activitate mai redus sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate se poate face i n kukte; -este dotat cu etuve pentru sterilizarea sticlriei. 3.Camera pentru prepararea mediilor de cultur Destinaie: este ncperea n care se realizeaz prepararea mediilor de cultur. Organizare: -trebuie s fie spaioas i iluminat corespunztor; -trebuie s fie dotat cu instalaii de canalizare, curent electric, gaz, ap curent; -pardoseala trebuie s fie acoperit cu un material uor lavabil, iar mesele s fie placate cu faian sau folie melaminat pentru a fi uor de ntreinut; -aceast ncpere va fi dotat cu etuve, pupinele pentru presterilizarea instrumentarului, agitatoare magnetice, bi marine, pH-metru (Fig.2), frigider, congelator,

distilator (Fig.3), balan tehnic i balan analitic (Fig.4), precum i un variat sortiment de sticlrie. 4.Camera de cretere Destinaie: este destinat pstrrii inoculilor n condiii optime n vederea creterii i dezvoltrii acestora. Organizare: -trebuie s fie perfect curat, faianat, bine izolat de mediul extern, dotat cu instalaie de curent electric, sistem de climatizare; -camera va fi ocupat cu rafturi pe care se aeaz vasele de cultur, avnd polie situate la distane de 40-50 cm, fiecare poli avnd sistem de iluminare ce poate fi ntrerupt separat; -iluminarea se realizeaz cu tuburi fluorescente, realiznd o intensitate luminoas de 3000-4000 luci; -fotoperioada n camera de cretere trebuie s fie, de regul, de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric; studii recente (Teodorescu Al. i colab., 1994,1995) reliefeaz c durata zilei poate fi redus fr probleme la 10-12 ore realizndu-se astfel importante economii de energie; -nivelul temperaturii trebuie s fie, n general, ntre 22-24oC; n funcie de specie, scopul urmrit i tipul de cultur aceasta poate varia ntre 15-30oC; -umiditatea din camera de cretere trebuie s fie cuprins ntre 70-75%; reducerea umiditii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultur cu consecine grave asupra plantelor; -pentru culturile pe mediu lichid, n camera de cretere trebuie sa existe unui sistem de agitare, pentru asigurarea oxigenrii esuturilor explantului inoculat. B. Zona steril Camera steril Destinaie: n aceast ncpere se execut repartizarea mediului de cultur precum i prelevarea, sterilizarea i inocularea explantelor sau subcultivarea materialului biologic crescut in vitro. Organizare: -trebuie s fie ct mai izolat de restul ncperilor din zona nesteril pentru a prentmpina vehicularea germenilor; -trebuie s fie prevzut cu instalaii de gaz, curent electric, dar fr ap curent i canalizare; -pardoseala va fi placat cu gresie, iar pereii cu faian; -cea mai important dotare din camera steril este hota cu flux de aer steril; sunt dou tipuri de hote cu flux de aer orizontal i flux de aer vertical, ambele fiind dotate cu baterii de filtre ce permit reinerea particulelor mai mari de 0,2 micrometri; ele trebuie s permit lucrul a dou persoane concomitent; cele mai folosite sunt hotele cu flux de aer orizontal; -hota cu flux de aer steril trebuie s posede sistem propriu de iluminare i posibilitatea atarii a 1-2 becuri de gaz; -nainte de nceperea lucrului cu cel puin 20 minute hota se pornete pentru a se realiza sterilizarea incintei de lucru; n acelai timp se pune n funciune lampa UV i se pulverizeaz alcool n interiorul hotei; -alte dotri n camera steril sunt: scaune rotative pentru personalul care lucreaz la hot, dulapuri pentru sticlria steril, cuptor cu microunde, msue pentru depunerea vaselor cu medii i a celorlalte materiale folosite n perioada de lucru;

-nainte de nceperea lucrului personalul se va spla pe mini n antecamer, iar n camera steril se va clti cu alcool i va purta echipamentul specific: halat alb, boneta i masc pe figur. 3.1.2 Dotrile necesare ntr-un laborator de culturi in vitro Sticlria Se utilizeaz toate tipurile de recipiente de sticl, folosite ntr-un laborator de chimiebiologie. Este bine ca vasele s fie din sticl termorezistent de tip Pyrex sau din silicat de bor. ntr-un laborator sunt necesare pipete, cilindri gradai, baloane cotate, pahare Berzelius, pahare Erlenmayer, plnii, vase Petri, sticle i borcane pentru reactivi. Se are n vedere tipul de vase utilizate pentru inocularea materialului biologic, pentru a evita pasarea repetat a plntuelor chiar dac mediul de cultur nu a fost epuizat, ceea ce conduce la risip de substane chimice. De reinut: orice recipient nou din sticl elibereaz, cu ocazia primei utilizri, compui toxici n mediul de cultur. De aceea, se recomand ca sticlria nou s fie splat cu ap i detergent i apoi limpezit, dup care se umple cu ap bidistilat i se autoclaveaz de 2-3 ori cte 30 minute. Dup aceast operaiune se poate utiliza n inoculri. Din ce n ce mai des, pentru inoculri, se folosesc vase speciale din material plastic autoclavabile i cutii Petri din material plastic de unic folosin, care sunt livrate steril. Aparatura i dispozitivele Dotrile necesare ntr-un laborator de culturi in vitro sunt (Fig.11): -hota cu flux de aer steril; -autoclav; -aparat de distilat i bidistilat apa; -frigidere de mare capacitate; -agitatoare magnetice; -balane analitice i tehnice; -pH-metru; -etuve; -microscoape i lupe binoculare; -centrifug; -aparat pentru repartizarea mediului de cultur; -aparat de fotografiat. Instrumentar n lucrrile de culturi in vitro se lucreaz cu instrumentar de tip chirurgical: -pense de diferite forme i mrimi; -foarfeci; -bisturie, cuite, lame de ras; -ace, anse, seringi. Substane necesare n laboratorul de culturi in vitro se utilizeaz o serie de substane: -sruri anorganice; -compui organici; -reactivi de uz comun; -substane indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal; -alte materiale chimice: detergeni, spunuri, praf de curat, alcool, amestec cromic.

Fig.11 Dotrile necesare ntr-un laborator de culturi de celule i esuturi vegetale a) etuv; b) pH-metru; c) microscop binocular; d) lup binocular; e) distilator; f) balan analitic; g) centrifug; h) balan tehnic; i) autoclav

CAPITOLUL IV 4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR VEGETALE CULTIVATE N CONDIII ASEPTICE
4.1.1 Mediul de cultur Explantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta donator, au nevoie de condiii speciale de cultur, s fie protejate de agenii patogeni (asepsie total) i s aib ca surs de hran o soluie nutritiv complex, format din ap, sruri minerale, substane organice i fitohormoni. Pentru meninerea explantelor la suprafa i pentru ca acestea s nu fie asfixiate, mediul de cultur se solidific cu un agent de solidificare. Soluia nutritiv complex lichid sau solid se numete mediu de cultur sau substrat de cultur. Acest mediu de cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie complex deoarece explantul nu are capacitate de a se hrni autotrof, el triete heterotrof pe baza substanelor existente n mediu. n funcie de scopul urmrit, evoluia explantului poate fi dirijat prin modificarea compoziiei mediului, obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei. Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi i faz de dezvoltare, cerinele fiind diferite i n funcie de explantul folosit, momentul de prelevare i zona din care s-a prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi. n prezent se cunosc i se utilizeaz o serie de medii de cultur ce poart numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul 4.1). Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite substane, ct i prin studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii privind absorbia i desorbia, schimbul ionic care exist ntre plant i mediul nconjurtor. n prezent se cunosc destul de bine modificrile pe care le sufer plantele cnd elementele chimice sunt n exces sau n deficit. Trebuie evitate pe ct posibil aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp, ct mai ales la culturile in vitro. 4.1.1.1 Compoziia chimic A. Compuii anorganici i rolul lor Apa Apa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. Este utilizat n tot fluxul tehnologic de producere a plantelor in vitro, de la splarea materialului vegetal i a vaselor de cultur, pn la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la concentraia dorit. Pierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct proporionale cu cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante dac este de scurt durat i dac nu se atinge nivelul de vetejire. n aceast ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse n condiii favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor. La culturile in vitro exist momente cnd explantele pot s-i piard turgescena prin pierderea apei, momente n care trebuie acordat atenia cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii. Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de vedere, deoarece soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor patogeni. Trebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare i concentraia soluiilor utilizate n funcie de starea

de vegetaie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoz. Prelevarea explantelor trebuie fcut repede, altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin rnile care sunt mari comparativ cu mrimea lui. Manipulrile sub hot trebuie fcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidrateaz relativ uor explantele care stau descoperite. Pe timpul creterii explantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie nchise pentru a evita pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina concentrarea mediului n elemente nutritive, ar provoca crparea mediului i ca atare slaba cretere a culturilor. Pentru respectarea strict a concentraiilor soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii minerali pe care i conine. La splarea materialului vegetal dup sterilizare se folosete ap steril, sterilizare ce se face n autoclav odat cu sterilizarea mediului sau separat. Srurile anorganice Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele mai utilizate sunt: azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbia elementelor din mediu se face sub form de ioni, utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de cerinele fiecrei specii i de faza de vegetaie. n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n mediu, elementele se mpart n: -macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor C, O, H, N, K, Ca, P, S, Mg; -microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli. Tabelul 4.1 Principalele medii de cultur utilizate n culturi in vitro (dup Street, 1977)
Constitueni Heller White Nitsch mg/l Macroelement KCl NaNO3 MgSO4 x 7H2O NaH2PO4 x H2O CaCl2 x 2H2O CaCl2 KNO3 Na2SO4 (NH4)2SO4 NH4NO3 KH2PO4 Ca(NO3)2 x 4H2O Microelemente FeSO4 x 7H2O Na2EDTA x 2H2O MnSO4 x H2O MnSO4 x 4H2O KI NiCl2 x 6H2O CoCl2 x 6H2O ZnSO4 x 7H2O CuSO4 x 5H2O 0,01 0,01 0,03 1,0 0,03 7,0 0,75 3,0 27,8 37,3 25 10,0 0,025 27,8 37,3 22,3 0,83 0,025 8,6 0,025 27,8 10,0 0,75 0,025 2,0 0,025 750 600 250 125 75 65 720 16,5 80 200 300 185 166 950 720 68 370 440 1900 1650 170 250 150 150 2500 134 Murashige Skoog Gamborg

H3BO3 FeCl3 x 6H2O Na2MoO4 x 2H2O AlCl3 Fe(SO4)3 Constitueni organici Inozitol Acid Nicotinic Piridoxin HCl Tiamin HCl Glicin Acid folic Biotin Zaharoz

1,0 1,0 0,03 -

1,5 2,5 0,05 0,01 0,01 3,0 2%

10,0 0,25 100 5 0,5 0,5 2 0,5 0,05 2%

6,2 0,25 100 0,5 0,5 0,1 2,0 3%

3,0 0,25 100 1,0 1,0 10 2%

Diferenele ce exist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul dintre diferii ioni. Rolul fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic n care se gsete n mediu, de concentraia lui, de natura explantului. n prezent se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate care se preteaz la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat nc, trebuie fcute tatonri pentru gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru elementele minerale in vitro se manifest dup 2-3 subculturi, deci trziu, cnd nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. De exemplu N are rol important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de N duce la acumulri de antociani n vacuolele celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n metabolismul glucidelor i proteinelor. Potasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare slab. mpreun cu calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a fluiditii protoplasmei, intervine n schimbul ionic la nivelul membranelor. Magneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri grave n structura frunzei. Microelementele exercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele ale macroelementelor. Intr n compoziia multor combinaii organo-metalice complexe, cu valoare biologic ridicat de tipul enzimelor, care controleaz ntreg procesul metabolic al plantelor. B. Compuii organici Sursele de carbon Viaa in vitro este aproape n exclusivitate heterotrof, n special n primele faze ale existenei, pn la formarea unui numr suficient de mare de frunze pe fiecare plantul sau lstar. Datorit acestei nutriii heterotrofe mediul de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic necesar n metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanele cele mai utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% n funcie de faza de vegetaie i tipul de explant folosit. Dintre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor culturilor in vitro. Aminoacizii Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule i esuturi, fa de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n mediu sub form de compui simpli sau compleci. Principalii aminoacizi utilizai sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina etc.

Vitaminele Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu i esuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro esuturile i plantulele rspund favorabil la adaosul exogen de vitamine n cantiti mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i substanele reziduale au rol favorabil asupra culturii. Principalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt: -tiamina (vitamina B1, aneurina), se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,1-10 mg/l; stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in vitro; -piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, cataliznd reacii de baza n metabolismul aminoacizilor; -riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (280oC); inhibitor al creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular; -acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se folosete n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,5 mg/l; -cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosit, stimuleaz sinteza nucleoproteidelor; -acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234-237oC); rol n metabolismul intermediar; -biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimuleaz creterea esuturilor meristematice i proliferarea celulelor; -acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creterii esuturilor la lumin; la ntuneric are efect toxic; -acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimuleaz biosinteza acidului pantotenic i a biotinei; -acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge n bun parte; este activator general al metabolismului celular; -vitamina E (tocoferolul), mrete sensibilitatea celulelor la auxine; -inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l; este considerat att vitamin ct i glucid; stimuleaz diviziunea celular. Fitoregulatorii Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt substane organice utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de cretere i dezvoltare. Exist fitohormoni endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni exogeni sau de sintez. esuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de care au nevoie, fiind necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a asigura o bun cretere a explantelor. Cei mai folosii fitohormoni n culturile in vitro sunt auxinele, citochininele i giberelinele. Auxinele sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez alturi de citochinine. Auxina natural descoperit este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce i prin sintez pe cale industrial. Cele mai folosite auxine de sintez sunt: -IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic). Aciunea auxinelor este foarte complex datorit intreaciunii pe care o are cu alte substane regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi redat astfel: -stimuleaz diviziunea celular; - influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui celular;

-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni; -rol important n dominana apical; -inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare; Auxinele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze, fructele tinere i bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se folosesc ANA i 2,4D care sunt mai stabile, nu se oxideaz n prezena luminii. 2,4D este mult utilizat pentru inducerea i creterea calusului i pentru rizogenez. La calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic. Citochininele sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n fructe, semine, etc., iar ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic. Prima citochinin izolat a fost chinetina, experimentat cu succes la culturile in vitro. La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). n prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru citochinine dintre care dou naturale (2 IP i zeatin) i doua de sintez (chinetina i BAP). Efectul fiziologic al citochininelor const n: -acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de auxine; -stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus; -stimuleaz formarea lstarilor laterali; -stimuleaz sinteza proteic; -inhib formarea rdcinilor. Biosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar migrarea este dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile suportnd uor autoclavarea. Giberelinele sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i nu asupra celulei, cu rol n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai utilizat giberelin este acidul giberelic (GA3) fiind i cea mai activ. Aciunea fiziologic este urmtoarea: -produce alungirea internodiilor tulpinilor; -stimuleaz creterea frunzelor i rdcinilor. Giberelinele sunt sintetizate n frunzele i fructele tinere, n mugurii activi, n embrioni i vrful rdcinilor, circulnd n plante prin vasele liberiene. Pentru meristeme giberelina este indispensabil n vederea alungirii lor. La alte tipuri de explante nu se recomand giberelina deoarece inhib dediferenierea celular. Etilena a fost recunoscut ca fitoregulator mult mai trziu i este utilizat puin n culturile in vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel: -exercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor; -induce senescena esuturilor; -are rol n transportul auxinei; -se produce n cantiti mai mari n esuturile i celulele rnite; -inhib extensia celular. Acidul abscisic este implicat n procesele de laten a mugurilor i seminelor. Poate fi utilizat pentru: -inducerea latenei embrionilor somatici; -inducerea latenei seminelor artificiale n vederea pstrrii lor o perioad mai lung; -inhibarea creterii esuturilor i organelor pe timpul stocrii; -are rol antagonist cu auxinele i giberelinele. Agenii de solidificare Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid, utilizarea mediului lichid fiind limitat doar la unele experiene i la cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obinut din alge i are urmtoarele caracteristici:

