OsojnikG 2009 Imobilizacija

Imobilizacija
IljaGasanOsojnikrnivec
Seminarskanalogapripredmetu: Izbranapoglavjaizbiotehnolokihprocesov
Ljubljana, 2009
TodelojezaitenozlicencoCreativeCommonsPriznanjeavtorstva2.5SlovenijaLicense http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/si/
OsojnikrnivecI.G.Imobilizacija.Seminarskanalogapripredmetu:Izbranapoglavjaizbiotehnolokih procesov.UL,FKKT,DoktorskitudijskiprogramKemijskeznanosti,2009
II
KAZALOVSEBINE
str.
1 2
UVOD KATALIZA
1 2 3 5 9 11 12 15 15 21 26 27 31 32 32 35 36 37 43 44
3 HETEROGENIKATALIZATORJI 3.1 PRIPRAVATRDNIHHETEROGENIHKATALIZATORJEV 4 HOMOGENIKATALIZATORJI 4.1 HETEROGENIZACIJAHOMOGENIHKATALIZATORJEV 5 DVOFAZNIKATALITSKISISTEMI 6 BIOLOKISISTEMI 6.1 ENCIMIINDRUGEKATALITSKOAKTIVNEBIOLOKEMOLEKULE 6.2 IMOBILIZACIJAENCIMOV 6.3 CELICE 6.4 IMOBILIZACIJACELIC 6.5 LASTNOSTIIMOBILIZIRANIHBIOKATALIZATORJEV 7 REAKTORJIZAIMOBILIZIRANESISTEME 7.1 KINETIKA 7.2 PRENOSSNOVI 7.3 LABORATORIJSKIREAKTORJI 7.4 VRSTEREAKTORJEV 8 ZAKLJUEK 9 VIRI
NASLOVNICA
Na naslovni strani je prikazan del kristalne strukture I oblike celuloze. Celuloza ima velik potencial, kot nosilni material za imobilizacijo. Mnoge beljakovine celo razpolagajo s strukturami, ki se veejo izkljuno na celulozo (Linder & Teeri, 1997).
UVOD
Imobilizacija je omejevanje prostega gibanja neke snovi v okolju. V biotehnolokem kontekstu pojmujemo imobilizacijo kot omejevanje gibanja celic in njihovih delov, predvsem z zadrevanjem v ali na doloenem nosilcu, z agregacijo in s flokulacijo (Bucke, 1983). Z imobilizacijskimi tehnikami zmanjamo potrebne koliine in zagotovimo vejo obstojnost imobiliziranih komponent v procesu, enostavno separacijo od reakcijske meanice in vekratno ali kontinuirano rabo v ustreznih reaktorskih sistemih (Bucke, 1983; Walker in Rapley, 2009). V anorganski in organski kemiji poznamo podobne naine zadrevanja aktivnih katalitskih komponent v reakcijski meanici, z namenom izboljave procesne uinkovitosti. Na teh podrojih izraza: imobilizacija ne uporabljamo, temve govorimo o tehnikah priprave heterogenih katalizatorjev, heterogenizaciji homogenih katalizatorjev in dvofaznih sistemih. Mnoge snovi, ki izraajo katalitsko aktivnost, lahko delujejo samostojno v suspendirani oz. prosti obliki (Ullman's Biotechnology ... , 2007). Takni postopki pogosto niso upravieni z ekonomskega vidika, saj so na proizvodnem nivoju potrebne velike koliine prostih katalizatorjev, encimov ali celic za ustrezno pretvorbo reaktantov. Ponovna uporaba mobiliziranih katalitskih komponent je prav tako oteena, saj ostajajo v reakcijski meanici e po separaciji produktov (Laskin, 1985). Stroki ponovnega pridobivanja katalizatorjev iz izrabljene reaktorske vsebine neredko kljubujejo uspehu znanstvenih dosekov na proizvodnem nivoju (Rothenberg, 2008). Imobilizacija katalitsko aktivnih snovi nam ponuja ve prednosti pred sistemi, ki vsebujejo proste aktivne katalitske komponente (Marinek-Logar, 1999): poveana koncentracija katalizatorja na enoto prostornine, zmanjan volumen oz. zmanjan zadrevalni as zaradi vije produktivnosti reaktorja, neodvisen tok substratov / reaktantov in produktov od katalizatorja, enostavna separacija katalizatorja od produktov reakcije, vekratna raba katalizatorja v arnih procesih, dolgotrajna raba katalizatorja v kontinuiranih procesih, bolji nadzor procesa, stabilizacija katalizatorja / znatno poveanje ivljenjske dobe imobiliziranih celic.
Imobilizirane komponente po zakljuku arnega procesa enostavno loimo od reakcijske meanice in jih ponovno uporabimo v novi ari. V kontinuiranem procesu vgradimo katalitsko aktivno snov, npr. v cevni rektor ter med samim procesom v bioreaktor dodajamo reaktante in odvzemamo produkte. Taken sistem lahko vodimo ve mesecev ali celo ve let brez prekinitev S ponovno ali neprekinjeno rabo zmanjamo potrebno koliino surovin v procesu in tako zmanjamo stroke njihove nabave. Niji so tudi stroki cena zakljunih postopkov, ker separacijo produktov izvedemo v manj korakih. Konni produkti reakcije namre niso kontaminirani s katalitskimi komponentami, saj so le-te e v osnovi loene od reakcijske meanice (Walker in Rapley, 2009). Po izvedeni imobilizaciji lahko zaznamo poslabanje ali izboljanje lastnosti imobilizirane snovi v primerjavi z njeno prosto obliko. Pomembni lastnosti katalitsko aktivne snovi, na kateri lahko vplivamo z imobilizacijo, sta stabilnost in katalitska aktivnost. Obseg in vrsta spremembe je odvisna od lastnosti snovi same, lastnosti nosilnega materiala, reaktantov oz. substratov in produktov obravnavanega procesa. V konkretni situaciji je zato zelo teko napovedati, natanno
kaken bo uinek nekega imobilizacijskega postopka (Ullman's Biotechnology ... , 2007; Bowker, 2008; Walker in Rapley, 2009) Komercialna aplikacija imobilizacije je upraviena, ko zmanjanje strokov zaradi zmanjane rabe katalitske snovi in poenostavitve zakljunih procesov odtehta stroke same tehnine izvedbe imobilizacije (Laskin, 1985).
2 KATALIZA
V seminarski nalogi posegamo tudi na podroja onkraj biotehnologije, saj imobilizacijo obravnavamo iz vidika zadrevanja vira aktivnih katalitskih komponent v reakcijskem okolju. Zato moramo nekaj uvodnih besed nameniti tudi fenomenu katalize. Katalizator je snov, ki pospeuje potek kemijske reakcije, tako da v mehanizem kemijske reakcije vnese ve vmesnih stopenj, pri emer ima novi reakcijski mehanizem nijo aktivacijsko energijo (Slika 1). V procesu se katalizator ne porablja, ne vpliva na kemijsko ravnoteje in ostaja po poteku reakcije nespremenjen.
Slika1:Katalizatorspremenireakcijskopottertakozmanjaaktivacijskoenergijo(G). Termodinamskifaktor(H,spremembaentalpije)seobtemnespremeni.
Snovi, ki izboljujejo delovanje katalizatorjev imenujemo promotorji, snovi, ki katalitsko mo zavirajo, pa katalizatorski strupi. V grobem razpoznavamo (Hagen., 2006): homogeno katalizo (reaktanti in katalizatorji so v isti fazi, npr. proizvodnja ocetne kisline iz metanola), heterogeno katalizo (reaktanti in katalizatorji v loenih fazah, npr. proizvodnja margarine z Raney-Ni), biokatalizo (reakcijo katalizirajo bioloke molekule, npr. uporaba celulaz v proizvodnji biogoriv), elektrokatalizo (reakcijo katalizira elektroda, npr. shranjevanje H2 v gorivnih celicah), fotokatalizo (reakciji zagotavlja energijo vir svetlobe, npr. ienje odpadnih voda z UV aktivnim TiO2).
Prebivalci planeta Zemlje imamo od katalitskih sposobnosti snovi velike koristi. Osnovne biokemijske reakcije, ki so nujno potrebne za ivljenje, poteejo v reakcijskih pogojih naih habitatov veinoma le ob prisotnosti ustreznih katalizatorjev. Potek biolokih procesov najvekrat katalizirajo encimi. Prikaz evolucijske pomembnosti encimov sta nedavno prikazala Lewis in Wolfenden (2008) na primeru encima UroD, ki sodeluje v biosintezi hema, klorofila in citokromov. Pri opazovanju
spontanega poteka ene izmed stopenj sinteze hema sta izraunala, da je razpolovni as reakcije pri 25C 2,3 milijarde let. V prisotnosti encima ta reakcija potee v milisekundah. Katalitski procesi so preli iz narave v loveka bivalia e na pragu civilizacije. lovek se je v zgodnji kameni dobi nauil priprave vina in piva, t.j. procesov alkoholne fermentacije v katerem ima katalitska pretvorba organskih snovi kljuno vlogo (McGovern 2004; McGovern 2009). Znanost namenja katalizi aktivno pozornost ele od zaetka 19. stoletja. Leta 1936 je vedski Baron Jns Jacob Berzelius objavil sistematien pregled opazovanj sodobnikov in dotlej nedefiniranem pojavu podelil ime: kataliza (, cata - za, z, dol; lysein razcepiti, popustiti, zrahljati). Kasneji Nobelov nagrajenec Jacobus Henricus van 't Hoff je z utemeljitvijo fizikalne kemije, predvsem s svojimi opazovanji na podroju kemijskega ravnoteja, omogoil razvoj tehnik priprave katalizatorjev (Santen in sod., 2000). V istem obdobju so zaele potekati raziskave na podroju biolokih katalizatorjev. Luis Pasteur je leta 1850 opisal fermentacijo sladkorja s kvasovkami in predpostavil, da fermenti za svoje delovanje potrebujejo: ivljenjsko silo. To tezo vitalizma je leta 1897 zavrnil Eduard Buchner, ker je dokazal, da izolirana celina vsebina kvasovk e vedno katalizira pretvorbo kvasovk do alkohola. Prepoznavanje encimov kot samostojno aktivnih molekul je postavilo znanstvene temelje za aplikacijo izoliranih encimov v industriji. Moderno razumevanje delovanja encimov je osnoval J.B.S Haldane, z ugotovitvijo da je katalitska mo encimov pogojena s ibkimi interakcijami med encimom in substratom (Buchholz in sod., 2005; Palmer in Bonner, 2007).
