10.

- CINTICA ENZIMTICA

Imagen generada por ordenador de un modelo de la estructura tridimensional de la enzima purina nuclesido fosforilasa bacteriana. La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica de una enzima nos mostrar los detalles del mecanismo cataltico de esa enzima, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por drogas o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son macromolculas con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la DNA-polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurre n durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se

suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y los ribosomas radica en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiados y clasificados por los mismos mtodos. Principios generales

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y su punto mximo de saturacin. El conocimiento de estas propiedades nos permitir hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

Cintica de las Reacciones Enzimticas En principio, las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas enzimticamente, aunque estas ltimas tienen la particularidad de mostrar el fenmeno de saturacin por el sustrato. A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad, en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reaccin es independiente de esta. Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una regin determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias llevaron a postular la existencia de un complejo enzima sustrato (E S) como etapa previa a la formacin de productos. Centro activo de una enzima Ya se haba mencionado que la porcin de la molcula en la enzima que se una al o a los sustratos es una zona relativamente pequea de la misma. Esta zona, responsable de la actividad cataltica, que favorece la orientacin de los grupos qumicos (que reaccionan para dar los productos de la reaccin) recibe el nombre de centro activo. Los grupos responsables de la actividad cataltica propiamente dicho se los denomina sitios catalticos. En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos prostticos de los cuales ya se ha hablado. Factores que influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 450 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 370 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 00 C. Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimtica: El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.

Enzimas: Pepsina Tripsina Catalasa Arginasa Fumarasa Ribonucleasa

pH ptimo 1,5 7,7 7,6 9,7 7,8 7,8

11- INHIBICIN ENZIMTICA La actividad enzimtica puede ser disminuida o eliminada por la accin de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimticos. Mediante el uso de inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin muy valiosa sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas. Ciertos metales como el plomo, mercurio y arsnico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos SH libres. El proceso de inhibicin enzimtica es til para comprender los mecanismos de accin txica y farmacolgica de algunos compuestos. Inhibidor enzimtico

Proteasa del HIV formando un complejo con la proteasa inhibidora ritonavir. La estructura de la protesa se muestra como una cinta roja, azul y amarilla. La inhibidora se muestra comouna estructura de pequeas bolas y varillas cercana al centro. Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Ya que el bloqueo de una enzima puede matar un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico, muchos medicamentos actan como inhibidores enzimticos. Tambin son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad. La unin de un inhibidor puede detener al sustrato de entrar al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima catalice su reaccin. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles usualmente reaccionan con la enzima y cambian su estructura qumica. Estos inhibidores modifican los residuos esenciales de los aminocidos

necesitados para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente y diferentes tipos de inhibiciones son producidas dependiendo en si el inhibidor se une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a los dos. Muchas molculas de medicamentos son inhibidores enzimticos, por lo que su descubrimiento y mejora es un campo de investigacin activo en la bioqumica y la farmacologa. Un inhibidor enzimtico medicinal es juzgado a menudo por su especificidad (su carencia de unirse a otras protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual indica la concentracin necesaria para inhibir a la enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y as su toxicidad baja. Los inhibidores enzimticos tambin son usados en la naturaleza y estn implicados en la regulacin del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas en una ruta metablica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas va. Este tipo de contrarreaccin retarda el flujo a travs de la va cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una clula. Otros inhibidores enzimticos celulares son protenas que se unen especficamente e inhibe a su blanco de la enzima. Esto puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dainas para la clula, como las proteasas o nucleasas; un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones protenaprotena ms fuertes conocidas. Inhibidores enzimticos naturales tambin pueden ser venenos y ser usados como defensa en contra de depredadores o una forma de matar a la presa. Inhibidores reversibles Tipos de inhibidores reversibles Los inhibidores reversibles se unen a la enzima con interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y enlaces inicos. Los enlaces dbiles mltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unin fuerte y especfica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones qumicas cuando se unen a la enzima y puede ser removido fcilmente por dilucin o dilisis.

Inhibicin competitiva: el sustrato (S) y el inhibidor (I) compiten por el sitio activo. Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican segn el efecto de variar la concentracin del substrato de la enzima en el inhibidor.