-formeaz cu apa un gel care se topete la 100oC i se solidific la 45 oC, rmnnd solid n condiii normale de cultur; -nu este toxic pentru plante i nu este asimilat de plante; -nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n mediul de cultur, fa de reeta de mediu folosit; -nu reacioneaz cu constituenii mediului. Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de consistena dorit, ntre 0,5-1%. Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc: -agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru cultura protoplatilor i n prepararea gelului pentru electroforez; -acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor celulare i pentru ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii seminelor artificiale; -phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se folosete n concentraii de 1,5-2,0 % i se gelifica la 27-31oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care necesit un pH mai acid, asigurnd solidificarea mediului i n aceste condiii. C. Alte substane utilizate Adenina are rol regulator n mediul de cultur, favorizeaz formarea mugurilor adventivi, stimuleaz creterea i alungirea apexurilor ct i rata de multiplicare. Se pare c are o aciune sinergic cu a citochininelor putnd fi un precursor al acestora. De regul se folosete sub form de sulfat de adenin, n doz de 40-80 mg/l. Compuii fenolici stimuleaz creterea calusului, favorizeaz nrdcinarea, creterea lstarilor i a ratei de multiplicare. Are o aciune sinergic cu a auxinelor, n special cu AIA. Dup unii autori are rol n prevenirea degradrii auxinelor. Dintre compuii fenolici cel mai utilizat este fluoroglucinolul i procaina. Floroglucinolul este mult utilizat n multiplicarea meristematic a pomilor i arborilor, se gsete n seva brut, mai ales la mr. Procaina are rol n multiplicarea i respiraia celulelor, stimuleaz creterea biomasei explantelor, a coninutului n pigmeni, stimuleaz germinaia seminelor i creterea plantelor. Dozele utilizate sunt cuprinse ntre 0,1-10 mg/l. Substanele antioxidante se utilizeaz pentru prevenirea brunificrilor explantelor i a mediului, n special, la speciile ce conin substane fenolice n cantiti mari, evitnd oxidarea lor. Se folosesc fie ca soluii n care se ine materialul vegetal naintea prelevrii explantelor, fie se adaug n mediul de cultur. Dintre substanele antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100 mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l). Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbia i blocarea fenolilor, mpiedicnd astfel oxidarea lor cu brunificarea i moartea explantului. Se folosete n concentraii de 250-1000 mg/l. Crbunele activ este un crbune vegetal, bine mrunit ce se adaug mediului, cu scopul de a absorbi i bloca substanele toxice din mediu. Poate avea aciune i asupra fitohormonilor (auxine), blocndu-le parial efectul, are aciune de inhibare a formrii calusului, stimuleaz embriogeneza, favorizeaz formarea rdcinilor. Uneori se mai pot folosi i alte substane cu rol de a mbuntii, de a completa compoziia mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. Prezena acestora n mediul de cultur este facultativ.

4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultur Metabolismul unui esut vegetal poate fi modificat integral n funcie de consistena mediului de cultur. Rdcini de cicoare cultivate pe hrtie de filtru mbibat cu mediu lichid pot produce doar lstari vegetativi, n timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea tipului de mediu de cultur, lichid sau solid, prezint o importan deosebit. La mediul solid, concentraia de agar-agar, precum i calitatea acestuia au un efect distinct. Masa calusului de cartof se dubleaz atunci cnd concentraia de agar-agar din mediu crete de la 0,8 la 1%, iar microbutaii de anghinare prezint fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraie de agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci cnd concentraia agarului crete la 1,1%. Concentraia optim de agar variaz n funcie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului folosit i de pH-ul mediului. n general, consistena mediului de cultur crete odat cu pH-ul acestuia. Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o faz necesar n procesul de micropropagare, ca n inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus n mediu lichid. n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate n mediu lichid cu agitare pentru a induce lstrirea axilar multipl. Viteza de agitare a mediilor lichide este n general sczut atunci cnd se cultiv organe (cca 1rpm) i ridicat n cazul culturii de suspensii celulare (cca 100 -150rpm). Dac n alte tipuri de culturi nu se acord o mare importan schimbului de gaze, la culturile in vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezint o mare importan pentru inoculi. Schimburile de gaze se realizeaz prin difuzie, diferenele de concentraie ntre gazele din interiorul containerelor i cele din mediul ambiant exterior, precum i variaiile de temperatur influennd aceste schimburi. Organogeneza indirect la morcov este stimulat de reducerea concentraiei de oxigen, pe cnd nrdcinarea lstarilor a fost stimulat de creterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit c difuzia liber a oxigenului n esuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenic a acestora. Alte studii au demonstrat c intervenirea unei modificri n schimburile de gaze dintre esuturile cultivate in vitro i mediu a indus apariia unor modificri n morfologia plantulelor. De aceea, este demn de luat n considerare i tipul de vas de cultur folosit pentru culturile de celule i esuturi, precum i de capacele utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc. Un alt factor important pentru mediul de cultur i implicit pentru plntuele regenerate in vitro este pH-ul. n practic, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 n timpul preparrii mediului de cultur. Totui, n dese cazuri pH-ul mediului scade n timpul autoclavrii sau chiar n timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se tiu nc foarte puine despre efectele acestor variaii ale pH-ului i despre cauzele determinante.

4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENEAZ CULTURILE DE ESUTURI

Principalii factori ai mediului nconjurtor sunt lumina i temperatura. Umiditatea relativ este irelevant atta timp ct n interiorul vaselor de cultur aceasta atinge valori de aproximativ 100%. 4.2.1 Lumina Cerinele fa de lumin pot fi divizate n mai muli parametri:

-intensitatea luminii pe unitatea de suprafa exprimat n W/m2 (unitatea lux nu ar mai trebui folosit ca unitate de msur a intensitii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesitilor unei plante); -durata iluminrii, exprimat n ore/zi; -calitatea spectral a luminii primite de plante. Pentru culturile de esuturi, fotosinteza nu este o activitate necesar atta timp ct energia este furnizat sub forma carbohidrailor. Totui, unele cercetri au evideniat c fotosinteza nu este eliminat n totalitate din culturile de esuturi vegetale, dar este considerabil redus probabil datorit prezenei zaharurilor n mediu. Numeroase studii au dovedit c lumina este indispensabil reglrii multor procese morfogenetice. A.Intensitatea luminoas O intensitate luminoas foarte mare poate duce la pierderi importante n culturile in vitro. Utilizarea unei intensiti luminoase de 50 W/m 2 (aproximativ 10000luci) n camerele de cretere, intensitate folosit n mod obinuit n fitotron, duce la ncetinirea creterii i scderea capacitii de regenerare la multe specii vegetale. Intensitatea luminoas optim culturilor in vitro variaz ntre 5 i 25 W/m2 (1000-5000 luci) cele mai folosite valori fiind de 10 pn la 15 W/m2. deseori, n faza a treia a micropropagrii, se urmrete creterea treptat a intensitii luminoase n vederea aclimatizrii plantulelor la condiiile de lumin din fitotron. B.Durata iluminrii Nu exist multe date cu privire la influena fotoperiodismului asupra morfogenezei esuturilor in vitro, aa cum exist dovezi clare ale influenei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo. Se pare c n medie, calitatea luminii (intensitatea durata luminii) este important dezvoltrii armonioase a plantulelor n condiii aseptice de cultur. n practic, marea majoritate a camerelor de cretere au o durat a iluminrii de 16-18 ore/zi. Cerinele fa de durata de iluminare, din camerele de cretere sunt diferite n funcie de natura explantului, scopul urmrit dar i de specia la care se experimenteaz. Astfel, la gru, n cazul culturii de antere, n vederea obinerii de produi androgenetici, s-a dovedit c, anterele cultivate n primele ase sptmni la ntuneric, vor forma un procent mai ridicat de produi androgenetici. Dup aceast perioad, culturile vor fi incubate n condiii normale de fotoperioad cu 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. C.Calitatea luminii Numeroase studii au evideniat c spectrul luminos influeneaz procesele fiziologice i morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina albastr (cca 467nm) sau violet (cca 419nm) induce formarea de lstari din calus de tutun, iar cea roie (cca 660nm) induce rizogeneza. Aceste rezultatele asemntoare altora indic faptul c procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenii fotoreceptori, cum ar fitocromul. n mod normal, lumina de zi conine radiaii n principal albastre, iar lumina numit lumin alb conine radiaii roii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale de emisie ale acestora. n general, tuburile fluorescente albe aflate n comer sunt adecvate culturilor de esuturi. n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu lumin cald i tuburi cu lumin rece, astfel c, o combinaie ntre cele dou tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivit pentru culturile incubate n camerele de cretere.

4.2.2 Temperatura n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de 22-24oC. Aceste temperaturi sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur temperatura poate fi cu 2 pn la 4oC mai mare dect n camera de cretere. Practic, temperatura din camera de cretere trebuie s fie cu 2 oC mai mic dect cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt obinuite la temperaturi mai sczute dect speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate s se seteze temperatura n camera de cretere la 201 oC , iar pentru cele tropicale la 251 oC. De asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n funcie de scopul urmrit n cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat c o temperatur de cca 19 oC, influeneaz pozitiv formarea minituberculilor, n timp ce la gru, cultura de antere necesit o temperatur de cca 27oC. De aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de cel puin dou camere de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n funcie de necesitile explantelor i tipurilor de culturi existente. n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea lor n camera de cretere ar fi fr ndoial avantajoas. Totui, prea puine studii au fost fcute n aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevant.

CAPITOLUL V 5.1 ASEPSIA I ASEPSIZAREA

O condiie esenial, n realizarea culturilor de celule i esuturi vegetale, este asigurarea unei perfecte sterilizri, nu doar a mediului de cultur i a recipientelor, ci i a tuturor celorlalte componente unei culturi in vitro, cum ar fi materialul biologic, instrumentar dar i a suprafeelor n care se desfoar astfel de activiti. Cile posibile de infecie trebuie excluse cu rigurozitate. Contaminarea cu microorganisme a recipientelor, mediului de cultur i materialului biologic se poate produce foarte uor, att n faze incipiente, n momentul inoculrii, ct i n momentul repicrii culturilor; alteori infeciile se produc n mod pasiv, datorit ineficienei sistemului de nchidere a vaselor de cultur, a manipulrii lor neatente, sau a dezvoltrii ntrziate a unor germeni care au stat n stare latent n esuturile profunde ale inoculilor. 5.1.1 Sterilizarea recipientelor de cultur ntruct, o serie de microorganisme au spori rezisteni la temperaturi ridicate i la diferii ageni sterilizani, se recomand presterilizarea prin cldur uscat, a sticlriei, n etuve, prealabil introducerii mediului de cultur n recipiente. Apoi se va proceda la o resterilizare a recipientelor cu medii, prin cldur umed, respectiv, prin autoclavare. Sterilizarea prin cldur uscat se va face la 160 oC, timp de 2-3 ore, ntruct exist anumite forme de bacterii termorezistente. Durata expunerii sticlriei la temperatur ridicat depinde i de modul n care aceasta a fost splat, dac a fost sterilizat prin autoclavare, prealabil deschiderii flacoanelor infectate, precum i n dependen de gradul de infectare al atmosferei din laborator. Dac ns se depete temperatur de sterilizare a sticlriei, peste 180 oC se poate produce degradarea calitii acesteia i eliberarea de compui toxici n mediul de cultur.

Pentru a prentmpina infeciile rebele se recomand, n primul rnd o corect curire a sticlriei, prin meninerea acesteia minim patru ore n amestec cromic. Splarea se va face cu mult atenie, ntruct o splare incorect poate reprezenta primul pas n realizarea unei infecii n mas a flacoanelor cu pierderi uriae de material biologic i mediu de cultur. Sticlria nou va fi folosit abia dup splarea i autoclavarea acesteia, umpluta fiind cu ap distilat, pentru a prentmpina trecerea unor ioni din sticlrie n mediul de cultur. n unitile cu activitate intens se recomand splarea mecanic a sticlriei, ntruct astfel crete operativitatea muncii, beneficiind astfel i de o temperatur mai ridicat a apei de splare, fa de splarea manual. O foarte bun curire a recipientelor poate fi asigurat prin splarea acestora cu ajutorul ultrasunetelor. Obiectele din sticl, cutiile Petri, pipetele, lamele de microscop, se mpacheteaz n hrtie, iar pachetele se aeaz n tvi metalice i se sterilizeaz n etuv, n condiii de cldur uscat, la 120 oC, timp de 1-2 ore. Asepsizarea aparatelor introduse n hota cu flux de aer steril (microscop, lup binocular, etc.) se va face prin tergerea lor periodic cu alcool 70 o. Prentmpinarea infeciilor derivate din incorecta pregtire a recipientelor de cultur se face, n primul rnd, prin manipularea corect a acestora, avndu-se n vedere i faza de transport a lor de la autoclav pn la hota cu flux de aer steril. n condiii de producie se recomand chiar utilizarea autoclavelor cu deschidere dubl. n acest caz, recipientele de cultur se introduc n autoclav dintr-o ncpere situat n afara perimetrului steril i se vor scoate printr-o a doua u, direct n camera steril, ele fiind transportate cu un risc minim de a mai putea fi contaminate. Metodele moderne utilizate n ultimul timp presupun utilizarea recipientelor de cultur din material plastic, fie de unic folosin, livrate steril de ctre furnizor, fie reutilizabile care pot fi sterilizate prin autoclavate. 5.1.2 Sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate Dup prepararea mediilor de cultur, n cel mai scurt timp se va proceda la autoclavarea acestora. n vederea autoclavrii, vasele prevzute cu dopuri nfiletante nu vor fi nchise etan pentru a permite astfel accesibilitatea aburului nclzit n recipientele cu mediu; n caz contrar, sterilizarea mediilor se produce defectuos, doar cldura nefiind suficient n sterilizarea substratului de cultur folosit in vitro, cldura umed fiind aceea care distruge germenii. Exist diferite tipuri de autoclave, electrice sau folosind gazul ca surs de energie, cu orientare vertical sau orizontal, de capacitate mare sau mic. Esenial este ca autoclavul s funcioneze la parametri stabilii, care s asigure asepsizarea corect a mediilor de cultur, distrugnd germenii, fr a altera i degrada substanele ncorporate n substratul de cultur. n general se recomand autoclavarea mediilor i a apei distilate, la temperatura de 121 oC (echivalent cu presiunea de 1 atmosfer); durata meninerii recipientelor cu medii n autoclav depinde de volumul de lichid, respectiv de mediul introdus n flacoane, dup cum urmeaz: -vase de mediu coninnd ntre 20-50 ml 20 minute la 121oC ; -vase de mediu coninnd ntre 50-500 ml 25 minute la 121oC ; -vase de mediu coninnd ntre 500-5000 ml 35 minute la 121oC. Supraautoclavarea mediilor de cultur conduce la o alterare a proprietilor i calitilor acestora i la o deteriorare a raportului ionic. Subautoclavarea mediilor duce la dezvoltarea de colonii de microorganisme i care fac ca mediul s fie inutilizabil. Pentru a ne asigura c nu ratm o serie experimental este indicat s amnm inocularea i cteva recipiente cu mediu s le inem 2-3 zile ntr-un incubator la 37 oC. n acest mod ne vom convinge de calitatea sterilizrii substratului de cultur.