3 HETEROGENIKATALIZATORJI
Pravimo, da so heterogeni tisti katalizatorji, ki so od reaktantov loeni s fazno mejo. Veinoma so heterogeni katalizatorji v trdni snovi in delujejo na reaktante v plinasti ali tekoi fazi. Kot primera navedimo uporabo platine za ienje izpunih plinov avtomobila in proizvodnjo margarine iz rastlinskega olja s pomojo niklja. Dandanes so heterogeni katalizatorji prisotni v veini industrijskih katalitskih procesov (Preglednica 1). Kot enega izmed prvih procesov industrijske katalize tejemo postopek sinteze amoniaka, ki se je uveljavil v zgodnjih letih 20. stoletja. Nemki kemik Fritz Haber je v eksperimentalnih pogojih proizvedel amoniak iz plinov duika in vodika pri visokem pritisku s pomojo osmijevega katalizatorja. Nato sta Carl Bosch in Alan Mittasch v podjetju BASF preizkusila e preko 2500 snovi, preden sta pridobila ustrezno kovinsko spojino, ki je bila kot katalizator dovolj poceni za komercialno sintezo amoniaka. Katalizator je v osnovi kompatibilen z reaktanti in produkti reakcije, e se med katalizo ne spreminja v svoji notranjosti, temve le preko svoje povrine vpliva na reaktante. Mehanizmi delovanja heterogenih katalizatorjev so preteno odvisni od naina adsorpcije reaktantov na fazni meji (Slika 2). Kadar molekule reaktantov na povrini katalizatorja zadrujejo Van der Waalsove sile, govorimo o fizini adsorpciji. Kadar je interakcija kemine narave, govorimo o kemijski adsorpciji. Na nizkovalenne povrine se reaktanti pri nizkih temperaturah navadno adsorbirajo fizino, medtem ko pri vijih temperaturah poteka kemijska adsorpcija. Dobro povrinsko aktivnost in adsorbcijske sposobnosti za vodik in ogljikovodike izraajo prehodne kovine, zato so te snovi in njihove zlitine dobri katalizatorji pri hidrogenaciji, dehidrogenaciji, hidrogenolizi in podobnih reakcijah. Nekaterih kovinskih oksidov ni mo uporabiti za tovrstno katalizo, saj se med reakcijo lahko reducirajo do kovin.
Preglednica1:Pomembnejiindustrijskiprocesirabeheterogenihkatalizatorjev(Rothenberg,2008). Proces HaberBoschsintezaNH3 sintezametanola FischerTropsch kreking alkilacija dehidrogenacija/ reforming odstranjevanjevepla hidrokreking izomerizacija polimerizacija oksidacija Katalizator magnetit(Fe) Cu,ZnO,Al2O3 Co,Fe glina zeoliti,glina, silikati Pt,Al2O3 CoaliMosulfidi Ptnazeolitihali aluminosilikatih zeolitiHZSM5 Ti,ZieglerNatta vanadijevoksid Reaktanti H2,N2 CO,CO2,H2 premog, zemeljskiplin C12+alkani C5C3alkani alkani dizelskogorivo meanica aromatov ksileni,tolueni eten ksileni Produkti NH3 CH3OH C5C11ogljikovodiki C7C9alkani C7C9isoalkani alkeni dizelznijo vsebnostjovepla nasieni ogljikovodiki pksilen polietilen ftalnakislina Podrojeuporabe gnojila, razstreliva goriva, kemikalije avtomobilska goriva goriva, detergenti visokooktanska goriva polimeri, kemikalije avtomobilska goriva avtomobilska/ letalskagoriva polimeri, kemikalije polimeri, kemikalije polimeri
Za katalizo oksidacije uporabljamo plemenite kovine, ker se pri potrebnih reakcijskih temperaturah ne oksidirajo tako zlahka kot navadne kovine. Polprevodni oksidi prav tako uinkovito spodbujajo redoks reakcije. Neprevodni oksidi (npr. aluminijevi, silicijevi ali magnezijevi oksidi) so slabi oksidacijski katalizatorji. Zaradi njihovih higroskopskih lastnosti jih uporabljamo pri katalizi dehidracije in polimerizacije.
difuzija vplinskifazi povrinska difuzija disociativna adsorpcija
povrinska reakcija
desorpcija produkta
molekularna adsorpcija
kovina
adsorbiran produkt
Slika2:Primeradsorpcijenapovrinskikatalizator(povzetopo:Bowker,2008)
Kovinski sulfidi katalizirajo reakcije, v katerih so vkljuene veplove spojine. Za tako rabo oksidi niso primerni, saj sulfidirajo v kratkem po vstopu v reakcijsko okolje. Za katalizo krekinga, polimerizacije in izomerizacije so v uporabi tevilne soli in kisline v trdni obliki (Chakrabarty in Viswanathan, 2009). Aktivnost katalizatorja izrazimo kot koliino produkta, ki nastane oz. kot koliino reaktantov, ki se pretvorijo v doloenem asu na enoto mase katalizatorja. V heterogeni katalizi je hitrost pretvorbe reaktantov v produkte tesno povezana s povrino katalizatorja, ki je na voljo za adsorpcijo reaktantov. Majhno specifino povrino kovin in kovinskih oksidov izboljamo z jedkanjem lebiev in vdolbin, z obarjanjem drobnih delcev ali z nanaanjem aktivnih katalitskih komponent na nosilne strukture z veliko specifino povrino (Bond, 1987; Chakrabarty in Viswanathan, 2009).
3.1 PRIPRAVATRDNIHHETEROGENIHKATALIZATORJEV
Pri zasnovi heterogenih katalizatorjev moramo upotevati elemente fizikalne, anorganske, organske, organokovinske kemije, povrinske fizike in znanosti o materialih. Zaelene lastnosti heterogenih katalizatorjev so (Chakrabarty in Viswanathan, 2009): visoka aktivnost in stabilnost, enakomerna in visoka selektivnost, velika povrina in enakomerna poroznost, odpornost na visoke temperature, nihanja temperature in mehanske obremenitve.
Konne lastnosti katalizatorja so odvisne od posameznih korakov postopka priprave in preienosti vhodnega materiala.
Heterogenikatalizatorji Katalizatorjizenotno prostorninskosestavo Impregnirani katalizatorji
obarjanje (oksidiAl2O3,SiO2) hidrotermalnasinteza (zeoliti)
mokraimpregnacija (ienjeizpunihplinov) metodazaetnevlanosti (Pt/Sn/Al2O3) vakuumskaimpregnacijapor (Bi/Pt/SiO2) ionskaizmenjava (kislizeoliti) sidranjeincepljenje (kompleksiprehodnihkovin)
legiranje (Raneynikelj,meanioksidi)
solgelsinteza (meanioksidi,nosilci) plamenskahidroliza (meanioksidi,nosilci)
Slika3:Nainipripraveheterogenihkatalizatorjev(delitevpo:Rothenberg,2008)
Izbiramo lahko med tevilnimi tehnikami priprave heterogenih katalizatorjev (Slika 3), kot so: metoda impregnacije, metoda obarjanja, metoda nanosa, metoda seiganja, sol-gel metoda, metoda trdne ablone, metoda nanosa kovin s keminim naparjevanjem (MOCVD) ipd. Pri izbiri upotevamo, (i) ali bo aktivna katalitska komponenta pritrjena na dodaten nosilni material, (ii) kakna bo oblika katalizatorja (kroglasta, valjasta, obroasta, monoliti, premazi, ...), (iii) kaken dele praznega prostora moramo zagotoviti v poroznem materialu in (iv) kako bomo dosegli primerno trdnost materiala ter, (v) ali bo hitrost katalize omejena s transportnim uporom. Tipien heterogeni katalizator je sestavljen iz aktivne katalitske komponente, promotroja, in nosilnega materiala (npr. Al2O3, SiO2, ...). Nosilni material je lahko bodisi inerten bodisi deluje kot sekundarni katalizator, ki dopolnjuje delovanje osnovne katalitske komponente (Chakrabarty in Viswanathan, 2009). V prvi fazi priprave heterogenih katalizatorjev pripravimo bodisi nosilni material za povrinski katalizator bodisi ogrodni katalizator z enotno prostorninsko sestavo, oboje z uporabo postopkov legiranja, obarjanja, eliranja, polimerizacije in hidrotermalne sinteze (Pechini, 1967; Rothenberg, 2008). Katalizatorji z enotno prostorninsko sestavo sestojijo v celoti iz katalitsko aktivnega materiala. Katalitsko aktivne snovi, ki imajo visoko komercialno vrednost, ali pa so same nestabilne v reakcijskih pogojih, s postopki impregnacije, ionske izmenjave in sidranja pritrdimo na nosilni material. Nosilni material mora omogoati im bolj enakomerno porazdelitev in veliko gostoto pritrjene aktivne komponente, dobro prehodnost reagentov do aktivnih mest katalizatorja ter dobro odpornost na sintranje. Legiranjeznadaljnjoobdelavo Z legiranjem pripravljamo katalizatorje na osnovi zlitin in nekaterih meanih kovinskih oksidov. Pri visokih temperaturah se kovine raztalijo in raztopijo druga v drugi. Iz trdne raztopine lahko v nadaljnjem odstranimo eno izmed prvin, da pridobimo porozno snov z vijo specifino povrino in dobro razporejenostjo vrzeli. Taken postopek se uporablja pri pripravi Raney-Ni katalizatorja. V proizvodnji katalizatorja najprej pripravijo Ni-Al zlitino in zmes naknadno obdelajo z NaOH. Veina aluminija zrn se izloi iz zmesi, s imer pridobimo urejeno porozno strukturo. Aluminij, ki ostane v katalizatorju (ponavadi okrog 25 %) pomaga pri stabilizaciji konne strukture (Raney, 1940). Ogrodni katalizatorji na osnovi Raney-kovin (veinoma Ni in CU) so dandanes najbolj razirjeni v katalizi hidrogenacije, alkilacije in razgradnje amoniaka. Z razmeroma nezahtevno pripravo pridobimo stabilen material, ki ima visoko stopnjo istosti, veliko specifino povrino in ne potrebuje naknadne redukcije oz. kakne druge vrste aktivacije.
Slika4:Dbereinerjevvigalnik
aposoda,bsteklenica,cica, dvaljizcinka,evzmetnopero, foba,gglinaprepojenasPt NemkikemikJohanWolfgangDbereinerje leta 1823 izdelal prvo razliico komercialno uporabnegavigalnika(Slika4). V kovinsko posodo je namestil steklenico, napolnjeno z veplovo (VI) kislino. V kislino je obesil kos cinka in steklenico plinotesno zaprl. Zaradi reakcije med kislino in kovino je nastajal vodik.Kosejetlakpovealvzadostnimeri,seje reakcijaustavila. Nastali vodik je Dbereiner odvedel skozi ventilnaglineninosilecprepojensplatino,kjerje platinakataliziralagorenjevodika. Splatinoprepojenaporoznaglina,kijesluila priiganju plamena na Dbereinerjevem vigalniku, je prvi znani primer priprave heterogenega katalizatorja na nosilnem materialu(Hoffmann,1998).