En la inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma

enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato tambin se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del substrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores competitivos tienen comnmente Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al substrato verdadero (vea los ejemplos abajo).
En la inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que al sustrato de la enzima. Sin embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del substrato, y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibicin resulta generalmente de un efecto alostrico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo en una enzima. La unin del inhibidor con el sitio alostrico cambia la conformacin (es decir, la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. La inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del

inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato. Como resultado, el grado de la inhibicin depende solamente de la concentracin del inhibidor. Inhibidores irreversibles Tipos de inhibiciones irreversibles

Reaccin entre el inhibidor irreversible diisopropilfluoroposfato (DFP) con la proteasa de la serina.

Los inhibidores irreversibles usualmente modifican una enzima covalentemente, y por lo tanto la inhibicin no puede ser invertida. Los inhibidores irreversibles comnmente contienen grupos funcionales reactivos como mostazas nitrogenadas, aldehdos, haloalcanos o alquenos. Estos grupos electroflicos reaccionan con las cadenas de aminocidos para formar uniones covalentes. Los residuos modificados son esos que contienen en sus cadenas laterales nuclefilos como por ejemplo un grupo hidroxilo o un grupo sulfhidro; esto incluye a los aminocidos serina (como en DFP, a la derecha), cisteina, treonina o tirosina. La inhibicin irreversible es diferente de la inactivacin enzimtica irreversible. Los inhibidores irreversibles son generalmente especficos para un tipo de enzima y no inactivan a todas las protenas; estos no funcionan destruyendo la estructura protenica, pero especficamente alterando el sitio activo de su blanco. Por ejemplo, pH y temperaturas extremas usualmente causan la desnaturalizacin de todas las estructuras protenicas, pero este no es un efecto especfico. Similarmente, algunos tratamientos qumicos no especficos destruyen la estructura de la protena: por ejemplo, poner una concentracin alta de cido clorhdrico hidrolizar los enlaces peptdicos que mantienen unida a las protenas, liberando aminocidos libres. Descubrimiento y diseo de inhibidores Nuevos medicamentos son productos de un largo proceso de desarrollo de medicamentos, en el cual el primer paso casi siempre es el descubrimiento de un nuevo inhibidor enzimtico. En el pasado la nica forma de descubrir estos nuevos inhibidores era a travs de la prueba y error: probando una gran cantidad de compuestos contra la enzima a la cual se quiere inhibir y esperando que pueda emerger algo que nos conduzca a algo til. Este acercamiento a fuerza bruta es todav a exitoso y a sido extendido por acercamientos a la qumica combinatoria que rpidamente produce un gran nmero de compuestos novedosos y investigacin de procesamiento de altorendimiento tecnologa para investigar rpidamente estas bibliotecas qumicas enormes para los inhibidores tiles. Ms recientemente, un tipo de investigacin alternativa ha sido aplicada: el Diseo racional de frmacos que usa la estructura tridimensional del sitio activo de una enzima para predecir cuales molculas podran ser inhibidores. Estas predicciones entonces se prueban y uno de estos compuestos probados puede ser un inhibidor novedoso. Este nuevo inhibidor es usado despus para tratar de obtener una estructura de la enzima en un complejo enzima-sustrato para mostrar como se une la molcula al sitio activo. Esta estructura es despus infeccionada y cambios efectuados al inhibidor intentan optimizar la unin con la enzima. Este ciclo de prueba y optimizacin es despus repetido hasta un inhibidor lo suficientemente potente es producido. Tpicamente, este proceso intenta producir un inhibidor con una constante de disociacin de <10-9 M. Aplicaciones de los inhibidores Inhibidores enzimticos son encontrados en la naturaleza y tambin son diseados y producidos como parte de la farmacologa y la bioqumica. Los venenos naturales son a menudo inhibidores enzimticos que han evolucionado para defender a la planta o animal contra depredadores. Estas toxinas naturales incluyen algunos de los compuestos ms venenosos conocidos hasta hoy. Los inhibidores artificiales son a menudo usados como medicamentos, pero tambin pueden ser insecticidas como el malathion, herbicidas como el glifosato, o desinfectantes como el triclosn.

12- ISOENZIMAS Son enzimas que difieren en su forma estructural pero que poseen la misma actividad cataltica, catalizan la misma reaccin.