n laboratoarele de mic capacitate, care nu dein n dotarea lor autoclave, sau pentru sterilizarea unor cantiti reduse de mediu de cultur, se pot utiliza kukte n care se va introduce ap, astfel nct s se asigure umiditatea necesar formrii vaporilor. Durata sterilizrii va fi de 15-25 minute, n funcie de volumul de mediu, din momentul n care a nceput s se evacueze aburul prin supap. Deschiderea kuktei se va face dup depresurizarea acesteia. Mediile de cultur lichide pot fi sterilizate i la rece, prin filtrare. Pentru acest mod de sterilizare sunt preferate nucile filtrante din sticl cu porozitatea de 1 micron. Avantajul acestor nuci filtrante este ca se pot refolosi. Substanele termolabile folosite la prepararea mediilor de cultur (zeatina, acidul giberelic, tiamina, piridoxina ) se sterilizeaz prin filtrare folosind filtre de unic folosin (Millipor) i se adaug n mediul de cultur la o temperatur a acestuia cuprins ntre 45-50oC. Filtrele Millipor au porozitatea cuprins ntre 0,5-0,2 microni, fiind livrate steril de ctre productori, ceea ce presupune utilizarea lor numai n hota cu flux de aer steril. Sterilizarea la rece a unor substane termolabile se mai poate face i prin dizolvarea lor n alcool, eter etilic sau aceton, acestea evaporndu-se uor, dup care substana solid solubilizat se va dizolva n ap distilat steril i apoi n condiii aseptice se va aduga mediului de cultur aseptic. 5.1.3 Sterilizarea materialului biologic Proveniena materialului vegetal va constitui un prim reper n alegerea modului de sterilizare a organelor donatoare de explante. Substanele alese pentru asepsizarea materialului biologic, concentraia acestora i durata sterilizrii vor fi selecionate n funcie de calitatea materialului biologic. Estimrile de acest tip se fac fie prin aprecieri de ordin subiectiv, fie pe baza executrii unor experimente de tatonare. Gradul de infecie i procentul de viabilitate realizat n cultur ne ajut n adoptarea celei mai bune metode de sterilizare. De regul, rdcinile sau organele subterane sunt purttoare de nenumrai germeni, iar sterilizarea lor poate ridica probleme. Mugurii i tulpinile cu lenticele, precum i organele cu pilozitate ridicat prezint inconvenientul aderrii sporilor i a germenilor la nivelul formaiunilor epidermale, ceea ce creeaz serioase impedimente n sterilizare cu att mai mult cu ct, n momentul imersiei lor n soluia dezinfectant, se interpune, ntre suprafaa epidermei i soluie, un strat de aer, pelicul care mpiedic accesibilitatea dezinfectantului la epiderm. Pentru micorarea tensiunii superficiale n soluia de sterilizat se vor aduga cteva picturi de Tween 20 sau Tween 80. Dezinfectantul trebuie s fie suficient de puternic nct, n scurt timp, s distrug microorganismele aderente la suprafaa organelor dar, totodat, s nu ptrund prea mult n profunzimea acestora. O alt condiie pe care trebuie s o ndeplineasc agenii dezinfectani este aceea de a putea fi ndeprtai cu uurin de pe materialul biologic, prin splri succesive cu ap distilat steril. Dezinfectanii utilizai frecvent asigur o sterilizare de suprafa, dar foarte multe bacterii, virusuri sau micoplasme sunt localizate n celule situate n profunzimea organelor, ceea ce ridic probleme deosebit de complicate privind depistarea i prevenirea dezvoltrii lor. Pentru a reduce posibilitatea apariiei unor astfel de infecii, dar i pentru a cunoate cu exactitate natura lor, este obligatorie efectuarea unui control fitopatologic sever al plantelor donatoare de explante. La unele plante (mucate, kiwi) se pot lua msuri mai speciale de dezinfectare. Astfel materialul se introduce n alcool (96 o) dup care acesta va fi trecut rapid trecut prin flacr, iar dup aprindere va fi plonjat n ap distilat steril.

Un dezinfectant cu utilizare frecvent, cu aciune rapid i eficient este alcoolul etilic. Trebuie avut n vedere faptul c alcoolul este liposolubilizant, coaguleaz proteinele, dup ptrunderea lui n celule i cauzeaz o deshidratare puternic a esuturilor. Ca atare, fragmentele de organe vor fi plonjate un timp foarte scurt n alcool (30-60 secunde) dup care vor fi introduse rapid n ap distilat steril. Materialul biologic puternic infectat, dup splare n ap, imersie n alcool i apoi n ap distilat steril, necesit o continuare a sterilizrii cu unul dintre agenii de sterilizare utilizai frecvent (tabelul 5.1). Obinuit se utilizeaz soluiile de hipoclorit de calciu i sodiu n concentraii variabile. De regul, se procedeaz la imersia n dezinfectant a unor fragmente mult mai mari, ca dimensiune, dect viitorul inocul (pentru a proteja celulele explantului de necrozele provocate de ctre agentul sterilizant). La nivelul suprafeelor secionate, hipocloritul cauzeaz o albire a zonelor traumatizate, sub aciunea direct a clorului, ceea ce ne d i o certitudine privind eficacitatea dezinfectantului. ntruct zonele albite sunt traumatizate, respectiv distruse de ctre agentul sterilizant, ele vor fi ndeprtate, n momentul delimitrii i fasonrii explantelor. Tabelul 5.1 Agenii de sterilizare utilizai frecvent n culturile in vitro (dup Street, 1977)
Nr. crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Compus chimic Hipoclorit de calciu Hipoclorit de sodiu Ap oxigenat Ap bromat Azotat de argint Clorur mercuric Antibiotice Concentraia utilizat 9-10 % 2-5 % 10-12 % 1-2 % 1% 0,1-1 % 4-50 mg/l Uurina de nlturare +++ +++ +++++ + + + ++ Durata sterilizrii (minute) 5-30 5-30 5-15 2-10 5-30 2-10 30-60 Eficacitate f. bun f. bun f. bun f. bun f. bun Satisfctoare Destul de bun

Hipocloritul este puternic alcalin i, n unele cazuri, se recomand ca n prima cltire cu ap distilat steril s se adauge cteva picturi de acid clorhidric diluat, acidulnd astfel uor ap distilat steril; operaiunea are drept scop extragerea clorului prezent n straturile superficiale de celule. Pentru ndeprtarea soluiei dezinfectante se recomand cltirea repetat, n cinci reprize, cu ap distilat steril, a cte 10-15 minute fiecare. Att n cursul sterilizrii ct i al cltirii, materialul vegetal trebuie agitat continuu. 5.1.4 Sterilizarea ncperilor i a suprafeelor O prim msur, cu caracter preventiv, const n meninerea unei curenii exemplare n ncperile destinate laboratorului de culturi de celule i esuturi vegetale. nainte de efectuarea tuturor operaiunilor dintr-un astfel de laborator, se impune sterilizarea cu radiaii UV a ncperilor i mai ales a camerei sterile, unde se execut cea mai important etap inocularea pe medii aseptice.

Radiaiile UV vor fi ntrerupte, cu aproximativ 30 minute nainte de nceperea operaiunilor n zona steril, ntruct pericliteaz sntatea operatorilor. Ozonul acumulat n ncperi, n cursul iradierii va fi lsat s difuzeze pasiv din zonele sterilizate. Casoletele cu recipiente, coninnd mediile sterile sau flacoanele dup inoculare, vor fi stocate n apropierea surselor de UV. n cazul n care mediile, dup autoclavare, nu sunt utilizate imediat, ele pot fi pstrate pentru cteva zile n camerele frigorifice, la 4 oC. nainte de nceperea activitilor de inoculare n hota cu flux de aer steril, se terge suprafaa de lucru cu alcool 70 o, iar incinta steril se pune n funciune cu 20-30 minute nainte de orice activitate pentru ca fluxul de aer steril s baleeze suprafaa de lucru. Dac se lucreaz i se inoculeaz la cca 20 cm de flacr, pericolul de contaminare cu germeni este minim. n perioada executrii operaiunilor n hota cu flux de aer steril, este indicat ndeprtarea bijuteriilor, a ceasului i brrilor de pe mini i sterilizarea cu alcool 70 o a degetelor, insistnd la unghii. Instrumentarul cu care se va lucra n camera steril, este bine s fie presterilizat, fie n baia electric de aseptizat instrumentar chirurgical fie n pupinel, timp de cca o or, sau prin meninerea acestora sub aciune direct a razelor UV. nainte de nceperea operaiunilor, instrumentele vor fi introduse n alcool i flambate, apoi vor fi aezate pe diverse suporturi (cutii Petri sterile, tvie folosite doar n hot, etc.) pentru a se rci. Ele vor fi utilizate pentru dimensionarea explantelor abia dup rcire, n caz contrar, temperatura ridicat a acestora poate traumatiza profund explantul. Instrumentele tioase, dup introducere n alcool, se trec prin flacr, timp de o fraciune de secund, iar apoi vor fi plonjate ntr-un recipient cu ap distilat steril. Flacoanele cu medii, atunci cnd modul de obturare l permite, prealabil deschiderii lor vor fi trecute prin flacr, rotindu-se gtul acestora astfel nct flacra s ajung n contact cu toat circumferina deschiderii. Dup scoaterea dopurilor, sau capacelor, flacoanele vor fi flambate din nou, apoi se execut inoculare urmnd ca la final operaiunea de flambare s se repete. Operatorii care execut lucrri n camera steril, la hota cu flux de aer steril, trebuie s fie bine instruii din punct de vedere teoretic, s fie echipai corespunztor, cu halate albe, bonet i masc pe figur, pentru a evita expirarea direct pe materialul vegetal. De asemenea, la hotele care permit lucru a dou persoane concomitent, acestea vor evita discuiile ntre ele, rezumndu-se la strictul necesar. Este indicat ca personalul s-i spele minile cu ap i spun, nainte de nceperea activitii, dup care att nainte ct i n mod repetat, n timpul operaiunilor efectuate, s se clteasc cu alcool 70 o.

CAPITOLUL VI 6.1 INIIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

6.1.1 Aspecte generale privind condiiile aseptice de cultur Prima condiie n realizarea cu succes a unei culturi de celule sau esuturi in vitro este asepsia. Mediile de cultur sunt foarte favorabile dezvoltrii bacteriilor i ciupercilor, creterea crora este mult mai rapid dect cea a celulelor vegetale i duce la inhibarea proceselor fiziologice ale esuturilor cultivate. De aceea un laborator de culturi de esuturi este organizat i pstrat ntr-o asepsie strict asemeni unei sli de operaie. Principalele cauze ale apariiei infeciilor n culturile in vitro sunt: 1) Aerul care conine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.

2) esuturile vegetale sunt acoperite la suprafa cu fungi i/sau bacterii. Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvolt n pmnt (rdcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile i ciupercile se dezvolt i n interiorul esuturilor, n vasele conductoare libero-lemnoase sau n spaiile intercelulare, caz n care este imposibil sterilizarea esuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este recomandat. 3) Corpul uman, care poart numeroase microorganisme pe piele sau n respiraie. Metodele de eliminare ale acestor surse de infecie sunt: a) Produsele chimice, care distrug microorganismele: -hipoclorit de sodiu; -hipoclorit de calciu; -mercurobutol; -clorid mercuric; -produse bactericide i fungicide; -etanol 70-80%. b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), cldur umed pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, cldur uscat (etuv) pentru sterilizarea sticlriei. d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori. e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai mari de 0,22m. Filtrarea este realizat de un ventilator-extractor ce asigur o ventilaie constant cu o vitez optim i are avantajul de a menine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. n momentul de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flux laminar de aer steril. 6.1.2 Prepararea mediului de cultur Datorit faptului c n prepararea unui mediu de cultur intervin mai muli factori este necesar alctuirea unei liste de materiale nainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparrii se vor bifa, pe rnd, toate elementele msurate i introduse, inndu-se seama cu strictee de volumul final al mediului. Se vor nota cu atenie toate detaliile legate de proveniena substanelor chimice sau a soluiilor stoc, erorile, coreciile, proveniena agarului, calitatea apei. n aparena sunt factori ce nu prezint o mare importan, dar n realitate succesul unei culturi depinde ntr-o foarte mare msur de calitatea mediului i implicit de factorii menionai mai sus. Etapele preparrii unui mediu de cultur sunt: 1)Diluia srurilor minerale: macro- i microelemente, apoi ajustarea la volumul final. 2)Msurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; n general pH-ul este de 5,5-5,8. 3)Adiia zaharurilor (sucrozei) urmat de adiia agarului, care se adaug n ploaie n timp ce mediul este amestecat tot timpul. 4)Sterilizarea mediului de cultur la 120oC ntre 20-30 minute, n funcie de cantitatea de mediu din recipient. 5)Adugarea vitaminelor i hormonilor (sterilizai prin filtrare) n mediu se face atunci cnd temperatura mediului ajunge la 40-50 oC. 6)Repartizarea mediului n vasele de cultur sterile se face imediat dup adiia vitaminelor i fitohormonilor. Observaii Mediile de cultur pot fi preparate n vase Erlenmeyer, dac se prepar cantiti mici (mai puin de un litru), iar agarul este sterilizat odat cu mediul prin autoclavare n kukt.

Pentru cantiti mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent. Dac mediul conine substane labile termic, substanele vor fi dizolvate separat, apoi sterilizate prin filtrare i incorporate n mediul autoclavat n prealabil. Acest procedeu se execut n hota cu flux laminar de aer steril. Dac se folosesc vase de cultur din plastic achiziionate din comer sterilizate, adiia mediului de cultur sterilizat se va face de asemenea n condiii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40oC, dup ce gura vasului Erlenmeyer n care se afl mediul s-a trecut prin flacr pentru flambare. Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul nainte de sterilizarea mediului. A se evita hrtia de pH deoarece aceasta nu d rezultate precise i importana stabilirii unui pH corect se reflect n succesul culturii in vitro. Agarul i zaharoza nu schimb pH-ul mediului, de aceea ajustarea acestuia se face nainte de adiia celor dou componente. Pentru a se evita infectarea soluiilor stoc este recomandabil folosirea unor recipiente auxiliare, n care se va goli o cantitate aproximativ egal cu cea necesar preparrii mediului de cultur, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optim. 6.1.3 Izolarea i inocularea explantelor Din punct de vedere teoretic, toate prile unei plante pot constitui explante pentru iniierea unei culturi de esuturi, datorit totipotenei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera n mod normal un individ ntreg, identic cu planta donor. Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse dou tehnici obligatorii: -stabilirea unei culturi aseptice din esuturi prelevate de la o plant ntreag cultivat n condiii nesterile (prima etap a micropropagrii vegetale); -meninerea asepsiei unei culturi deja iniiate prin transplantarea inoculilor n condiii aseptice pe alte medii de cultur (etapele a doua i a treia n tehnica de micropropagare vegetativ). Prima categorie prezint cele mai mari dificulti deoarece implic efectuarea unei sterilizri corect a esuturilor ce urmeaz a fi introduse n condiii aseptice de cultur. A.Sterilizarea esuturilor Sterilizarea materialului vegetal nainte de iniierea unei culturi in vitro este dificil deoarece gradul de infectare al esuturilor este variabil i pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substane chimice, n diferite concentraii cu durate diferite de timp pentru imersarea esuturilor. n general, prile aeriene ale unei plante sunt mult mai puin infectate cu bacterii i fungi dect cele subterane. Dificultatea sterilizrii const n necesitatea absolut de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel nct s nu se distrug i celulele vegetale (care sunt cel puin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesar stabilirea unui timp optim de imersare a esuturilor n soluiile sterilizante. Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt: -fasonarea peiolului n fragmente de aproximativ 1cm lungime; -imersia fragmentelor de peiol n etanol 70% timp de 20 secunde; -imersia n hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continu a vasului n care se realizeaz imersia; -efectuarea a trei cltiri succesive cu ap distilat steril pentru ndeprtarea agentului de sterilizare.

Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu penetreaz esutul vegetal. Este totui un produs puin stabil n soluie apoas i trebuie preparat imediat nainte de utilizare cantitatea dorit de hipoclorit este dizolvat n ap prin agitare continu timp de aproximativ 10 minute, dup care, soluia format se filtreaz, iar filtratul se utilizeaz imediat. Concentraiile standard folosite sunt de 4% i 8%, iar timpul de imersie variaz ntre 5 i 30 de minute. Ali produi chimici ce pot fi folosii pentru sterilizarea materialului vegetal sunt: Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat n pungi de plastic cu titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraii ntre 5% i 20% v/v. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizri optime la o diluie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetreaz esuturile putnd cauza leziuni la nivel celular ducnd la scderea capacitii regenerative a esuturilor cultivate in vitro. Biclorura mercuric (otrav puternic), HgCl2 este un sterilizant foarte eficient, folosit n doze mici de ordinul 0,01% pn la 0,05%. Este dificil de nlturat deoarece are aderen crescut la esuturi, necesitnd cltiri repetate, fiind recomandate cinci-ase cltiri comparativ cu trei n alte cazuri. Mercurobutol este de asemenea un sterilizant foarte bun i se poate gsi n farmacii. Conine un detergent ce-i mrete puterea de penetrarea i eficiena, dar este foarte dificil de nlturat necesitnd efectuarea a dou, trei cltiri cu alcool etilic de 70%. Trebuie subliniat faptul c sterilizarea materialului biologic vegetal se realizeaz numai la suprafa i dac accidental esuturile sunt infectate n interior nu este posibil sterilizarea lor. n unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesar, cum ar cazul meristemelor bine protejate de numeroase frunzulie rudimentare sau a anterelor protejate n spic. B.Pregtirea echipamentului necesar sterilizrii i lucrului la hota cu flux laminar steril nainte de realizarea sterilizrii materialului vegetal i nceperea operaiilor de fasonare i inoculare pe mediu de cultur artificial a materialului vegetal, activiti ce se realizeaz n condiii sterile, este necesar pregtirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate. Sterilizarea hotei necesit parcurgerea mai multor etape: - se terg, cu o bucat de vat nmuiat n alcool etilic de 70%, toate suprafeele orizontale i verticale din interiorul hotei insistndu-se pe suprafaa de lucru; - se pulverizeaz puin alcool pe filtrele de aer ale hotei; - se pulverizeaz alcool n toate colurile i colioarele interiorului hotei; - se pornete lampa UV, iar dup cinci minute se pornete i ventilaia. n cazul hotelor cu flux de aer laminar (alctuit din lamele dispuse n straturi paralele) steril este suficient, ca nainte de utilizare, s se tearg cu alcool etilic 70% toate suprafeele interioare, n special suprafaa de lucru. La acest tip de hot, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil. Pregtirea instrumentarului se face nainte de nceperea lucrului: - se flambeaz instrumentele de metal la flacra becului de gaz, dup nmuierea n alcool 90%; este recomandabil folosirea concomitent a cte trei buci din fiecare instrument; - instrumentele se imerseaz n alcool etilic 70% n vase de sticl dac nu se folosete flambarea i n alcool de 90-96% dac se dorete flambarea acestora; - hrtia de filtru sau aluminiu folosit ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizeaz prin autoclavare;

- vasele Petri sterilizate n prealabil n etuv la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de hrtie sau din cutiile de metal speciale n care au fost sterilizate, doar n hota sterilizat; - mediul de cultur sterilizat se va turna n vase de sticl sau plastic sterilizate n prealabil doar la hot, cnd aceasta este pornit; - se pregtesc vasele de cultur cu sau fr mediu; - se pregtesc dou borcane cu ap distilat steril, pentru cltirea materialului vegetal, sau a instrumentarului n cazul cnd acesta este introdus doar n alcool, fr flambare. C.Operaiunile ce se execut la hota cu flux de aer steril Meninerea condiiilor aseptice se face urmnd cteva reguli stricte i necesare: - nainte de a ncepe lucrul la hot, operatorul trebuie s-i spele minile cu spun (preferabil cu mercurobutol sau alt substan sterilizant), s-i suflece mnecile halatului pn mai sus de coate, s-i frece palmele, ncheieturile minilor i antebraele cu alcool 70% sau cu mercurobutol i s se clteasc cu ap distilat steril; - minile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dat cnd vin n contact cu materiale nesterile (pr, haine, etc); - instrumentarul se schimb des, dup dou pn la maximum cinci explante, i se sterilizeaz prin flambare sau imersie n alcool i cltire cu ap distilat steril; - explantele se fasoneaz cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fin, mai ales cnd se dorete obinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vrf subire, n cazul anterelor, ovulelor, etc; - explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor i intrarea n contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important n succesul culturilor in vitro; - orice explant ce a czut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva n afar de hrtia de lucru steril, va fi eliminat; - dopurile de vat nu vor fi lsate niciodat pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura n jos; - gturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer i sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacra becului de gaz; - odat cu terminarea lucrului, alcoolul rmas va fi pstrat n containere nchise, pentru siguran. 6.1.4 Meninerea culturilor n general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 luci) la o temperatur de 20-25o i un fotoperiodism de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. Odat cu instalarea culturilor se va urmri apariia infeciilor, care se vd n general dup cteva zile. 6.1.5 Infeciile i cauzele apariiei acestora Apariia infeciilor n culturile in vitro are mai multe cauze. Dup simptomele manifestate putem s ne dm seama dac infecia este cauzat de o ciuperc sau de o bacterie. Dac este generat de o ciuperc, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textur mat sau pufoas, de cele mai multe ori de culoare alb sau gri. Penicillium genereaz un miceliu de culoare gri mat, pe cnd Rhizopus nigricans, care se i multiplic foarte repede i care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor nainte de deschidere i splare, sau aruncare, formeaz miceliu de culoare nchis cu aspectul unor fructificaii de culoare neagr.

Dac infeciile se datoreaz unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lptoase n interiorul mediului i pe suprafaa acestuia. Aceast past este uneori colorat roz sau galben. Se va observa dac infecia a pornit de la zona de contact dintre esut i mediul de cultur, i dac e aa se poate concluziona c sursa de infecie este nsui explantul. Dac infecia pornete din alt punct al mediului de cultur, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficient a mediului sau din apa condensat pe capacul recipientului de cultur. n unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavrii, de aceea este necesar cltirea sticlriei n clorur lichid. Atunci cnd se observ dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constat o capacitate de lucru slab a operatorului. Manipularea necorespunztoare a materialului vegetal i aplicarea ineficient a tehnicilor de cultur in vitro, genernd infecii ale culturilor se poate datora: vorbitului n timpul lucrului la hota cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunztoare i insuficient a instrumentarului, transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate. Se poate ca, n cursul culturii, s nu se observe apariia unei infecii cu bacterii, caz n care mediul de cultur folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totui, culturile pot fi infectate i cea mai sigur cale este subcultivarea lor pe mediu adiionat cu 2g/l pepton (un component obligatoriu n mediile de cretere ale bacteriilor). Prin aceast metod se testeaz culturile i de elimin vasele de cultur infectate, obinnd culturi de esuturi libere de bacterii. 6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi n culturile in vitro Se poate ntmpla ca unele culturi s mearg foarte bine n anumite condiii, iar alteori, n aceleai condiii s mearg prost sau deloc. Problema poate fi dat de condiiile de cultur, care sunt rareori identice, condiiile climaterice din camera de cretere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultur sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor n aparen, poate schimba ntreaga evoluie a culturii, de aceea atenia i meticulozitatea sunt caliti absolut necesare unui operator in vitro. n continuare se prezint cteva exemple concludente: - creterea volumului vasului de cultur poate ncetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la ncetinirea creterii inoculilor; - utilizarea parafilmului ncetinete considerabil schimbul de gaze i poate modifica funcionarea esuturilor; - unele capace cptuite conin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare n apa condensat, s otrveasc esuturile; de aceea, este recomandat ndeprtarea acestor cptueli nainte de folosirea capacelor; - condensul apei n vasele de cultur apare atunci cnd temperatura din exteriorul vasului este cu cteva grade mai mic dect cea din interior, cauza putnd fi expunerea direct a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare. 6.1.7 Metode de iniiere a unor tipuri de culturi din diferite explante 6.1.7.1 Cultura de rdcini Cultura de rdcini const n creterea pe medii aseptice a rdcinilor detaate. Tehnicile de cultivare in vitro a rdcinilor au fost realizate nc n etapa de pionierat a cercetrilor efectuate n aceast direcie. Astfel, White a dovedit c rdcini detaate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate. n general, se utilizeaz rdcina primar, embrionar, prelevat de la plantulele formate prin germinarea seminelor n condiii aseptice. Principala problem care se ridic, n

acest caz, este aceea a realizrii unei perfecte sterilizri a seminelor. Smna sntoas, cu tegumentele ntregi, nelezate, are esuturi embrionare neinfectate. Seminele pot fi dezinfectate folosind ageni puternici de sterilizare ntruct prezena tegumentului protejeaz formaiunile embrionare de toxicitatea soluiei de sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare a sterilizrii, izolrii i cultivrii in vitro poate fi cel al unei rdcini primare prelevate de la o plantul de mazre. Aproximativ 20 semine de mazre, cu tegumentul ntreg, se introduc ntrun vas Erlenmayer, n aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agit seminele, iar dup cca 10 secunde se decanteaz etanolul iar peste semine se adaug soluie de hipoclorit de calciu 10%, timp de 20 minute, toate operaiunile efectundu-se n camera steril. Dup cele 20 minute se decanteaz soluia de hipoclorit de calciu iar seminele se cltesc n trei reprize de ap distilat steril. Dup cltire se ndeprteaz seminele devenite translucide, ca urmare a infiltrrii apei sub tegument, iar seminele ntregi se inoculeaz, tot n condiii sterile, n vase Petri, n care a fost repartizat un mediu de cultur MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluia stoc de macroelemente i agar 6,5%. Seminele se incubeaz la ntuneric, n condiii controlate, timp de 48 ore, dup care, cnd rdcinia plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm, n condiii aseptice, se detaeaz vrful rdciniei (cca 5-10 mm) i se inoculeaz tot n vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un mediu de cultur constituit din macroelemente i zaharoz, pH-ul fiind 5,8 (Reinert i Yeoman, 1982). Se poate constata c mediul de cultur recomandat este unul simplu lipsit de microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza i medii mai complexe, clasice, iar ca surs de carbon organic poate fi folosit glucoza n loc de zaharoz. Creterea rdcinilor in vitro are loc pe medii de cultur lichide neagitate. Zilnic se poate urmri dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia Petri a unei hrtii milimetrice. De obicei, dup 21 zile de cultur se constat o plafonare a creterii, moment n care se recomand subcultivarea rdcinilor, prin excizarea apexului i transferarea lui pe mediu proaspt. Subcultura se poate face i la interval de 7 zile. Dup aproximativ dou subculturi, este oportun introducerea n mediul de cultur a tiaminei i a acidului nicotinic, n dozele normale, utilizate pentru alte tipuri de explante. Prin cultura de rdcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street precizeaz c auxina stimuleaz att creterea n lungime a fragmentelor de rdcini de tomate ct i diviziunea celulelor meristemului apical. Utiliznd culturi de rdcini, pe diferite tipuri de medii, ca i compoziie i consisten, s-a putut stabili efectul diferiilor fitohormoni de cretere, al elementelor chimice sau al unor substane organice, n formarea rdcinilor, n creterea lor, precum i urmrile carenrii celulelor lor n anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuit mbogirea, an de an, a cunotinelor privind funcionarea rdcinilor i rolul lor n metabolismul general. De asemenea, din cultura de rdcini se poate obine uor calus, mai ales din cele principale sau din cele ngroate secundar. Procesele de organogenez, la nivelul rdcinilor netransformate n calus, se rezum la ramificarea acestora n radicele secundare. Geneza de mugurai i tulpinie are loc la nivelul esutului calusal, provenit din rdcini, sau pe explante radiculare. 6.1.7.2 Cultura de meristeme Meristemele sunt esuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-i menin, n tot cursul vieii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formnd mereu noi celule. Meristemele sunt localizate n vrful ramificaiilor organelor (tulpini sau rdcini), fiind meristeme apicale, de tip primar, cu rol n creterea n lungimea organelor; meristeme primare gsim i n straturile profunde ale rdcinilor i tulpinilor. La organele ce sufer procese de modificare secundar morfo-anatomic, ngrori, ntlnim meristeme

secundare, respectiv cambiul i felogenul. De regul, prin termenul de cultur de meristeme se nelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare. Masivul de celule care alctuiete meristemul apical se apreciaz c msoar maximum 500 (Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru i 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). n cazul n care se depete aceast dimensiune, vorbim despre o cultur de apex. Celulele meristematice dein caracteristici structurale particulare, ce le confer capacitatea de a se menine ntr-o continu stare de proliferare, cum ar fi: -au pereii celulari subiri, celulozici, nemodificai secundar; -sunt bogate n citoplasm, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine reliefai; -vacuolele sunt mici i nu dein metabolii. n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonal iar meristemele secundare au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul meristematic mam sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat natere. Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt submprite n tunica i corpusul. La meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de aceea descris la tulpin. Forma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz mult la diferitele specii dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme i meristemul de angiosperme. Meristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de regul, este protejat n mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv. Mugurele este constituit dintr-un ax, n apexul cruia se afl meristemul. Prin diviziunea continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se ndeprteaz de apex se difereniaz funcional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de cretere sau vrf vegetativ) se pliaz, iar protuberanele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n primordii foliare sau florale. De regul, n primordiile florale se produce o cretere a intensitii ratei de multiplicare celular, aceti muguri devin mai bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se difereniaz n xilem, floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n boboci, respectiv n componente florale. Mugurii i bobocii au capacitate regenerativ ridicat, graie faptului c dein esuturi tinere, slab difereniate i celule meristematice. Meristemele apicale posed o relativ autonomie, fapt nc insuficient argumentat i dovedit experimental. n evoluia in vitro a explantelor meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transform n floare. Adeseori, funcie de specie, la nivelul nveliurilor florale se poate induce neogeneza de formaiuni meristematice adventive. Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate secundar sau n cele metamorfozate (rdcini tuberizate). De regul, cambiul constituie o principal zon regenerativ. esuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate morfofuncional, trebuie s se dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dedifereniere

celular se produce i spontan, de exemplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini secundare din celulele periciclului radicular. Dediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de calus, dedifereniere primar, din care se poate ajunge la un stadiu de dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele calusului se transform n meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini. Dediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a formrii de promeristeme i de iniiere a organogenezei. n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou primordii foliare subiacente acestuia. Ball (1946) a fost primul care a obinut plantule din meristeme de Lupinus albus i Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenialitatea organogenetic a diferitelor pri ale apexului. n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea reaciei meristemului cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a meristemului in situ, precum i a rolului primordiilor. Este evident faptul c un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta totipotenialitatea sa real; n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast capacitate este mascat de corelaiile existente ca urmare a prezenei alturi de meristem i a celorlalte esuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui nsoit de primordii, este dependent de fitohormonii de cretere prezeni n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care frunzele sunt abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. Experienele de microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight i Koehnert (1969), precum i ale altor autori, au permis stabilirea faptului c tinerele mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc morfofuncional. Problema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de tranziie care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral, precum i a celor legate de reversia meristemelor iniial florale, n meristeme vegetative constituie punctul de plecare n multiplicarea vegetativ in vitro, pornind de la explante constnd din boboci sau din nveliuri florale. La conopid, n faza de preinflorescen, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme: vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a florilor. Definitivarea direciei de evoluie a meristemului apical, din vegetativ n floral, depinde de o serie de factori exogeni fotoperioad, temperatur sau endogeni specie, hormoni. n condiiile cultivrii unor explante in vitro, celulele esuturilor inoculate pe medii aseptice sufer un proces de dedifereniere i genereaz meristeme. Din aceste meristeme, prin redifereniere, vor lua natere organe. Organogeneza constituie momentul de baz n asigurarea multiplicrii vegetative. De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaiuni meristematice, aflate ntrun stadiu tnr, nedifereniat funcional n meristem generator de rdcini, sau n meristem generator de tulpini, fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematic incipient, exist i un alt termen, ntlnit n literatura de specialitate meristemoid (Torrey, 1966). Aceast noiune se refer la formaiuni meristematice, abia schiate, cu direcie de dezvoltare nedeterminat, aparent identice din punct de vedere morfologic. Se tie c meristemul radicular al angiospermelor se deosebete funcional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate c axa caulinar i cea radicular, n evoluia filogenetic, au o origine comun. Diferenierea funcional a meristemului se face, probabil, n stadiul de promeristem; n cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evolueaz n: meristem proliferativ, meristem generator de rdcini i meristem de tip caulogen. Dar nu se cunoate dac aceti meristemoizi sunt identici sau prezint deja amprenta determinismului lor funcional, radicular i caulinar. Meristemele radiculare, funcie de originea lor se mpart n mai multe categorii:

-meristem apical situat n vrful rdcinilor; -meristem lateral format pe rdcina principal; -meristem adventiv provocat n a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe, care n mod natural nu sunt purttoare de rdcini. Inducerea formrii acestor meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicrii vegetative prin butai, marcote sau organe de rezerv; -meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv. Meristemele caulinare pot fi mprite astfel: -meristeme apicale (terminale) derivate din muguraul embrionului; -meristeme axilare aflate la axila frunzelor; -meristeme adventive formate pe diverse organe; -meristeme neoformate generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro. Formarea meristemelor i organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic i hormonal. Factorii de mediu pot i ei stimula inducerea i viteza de desfurare a proceselor de organogenez. Hormonii sau regulatorii de cretere de sintez constituie factori cu rol hotrtor n direcionarea proceselor de difereniere a meristemelor, n meristeme radiculare sau caulinare. Auxinele intervin n reglarea formrii meristemelor radiculare iar citochininele n neogeneza de mugurai. Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite n tehnicile de multiplicare i de micropropagare a o serie de specii de interes economic. Astfel, se poate concluziona faptul c, la plantele superioare exist o diversitate de meristeme clasificate, dup localizarea lor n plant. Meristemele mai pot fi clasificate i n alte dou categorii: -meristeme histogene care produc obinuit numai esuturi; -meristeme organogene care dau natere la esuturi ce formeaz organe; Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structur i funciune, meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural i funcional. Ele variaz ca aspect i potenialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, n fapt, un microbuta, ntruct vrful vegetativ al plantei, inoculat in vitro i formeaz un propriu sistem radicular, n partea sa bazal. n consecin, acest tip de meristem este frecvent folosit n tehnicile de multiplicare i de propagare accelerat a plantelor, pe medii aseptice. Potenialitatea regenerativ a acestor meristeme este, de regul, extrem de mare. Ele se adapteaz bine la condiiile in vitro, suport uor traumatismul provocat de explantare, relundu-i activitatea n urma trecerii lor pe medii aseptice, genernd plante. Acest fapt presupune att creterea axei mugurelui i a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzulielor, ct i neogeneza de rdcini. n final, meristemul terminal, apical sau axial genereaz una sau mai multe plante, n funcie de balana hormonal prezent n mediul de cultur. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridic probleme speciale, ntruct ele aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce ngreuneaz o alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. Acest lucru constituie impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a capacitii regenerative a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii acestor meristeme. Meristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i rmne activ n tot cursul vieii plantei. Excepie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical n decursul sezonului de iarn se afl n stare de laten. Prin intermediul culturii de meristeme apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor horticole i a unor specii silvice.

Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de important n horticultur, asigurndu-se astfel o multiplicare clonal. Un alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic a plantelor, este acela al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen. Plantulele generate in vitro din meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile nmulirii vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin semine poate asigura, ntr-o oarecare msur, eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie de viroze. Dar nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri, multiplicarea prin semine este dificil (orhidee), ori seminele nu sunt fertile, ceea ce a fcut ca nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica metod de multiplicare a lor. Pe de alt parte, multiplicarea plantelor pe cale asexuat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la degenerarea descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. Astfel, o cultur sntoas de garoafe (Rudelle, 1977), nmulite timp de cinci ani prin butire clasic, a prezentat o rspndire n mas a virozelor, multe din ele, cauznd degenerri. Totodat, multiplicarea vegetativ, prin metode tradiionale, are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice. Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n floricultur i n arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad potenialul productiv al acestora, producia realizat este mediocr i produsele agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Butaii obinui din plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent sczut de prindere. Pe de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante virozate se creeaz pericolul transmiterii virusurilor i la alte plante, prin vectorii biologici prezeni n cultur. Primele ncercri de cultivare a extremitilor de tulpini i de rdcini sunt citate ca fiind realizate nc din 1922, de ctre Kotte i de ctre Robbins, la mazre i porumb, dar fr mare succes. Ulterior, n 1946, Ball a reuit s obin plante din apexuri meristematice la Lupinus albus i la Trapaeolum majus. Pn n jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zis de meristeme nu era cunoscut, abia ncepnd din anul 1949, prin lucrrile lui Wetmore i Morel s-au pus bazele cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei explantelor meristematice la condiii de cultur, precum i cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate n condiii variate de mediu. Dac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, n schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de rezultatele obinute ntre anii 1949-1950 de ctre Limasset i Cornuet, Morel a avut intuiia de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 m lime i 150200 m nlime, cu 1-2 primordii foliare. Experienele efectuate de Limasset i Cornuet au constat n urmrirea, prin analize serologice, a gradului de rspndire i a evalurii intensitii virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distane de apex. Ei au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au observat un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost semnalat n sucul extras din frunzele aflate nc n mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset i Cornuet au extirpat, aseptic o calot de esut apical sau meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun, lezat printr-o scarificare superficial. Dup trecerea unei perioade de incubaie s-a putut constata c frunzele de tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematic, au fost virozate n proporie de 60%, n

timp ce frunzele pe care s-au aplicat esuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai ndeprtate de meristem) s-a infectat n procent de 100%. Aceste experiene ia condus pe Limasset i Cornuet la concluzia c n apexul caulinar migrarea i nmulirea virusurilor este oprit. nc din 1952, Morel i Martin au intuit faptul c, pornind de la plante virozate, prin explantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obine o plant sntoas, conservnd, n acelai timp, caracterele genetice ale plantei mam. Aceast ipotez a fost atestat de ctre Morel i Martin prin experiene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre Morel i Martin. Tulpinile generate in vitro, neposednd rdcini, au fost transformate n minibutai. Acetia au dat natere la plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii i orhideele. n 1957, Quak a remarcat c metoda lui Morel i Martin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare i producere a unui material sditor sntos, cu randament economic asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de calitate superioar. n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor meristematice la atacul viral. Dac prelevarea se face de la o plant neinfectat, sau care prezint o infecie viral slab, atunci cresc i mai mult ansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecii virale. Din pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot mbolnvi tot att de repede ca i oricare alt plant. De regul, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie executat n condiii speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen. Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a fungilor i a bacteriilor. Astfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium i Diffenbachia eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979). Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere de infecii virale. Invazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul meristemului, al virusului i de specia plantei parazitate. Cu ct explantele meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule lipsite de virusuri este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai ridicat capacitatea lor regenerativ. Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire meristematic (Martin, 1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi nlturat, prin nmulire meristematic, numai n procent de 1%. Unele virusuri pot exista chiar i n meristemele apicale (Hollings, 1962). Termoterapia vine n ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de combatere a infeciilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborat de ctre Kunkel, n 1936. Aceasta const n supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse ntre 35-39oC, timp de 2-4 sptmni. n cursul aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic; ele rmn la nivelul celulelor n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic. Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse foarte mari de reuit, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. n consecin, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil explantrii, tratamentului termoterapeutic. Dar, n aceast situaie, descrete vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de regenerare a celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungete iar virusurile, nemultiplicndu-se, rmn n celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor explante apicale mai mari de pn la 1 mm, micornd

pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului, infectate cu germeni fitopatogeni. n consecin, explantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea ce compenseaz epuizarea fiziologic, cauzat de termoterapie. Kassanis (1950) a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat c la tomate exist virusuri a cror activitate este suprimat abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni i s ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977). Hakkaart i Quak (1964), experimentnd cu meristeme excizate de la crizanteme, de pn la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat c prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste aceast durat de timp (pn la 50-60 zile)nu a condus la depirea procentului de plante devirozate. n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful meristematic i n decursul cultivrii esuturilor in vitro. Astfel, Hollings i Stone (1964), au reuit aceast performan la garoafe, iar Walkey i colab. (1969) la cire. Aceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecin a traumatizrii celulelor excizate. Cu ct a fost mai mic fragmentul de esut excizat, cu att traumatismul a fost mai puternic i efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980). De regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din fragmente att de mici de esuturi; ori n alte condiii, nu poate fi realizat o traum de o aa amploare nct s se produc o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldat cu suprimarea atacului viral. Explicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist infeciilor nclin spre justificri de ordin molecular. Una din ipoteze susine c exist o competitivitate ntre celula gazd i parazit, n ceea ce privete utilizarea unor enzime implicate n procese de restituie; alt ipotez, susine c celula meristematic utilizeaz ARN viral, sau c substanele generate n urma traumatizrii celulelor ar suprima virusurile prezente n celule. n anul 1978, Walkey, a reuit obinerea de plante sntoase i prin cultivarea in vitro a esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut nucelar, sau a meristemului floral. Trebuie subliniat i marele merit pe care Morel l-a avut n intuirea importanei deosebite a descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din plante bolnave, precum i a direciilor aplicative pe care le-a deschis aceast tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri le-a avut Morel n multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, n anul 1963, Morel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul c meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, genereaz un glomerul de 1-2 mm, de culoare verde, numit protocorm. Prin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas globuloas, un glomerul de cca 3-4 mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un parechim, cu celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. n partea central a glomerulului se disting cteva fascicule vasculare. Fragmentnd periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. n anul 1978, Murashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin fragmentri i subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca 4 milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemntor cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii seminelor. n 1959, Martin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu explante, n care s fie conservat materialul biologic meristematic sntos. Prin aceast tehnic, astzi, materialul vegetal generat in vitro este uor conservat, esuturile deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.

Valoarea mare a culturii de meristeme const deci n: -asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro; -eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni; -creterea la maximum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt timp, a unui exemplar vegetal; -obinerea unui material sditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiionale de nmulire vegetativ; -conservarea prin temperaturi sczute a inoculilor meristematici, pentru o lung perioad de timp, ntr-o anumit faz de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce s asigure, oricnd, necesarul de material sditor solicitat pe pia; -conservarea germoplasmei n bnci de gene. n extinderea rapid a acestor practici, n regim industrial a predominat factorul economic rezultat, n primul rnd, din aspectele fitosanitare, respectiv din obinerea unor culturi viguroase, sntoase. Astfel, cartoful, plat extrem de important att n hrana omului i pentru industrializare dar i n hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozitii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivnd in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumrate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent n esuturi, ceea ce epuizeaz planta i scade, considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate tipurile de virusuri pot fi n egal msur combtute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des n cultur (A, Y, M, S, X) virusul A este mai uor de ndeprtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare i la garoafe. Astfel, n Frana, cifra de afaceri realizat, n categoria florilor tiate, prin vnzarea garoafelor, ocup locul doi iar exportul horticol francez este reprezentat n proporie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea provenind din mutaii de culoare, practicate la tipul american de garoaf creat de William Sim, n 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a fcut n miliarde de exemplare. Conservarea calitilor sale genetice se datoreaz metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale. Infeciile virale afecteaz nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult i capacitatea de nrdcinare a butailor. n laboratoarele unei singure uniti se produc anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. nmulirea meristematic a permis vindecarea garoafelor i de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, i a bacteriozelor Pseudomonas caryophylli i Pectobacterium parthenii. De o mare importan este cultura orhideelor, obinerea de material sditor devirozat la garoafe, cpun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori i arbuti. Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu nseamn urmrirea, ca scop n sine, numai eradicarea bolilor ci pur i simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. Aceast metod este cu att mai important cu ct se pleac de la un material iniial devirozat. Se practic diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar i anume: -unele procedee vizeaz cultivarea exclusiv a celulelor conului meristematic, fr primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, n dependen de dimensiunea redus a explantelor i de consecinele traumatismelor provocate; -altele privesc obinerea de material sditor devirozat, explantele constnd din meristeme recoltate mpreun cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor fiind de pn la 500 m, respectiv 0,25-0,7 mm; -altele au n vedere obinerea unui numr foarte mare de plantule, n timp scurt utiliznd explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionnd diferenierea de meristeme axilare i de muguri adventivi pe apexul iniial. n oricare din cazuri trebuie s avem n vedere selectarea, cu mare atenie i pricepere, a plantelor mam, donatoare de explante. Este de dorit ca ele s fie sntoase i s se afle ntr-

o perioad de cretere activ. Latena organelor uneori ridic probleme speciale i implic aplicarea unor tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergena meristemelor. Alegerea explantelor, sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultur folosit, regimul din camerele de cretere influeneaz supravieuirea explantelor. Restabilirea proceselor biologice, de diviziune i de regenerare precum i sensul desfurrii histo i organogenezei, diferenierea de plante, dezvoltarea lor i apoi capacitatea adaptativ a acestora la mediul normal sunt influenate att de factori endogeni, ct mai ales de cei exogeni, n special de balana hormonal i de regimul de lumin, respectiv de temperatur. De regul meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapid cretere. Cu toate acestea i meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite n culturile de meristeme. La crizanteme din 5000 de vrfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut, genernd plante mature, n timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante. Mrimea explantelor se stabilete n funcie de specie i de scopul urmrit. Cnd se are n vedere obinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie s depeasc 0,5 mm dar nici s fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, n acest caz, este dificil nrdcinarea plantulelor generate din meristeme. n cazul n care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare, de pn la 1 mm. n camerele de cretere intensitatea luminii se recomand s fie de 2400-2600 luci, n regim de fotoperioad cu 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. n alte cazuri, lumina trebuie intensificat la 3500-4000 luci, iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 luci. Temperatura trebuie s fie stabilizat ntre 22-25oC. Uneori exist indicaii stricte cu privire la regimul termic i de iluminare, cerute de un anumit tip de cultur, potrivit unei anumite specii sau corespunztor unei anumite etape de dezvoltare a inoculilor. n literatura de specialitate sunt recomandri i cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru prelevarea i inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specific c meristemele de garoafe supravieuiesc, n proporie mai mare, dac sunt recoltate primvara sau toamna devreme; meristemele recoltate iarna nrdcineaz mai uor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate primvara sau vara, de timpuriu, nrdcineaz mult mai repede n raport cu cele care sunt prelevate i inoculate la finele anului. n ceea ce privete substratul de cultur, de cele mai multe ori, se utilizeaz medii de cultur solide. La cartof, garoafe i la alte specii se pot folosi i mediile lichide. PH-ul mediului de cultur poate constitui un factor limitativ al creterii i dezvoltrii meristemului cultivat in vitro. Astfel, de regul, pH-ul de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; dup autoclavare, pH-ul scade, iar n decurs de o sptmn de la cultivarea esuturilor, pH-ul descrete pn aproape de 5,4. Un pH iniial sczut inhib formarea rdcinilor. n compoziia mediilor de cultur sunt incluse macro i microelemente, FeEDTA, vitamine, aminoacizi i o surs de carbon organic, reprezentat, de regul de zaharoz n concentraie de 2-3%. Natura hormonilor i concentraia acestora variaz de la o specie la alta, n funcie de scopul urmrit. Astfel, pentru nrdcinare se folosesc cu precdere ANA i AIA, care ns folosite timp ndelungat pot duce la inhibarea creterii rdcinilor. n acest caz, se recomand subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. Citochininele stimuleaz creterea meristemelor, mai ales n cazul n care ele se fal n laten, precum i formarea de nenumrai mugurai. Concentraia fitohormonilor de cretere variaz n diferitele faze de evoluie ale meristemelor. Plantele complet formate prezentnd rdcini i tulpini vor fi scoase din condiiile in vitro, fiind trecute n condiiile mediului septic. Ele vor fi transferate n ghivece mici, n amestec de perlit cu pmnt. Se poate realiza transferul lstrailor n mediul septic,chiar nenrdcinai, aceast operaiune putnd determina nrdcinarea lor. Buys (1969)