Zaradi velike mase lahko te katalizatorje loimo od reakcijske meanice kar z usedanjem. Ker so piroforni, jih hranimo v vodi (Rothenberg, 2008). Precipitacijainkoprecipitacija Z obarjanjem pripravljamo tevilne katalizatorje in nosilce, kot so silicijevi in aluminijevi oksidi ter Cu/ZnO/Al2O3 (katalizator sinteze metanola). Metoda obarjanja omogoa pridobivanje materialov visoke istosti, pri soobarjanju pa dobimo dobro definirane meane kristalite v stehiometrinem razmerju. Zaradi potrebnega topila in precipitacijskega sredstva je stroek separacije oborjenega katalizatorja in ravnanja z odpadno brozgo veji kot pri uporabi drugih tehnik. Veinoma govorimo o obarjanju iz vodne raztopine soli. Z dodajanjem precipitacijskega reagenta iz raztopine oborimo gel ustrezne soli (sol-gel metoda). Obarjanje se prine s prenasienim stanjem in poteka preko nukleacije oborine do dokonnega oblikovanja velikosti delcev. Gel po obarjanju stabiliziramo, filtriramo, oistimo, suimo in kalciniramo. Glede na lastnosti konnega materiala, ki ga pripravljamo, je mogoe uporabiti tevilne kombinacije prekurzorjev in precipitatorjev (Rothenberg, 2008; Mouret in sod., 2009). Impregnacijaporoznihnosilcev Impregnacija je ena izmed najbolj uporabljanih metod za pripravo heterogenih katalizatorjev na nosilcih. Pri mokri impregnaciji potopimo porozni nosilec v raztopino z aktivno katalitsko komponento. Vezava na nosilec potee spontano, ali pa obarjanje komponente na povrino nosilca induciramo (npr. s spremembo pH). Katalizator nato filtriramo iz raztopine, posuimo in kalciniramo. Z mokro impregnacijo ustvarimo precej ve odpadne raztopine kot z metodo zaetne vlanosti, kjer je prostornina dodane raztopine prilagojena skupni prostornini por nosilca. Nosilcem, ki so v obliki suhega prahu, dodajamo raztopino z aktivno katalitsko komponento dokler zmes ne postane lepljiva tako vemo, da so vse pore v materialu napolnjene z raztopino (Bowker, 1998; Chakrabarty in Viswanathan, 2009). e bolj uinkovita je metoda vakuumske impregnacije por. V vakuumski komori izpraznimo zrak iz por dobro osuenega nosilnega materiala ter dodamo ekvivalentno koliino raztopine s katalitskim prekurzorjem. Z vekratno ponovitvijo postopka doseemo visoko obremenjenost nosilnega materiala z aktivno katalitsko komponento (Rothenberg, 2008). Hidrotermalnasinteza V tipinem postopku hidrotermalne sinteze segrevamo razne oborine, gele ali flokule v avtoklavu pri 100 do 300 C. Med sintezo potekajo teksturne in/ali strukturne spremembe snovi, kot je rast kristalov, rast delcev, spremembe v strukturi kristalov, kristalizacija amorfnih snovi ipd. Aktualno podroje aplikacij hidrotermalne sinteze je izdelava zeolitnih struktur. To so kristalni aluminosilikati z aktivnimi mesti Lewisovih in Brnstedovih kislin (Chakrabarty in Viswanathan, 2009). Vasih jim pravimo tudi molekularna sita, saj jih prepredajo kanalki in pore nanometrinih dimenzij (Corma, 1995). Tovrstni materiali v praksi postopoma nadomeajo amorfne aluminosilikate. M xn/+n ( AlO2 )x (SiO2 ) y z H 2 O
[1]
Enaba 1 povzema splono sestavo zeolitov (M kation, n+ naboj, x/y/z mnoine). Razmerje med vsebnostjo AlO2 in SiO2 (y/x) je lahko zelo iroko. Poznani so celo nekateri primeri zeolitnih struktur, ki ne vsebujejo aluminija (Chakrabarty in Viswanathan, 2009).
natrijev silikat/aluminat H2SO4 ablona
ZSM5
filtriranje spiranje avtoklav 100150C gel suenje kalciniranje
Slika5:SintezamaterialaZSM5(ZeoliteSoconyMobilno.5),kiseuporabljavproizvodnjisintetinihgoriv (postopekpovzetpoRothenberg,2008).
Obiajen postopek priprave vkljuuje segrevanje prenasienih raztopin natrijevih silikatov in natrijevih aluminatov do temperature 100 150 C (Slika 5). Kristalizacija zeolitov poteka poasi in je mono odvisna od pogojev priprave. V zgodnjih sedemdesetih letih so znanstveniki odkrili, da majhne koliine alkilamonijevih soli delujejo kot ablona za rast zeolitnih kristalov z urejeno strukturo por. Odkritje je dobilo pravo teo ele dobri dve desetletji kasneje, ko je izboljanje analiznih metod omogoilo opazovanje visoko topoloko urejenost por (Chiola in sod., 1971). Zakljuniprocesi Po poteku sinteze katalizatorja v raztopini moramo katalitski material e loiti od topila. Kristalne strukture zelo enostavno odstranimo iz raztopine, medtem ko je suenje gelov ter flokulatov bolj zahtevno. Geli lahko vsebujejo tudi do 90 % vode, zato lahko med suenjem njihova porozna struktura propade. Z nadzorovanim odstranjevanjem vode iz povrhnjega sloja gela doseemo zmanjanje gostote in prostornine gela. Tako pridobimo t.i. kseroge, v katerem ostaja 25-30 % topila ali pa s suenjem pri superkitirinih pogojih naredimo t.i. aerogel, v katerem tekoo komponento popolnoma nadomesti zrak. Naslednji termini postopek, ki se uporablja v zakljuni fazi priprave katalizatorjev, je kalciniranje. Z ogrevanjem materiala do 300 800 C v prisotnosti zraka ali drugih plinov kovinskih oksidov na nosilec in vplivamo na povrinsko hidrofobnost katalizatorske povrine. Konna faza priprave mnogih katalizatorjev z enotno prostorninsko sestavo je peletiranje. Postopek izdelave peletov lahko poteka na dva naina. S peletirnim postrojenjem pri visokem pritisku stisnemo material v kalupe, ali pa katalizatorski prah dodamo ekstrudorju plastinih mas. S temi postopki dobimo katalitski material makroskopske velikosti in ustreznih oblik v rinfuzi, s katerim je enostavno ravnati v proizvodnih pogojih (Bowker, 2008). Z zakljunimi postopki vplivamo tudi na lastnosti aktivnih mest katalizatorja. V primeru, da se katalitske lastnosti izhodnega materiala poslabajo, je katalizator pred uporabo potrebno ponovno aktivirati.
4 HOMOGENIKATALIZATORJI
Homogeni katalizatorji delujejo v isti fazi kot reaktanti (Slika 6). Homogeni katalizatorji delujejo torej kot plini (npr. duikov oksid katalizira oksidacijo veplovega dioksida) ali kot tekoine (npr. kisline ali baze katalizirajo izomerizacijo glukoze) (Bond, 1987). Razirjena definicija homogenih sistemov velja tudi za nekatere sisteme med kapljevinami in plini. V industrijskem procesu hidroformilacije v tekoi alken raztopimo organokovinski kompleks in prepihujemo z vodikom in ogljikovim monoksidom. V reakciji potee adicija vodika in skupine CO na alkensko verigo. Ker se plina H2 in CO se v dejanskih pogojih raztopita v reakcijski meanici, govorimo o homogeni katalizi (Rothenberg, 2008). CH3 H M CO
disociacija liganda
CH3 M H Br
CH3 CO
CH3Br oksidativna adicija reduktivna eliminacija
koordiniranje liganda
M H
CH3 O
CH3 M H CO
migratorna insercija
nukleofilni napad
eliminacija
CH3 M CO
HO H
CH3 M CO
Slika6:Osnovnikorakihomogenekatalize(povzetopo:Rothenberg,2008)
eprav je najbolj razirjena uporaba heterogenih katalizatorjev, saj ti po nekaterih virih katalizirajo preko 90 % procesov industrijske katalize, uporaba homogenih katalizatorjev ni zanemarljiva(Preglednica 2). Homogeni katalizatorji se pogosto ponaajo z vejo selektivnostjo kot heterogeni, vendar pa je njihova ponovna uporaba precej bolj zahtevna (Rothenberg, 2008). Vrste homogenih katalizatorjev so (Rothenberg, 2008): topni kovinski kompleksi, klasine kisline/baze, organski katalizatorji.
Topni kompleksi prehodnih kovin katalizirajo hidrogenacijo, oksidacijo, hidroformilacijo, karbonilacijo, tvorbo C-C vezi, telomerizacijo, odpiranje ogljikovih obroev in kopolimerizacijo. V aplikacijah poznamo predvsem hidroformilacijo alkenov do alkoholov ali aldehidov, karbonilacijo metanola v ocetno kislino, sintezo uinkovine L-dopa z asimetrino hidrogenacijo, oksidacijo p-ksilena do tereftalne kisline, oligomerizacija etilena, itd (Preglednica 2). tevilne reakcije katalizirajo H+ ali OH- ioni. V grobem poznamo dva naina katalitskih uinkov kislin in baz. Pri splonem uinku reakcijo katalizirajo vse donorske / akceporske specije
10
protonov, medtem ko pri specifinem uinku na hitrost reakcije vpliva le koncentracija protoniranih / deprotoniranih molekul (Kwan, 2005).
Preglednica2:Rabahomogenihkatalizatorjevvpraksi(poMukhopadhyay,2003) Homogenikatalizatorji
Karbonilacija Hidroformilacija Oksidacija Oligomerizacija/ polimerizacija etilen Hidrocianacija
metanol
propilen
pksilen
butadien
ocetnakislina
propin
butanal
C6C11alkeni
tereftalna kislina
aldehidi
alkeni
polyetilen poliketon
adiponitril
MMA ariletanol/alkeni
C7C12aldehidi C12C19alkeni
karboksilne kisline
butadien
2arilpropionska kislina benzilklorid
C13C20 aldehidi alilalkohol
polibutadien
fenilocetnakislina duikovespojine
4hidroksi butanal diacetoksibuten
izocianati Oksidativna karbonilacija fenol
vitaminA
difenilkarbonat amini
izocianati Amidna karbonilacija
aldehini/alkeni
aminokisline
Organski katalizatorji so nizko molekularne organske molekule, ki pogosto izraajo lastnosti Lewisovih kislin. V primerjavi z organokovinskimi kompleksi so veinoma bolj stabilni, ceneni in dostopneji. Ker ne vsebujejo kovin so manj toksini in jih po separaciji produktov ni potrebno dodatno loevati od odpadne meanice (Rothenberg, 2008).
11
4.1 HETEROGENIZACIJAHOMOGENIHKATALIZATORJEV
Homogeni katalizatorji imajo tevilne privlane lastnosti, vendar je njihova raba v praksi omejena z nestabilnostjo katalizatorjev pri industrijskih pogojih in visokimi stroki loevanja katalizatorjev in produktov. V komercialni rabi so homogeni katalizatorji, ki bodisi katalizirajo reakcije lahko hlapnih substratov in/ali produktov bodisi ne vsebujejo termolabilnih organskih ligandov (Mukhopadhyay, 2003). Zdruevanje prednosti homogenih (visoka selektivnost in monost modifikacije lastnosti katalizatorja z razlinimi reakcijskimi pogoji ter neoviran prenos snovi med reakcijo) in heterogenih katalizatorjev (dobra obstojnost pri visokih temperaturah, enostavna separacija) je svojevrsten raziskovalni izziv. Heterogenizacija je postopek imobilizacije kompleksov prehodnih kovin na povrino ali v notranjost (t.i. ship-in-a-bottle princip) inertnega organskega ali anorganskega nosilca. Postopki heterogenizacije homogenih katalizatorjev se v principu zgledujejo po metodah priprave heterogenih katalizatorjev in metodah imobilizacije celic in encimov (Preglednica 3). Dendrimeri Nosilni materiali, ki jih uporabimo za imobilizacijo, se v reakcijskih pogojih lahko raztopijo v meanici. S pripravo taknih snovi doseemo bolj enakomerno razporeditev aktivne katalitske komponente v raztopini. Pri oblikovanju taknega katalizatorja posnemamo strukturo njegove homogene razliice, le da lahko v primeru uporabe nosilca katalizator povrnemo iz reakcijske meanice s filtracijo (Mukhopadhyay, 2003).
katalizator
Slika7:Razlininainivezaveaktivnekatalitskekomponentenadendrimer(vanHeerbekinsod,2002) aindperifernavezava,bincarinavezava
Topni polimerni materiali laje prehajajo skozi filtracijske membrane, zato so bolj primerni nosilci dendrimeri (Slika 7). Dendrimeri so visoko razvejane globularne molekule reda velikosti nekaj nm. Omogoajo dolgotrajno vezavo kovin, saj eno vezavno mesto dendrimera pogosto razpolaga z dvema donorskima atomoma, kar omogoi vzpostavitev dvojne vezi povrine dendrimera s kovinskim ionom. Nadalje skrbi za obstojnost vezave kelatni uinek. Tudi e se kovinski atom sprosti z enega vezavnega mesta, se lahko v kratkem asu vee na tevilna druga nezasedena mesta v bliini (van Heerbek in sod, 2002).
12
Netopninosilci Trdne ogrodne strukture, ki so primerne za povrinsko vezavo ali enkapsulacijo kovinskih kompleksov so kovinski oksidi (silicijevi in aluminijevi oksidi, mikroporozni zeoliti, mezoporozni M41S materiali in mezoporozni glineni delci), ogljik, ogljikove nanocevke, fulereni in polimeri(De Vos in sod., 2002). Ligande kovinskih kompleksov lahko glede na design namenimo vezavi na zunanjo povrino ali v notranjost nosilca (Preglednica 3). Na ta nain ohranimo selektivnost in katalitsko mo po imobilizaciji homogenega katalizatorja, saj so med reakcijo reaktantom dostopna vsa katalitsko aktivna mesta. Kovalentne vezi med kovinskim kompleksom in nosilcem so dovolj mone, da vzdrijo izredne razmere katalitskih reakcij. Vezi med ligandi in kovinskimi atomi so ibkeje in se med reakcijo pogosteje razcepijo oz. reformirajo. Zaradi posledinega sproanja kovin v raztopino se zmanjuje aktivnost katalizatorja (Mukhopadhyay, 2003).
Preglednica3:Principiheterogenizacijehomogenihkatalizatorjev(CubillosLobo,2005) L M L L M L L M3+ L Z Z Z
L M3+ L
Nainiimobilizacije Monostaplikacije Slabosti kovalentnavez iroka priprava adsorpcijain ionskavez omejena kompeticijastopiliin substrati enkapsulacija Shipinabottle omejena velikostsubstratain omejenostzdifuzijo
Pri enkapsuliranih katalizatorjih je aktivna katalitska komponenta ujeta v porah zeolitov ali v mezopornem materialu, reaktanti in produkti pa so dovolj majhni, da prehajajo skozi nosilno strukturo (Corma in Garcia, 2004). Ujeti kovinski atomi v manji meri uhajajo iz obdajajoe strukture, kot se to dogaja pri ionih pritrjenih na zunanjo povrino nosilcev (Corma, 1997; De Vos in sod., 2002).
5 DVOFAZNIKATALITSKISISTEMI
V dvofaznih sistemih tekoe-tekoe so katalizatorji in regenti v eni tekoini, regenti pa v drugi. Ker je med raztopinama fazna meja, nekateri avtorji katalizatorje, ki nastopajo v takih sistemih tejejo med heterogene katalizatorje (Rothenberg, 2008). Drugi viri zaradi raztopljenosti katalizatorjev v topilu tovrstne katalizatorje uvrajo med homogene oz. na podroje heterogenizacije homogenih katalizatorjev (Mukhopadhyay, 2003; Cubillos Lobo, 2005). Ker je meja med homogeno in heterogeno katalizo v dvofaznih sistemih zabrisana (Baricelli in sod., 2001) in so lahko vhodni katalizatorji tako homogeni (Zheng in sod., 1998; ), kot heterogeni (Zhu in sod., 2003; ), navajamo to podroje v loenem poglavju. Vodnidvofaznisistemi Z modifikacijo katalizatorjev (uporabo ligandov, derivatizacijo, ipd.) pripravimo njihove vodotopne razliice (Zhu in sod., 2003). Drugi raztopini dodamo organske reagente, ki se v vodi
13
slabo topijo. Stik med reagentom in katalizatorjem vzpostavimo z burnim meanjem, po poteku reakcije pa meanico umirimo in odlijemo produkte. Katalizator ostane v vodni fazi in je na voljo za naslednjo aro (Slika 8).
organskafaza
produkti reaktanti katalizator
organskafaza
reaktanti katalizator
vodnafaza
produkti katalizator
vodnafaza
Slika8:Principdelovanjavodnoorganskihdvofaznihsistemov
Zaradi zelo nizke topnosti v vodi, dolgo verini alkeni v praksi niso primerni reaktanti za tovrstno pretvorbo. Poasna sinteza aldehidnih detergentov v vodno-organskih sistemih neredko ovira komercialno opraviljivost proizvodnje. Fluornidvofaznisistemi Zaradi omejene topnosti v vodnih sistemih, sta Horvth in Rbai (1994) razvila postopek fluornih dvofaznih sistemov. Uporabila sta ga za hidroformilacijo alkenov z rodijevim kompleksom fluoriranih fosfinov. Fluorni dvofazni sistemi temeljijo na omejeni sposobnosti meanja delno in povsem fluoriranih spojin z nefluoriranimi spojinami (Slika 9).
O2
organskafaza
O2 produkti katalizator reaktanti

flournafaza flournafaza organskafaza
60C
25C
produkti katalizator
Slika9:Prehodfluornoorganskegasistemavenofaznisistem(povzetopoKlementinsod.,1997)
Reagent in katalizatorji so raztopljeni v fluorni fazi, za drugo fazo pa lahko uporabimo katerokoli topilo, ki ima slabo topnost oz. se ne raztaplja v prvi. Reakcije potekajo bodisi v fluorni fazi, bodisi na fazni meji med raztopinama. Fluorna faza je bogata s fluoriranimi ogljikovodiki (veinoma perrfluorirani alkani, etri in terciarni amini). Od koliine fluoriranih funkcionalnih skupin na katalizatorju in reaktantih (najbolj uinkovite so vije perfluoroalkilne verige), je odvisna uinkovitost in selektivnost raztapljanja v fazah sistema. Fazniprehod V nekaterih primerih lahko s spreminjanjem reakcijskih pogojev (navadno s termoregulacijo) vplivamo na prehod katalizatorja med raztopinama dvofaznega sistema. Naelo derivatizacije trifenilfosfina s polietersko verigo je uporabno za sintezo tevilnih katalizatorjev v vodno-organskih dvofaznih sistemih. Zheng in sodelavci (1998) poroajo o
14
pripravi rodijevega derivata fosfina. Pri sobni temperaturi je kompleks dobro topen v vodi in netopen v organskem topilu, ki raztaplja reaktante. Z ogrevanjem reakcijske meanice se kompleks vedno slabe raztaplja v vodi in vedno bolj v organskem topilu. Po poteku reakcije reakcijsko meanico ohladimo in katalizatorji se ponovno raztopijo v vodni fazi. Nekontaminirane produkte loimo z dekantiranjem in sistem je pripravljen za ponovno uporabo.
a
organskafaza
b
organskafaza
Q R Q X +RY
+
RX+Q Y RH X+Q+Y
vodnafaza
Q+X R H2O X
R'X
faznameja
Q X +Y
OH
vodnafaza
Slika10:ShematskiprikazStarksovega(a)inMakoszovegamehanizmafaznegaprehoda (poRothenberg,2008),Xreagent,Yintermediat
Superkritinifluid Superkritini fluidi so komprimirani plini ogreti na temperaturo vijo od kritine temperature plina. Docela se meajo z ostalimi plini in raztapljajo tevilne nizko- do srednje-polarne organske molekule.Ob prisotnosti katalizatorja, topnega v superkritinem fluidu, potee prava homogena kataliza. eprav lahko superkritini plin po poteku reakcije enostavno loimo od reakcijske meanice z znievanjem tlaka, ostanejo v preostali zmesi produkti kontaminirani s katalizatorji. Zahtevnem separacijskem postopku se je mogoe izogniti na razline naine, npr. z inducirano precipitacijo (Koch in Leitner, 1998). Ionsketekoine Ionske tekoine so soli v tekoem stanju. Njihovi parni tlaki so zelo nizki, kot je to sicer znailno za trdnine. Z zasnovo ionske tekoine lahko vplivamo na topnost snovi v njej. Tiste soli, ki so tekoe v reakcijskih pogojih, lahko uporabimo za selektivno raztapljanje ionskih katalizatorjev (npr. kovinskih kompleksov) in organskih spojin (Gordon, 2001). Dandanes so ionske tekoine prisotne v skorajda vseh procesih industrijske katalitske pretvorbe (Welton, 2004; Olivier-Bourbigou in sod., 2010). Mogoe jih je uporabljati tudi v kontinuiranih sistemih, saj jih v obliki filmov lahko pritrdimo na nosilni material (Mehnert, 2005). Produkte reakcije, ki je katalizirana v ionski tekoini, po poteku odstranimo s pomojo organskih topil. tevilne organske snovi lahko iz ionskih tekoin estrahiramo tudi z raztapljanjem v superkritinih fluidih (npr. v scCO2). Postopki uvajanja superkritinega fluida v reakcijsko meanico, raztapljanja produktov, odvajanja fluida s produkti in konnega loevanja produktov s dekompresijo prav tako omogoajo kontinuirano rabo ionskih tekoin (Sellin in sod., 2001).