recomand transferarea timpurie n sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, ntruct rdciniele generate in vitro sunt n mic msur folositoare n sol, iar prelungirea duratei de meninere a plntuelor n flacoanele de cultur, ridic nejustificat costul materialului plantat rezultat. Atunci cnd plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic, eventuala prezen a virusurilor i gradul de infecie. Metodele de testare a virozelor i natura acestora variaz de la o specie la alta. n 1977, Clark i Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenei virusurilor, iar n 1973, Derrick, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate n determinrile de virusologie vegetal. Pentru a uura exactitatea investigaiilor este de dorit s se fac o analiz a infeciilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum i n cultura, sau culturile apropiate. Dup stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele s fie meninute n condiii speciale fie c ele sunt prezervate n condiii de temperaturi sczute, n recipientele lor de cultur, pe medii aseptice, fie c sunt cultivate n teren, ntr-un perimetru ferit de infecii, metodele fiind menite s realizeze evitarea unei reinfectri a plantelor. Metodele criobiologice de prezervare a materialului obinut in vitro sunt economice i indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum i a unei cantiti limitate de material iniial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizat la temperaturi extrem de sczute. n aceste condiii se asigur reducerea tuturor funciilor metabolice. Primele ncercri de crioconservare au fost fcute de ctre Seiberg n anul 1976, la garoafe. Ulterior sa reuit i conservarea altor tipuri de inoculi: calus, celule sau protoplati. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substane crioprotectoare, cu rol n prevenirea daunelor cauzate de nghearea brusc a celulelor, respectiv formarea cristalelor de ghea. Cele mai folosite substane crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) i glicerolul (Kartha, 1981, citat de Cachi, 1984). Meristemul este esutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi sczute, graie alctuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el i poate pstra ntreaga capacitate regenerativ, ntruct n momentul repunerii lui n condiii optime de mediu, celulele i reiau activitatea metabolic i fiziologic normal. Meristemul se preteaz cel mai bine conservrii prin crioconservare, celulele lui fiind srace n vacuole i avnd o citoplasm dens. Pentru executarea operaiunilor de congelare, ndeosebi pentru coborrea gradat a temperaturii, exist dispozitive speciale. O metod accesibil preconizeaz introducerea flacoanelor cu inoculi ntr-o baie de alcool, mediu n care se produce descreterea gradat a temperaturii. n anul 1980, Dale i colab. Au pus la punct o metod de stocare la temperaturi sczute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constnd n conservarea ndelungat a plantelor, generate in vitro, prin meninerea lor la temperaturi de 2-4oC, n regim de 8 ore lumin pe zi si o intensitate de 300 luci. Cultura poate fi meninut astfel 10-11 luni, dup care se recomand ca aceasta s fie transferat pe mediu proaspt. O alt problem deosebit de biologie se ridic n cazul plantelor generate in vitro. Plantele provenite att din meristeme ct i din explante de alt natur, prezint un grad de juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui obinut prin metodele tradiionale: butire, marcotaj, altoire. Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatat morfologic, de exemplu la plantulele de cpun, difereniate din meristeme. La cpun, frunzele tinere sunt ntregi, n timp ce frunzele plantelor btrne sunt trifoliate. Generarea de frunzulie ntregi sisteaz la inoculi n momentul n care se depete faza de morfogenez, constnd n proliferarea a noi muguri axilari, prin repicri repetate i cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinin.

Un caz particular este acela al rentineririi unor organe de pe care urmeaz s fie prelevate meristeme apicale. Un exemplu l constituie plantele lemnoase, multianuale. Explantele sau butaii prelevai de la astfel de plante i pierd capacitatea de nrdcinare. La aceste plante se practic diferite metode de rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule. Sfecla constituie un alt exemplu de plant a crei esuturi adulte prezint o foarte sczut capacitate organogenetic. De aceea se recomand inducerea formrii de meristem prin repicri succesive. O problem deosebit o constituie aceea a meninerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii aseptice, ntr-o stare primar, ntruct n cazul n care se inoculeaz un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpin florifer, exist pericolul ca anumii factori de mediu s induc formarea florilor sau invers, s grbim, prin reglarea fotoperioadei i a altor factori de mediu, transformarea unui mugur vegetativ, n mugure florifer. Reglarea fotoperioadei i sporirea cantitii de zaharoz din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par s determine transformarea apexului vegetativ n florifer. La numeroase plante, detaarea meristemelor florale i cultivarea lor in vitro imprim esuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, genernd mugurai. Adeseori, se formeaz muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui s se formeze boboci. Inocularea in vitro, pe medii, cu sau fr fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescene tinere conduce la formarea a numeroi muguri. La conopid, prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenei i cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxin (AIA), provoac reveria esuturilor din florifere n vegetative. Astfel, poate fi nmulit planta pe cale vegetativ (Crisp i colab., 1974, citat de Cachi,1984). Originea comun a meristemului vegetativ i a celui florifer face ca transformarea, n direcia diferenierii morfologice i funcionale s fie posibil, ntr-o anumit faz de dezvoltare a plantelor sau a organelor. Reuita este dependent de vrsta esutului, de specie i de condiiile de mediu. Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante. 6.1.7.3 Cultura de calus Calusul este o formaiune particular constituit dintr-o mas nedeterminat de celule deinnd o structur histologic uniform. De regul, cnd este tnr, posed celule nedifereniate, care se divid activ. Un anumit tip de calus se produce i n mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, avnd rol n cicatrizarea rnilor, fie se formeaz la baza butailor plantai pentru nrdcinare, constituind zona de genez a rdcinilor adventive. n funcie de obiectivul urmrit, obinerea de calus poate constitui un scop n sine, alteori apariia i dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formrii de calus ct mai friabil constituie scopul principal atunci cnd se urmrete iniierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei culturi de protoplati. Instabilitatea genetic a celulelor sale i poliploidizarea facil a lor, n anumite condiii de cultur, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra cruia agenii mutageni i factorii stresani pot opera modificri, selectndu-se linii cu caliti speciale. Multiplicarea clonal, via calus nu este posibil tocmai din cauza facilei poliploidizri a celulelor sale. Pe aceast cale se practic ns nmulirea regenerativ, rapid a unei specii, fr a avea sigurana conservrii genotipului. La unele specii: morcov, tutun, crizanteme din calus se pot obine uor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase (stejar), geneza de plante din calus este extrem de dificil. Atunci cnd se urmrete multiplicarea clonal rapid, formarea de calus n poriunea bazal a explantului sau transformarea ntregului inocul ntr-o mas de calus constituie un

fenomen care perturb dirijarea proceselor de morfogenez. Astfel, administrarea unei balane hormonale neechilibrate, face ca la baza explantului s se genereze calus, cauznd dezvoltarea preponderent a rdcinilor, n defavoarea diferenierii mugurailor sau invers, se formeaz unul sau mai muli mugurai, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare mugura trebuie detaat i subcultivat pe un mediu cu sau fr auxin. Aceast metod se practic cu succes, atunci cnd se procedeaz la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia i Gerbera), constnd n desprinderea de propaguli, de pe un esut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniial, situat n poriunea bazal a coloniei de propaguli. Creterea calusului este considerat ca fiind nedefinit, ntruct el poate fi nmulit i cultivat la nesfrit, atunci cnd, periodic, se procedeaz la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. Fiecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspt. Calusul crescut la 25oC se recomand a fi repicat la un interval de 4-6 sptmni, n dependen de natura esuturilor din care a provenit i de condiiile n care a fost cultivat. Numai prin subcultivri repetate poate fi conservat vitalitatea celulelor sale. Dac calusul nu este subcultivat n timp util, se produce o mbtrnire a celulelor sale, masa tisular i schimb culoarea, din glbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuie sau galben-brun; uneori culoarea calusului devine roiatic sau viinie, datorit formrii i acumulrii de antociani n sucul vacuolar. Proveniena calusului i natura inoculului iniial influeneaz sinteza antocianilor. Street (1973) precizeaz c trecerea calusului n suspensie celular duce la scderea substanial a cantitii de antociani. De altfel, s-a constatat c anaerobioza inhib formarea antocianilor (Gautheret, 1959, citat de Cachi, 1984). n general, prezena luminii i natura acesteia intensific acumularea n celule a antocianilor. Antocianii sunt sintetizai ns i la ntuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultur de celule de Haplopappus cu raze UV, a izolat o linie celular cu un coninut foarte ridicat de antociani. Fitohormonii de cretere i natura acestora influeneaz i ei sinteza antocianilor. Astfel, auxina inhib, iar citochininele stimuleaz formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981). Temperatura sczut, carena de azot i coninutul ridicat al mediului de cultur n glucide stimuleaz sinteza de antociani. Se pare c zaharoza intervine prin presiunea osmotic pe care o creeaz, ntruct i un coninut ridicat de NaCl stimuleaz formarea acestor pigmeni. La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai mult uurin, dect la gimnosperme sau la monocotiledonate. Pe msur ce calusul depete un numr de zile de cultur, n profunzime se difereniaz centri vasculari, ori noduli organoformatori. n morfo i organogeneza calusului un rol determinant l au mediul de cultur i condiiile de cultur, natura esuturilor din care a provenit calusul i vrsta acestora. Formarea, creterea i aspectul calusului sunt dependente de natura i concentraia fitohormonilor de cretere, prezeni n mediile de cultur. De regul, concentraiile ridicate de auxin conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine n inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite n concentraii cuprinse ntre 1-10 mg/l. n general, calusul poate fi generat cu uurin din material vegetal de provenien diferit, chiar i din esuturi cu structur definitiv. Astfel, prin inocularea de liber secundar, muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat n 2,4D, se ajunge uor la formarea de calus. Celulele esutului calusal pot fi mai compacte, legate ntre ele, sau pot fi mai laxe, formnd un calus friabil, grunjos, separabil n fragmente granulate, de mrimi diferite, mai greu dezagregabile, sau spumos, ce se separ n formaiuni tisulare fine, adecvat pentru iniierea unei culturi de celule. Consistena i friabilitatea esutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost detaate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de cretere prezeni n substratul de cultur i uneori de condiiile de cultur.

Capacitatea organogen sau embriogen a esutului calusal este dependent att de factorii endogeni i exogeni, de numrul repicajelor fcute, de condiiile de cultur i de vrsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar i dup cinci ani, i menin o potenialitate ridicat de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativ sczut, evaluat la cteva sptmni (Conger, 1981). Dintr-un inocul iniial se obine calus de tip primar, ce conine un numr de aproximativ 50 000 celule. Dup cca ase sptmni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspt, se numete calus secundar. Calusul obinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna d natere la noi plante i un calus de tip neregenerativ ce prezint, de regul, o cretere luxuriant, din el difereniindu-se rdcini, i uneori mugurai, dar niciodat plante (Nabors, 1982). Aceste dou tipuri de calus au mai fost denumite calusuri embriogene i neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare alb-lptoas, spre galben, ori galben-verde. Citologic se remarc zone compacte, cu celule nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb, brunie sau verde. Acest tip de calus prezint o consisten mai lax, fiind mai friabil, desfcndu-se uor n pachete de celule. Regiunile friabile prezint celule mari, mult vacuolizate. Aceste regiuni genereaz rdcini i mai rar mugurai dar niciodat plante. Nabors a fost primul care a dovedit c cea mai ridicat capacitate regenerativ, meninut timp ndelungat o prezint calusul embriogen, denumit de tip regenerativ. Tot Nabors a observat c acest calus regenerativ tinde s devin neregenerativ; dup producerea acestei reversibiliti procesul este definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de calusuri, diferite funcional, nu sunt interconvertibile. De altfel, cele dou tipuri de calusuri necesit fitohormoni diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i pentru difereniere. De regul, calusul neregenerativ crete abundent, n timp ce calusul regenerativ are o cretere mult mai lent, chiar i pe medii potrivite scopului meninerii unei creteri susinute a acestuia. Pentru a prentmpina dezvoltarea neomogen a calusului se urmrete obinerea unui calus regenerativ omogen sau cel puin predominant ca mas, ntr-o populaie de celule calusale. Nabors a remarcat i faptul c ceea ce la un anumit moment, ntr-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului, pare s fie esut de tip neregenerativ, poate genera, n continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate i subcultivate (Cachi, 1984). Frecvent, cele mai bune medii de cultur, adecvate creterii optime a esutului calusal, nu constituie medii corespunztoare producerii calusului de tip regenerativ. n general, mediul Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziie similar, respectiv srace n azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat. La cereale se recomand adugarea n mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, avnd efect pozitiv n susinerea creterii calusului. Acest mediu ns nu este cel mai potrivit pentru inducerea i meninerea proceselor regenerative. n general, calusul care provine din rdcini de plantule de cereale posed mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, n raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar i la calusul bogat n zone regenerative acestea reprezint numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dac regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin procesele regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante. Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin meninerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivri de ntreinere. Pe alt cale se pot identifica i izola insulele de calus regenerativ, pe msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor pe un mediu de cretere adecvat.