15
6 BIOLOKISISTEMI
Biotehnogija temelji predvsem na izkorianju katalitske sposobnosti celic ali delov celic (Nekrep, 1996). Bioloke molekule, ki izraajo katalitske sposobnosti, so encimi in multiencimski kompleksi, ribocimi, deoksiribocimi, ribosomi, izrezovalna telesca in abcimi (Walker in Rapley, 2009). Pri izboru sistema konkretne bioloke pretvorbe upotevamo tri osnovne faktorje. Prvi, kakne so razpololjive oblika izbrane biokatalitske snovi, so to isti izolirani encimi, delno preieni encimski preparati, surov encimski ekstrakt, ekstrakt celinih organel oz. celic, odmrle celice z ohranjeno strukturo ali ive celice v aktivnem oz. inhibiranem stanju. Drugi, kateri bioreaktor je primeren za biokatalizo glede na izbrano obliko katalitskega materiala, lastnosti substrata in zahtevanih lastnostih konnega produkta. In tretji, ali elimo na katere znailnosti sistema elimo vplivati z imobilizacijo, kar bo odvisno tudi od predhodnih korakov izbire (Walker in Rapley, 2009).
6.1 ENCIMIINDRUGEKATALITSKOAKTIVNEBIOLOKEMOLEKULE
Encimi so skupina proteinov, ki nastajajo v celicah za katalizo reakcij metabolnih poti (Walker in Rapley, 2009). Katalitske sposobnosti encimov so izjemne, njihova pretvorbena tevila se gibljejo med 102-104 ter dosegajo vrednosti do 108 molekul/sekundo (Rothenberg, 2008). Aktivna mesta encimov in obdajajoih struktur izraajo visoko regionalno selektivnost tevilnih funkcionalnih skupin na eni molekuli, kar se odraa v enostavnejem vodenju procesa. Zaradi visoke specifinosti prepoznavanja substrata v mnogih encimskih reakcijah nastajajo istovrstni enantiomeri produktov ob manji koliini / odsotnosti stranskih produktov, kar je izredno koristna lastnost v proizvodnji.
a
encim
substrat
produkti
Slika11:Komplementarnostencimainsubstrata akljuinkljuavnica,binduciranoprilagajanjeencimasubstratu
Encim nudi substratom specifino reakcijsko okolje, reakcija potee na aktivnem mestu ki se ne nahaja nujno na isti regiji encima kot vezavno mesto za substrat. Emil Fischer je leta 1894 primerjal komplementarnost substrat in vezavnega mesta s kljuem in kljuavnico. Po tej definiciji naj bi bila struktura vezavnega mesta popolni negativ strukture dela substrata, ki se vee na encim. Danes komplementarnost opisujemo s principom induciranega prilagajanja encima substratu, modifikacijo Fischerjevega modela, ki jo je leta 1985 predlagal Daniel Koshland. Model induciranega prilagajanje encima substratu poleg specifinosti encima opisuje e stabilnost encima v prehodni konformaciji (Slika 11).
1.cifra:Gledenareakcijo,kijoencimkatalizira: 1.oksidoreduktaze 2.transferaze 3.hidrolaze 4.liaze 5.izomeraze 6.ligaze zdruevanjemolekulskovalentnoCC,CN,CO,CS vezjoobporabiATP.

vezavnomestozacelulozocelulazeC
redoksreakcije, prenosskupinmedmolekulami, prenosskupinnaH2O(hidroliza), odstranjevanjeskupin, prenosskupinznotrajmolekule,
EC3.2.1.4celulaze

1.Oksidoreduktaze

2.Transferaze Hidrolaze
2.cifra:Vezpodvrenahidrolizi: 1ester, 2glikozidna, 3peptid(CONH), 4nepeptidneCNvezi.
2.cifra:Gledenaskupinovprenosu: 11Cskupina, 2aldehidialiketoni(>C=O), 3acil(COR), 4glikozil, 5fosfat.
2.cifra:Gledenadonorvodika/elektronov: 1alkoholi(>CHOH), 2aldehidialiketoni(>C=O), 3CHCH, 4primarniamini(>CHNH2ali>CHNH3), 5sekundarniamin(>CHNH), 6NADHaliNADPH(samozdrugimredoxakceptorjem). 3.cifra:Veinomaopisujenadaljnjiznaajskupinev prenosu.
3.cifra:Opisujenadaljnjiznaajhidroliziranevezi.
Npr.prihidroliziestrov: 3.1.1hidrolazekarboksilnihestrov(COO), 3.1.2hidrolazetiolnihestrov(COS), 3.1.3hidrolazefosfornihmonoestrov(OPO32), 3.1.4hidrolazefosfornihdiestrov(OPO2O).
3.cifra:Gledenaakceptorvodika/elektronov: 1NAD+aliNADP+, 2Fe3+, 3O2, 99drugakceptor.

Npr.: 2.1.1metiltransferaze(prenosCH3), 2.1.2hidroksimetiltransferaze(prenosCH2OH), 2.1.3karboksi(COOH)alikarbamoil(CONH2)transferaze.
3.2.1glikozidaze(hidrolizaOinSglikozidnihkomponent)
4.Liaze
5.Izomeraze 2.cifra:Vrstaizomeracije: 1racemizacijaaliepimerizacija, 2cistransizomerizacija, 3redoxreakcijeznotrajmolekule, 4prenosskupinznotrajmolekule.
3.Ligaze
2.cifra:Razcepljenavez: 1CC, 2CO, 3CN, 4CS.

Npr.zaracemnemeaniceinepimere: 1aminokisline, 2hidroksilnekisline, 3ogljikovihidrati.
2.cifra:Nastalavez: 1CO, 2CS, 3CN, 4CC.
3.cifra:Odcepljenaskupina: 1karboksilna, 2aldehidna(CH=O), 3ketokislinska(CO.CO2).
3.cifra:Snov,kijepodvrenaizomerizaciji.
3.cifra:Opisujenadaljnjiznaajsintetiziranevezi.
Slika12:Klasifikacijaencimov(JCBN,2009)naprimerucelulaz
16
17
Encimi v osnovi katalizirajo kompleksneje biokemijske pretvorbe, kot konvencionalni katalizatorji in manj zahtevne procese, kot potekajo pri fermentaciji. Raba izoliranih encimov je smotrna, ko za pretvorbo substrata do konnega produkta ne potrebujemo veliko razlinih vrst encimov ( 3) in regeneracija kosubstratov (ATP, NADH) ni potrebna. V takem primeru lahko z izoliranimi encimi uporabimo manje in ceneje reaktorje oz. pri enaki prostornini zagotovimo vejo proizvodnjo kapaciteto. Ker v sistem vnesemo samo potrebne encime, ni nevarnosti nadaljnje razgradnje oz. preoblikovanja produkta. Z imobilizacijo izoliranih encimov omogoimo kontinuiran proizvodni sistem v pretonih reaktorjih, ki so lahko stabilni ve mesecev (Buchholz in sod., 2005). Mednarodna klasifikacija encimov deli encime v 6 razredov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo. Razredi so razdeljeni v podrazrede, ki nadalje opisujejo znailnosti reakcij, encimov ali substratov (Slika 12). Trenutno je klasificirano okrog 4200 razlinih encimov (JCBN, 2010). tevilni od teh encimov katalizirajo reakcije preko 150 aktivnih industrijskih procesov (Preglednica 4; Rothenberg, 2009). Najve encimov se uporabi v industrijskih procesih (56 % tria vkljuno s istilnimi postopki), dobra tretjina (33 %) v ivilski industriji, preostala proizvodnja pa je namenjena uporabi v prehrani domaih ivali (Buchholz in sod., 2005). Raba izoliranih encimov je ekonomsko upraviena, (i) ko je na trgu mogoe nabaviti dovolj encimskega pripravka ustrezne kvalitete, (ii) metabolizem morebitnih organizmov, ki so prisotni v reakcijski meanici, ne moti delovanja dodanih encimov in (iii) znaajo stroki uporabe encimov 5-10 % skupne vrednosti produkta (Buchholz in sod., 2005). Ribocimi,deoksiribocimi,ribosomi Ribocimi in deoksiribocimi so RNK in DNK molekule z endonukleazno aktivnostjo. Na podlagi njihovih katalitskih lastnosti se sklepa, da so evolucijski predhodniki encimov. Ker so sposobni katalize svoje lastne sinteze, je njihovo odkritje omogoilo oblikovanje novih spoznanj o nastanku ivljenja na Zemlji (Orgel, 1994). Ribocimi sodelujejo pri prepisovanju DNK, kjer katalizirajo izrezovanje odvenih regij mRNK in tRNK. S katalizo hidrolize omogoijo izomerizacijsko prerazporeditev fosfodiesterskih vezi RNK molekule in odstranitev nepotrebnih regij (The Nobel Prize in Chemistry, 1989). Te bioloke molekule so ponavadi manje in preprosteje strukture kot encimi, zato v literaturi naletimo na veliko tevilo raziskav, ki se ukvarjajo s sintezo in designom umetnih ribocimov in deoksiribocimov za katalizo irokega nabora kemijskih reakcij (Jschke, 2001; Breaker, 2002; Lilley, 2005). e dolgo vemo, da sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih. Podroben pogled na del tega ribonukleotidnega kompleksa, kjer nastaja peptidna vez med aminokislinami pa nam razkrije, da se na aktivnem mestu nahaja ribocim (Rodnina in sod., 2007). Izrezovalnatelesca Izrezovalno telo sodeluje v postopku spajanja mRNK po procesu prepisovanja. Tako kot ribosom, je izrezovalno telo kompleksna ribonukleotidno-proteinska struktura. V prvi fazi bodo nadaljnje raziskave mehanizma delovanja izrezovalnega telesca omogoile razvoj terapevtskih metod za zdravljenje bolezenskih stanj povezanih z motnjo spajanja RNK. Abcimi Protitelesa so glikoproteinske molekule, ki izraajo visoko afiniteto za vezavo tujkov v organizmu. V naravi veinoma nimajo katalitskih sposobnosti in veejo antigene z izredno obstojno selektivno vezavo. Z oslabitvijo vezavnih mest so raziskovalci razvili abcime, t.j. nove vrste umetno sintetiziranih protiteles, ki izraajo katalitsko aktivnost (Walker in Rapley, 2009).
18
Abcimi in encimi izraajo tevilne podobne lastnosti, kot so inducirano prileganje substratom in alosterina modulacija aktivnosti. tevilne raziskave katalitskih protiteles so usmerjene v klinino aplikacijo. Noveje tudije vkljuujejo psihoaktivno deaktivacijo kokaina, razgradnjo nikotina, aktivacijo predzdravil za tarno kemoterapijo, zaito pred UV-svetlobo, inhibicijo infektivnosti humanega virusa imunske pomanjkljivosti in zmanjevanje -amiloidnih agregatov ki nastajajo pri Alzheimerjevi bolezen (Hanson in sod., 2005). Multiencimi V aplikacijah katalize biokemijskih procesov uporabljamo encime pri enostopenjskih procesih, celice in celine organele pa pri vestopenjskih pretvorbah. Mona alternativa katalize ve zaporednih biokemijskih reakcij je uporaba multiencimskih proteinov (Walker in Rapley, 2009).
encimskimodul sidrniprotein
kohezin veznipeptid
modulzavezavonacelulozo celinastena
Slika13:Shematskiprikazcelulosoma
Multiencimi so proteini, z ve kot eno katalitsko funkcijo, ki jo prispevajo razlina obmoja oz. podenote polipeptidne verige. e se katalitske domene teh organiziranih encimskih sistemov nahajajo na ve kot eni vrsti polipeptida, govorimo o multiencimskih kompleksih, eni vrsta polipeptida z ve katalitskimi domenami pa pravimo multiencimski polipeptid. Multiencimski kompleksi se povezujejo nekovalentno, multiencimski polipeptidi pa kovalentno (JCBN, 2010). Apoptosomi igrajo kljuno vlogo v procesu programirane celine smrti. Apoptoza ima pomembno vlogo pri homeostazi (ravnoteje med zaradi ravnovesja med tevilom odmrtih in prolifeliranih celic), embrionalnem razvoju (pravilen potek diferenciacije tkiv) in v imunskem sistemu (npr. propadanje limfocitov B in T). V normalnem stanju je proces dormanten, ob pozitivni indukciji pa se sproi proces tvorbe apoptosoma iz proteaznih encimov kaspaz. Apopotosom nato v natanno doloenem zaporedju reakcij unii celino proteinsko strukturo, encime in ostale proteine, ki omogoajo delovanje celice. Podrobno razumevanje mehanizma programirane celine smrti je pomembno iz ve vidikov. Apoptoza zavira razrast novotvorb, zato rakava obolenja nastanejo le s predhodno inhibicijo tega procesa. Nasprotno, pri degenerativnih boleznih ivevja prihaja do prezgodnje aktivacije apoptoze (Yu in sod., 2005).
19
Proteasomi so veliki multiencimski kompleksi (ponavadi okrog 2000 kDa), ki v citoplazmi in celinem jedru razgrajujejo okvarjene ali nepotrebne proteine. Kompleks je sestavljen iz tirih obroev, ki tvorijo obliko sodka. Razgradnja proteinov poteka v notranjosti kompleksa, kjer so nameene katalitske domene (Peters in sod., 1994). Encimske podenote multiencima izraajo tako endopeptidazno kot eksopeptidazno aktivnost encimskih podenot. Pri rakavih obolenjih so proteasomi pogosto tarno mesto zdravil, saj je razrast tumorjev odvisna tudi od deaktivacije proteinov, ki nadzorujejo procese celine delitve (Takimoto in Calvo, 2008; Walker in Rapley, 2009). Nekatere bakterije in glive izkoriajo visok energetski potencial celuloznih substratov. Za razgradnjo so potrebni ekstracelularni encimi, ki so se tekom evolucije pri tevilnih bakterijah organizirali v celulosom. Struktura celulosoma sestoji iz osnovnega proteinskega ogrodja (t.i. skafoldin) na katerega se pripenja irok spekter razlinih encimski modulov (celulaze, ligninaze, manaze, ksilanaze, pektinaze, hitinaze, -glukozidaze, endoglukanaze, eksoglukanaze, ...). Modularna zasnova omogoa uinkovito prilagajanje funkcionalnosti celulosoma glede na specifino strukturo celuloznega substrata, ki je mikroorganizmu na voljo (Slika 13). Fleksibilnost in prilagodljivost tega multiencimskega kompleksa sta privlani znailnosti z vidika izkorianja energetskega potenciala odpadne celulozne biomase (Bayer in sod., 2004). Design novih multiencimskih kompleksov odpira nova poglavje na podroju reakcijskega inenirstva in marsikje drugje. Mller in Niemeyer(2008) sta preuila eno izmed potencialnih metod za povezovanje zdruljivih encimskih komponent. Na kovalentne konjugate DNA sta imobilizirala razline encimske komponente, kar je omogoilo uspeno samo-organizacijo umetnega multiencimskega kompleksa.
20
Preglednica4:Pomembnejiindustrijskiprocesirabeencimov(Buchholzinsod.,2005). Produkt >10000000ton/leto koruznisirupzvisokimdeleemfruktoze(HFCS) etanol >10000ton/leto akrilamid 6aminopenicilanskakislina kakavovomaslo izomaltuloza mleniizdelkibrezlaktoze >1000ton/leto 7aminocefalosporanskakislina 7aminodesacetoksicefalosporanskakislina asparaginskakislina aspartam metoksipropilamin pantotenskakislina fenilglicin aminokisline 100010ton/leto(izbornovejihpostopkov) amoksicilin cefaleksin 3,4dihidroksifenilalanin lovekiinzulin sterinoisteoblikealkoholovinaminov mandljevakislina amilaze glukoamilaze glukozaizomeraze amilaze glukoamilaze nitrilaze penicilinamidaze lipaze saharozamutaze galaktozidaze aminooksidaze glutarilamidaze glutarilamidaze aspartaze termolizini metaloproteaze lipaze aldolaktonaze hidantoinaze karbamoilaze aminoacilaze penicilinamidaze penicilinamidaze tirozinaze karboksipeptidazeA lizilendopeptidaze tripsin lipaze nitrilaze celice vcelicah & Encim Imobilizacija
21
6.2 IMOBILIZACIJAENCIMOV
V zaetku 20 stoletja sta Newlson in Griffin (1916) postavila temelje sodobnih tehnik imobilizacije encimov, z raziskavami adsorpcije invertaze, tripsina in renina na razline organske nosilce. ez dobrega pol stoletja so znanstveniku temu podroju biotehnologije prieli namenjati ve pozornosti (Laskin, 1985; Buchholz in sod., 2005).
Imobilizacijaencimov
Heterogenakataliza (netopniencimi)
Dvofaznisistemi (topninetopniencimi)
Homogenakataliza (topniencimi)
vezava
ujetje
ultrafiltracijske membrane kapilarne membrane
preno povezovanje ko polimerizacija vezavana nosilec
ujetjevgel
mikro enkapsulacija ujetjev reverznemicele
fizikalna adsorpcija
adsorpcijain prenavezava
ionskavez
tvorbakelatov
kovalentna vez
biospecifina vezava
Slika14:Nainiimobilizacijeencimov(Ullman'sBiotechnology...,2007)
Imobilizacija encimov se je sprva uveljavila v ivilsko-predelovalni industriji, kjer e dandanes prednjai pred ostalimi sektorji uporabe (Preglednica 4). Specifinost encimov in njihove sposobnosti selektivne pretvorbe substratov, ponuja izboljavo organoleptinih lastnosti (okus, vonj, teksture, ...) in ohranitev hranilne vrednosti ivila. Pretvorba poteka v nadzorovanem procesu, v odsotnosti nezaelenih stranskih reakcij (Laskin, 1985). Naini imobilizacije encimov vkljuujejo (Slika 14): pripravo nevodotopnih razliic encimov, zadrevanje encimov v procesu z ultrafiltracijskimi membranami, omejevanje gibanja in vezava encimov s pomojo nosilnih materialov.
Uinkovitost imobilizacije encima s pomojo nosilnega materiala je odvisna od interakcije encima z nosilcem. Primerni nosilni materiali (Preglednica 5) so netopni v vodi, mehansko odporni in stabilni v reakcijskih pogojih, imajo hidrofilni znaaj, visoko specifino povrino, dobro prepustnost in veliko tevilo veznih mest za encim. Nosilci ne smejo biti toksini oz. se razgrajevati do strupenih snovi in morajo omogoati enostavno regeneracijo iz reakcijske
22
meanice. Aplikacija taknega sistema je omogoena s komercialni dostopnostjo nosilnega materiala (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).