n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii cultivai la ntuneric dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la ntuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n condiii de ntuneric. La gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci sptmni, pe mediu potrivit induciei diferenierii de plante. La calusul de gru, regenerarea se realizeaz pe un mediu lipsit de fitohormoni de cretere; astfel din calusul de tip regenerativ, n cca 2-5 sptmni dup transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. Dac calusul este mixt, componenta neregenerativ continu s creasc mult; concomitent, ns, din poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se difereniaz i plante. Dup dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea calusului rmas, pe un mediu coninnd auxin, pentru a favoriza continuarea creterii acestuia. Plantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise, coninnd perlit, care va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup 1-2 sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie transferate n ghivece cu pmnt n amestec cu perlit. Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l pe medii lichide, obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite scopuri. n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape: -alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul poate fi obinut din explante provenite din diverse surse: semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze, ramuri, antere, ovare; -prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n funcie de scopul propus. Atunci cnd scopul este doar obinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultur oarecare, coninnd substane anorganice (macro i microelemente) i substane organice (surs de carbon organic, vitamine, aminoacizi i fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizeaz cu agar; -sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur; -pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor. Se realizeaz curirea organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n funcie de tipul de explant utilizat; -dimensionarea explantelor este diferit n funcie de specia la care se lucreaz i de tipul de organ folosit ca surs de explante; -inocularea explantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar agitarea n vederea aerrii culturii; -incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la temperatura de o 25 C; -observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp; -subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca 4-6 sptmni, fiind obligatorie pentru meninerea viabilitii calusului. Este important inerea unei evidene stricte a numrului de subcultivri suportate de ctre fiecare fragment de esut calusal; -urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de condiiile n care a fost cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia. esutul calusal are o utilizare variat. El constituie unul din materialele biologice asupra cruia se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii de linii rezistente, pentru selecionarea de plante care s fie tolerante la prezena n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. Nabors (1982) a reuit s obin calus i apoi plante rezistente la concentraii

ridicate de NaCl, substan introdus n concentraii crescnde n mediul de cultur. Astfel, a raportat obinerea de plante de Triticum, Orisa i Pennisetum tolerante la concentraii ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum i la Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0,03%. La gru, cel mai bun calus, care rspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obinut din rdcinia embrionar, dezvoltat n condiiile germinrii cariopselor pe medii aseptice. Atunci cnd se urmrete cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de gru se sterilizeaz, dup care, la microscop, se detaeaz embrionii, evitndu-se lezarea acestora i inoculndu-i pe mediu de cultur. Mediul de cultur recomandat pentru gru (cariopse sau embrioni imaturi) este Linsmaier-Skoog, coninnd macro i microelemente, vitamine, surs de carbon (zaharoz), fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) i agar. Agenii selectivi la care dorim s obinem toleran pot fi introdui fie n mediul de cultur, preparat pentru inducerea formrii de calus, fie se adaug n substratul de cultur destinat repicrii calusului. n cazul n care se utilizeaz ca material biologic de iniiere a culturii de calus, o varietate n mod natural mai rezistent la aciunea duntoare a agentului selectiv n cauz, se realizeaz o reducere a timpului de obinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobndite stabilizate, transmisibile descendenilor. S-a constatat c stabilitatea caracterelor dobndite este dependent de durata n care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp n care s-a operat selecia. Pentru a fi atins o stabil toleran, chiar i n condiiile absenei ndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt necesare cel puin ase luni de clire i selecie, prin subcultivri repetate. Menionm c i n situaia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenierii capacitii regenerative a calusului, n calus de tip regenerativ i neregenerativ. Numai din calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este inutilizabil n acest gen de experimente. Calusul poate fi utilizat i ca instrument de cercetare n diferite experimente de fiziologie, n studierea problemelor de morfogenez, n urmrirea unor modificri ultrastructurale, n analize de ordin biochimic, sub aciunea unor anumii factori, administrai exogen sau n dependen de natura inoculilor din care a provenit calusul. n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reaciei celulei vegetale la o serie de substane sau condiii de cultur, permind efectuarea unor experimente de fiziologie privind: creterea, reacia la pesticide, noxe, ioni grei, respiraia, morfo i organogeneza, testarea viabilitii celulare, a biogenezei unor produi primari sau secundari de metabolism. 6.1.7.4 Cultura de embrioni i endosperm Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practic n diferite scopuri, att pentru cercetri de fiziologie a seminei ct i n experiene de hibridri intersoiuri, interspecii i intergenuri. nc din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivrii pe medii aseptice a embrionilor de Raphanus i Cachlearia pe soluii minerale cu adaos de zaharoz, obinnd plantule transferabile n sol. Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecionate continuu. Van Qverbeek i colab. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) i Morel (1956) s efectueze experiene de multiplicare in vitro folosind ca material iniial embrioni extrai din semine coapte. Seminele au fost sterilizate, dup care au fost mbibate n ap, 12-24 ore, i apoi, n condiii aseptice a fost izolat embrionul. Embrionii pot fi cultivai in vitro, ca atare sau se opereaz detari de fragmente embrionare, sau sunt cultivai n scopul obinerii de calus, care este utilizat ulterior n alte

experimente. Exist i practici constnd n grefarea de embrioni pe endospermul aparinnd altor specii sau genuri, operaie denumit hibridare in vitro. Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de explante, complexe. Un rol deosebit revine momentului n care se execut explantarea embrionului, respectiv timpul scurs dup fecundare, din clipa formrii zigotului i pn la inocularea lui in vitro, perioad care exprim vrsta embrionului n zile. Ovulul fertilizat adpostete zigotul care, dup formare, ncepe s se divid i se hrnete din rezervele endospermului. n aceast faz celulele embrionului sunt heterotrofe; pentru creterea i dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine i hormoni. n aceast etap explantarea embrionului i inocularea lui pe medii aseptice creeaz probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continurii proceselor de cretere i de dezvoltare. De regul, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice n momentul n care sunt formate cotiledoanele, respectiv cnd ncepe diferenierea intern a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogen a structurii embrionare variaz de la specie la specie i uneori este dependent de condiiile meteorologice. n unele cazuri, cnd este important izolarea timpurie a embrionului de sub aciunea plantei mam, poate fi realizat o cretere corespunztoare a acestuia numai dac embrionul este izolat mpreun cu nucela sau cu esutul nutritiv, sau dac se detaeaz ovulul n ntregime realizndu-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunztoare ca i compoziie. Prin cultura in vitro de embrioni se poate prentmpina avortarea sau dezvoltarea anormal a embrionilor ca urmare a instalrii unei incompatibiliti ntre embrion i esutul nutritiv, aa cum este cazul hibrizilor sexuali intervarieti interspecii i intergenuri, sau al formrii de hibrizi sterili. Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridic mari probleme, cultura de embrioni maturi este mult mai uor de realizat. Embrionii maturi necesit un mediu de cultur simplu, care are n compoziia sa sruri minerale i o component glucidic. Adugarea la mediul de baz a vitaminelor (acidul nicotinic, acidul ascorbic, piridoxin) impulsioneaz creterea esuturilor, iar adugarea fitohormonilor de cretere are drept scop urmrirea evoluiei embrionilor n prezena acestora, pentru a asigura stimularea creterii unui anumit organ sau pentru inducerea formrii de calus. n mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomand adiionarea unor extracte naturale: hidrolizat de casein, lapte din nuc de cocos, suc din fructe de tomate sau extract de endosperm. n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiia ca ei s fie explantai n acea faz de formare care s le permit, n continuare parcurgerea evoluiei fireti a proceselor de ontogenez i s se respecte integritatea lor morfoanatomic; cu ct stadiul n care au fost prelevai a fost mai timpuriu cu att i factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai compleci i greu de reprodus. n timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similar cu cei dezvoltai n condiii naturale, sau prezint chiar un uor avans n cretere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt plpnde, iar n sol dovedesc o cretere mai lent i sunt mai firave. Cultura de embrioni imaturi, recoltai foarte tineri, uneori conduce la obinerea de plantule malformate, chiar dac mediile de cultur au o compoziie adecvat dezvoltrii acestora. n unele cazuri, dup polenizarea interspecific sau intergeneric, dezvoltarea embrionilor a fost extrem de lent, ceea ce a fcut ca explantarea embrionilor i cultivarea lor in vitro, s fie imposibil. Taira i Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-aminon-caproic, facilitnd astfel, creterea embrionilor hibrizi, realizai ntre gru i secar, depind barierele fiziologice care mpiedicau creterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu anumii regulatori de cretere, dup polenizare, impulsioneaz creterea embrionilor pn la faza n care ei pot fi extrai i cultivai, cu succes, pe medii aseptice.

Prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n, mbinndu-se caracterul de perenitate cu cel al calitii furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune s-au obinut i n regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere, obinndu-se hibrizi interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, i Medicago. Tot prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante la specii ale cror semine nu germineaz (banane) sau a celor care se nmulesc greu prin semine (specii forestiere). n unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de laten, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metod eficient n scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor. De asemenea, embrionii pot s serveasc i ca esuturi de plecare n multiplicarea i propagarea rapid a unor plante (la specii ornamentale) atunci cnd acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de explante. O atenie deosebit trebuie acordat aspectelor teoretice i practice pe care le ridic problemele de embriologie experimental la gimnosperme. Cea mai veche cultur de embrioni la gimnosperme este citat ca fiind efectuat de ctre Schmidt n anul 1924, cnd a cultivat pe un mediu organic embrioni de Pinus sylvestris. Mai trziu, n 1936 Rue a reuit cultivarea in vitro a embrionilor provenii de la cteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis, Tsuga canadensis i Pseudotsuga menziensii i a demonstrat, totodat, c embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi cultivat pe medii aseptice, pn la stadiul de plantul. Experimentele ulterioare au reliefat faptul c embrionii de gimnosperme pot fi crescui in vitro, n lipsa megagametofitului (Cachi, 1984). La cultura de embrioni, presiunea osmotic, sau sursa de carbon organic, joac un rol important n evoluia acestora, atunci cnd embrionii sunt excizai i sunt cultivai in vitro. De exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un coninut de 3-6% zaharoz i hormoni, vor genera plantule, n timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoz, se constat o serioas limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare. Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuit scoaterea acestora din starea de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de sub aciunea megagametofitului. Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip secundar, derivnd din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar, avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip primar. Ambele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea creterii embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regul endospermul este consumat n primele faze ale dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor. Primele experimente constnd n proliferarea endospermului imatur de porumb au fost efectuate nc din anul 1933 de ctre Lampe i Mills. La Rue, n anul 1947, a realizat creterea nelimitat a endospermului de porumb. Cercetrile menionate au deschis calea unor experimente prin care s-a dovedit c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor rdcinie, mugurai i chiar plantule. n aceast direcie, Straus i La Rue n 1954, au obinut rezultate excelente cultivnd endosperm de porumb, la 12 zile de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile dup polenizare, nu crete pe medii aseptice. Deci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care se afl diferenierea celulelor embrionului. Endospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde scopului inducerii formrii de calus i anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifest procese de organogenez. Endospermul de porumb, de ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas

de calus n continu cretere, fr organogenez, n timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observ embriogeneza. Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de embriologie i n embriogeneza experimental, constituind un sistem de tip monitorial n redarea fazelor de cretere ale diferitelor pri componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate n dependen de natura substratului de cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind importante informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu regulatorii de cretere, procesele de depozitare ale substanelor de rezerv n esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n formarea i creterea embrionilor. 6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule i de esut nucelar n hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate ntre partenerii sexuali. De aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de ctre ovule a autopolenizrii ori a polenizrii ncruciate, nvingndu-se astfel barierele de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la ncruciri, operaiunile fiind fcute n scopul obinerii de semine viabile. Incompatibilitatea dintre ovule i polen este provocat de ctre diferite cauze, de ordin endogen i anume: o prim selecie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate prezenta o conformaie morfologic necorespunztoare, mpiedicnd angrenarea ornamentaiilor exinei polenului pe vilozitile stigmatului; pe de alt parte, natura umed sau uscat a suprafeei stigmatului poate constitui un impediment n reinerea polenului pe stigmat i n crearea mediului optim; substanele secretate de ctre celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum i creterea tubului polinic. n unele cazuri exist o autoincompatibilitate natural, generat de faptul c plantele care trebuie ncruciate prezint diferene morfologice constnd n mrimea polenului, amplasarea anterelor n floare etc. Alteori, maturitatea organelor sexuale se face n momente diferite, caz n care se impune ca, n prealabil, polenul s fie recoltat i s fie conservat, pentru o anumit perioad de timp. Experimentele de polenizare i fecundare artificial in vitro trebuie precedate de o cunoatere a bilogiei florilor cu care se dorete efectuarea experienelor, att n ceea ce privete morfologia, etapele de morfogenez ct i a compatibilitii i a incompatibilitii, a antezei i a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. Pe de alt parte trebuie fcute testri prealabile cu privire la mediile de cultur adecvate meninerii microsporilor la un potenial biologic i ntr-o stare optim de viabilitate, pentru asigurarea creterii tubului polinic, pentru meninerea viabilitii prilor componente ale pistilului. Polenizarea i fecundarea artificial in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea n contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele excizate. Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practic n cazul speciilor compatibile sexual, cnd nu exist impedimente morfofiziologice, privind fixarea i germinarea polenului la nivelul stigmatului. Prin aceast metod s-a reuit autopolenizarea la Antirrhinum majus (Usha, 1965), n schimb la Petunia violacea, specie autocincompatibil s-a constatat c autopolenizarea in vitro a fost urmat de o cretere a pistilului dar dup un timp acesta s-a brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachi, 1984). Deseori, ns, polenizarea i fecundarea in vitro a ovulelor au euat, n condiiile utilizrii tehnicilor constnd n folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la reproducerea acelorai ncruciri, dar opernd cu ovare sau ovule.

Meritul primei culturi de ovare i revine lui La Rue (1942), care a reuit cultivarea in vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobinnd, ns n final semine viabile. n aceast perioad, Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum, Cucumis angeria, Phaseolus vulgaris i Nicotiana tabacum. Mediile de cultur au fost complexe i au coninut ca fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic i acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic. Ovarele au fost recoltate fie nainte de polenizare fie dup ce polenizarea s-a petrecut n mod natural. In vitro ele au crescut, dar n final nu au format semine. Prin tehnicile de cultur in vitro a ovarelor au fost obinui hibrizi din ncruciarea hibrizilor diploizi de Brassica chinensis i autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata, 1968). Hibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare ntre cei doi prini. La Oryza sativa i la Haworthia turgida, Majumdar a obinut, n anul 1970, plantule din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice. Mitra (1972) a reuit obinerea de embrioizi din pereii ovarelor nepolenizate de Citrus aurantifolia i Citrus sinensis, cultivate in vitro. n general cultura de ovare servete la inducerea artificial a poliembrioniei, la seminele care, normal, sunt monoembrionare. Exist numeroase cercetri care atest rolul deosebit pe care l joac prile florale n dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari i Lal (1961, citai de Cachi, 1984) experimentnd cu flori excizate, cultivate in vitro, au constatat la Iberis amara formarea unor fructe normale, numai dac, n condiiile inoculrii lor la o zi dup polenizare, acestea prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi suplinit prin adugarea n mediul de cultur a unui surplus de zahr. n cazul n care florile au fost excizate i inocularea s-a fcut la opt zile dup polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimit. Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct ntre polen i ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic pn la sacul embrionar. n acest mod, s-a realizat actul de fecundare ntre indivizii ndeprtai filogenetic, nlturndu-se barierele incompatibilitilor genetice i obinerea, n final, de semine viabile. nc din anul 1932, White a ncercat s cultive ovule de Antirrihinum, dar a obinut calus, generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivnd in vitro ovule de Erythronium americanum, observat o cretere a acestora fr ca s obin maturizarea lor. n anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, n condiiile cultivrii in vitro a acestora, s-a observat apariia fenomenelor de poliembrionie. Embrionii izolai au continuat s prolifereze numeroi ali embrioni (Zatyko, 1975). S-a constatat c esutul placentar exercit un efect pozitiv asupra creterii ovulelor cultivate in vitro, favoriznd formarea i maturarea seminelor. Se presupune c esutul placentar cedeaz ovulelor anumite substane stimulatoare. Substanele respective nu prezint o specificitate, ntruct ovule fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe placent de Capsicum. n condiiile cultivrii acestora in vitro, ovulele s-au maturizat i au format semine viabile. Pot fi cultivate in vitro att ovule fertilizate ct i ovule nefertilizate. Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate n condiiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic. Exist perspective mari n ceea ce privete realizarea prin culturi in vitro a unor polenizri ncruciate, interspecifice i intergenerice care n condiiile obinuite, n natur duc fie la incapacitatea embrionului format n a-i menine viabilitatea, fie smna rezultat se dovedete inapt n a suporta dezvoltarea embrionului. n literatur se citeaz hibridul realizat ntre Lolium perene i Festuca rubra, utilizndu-se ovule detaate din floare, la cinci zile de la polenizare. Plantele rezultate au fost asemntoare cu Festuca rubra.