Preglednica5:Osnovnipreglednosilnihmaterialovzaimobilizacijoencimovincelic Anorganski Minerali atapulgit bentonit diatomejskazemlja plovec Sintetinimateriali neporoznosteklo poroznosteklo poroznikovinskioksidi kovine Organski Polimeri polietilen polistiren poli(met)akrilati Nylon poliamid polivinil ... Bioloki Polisaharidi celuloza krob dekstran agar&agaroza karagenan hitininhitozan Beljakovine kolagen elatina albumin svila Ogljinimateriali aktivnooglje Nanodelci zlatinanodelci kvantnepike nanolipidi nanotelesca nanoporoznasilika nanoprizme nanocevke
Pri izbiri nosilnega materiala je za imobilizacijo pomembna tudi makro in mikroskopska struktura snovi. Novi nosilni materiali, ki so osnovani na nanodelcih (npr. sferini polimeri, ki dosegajo velikosti od 50 nm - 10 m), omogoajo kovalentno vezavo proteinov, encimov in protiteles in odpravljajo procesne teave povezane z difuzijo substratov in produktov do/od biolokega katalizatorja (Jain, 2006). 6.2.1 Vezavaencimov
Encimi so velike proteinske molekule, ki razpolagajo z velikim tevilom reaktivnih mest, ionskih skupin in hidrofilnih domen. Vse te strukture s pridom izkoriamo pri imobilizaciji. Fizikalnaadsorpcija V primeru fizikalne adsorpcije se encim povee s povrino nosilca s fizikalnimi interakcijami, npr. z van der Waalsovimi vezmi, vodikovo vezjo ali hidrofilno-hidrofobnim delovanjem. Ker ne potee nobena kemijska reakcija, je konformacija adsorbiranih proteinov nespremenjena in katalitska aktivnost encimov ohranjena. Nosilni materiali za fizikalno adsorpcijo encimov so aluminijevi oksidi, aktivno oglje, glina, diatomejska zemlja, steklo in hidroksiapatit (Buchholz in sod., 2005). Zaradi ibke elektrostatine privlanosti se fizikalno adsorbirani encimi v pretonih sistemih izluujejo z nosilca. Reakcijski pogoji (pH vrednost, ionska upornost, ...) e dodatno vplivajo na tovrstno izluevanje. Izgubo katalitske aktivnosti lahko omejimo s prenim povezovanjem adsorbiranih encimskih molekul (Lee in sod., 2009). Ionskavez Ionska vez omogoa enostavno povezovanje encimov z nosilnim materialom. Vzpostavljene vezi ionskih parov med encimom in nosilcem so moneje kot pri fizikalni adsorpciji, mo vezi pa je prav tako odvisna od reakcijskih pogojev. Kot nosilno ogrodje je mogoe uporabiti kar komercialne anionske in kationske izmenjevalce.
23
Kovalentnavez Najpogosteji nain imobilizacije je kovalentna vezava encima na nevodotopni nosilni material. Pri uspeni imobilizaciji se tvori kovalentna vez med funkcionalnimi skupinami nosilca in med reaktivnimi aminokislinskimi ostanki encima (Preglednica 6), ki niso del encimskega aktivnega mesta ali veznega mesta za substrat. Kovalentno imobilizirani encimi se pri obiajnih reakcijskih pogojih ne izluujejo z nosilca in ostajajo stabilni tudi ob spremembi koncentracije substratov in/ali ionske jakosti. Napaen izbor oz. napana predpriprava nosilnega materiala se lahko odraa v spremenjeni strukturi aktivnega mesta oz. v zmanjanju encimske aktivnosti in selektivnosti.
Preglednica6:Reaktivneskupineaminokislinskihostankov Skupina Opis terminalnaaminoskupinaLlizinain Nterminalnaskupina tiolnaskupinaLcisteina karboksilnaskupinaLaspartatain Lglutamata,Cterminalna karboksilnaskupina
NH3 SH COOH OH
fenolnaskupinaLtirozina
HNH NC NH2 N NH SS N H CH3S CH2OH
Vezava nosilnih materialov in encimov ne potee spontano. Pred izpostavitvijo nosilca encimu moramo na povrini nosilnega materiala kemijsko aktivirati funkcionalne skupine amino, amido, hidroksilnega ali karboksilnega znaaja (reaktivne skupine, ki pri tem nastanejo so opisane v Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Takna priprava nosilnega materiala ponuja irok nabor imobilizacije encimov na nosilni material: Diazonijeva vezava je osnovana na pretvorbi amino skupine nosilca z nitritom v kislem mediju do arildiazonija, s katerim se povee npr. imidazolna ali fenolna skupina encima. Peptidna oz. amidna vez nastane med nukleofilno (amino, hidroksil, tiol) skupino encima in aktivirano skupino nosilca. Karboksilne skupine nosilca lahko aktiviramo na dva naina, z direktno pretvorbo do reaktivnega derivata ali z uporabo kondenzirajoih reagentov, ki tvorijo amidno vez z amino skupinami encima.
gvanidinskaskupinaLarginina
imidazolnidelfunkcionalneskupine Lhistidina disulfidnaskupinaLcisteina imidazolnidelfunkcionalneskupine Ltriptofana tioeterskaskupinaLmetionina hidroksilnaskupinaLserinainL treonina
Alkilirane ali arilirane amino, fenolne ali tiolne skupine encima reagirajo s halidnimi, epoksi ali vinilsulfonilnimi skupinami nosilnega materiala. V literaturi naletimo e na tevilne druge naine aktivacije funkcionalnih skupin nosilnega materiala. Opis konkretnih mehanizmov kovalentne vezave sta uredila Palmer in Bonner (2007). Tvorbakelatov Zanimiva tehnika imobilizacije je tvorba kelatnega kompleksa med encimom in nosilno molekulo. Centralni atom predstavlja navadno katera od prehodnih kovin (npr. Ti, Zr, ...), ki tvori ve vezi tako z organskim (npr. celuloza) ali anorganskim (npr. steklo) nosilcem, kot z encimom. Vzpostavljene strukture so neobstojne ob prisotnosti drugih kelatizirajoih snovi (Kirstein, 1996; Ho in sod., 2004).
24
Biospecifinavez Mnoge bioloke molekule razpolagajo tudi z vezavnimi mesti, ki so encimom specifina. Tovrstne strukture lahko izkoristimo za imobilizacijo, v primeru, da vezava molekule ne oslabi katalitske funkcije encima. Precej raziskovalnega napora je namenjeno imobilizaciji encimov s pomojo monoklonskih teles. V postopku dobro definirano regijo encima veemo na monoklonsko telo, monoklonsko telo pa na nosilni material. Takna vezava preko posrednika omogoa stabilizacijo encimske strukture in bolj nadzorovano imobilizacijo na poljubnem nosilnem materiali (Bruun in sod., 2000). Prenopovezovanjeencimov Encime lahko veemo kovalentno medsebojno, ali z drugimi inertnimi proteini (npr. albumini). Tako pripravljene agregate loimo iz raztopine z usedanjem. Preno povezovanje uporabljamo pogosto tudi za dodatno stabilizacijo v imobiliziranih sistemih, npr. preno povezovanje fizikalno adsorbiranih encimov na povrino steklenih kroglic in preno povezovanje encimov na povrino membranskih filtrov (Rios in sod., 2004). Zaradi tekih reakcijskih razmer, v katerih poteka vezava, je konna aktivnost preno povezanih biokatalizatorjev ponavadi nizka (Buchholz in sod., 2005). Noveja metoda izdelave preno povezanih encimskih kristalov (cross-linked enzyme crystals, CLECs), razvita za potrebe preuevanja strukture encimov s pomojo rentgenske kristalografije, je zanimiva tudi iz vidika separacijskih in imobilizacijskih postopkov (Noritomi, 2007). Preno povezani encimski kristali imajo izredno visoko stabilnost. Strukturo in katalitsko funkcijo ohranjajo tudi v nepolarnih topilih, v prisotnosti plinske fazi ali superkritinega fluida. Njihova ista in trdna zasnova omogoa razvoj novih bio-ipov za integracijo v vezja terenskih in diagnostinih senzorskih komponent. 6.2.2 Ujetjeencimov
Gibanje encimov v reakcijski meanici lahko omejimo fizino, z imobilizacijo znotraj poroznih materialov. Tvorba kemijskih vezi med encimom in nosilcem pri tem tipu imobilizacije ni nujno potrebne. Pore nosilnega material morajo biti dovolj majhne, da prepreijo uhajanje encima in dovolj velike, da omogoijo prehajanje substratov in produktov. Ujetjevgel Encime ujamemo v intersticije, ki nastanejo med prenim povezovanjem gela. Na voljo so tevilne kombinacije sredstev za preno povezavo (glutaraldehid, toluen diizocianat, UV svetloba, ...) in snovi, ki so sposobne tvorbe gelov (alginat, agar, karagenan, ...). Difuzija substrata do encima v gelu omejuje hitrost katalitske pretvorbe do produkta. Ker sterilizacija gelov ni enostavno opravilo so takni sistemi dovzetni za mikrobne infekcije in med potekanjem procesa zahtevajo ve pozornosti. Razliica vgrajevanja encimov v gel je ko-polimerizacija. Pri tem pristopu encim z kopolimerizacijo imobiliziramo v polimerni matriks. Zaradi kovalentne vezave v samo strukturo nosilnega materiala je verjetnost izpiranja encima iz polimera mono zmanjana. Chen in sodelavci (2000) poroajo o veji odpornosti tako imobiliziranega encima invertaze, na temperaturne spremembe in spremembe pH vrednosti. Mikroenkapsulacija Enkapsulirani encimi so obdani z membranami, ki so prepustni za substrate in produkte.
25
Priprava mikrokapsul navadno potee v organsko-vodnem dvofaznem sistemu. Emulziji vodne raztopine encimov in organske faze dodamo membranski polimer v organskem topilu. Polimer difundira v kapljice emulzije, kjer tvori stabilne membrane. Oblikovane strukture dosegajo velikosti 1 100 m. Z uporabo lipidno-poliamidnih membran je mogoe enkapsulirati tudi koencime in multiencimske komplekse. Z mikroenkapsuliranimi encimi doseemo najvije koncentracije encimov na enoto prostornine imobiliziranega preparata (Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Reverznemicele Amfifilne molekule oblikujejo kroglaste strukture, tako da mimimizirajo neugodne polarnonepolarne interakcije med okoljem in vodnimi molekulami. V polarnem okolju so lipofilni repi obrnjeni v notranjost micele, v nepolarnih topilih pa so micele organizirane obratno, repi so obrnjeni navzven, voda pa se nahaja v notranjosti reverznih micel (Slika 15).
H20 nepolarnirep polarnaglava nepolarnotopilo Slika15:Strukturareverznemicelevnepolarnemtopilu
Encimi, ki so raztopljeni v notranjosti takih struktur, ohranijo svojo aktivnost in so zaiteni pred nepolarnim okoljem z obdajajoim amfifilnim slojem. Membranski reaktorji ponujajo tevilne prednosti za vodenje procesa katalitske pretvorbe substratov, netopnih v polarnih topilih, s pomojo reverznih micel, kot sta kontinuirana proizvodnja in poenostavljena soasna separacija produkta (Serralheiro in sod., 1999). 6.2.3 Filtracijaraztopljenihencimov Imobilizacija encimov se lahko izraa v spremembi encimske aktivnosti in/ali selektivnosti. Kadar je v procesu potrebno uporabiti nativno obliko encima, lahko gibanje encimov v reaktorju omejimo z membrano, ki omogoa prehajanje substratov in produktov ter je neprehodna za veje encimske molekule. V ta namen se uporabljajo ultrafiltracijske in kapilarne membrane ter moduli in pregrade s poroznimi vlakni, ki encime tudi varujejo pred mikrobno infekcijo. Encimski kofaktorji so ponavadi manje molekule in zato prehajajo tudi ultrafiltracijske membrane. Z vezavo na veje molekule kofaktorje zadrimo v reakcijski meanici. Z izbiro in dodatno obdelavo membran (velikost por, hidrofilnost membrane, ...) vplivamo na selektivnost procesa. Osnovne teave, povezane z uporabo membran so maenje in kvarjenje membran (adsorpcija in reaktivnost z raznimi snovmi reakcijske meanice) ter hitrost procesa, omejena z uporom transporta snovi.