nvingerea barierelor morfo-fiziologice creeaz posibilitatea realizrii de hibrizi interspecifici care, n viitor, pot prezenta un interes economic major i care n mod natural nu pot fi obinui prin hibridare sexuat. S-au reuit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. Pornind de la acest tip de esut, in vitro se poate induce poliembrionia. Astfel, n 1976, Mullins i Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera Cabernet Sauvignon, specie n mod normal monoembrionar. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele cruia s-au difereniat embrioizi, ceva mai mari dect embrionii zigotici. Plantulele rezultate au fost viabile. La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspt, recoltat n perioada iniierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales n cazul urmririi realizrii de polenizri interspecifice sau intergenerice. n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculrii, polenul s fie testat n ceea ce privete capacitatea germinativ, creterea tubului polinic i s se studieze comparativ eficiena ctorva reete de medii de cultur, n vederea asigurrii unei creteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea i susinerea ntregului potenial biologic al celulei generative i a celei vegetative. n cazul n care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar s se aproximeze dac tubul polinic are o lungime corespunztoare pentru a fi asigurat accesibilitatea lui la ovule; n caz contrar se renun la cultura de pistile i ovulele vor fi excizate i cultivate ca atare. n acest mod, va fi facilitat fecundarea i se prentmpin epuizarea celulei generative, n decursul parcurgerii traseului de la stigmat, pn la sacul embrionar (Cachi, 1984). Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor i a altor pri florale, precum i a ansamblelor de componente florale a permis completarea cunotinelor actuale privind funcionarea organelor respective i privind biologia fecundrii, a formrii embrionului, a seminei i a fructului. Aceste cunotine servesc la obinerea de noi succese n nvingerea barierelor incompatibilitilor existente n hibridarea sexuat, fapt deosebit de important, ntruct prin nmulirea sexuat se poate rennoi continuu, potenialul biologic al plantelor, mbogindu-se zestrea ereditar, cu caracterele motenite de la doi prini, posednd acumulri genetice diferite. 6.1.7.6 Cultura de celule Poate fi definit ca o cretere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu de cultur lichid. n funcie de momentul n care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus n momentul iniierii culturii i mult mai accentuat n perioada optim de cretere. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente dezmembrri a celulelor inoculate, a separrii i individualizrii pariale a acestora. De asemenea ele pot fi i rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fr separarea celulelor, iar n astfel de cazuri frecvena agregatelor crete pe msura atingerii perioadei maxime de diviziune celular. Ulterior dei frecvena diviziunilor scade, mrirea agregatelor celulare se datoreaz creterii n volum a celulelor. Cea mai perfect cultur de celule nu este alctuit numai din celule libere. Pentru a reduce numrul de agregate se practica filtrarea culturii. Agregatele care persist i dup filtrare vor deine maximum 4-10 celule, uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976). Gradul de dispersare a celulelor, ntr-o suspensie celular, depinde de durata creterii celulelor n cultur, originea acestora, compoziia mediului i condiiile de cultur (Street, 1977). Mediul de cultur optim, de cultivare la celulele de gimnosperme difer de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate, dar i fa de mediul folosite la dicotiledonate. Unul din constituenii mediului de cultur de care depinde meninerea

celulelor n suspensie sunt fitohormonii de cretere care pot influena cultura celulelor in vitro prin natura lor i concentraia folosit. Astfel un coninut ridicat de auxin determin creterea numrului de celule n suspensie, iar reducerea coninutului n acest fitohormon, descrete capacitatea celulelor de a se separa (Torrey i Reinert, 1962). De asemenea s-a constatat c procesele de agregare celular sunt influenate i de prezena n mediul de cultur a etilenei dar i de creterea concentraiei n glucide. O cultur celular ideal trebuie s fie omogen din punct de vedere morfologic i biochimic. Numai o cultur de celule individualizate, obinute prin clonarea unei singure celule, meninut n condiii care s pstreze stabilitatea nuclear, constituie un material biologic valoros pentru operaiunile de mutagenez, n izolarea de linii celulare, n selectarea de mutani, de un anumit tip. Culturile de celule de lung durat manifest o diversitate genetic n cadrul populaiei de celule (Cachi, 1984). Pentru meninerea celulelor ntr-o stare activ de diviziune i astfel creterea gradului de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp. Din momentul iniierii unei culturi celulare i pn n momentul practicrii unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numete ciclu de cretere a culturii. n decursul acestui ciclu se produc schimbri n ceea ce privete viteza de diviziune i de cretere a celulelor. Se distinge o faz incipient de cretere a vitezei de multiplicare celular, urmat de o perioad de plafonare a frecvenei diviziunilor, dup care, fr o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate ntr-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse n acelai flacon de cultur. n aceste condiii creterea nceteaz atunci cnd nutrienii de baz din mediu s-au redus sau au fost epuizai. Exist i sisteme nchise de cultur care asigur remprosptarea continu a mediului consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de cultur aciune care asigur funcionarea sistemului i recoltarea biomasei produse. n acest sistem se realizeaz un echilibru ntre cantitatea de mediu introdus n sistem i mediul evacuat. Durata meninerii n condiii de viabilitate a unei culturi, fr a se produce modificri, depinde de specie, de condiiile de cultur, de epuizarea din mediu a constituenilor, care pot limita diviziunea i creterea, de pH. Dea asemenea oxigenul i glucidele din mediu pot influena creterea, astfel c o reducere a celor dou componente determin reducerea sau chiar stoparea creterii celulelor. Subcultivarea celulelor nainte de finalizarea perioadei exponeniale de cretere a celulelor permite obinerea unor populaii de celule mai stabile. Prin ncorporarea n mediul de cultur a unor concentraii reduse de enzime se poate realiza separarea celulelor, ntruct enzimele, n diluii adecvate, nu influeneaz negativ rata de cretere, permind obinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic i metabolic. Rata de cretere a numrului de celule n decursul ciclului de cretere a culturii se modific din momentul iniierii culturii, pn la oprirea diviziunilor. O prim faz, imediat dup inoculare, const ntr-o ntrziere a declanrii proceselor de multiplicare i de cretere, dar n urmtoarele 10 zile numrul de celule per unitatea de volum crete exponenial, urmnd apoi faza de staionare i apoi faza de declin. Faza exponenial de cretere se caracterizeaz ca o perioad finit de timp, n care rata de cretere a biomasei, raportat la unitatea concentraiei de biomas este constant. Faza de cretere exponenial este extins n condiiile n care cultura este iniiat cu o densitate redus a celulelor per unitatea de volum (Cachi, 1984). Pentru a menine culturile ntr-o faz de cretere exponenial trebuie prevenit situaia limitrii nutrienilor din mediu ca o consecin a epuizrii acestora. n acest sens se impune subcultivarea frecvent a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus

gracilis i la un interval de 48 ore. La o cultur de Acer pseudoplatanus, Dorre i colab. (1971) au realizat subculturile la un interval de 7 zile, obinnd o densitate iniial de 2 x 105 celule/ml. Pentru culturile de celule se pot folosi urmtoarele tipuri de dispozitive: -fermentatoare de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate i n cultura cu volum de mediu limitat, stabilit iniial; -chemostate pentru cultura continu, deschis; -fitostate chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate n care rata de cretere i densitatea celular sunt meninute constante, prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi i hormonali; -turbiostate sistem deschis de cultur continu, n care mediul proaspt se adaug n momentul creterii turbiditii culturii i a eliberrii, prin splare i eliminare a excedentului de celule. O cultur de celule poate fi obinut pe mai multe ci. Cea mai folosit metod const n realizarea n mediul de cultur lichid a unei suspensii utiliznd ca material iniial calus, pentru ca s se realizeze o dispersare a celulelor i a agregatelor ce alctuiesc masa de calus, condiie ce poate fi ndeplinit prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balan hormonal adecvat scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4 diclorfenoxiacetic, n diferite concentraii. n cazul n care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar i n condiiile agitrii mediilor de cultur lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului i diluarea agregatelor celulare mici n mediu de cultur proaspt. De asemenea, n acelai scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul lichid i recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel c, coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci cnd se reiniiaz suspensia celular (Street, 1976). O alt metod const n omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderat, n omogenizator de sticl i apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate. n acelai scop se pot utiliza protoplati obinui prin digestie enzimatic. Cultura de suspensii celulare se menine prin inocularea unei cantiti de mediu, dintro cultur deja existent, avnd o densitate cunoscut de celule, dilund-o cu mediu proaspt. Densitatea celulelor n subcultur nu trebuie s depeasc iniial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. n decurs de 15-25 zile densitatea va crete pn la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachi, 1984). Cultura de celule prezint foarte multe avantaje. Exist specii care constituie modele n ceea ce privete reacia la condiiile create i la care procesele de citodifereniere, de organogenez i embriogenez pot fi controlate i dirijate n sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule prezint avantaje deosebite n efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creterii, citodiferenierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de celule, fiind constituit ntr-o populaie omogen de celule se poate folosi n vederea inducerii variabilitii genetice i seleciei de mutani, prin expunerea culturii la aciunea unor anumii ageni fizici sau chimici. Unul din marile obiective urmrite prin culturile de celule l constituie acela al selectrii de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, sruri, etc. Prin astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar modificrile genetice operate la nivel celular pot fi regsite n plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaie. Selectarea liniei celulare se poate face uor prin etalarea suspensiei pe medii de cultur solide, recoltarea efectundu-se n perioada creterii exponeniale (Cachi, 1984). Capacitatea regenerativ depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora, vrsta culturii, compoziia substratului i de condiiile de cultur.

ntruct experienele de ameliorare i genetic din cmp sunt costisitoare, necesitnd mult for de munc i suprafa mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se simplific, reducndu-se activitatea, n prima faz, doar n laborator, astfel c se reduc att suprafeele de lucru ct i timpul necesar obinerii rezultatelor dorite. n plus materialul biologic valoros obinut, prin cultura de celule se poate pstra timp ndelungat prin crioconservare, n azot lichid. O problem deosebit este aceea a obinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele cultivate pe medii aseptice dei au clorofil nu pot supravieui n lipsa zahrului din mediul de cultur. n ncercrile fcute pe medii aseptice s-a constatat c succesul cultivrii esuturilor i celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim, nregistrndu-se o rat sczut a creterii acestora. Vigurozitatea slab a celulelor crescute n astfel de condiii a fost explicat printr-o activitate fotosintetic sczut, datorat unor deficiene de cultur, care mpiedic dezvoltarea cloroplastelor i a fotosintezei. Yamada i colab.(1978) s-au ocupat de aceast problem i au ajuns la concluzia c n realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie s se aib n vedere selectarea de celule care produc mult clorofil. Lumina puternic stimuleaz sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraie sczut de zaharoz. Prezena n mediul de cultur a unor concentraii ridicate de zaharoz inhib sinteza clorofilei. Culturile de celule au implicaii practice deosebite n industria aa zis de tip fermentativ, dup modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele n scopuri industriale. i n culturile de celule s-a asimilat i adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele n care se cultiv celule. La plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produii secundari de metabolism sunt depozitai n vacuole, nefiind excretai n mediul de cultur. La suspensiile celulare, derivnd din plantele superioare, durata de fermentaie este de cca 10 ori mai mare dect la culturile de tip microbian. Un aspect particular l constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma precursori sau anumii compui prezeni n mediul de cultur. Biotransformarea poate fi utilizat pentru diferite tipuri de reacii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiia de carbon, ruperea lanului de carbon. Culturile n mediu lichid prezint avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienii, se asigur un schimb de gaze optimizat, se evit neajunsurile provocate de o eventual orientare polar neadecvat, precum i depozitarea i concentrarea n jurul celulelor a produilor de metabolism, eliminai n mediu. 6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosit ca explant pentru iniierea culturilor in vitro. Inducerea neoformrii de esuturi este dependent de specie, de natura organului, de mrimea explantului, natura esuturilor prezente n explant, sezonul n care s-a recoltat organul, modul de sterilizare, compoziia mediului de cultur, orientarea lor pe mediu precum i balana hormonal folosit n mediul de cultur. De regul, n afar de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al inflorescenelor, cotiledoanelor i mai rar, n poriunea internodal a tulpinilor se constat existena unei capaciti regenerative, a crei intensitate depinde de specie, de vrsta organului din acre se preleveaz esuturile, mrimea explantului, orientarea lui pe mediu de cultur, de compoziia mediului sau de condiiile din camera de cretere. ntr-un experiment efectuat de Lazr i Cachi (1980-1982), cu explante de crizantem de natur diferit, cultivate pe mediu de baz cu adaos de AIA (2 mg/l) i BA (2mg/l) s-a constatat c, n afar de meristeme, alte tipuri de explante folosite de la peduncul floral, peiol, inflorescena, minibutai frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de organogenez, pe suprafaa superioar, formare de mugurai

iar pe cea inferioar, generarea de rdcinie. Din meristemele apicale, dup dou luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. Din meristemele axilare, diferenierea plantelor s-a fcut mai lent. Plantele formate din meristeme au avut o conformaie proporionat i s-au adaptat bine la viaa mediului septic. Explantele nodale i cele constnd din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un numr variabil de mugurai. Dintre acetia unul pn la trei s-au dezvoltat, ceilali rmnnd n diferite faze de cretere. separai i subcultivai pe medii proaspete au format rdcinie i s-au dezvoltat normal. Inoculii constnd din explante de form cilindric (ex. internod), au prezentat o pregnant polaritate morfogenetic, chiar dac explantul a fost acoperit de calus. Procesul de organogenez a fost i mai sczut la fragmentul desprins din mijlocul peiolului frunzelor. n general, inoculii constnd din internod i mai ales cei dimensionai din peiol au generat mult mai mult calus dect cei de form i mrime similar, obinui din peduncul floral. Explantele dimensionate din poriunea limbului foliar, n care nervura principal a frunzei era bine reprezentat, au generat o cantitate mai redus de calus, n schimb au dat natere la mugurai, din care s-au format plante (Lazr i Cachi, 1982). n general, lstraii formai la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, ceea ce atest c din celulele calusului se pot diferenia plantule cu o conformaie particular, diferit de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurat, pe aceast cale nmulirea clonal. Concluzia final a constat n aceea c regenerarea i diferenierea rapid a noi plante sa realizat din inoculii meristematici. Lstarii pot fi transformai n minibutai i prin aceasta se ridic coeficientul de multiplicare a clonei respective. Se poate deci concluziona c, n funcie de specia la care se dorete experimentare, dar innd cont i de scopul urmrit, natura explantului este diferit, iar rezultatul preconizat a se obine este influenat de o serie de factori, de la compoziia mediului de cultur, natura fitohormonilor de cretere i concentraia acestora, pn la vrsta organului donor sau condiiile din camerele de cretere. Exist, aadar, o gam variat de posibiliti de inducere a unei culturi in vitro, astfel c se pot depista pentru fiecare specie de cultur, ornamental sau forestier, sursele de explante cele mai potrivite n vederea realizrii unor astfel de experiene. Iar acolo unde literatura nu ofer posibiliti de inducere a culturilor de celule, experiena cercettorului poate permite depistarea prin tatonri a celor mai bune metode n vederea realizrii obiectivelor n acest domeniu.