26
6.3 CELICE
Katalitska aktivnost je pomembna lastnost celic in pripadajoih celinih organel. Iz tehnolokega vidika so celice pravzaprav razliica imobillizacije intracelularnih encimov oz. so: tovarna ekstracelularnih encimov in situ, ter vir drugih biolokih molekul s katalitskim delovanjem. Uporaba izoliranih encimov je v proizvodnji omejena na enostavne sisteme. Pri katalizi vestopenjskih reakcij izkoristimo zaitno vlogo celine strukture za stabilizacijo katalitskega potenciala encimov in za nemoten potek regeneracije kofaktorjev. Celice tako uporabljamo bodisi za katalizo kompleksnih reakcij, (i) kjer je vkljuena ena vrsta encimov; (ii) katalizo reakcij, ki vkljuujejo ve razlinih vrst encimov z ali brez kofaktorji in (iii) pri pridobivanju primarnih oz. sekundarnih metabolitov celotnih metabolnih poti. Raba celic v biotehnolokih postopkih je zaelena (Ullman's Biotechnology ... , 2007): ko potrebujemo intracelularne encime, ki so nestabilni v izolirani obliki, ko mikroorganizmi ne vsebujejo moteih encimov oz. so ti encimi deaktivirani, ko so substrati in produkti v procesu nizko molarni in hitro prehajajo skozi membrano.
Potek metabolnih poti in regeneracije kofaktorjev je pogojen z vitalnostjo celic, zato je tovrstna vestopenjska pretvorba mogoa le s fermentacijo z ivimi celicami. Pravilno izbrane in pripravljene aktivne celice sicer proizvajajo elene produkte, toda v osnovi je njihovo delovanje usmerjeno v lastno preivetje. Za svoje vzdrevalne potrebe porabljajo del kemino vezane energije substrata, zaradi esar je ovirana aplikacija marsikaterega procesa. Nadalje je zaradi vsebnosti ivih organizmov v iztoku potrebno dodana obdelava odpadne biomase, kar je dodaten stroek proizvodnega procesa (Buchholz in sod., 2005; Walker in Rapley, 2009). Celina membrana po eni strani varuje celino notranjost, po drugi strani pa omejuje hitrost transporta substrata v celico in produkta iz celice. Encimi v znotraj-celinem okolju privzamejo aktivno konformacijo. Na enak nain tudi multiencimske strukture ohranjajo znotraj celice stabilno geometrijo, v izolirani obliki pa so precej nestabilne.V primerih, ko preivetje organizma v reakcijskih pogojih ni pomembno, lahko z doloenimi tehnikami (npr. z elektroporacijo) poveamo prepustnost celine membrane, odpravimo problematinost iztoka in se izognemo porabi energije za vzdrevalne potrebe organizma (Ullman's Biotechnology ... , 2007). ive celice (ivalske, rastlinske celice in mikroorganizmi) oz. uporaba njihovih ohranjenih celinih struktur ponuja bogateji izbor biokatalitine aktivnosti, kot uporaba izoliranih encimov in drugih katalitsko aktivnih biolokih snovi. ivalskecelice ivalske celine in tkivne kulture so dobro uveljavljene tako v raziskovalnem okolju kot v aplikacijah. Raziskovalci v ivalskih celinih kulturah opravljajo rutinsko ekspresijo genov za proizvodnjo rekombinantnih proteinov in genski ineniring protiteles. V proizvodnji vakcin ivalske celice izpostavijo oslabljenim virusnim sevom (Deinhardt in Jilg, 1986; Barteling in Vreeswijk, 1991). Bakterijske celice lahko uporabimo za ekspresijo humanih proteinov, vendar veina proteinskih struktur po mRNA translaciji e ni bioloko aktivnih. Pomembna biokatalitska znailnost ivalskih celic je sposobnost posttranslacijskih modifikacij (glikozilacija, tvorba disulfidnih mostikov, karboksilacija, amidacija ali fosforilacija aminokislinskih ostankov,
27
specifina rez proteinske verige), ki zagotovijo pravilno delovanje proteina (Demain in Vaishnav, 2009). Navkljub tevilnim prednostim so ivalske celice v praksi obutljive, imajo natanno doloene ivljenjske potrebe, dajejo nizek donos proizvoda in so dovzetne za morebitne infekcije. Najve aplikacij ivalskih celic zato zasledimo v medicini, za proizvodnjo biolokih snovi z visoko dodano vrednostjo (Walker in Rapley, 2009). Rastlinskecelice Razvoj biokatalize s pomojo ivih rastlinskih celic napreduje poasi, delno zaradi omejitev povezanih z gojenjem rastlin (podnebne in vremenske razmere, nizki pridelki, ...), predvsem pa zaradi dragih ekstrakcijskih postopkov in problematinosti kopienja celinih odpadnih metabolitov v vakuolah. Zaradi tega specifinega problema celice med ekstrakcijo izloajo tudi vsebino vakuol, ki kontaminira produkt. Gojenje rastlinskih tkivnih kultur je mona alternativa klasini pridelavi rastlin za proizvodnje manjega obsega. Spoznanja s podroja genetskega ineniringa energetskih rastlin se odraajo v novih transgenih rastlinah, ki imajo mikroorganizmom primerljiv donos proizvodnje biomolekul. Mikroorganizmi Enostavneja zgradba mikroorganizmov nam zagotovo ponuja bolj raznovrstni potencial uporabe v primerjavi z njihovimi kompleksnejimi evolucijskimi sorodniki (Nekrep, 1996). Walker in Rapley (2009) ocenjujeta, da trenutno poznamo manj kot 3 % celokupnega katalitskega potenciala, s katerim razpolagajo mikroorganizmi. Najve pozornosti biotehnologije so bile v preteklih desetletjih delene bakterije. Njihove biokatalitske sposobnosti zaposlujemo v ivilski industriji in industriji pija, velik pomen imajo tudi v medicini, kmetijstvu, prehrani ivali in istilnih tehnologijah. Prokarionti ne vsebujejo celinih organel, vendar v njihovi protoplazmi potekajo izjemno dovreni mehanizmi katalize procesov biosinteze in razgradnje. V laboratorijskih pogojih jih gojimo laje, kot ivalske ali rastlinske celice, vendar je njihova uporaba v praksi odvisna od konne kvalitete produkta (separacija celic / metabolitov).
6.4 IMOBILIZACIJACELIC
Prednost imobilizacije celic pred uporabo suspendiranih kultur intenzivifikacija procesa, je znianje strokov biotehnolokega procesa zaradi vije celine gostote, enostavneje separacije in ponovne oz. kontinuirane rabe kulture. Postopki imobilizacije celic so pravzaprav razliica tehnik imobilizacije encimov. Obiajno so tehnike celine imobilizacije delovno in cenovno manj zahtevne, saj se izognemo stopnji ekstrakcije in ienja encimov. Intracelularni encimi so v taknih pogojih bolj stabilni, saj jim notranjost celice zagotavlja dodatno zaito v reakcijski meanici. Z imobilizacijo doseemo tudi vejo odpornost celic na strine sile. Zaradi imobilizacije celic v procesu biokemijske pretvorbe prihaja tudi do doloenih omejitev (Marinek-Logar, 1999): ovirana difuzija in tvorba koncentracijskih gradientov substratov in produktov v reakcijskem mediju, pomanjkanje kisika znotraj delcev pri aerobnih procesih, omejena celina delitev, metabolne spremembe celic.
28
V naravi pogosto naletimo na sesilne in agregirane oblike mikrobnih kolonij. Vsak e tako inerten material v naravnem okolju postane prej ali slej bioloko aktiven zaradi adhezije mikroorganizmov. Lep primer kompleksno organiziranih mikrobnih biofilmov so dentalni plaki. Na razpololjive povrine svojega naravnega okolja se pritrjujejo tudi fluvialni organizmi, ki se razraajo po povrinah in sedimentih ter vejih organizmih renega dna. Primer mikrobnih agregatov najdemo na koreninah rastlin iz druine metuljnic, kjer ti simbionti omogoajo bioloko fiksacijo duika iz zraka (Marinek-Logar, 1999; Fett in Cooke, 2005; Filoche in sod., 2010).
Imobilizacijacelic
Vezavananosilce
Agregacija
Ujetje
flokulacija
preno povezovanje
adhezijain adsorpcija
ionskavez
kovalentna vez
zamreevanje
membrane
mikro enkapsulacija
Slika16:Nainiimobilizacijecelic(Ullman'sBiotechnology...,2007)
Laboratorijski oz. industrijski postopki imobilizacije posnemajo in modificirajo organizacijo mikroorganizmov v naravnem okolju (Slika 16). Laboratorijsko sta bili razviti e tehniki imobilizacije z zamreevanjem celic in enkapsulacija celic v membranah. Glede na rabo nosilnega materiala lahko naine imobilizacije celic razdelimo v sledee kategorije (Ullmann's Biotechnology ..., 2007): imobilizacija brez nosilca imobilizacija na predhodno pripravljen nosilec, imobilizacija med pripravo nosilca, imobilizacija z nadzorovano rastjo / germinacijo spor Celicenanosilcih
6.4.1
Lastnosti nosilnih materialov za celice v osnovi ne odstopajo od elenih lastnosti nosilcev konvencionalnih katalizatorjev ali encimov. Zaelena je dobra komercialna dostopnost, visoka specifina povrina, dobra mehanska in kemina odpornost nosilca, ki ne sme biti toksien ali razgradljiv za izbrano celino kulturo. V primeru imobilizacije povsem aktivnih celic, je potrebno upotevati tudi potencial nosilca za kolonizacijo (velikost por in elastinost materiala). Adhezijainadsorpcija Proste celice v raztopini imajo visoko afiniteto za pritrjevanje na trdne snovi. Z dolgotrajno izpostavitvijo nosilnem materialu se celice nanj imobilizirajo same. Navadno je za nastanek
29
biofilma na povrini nosilnega materiala potrebna e predhodna vezava makromolekul, ki s celicami vzpostavijo tevilne vendar ibke elektrostatine sile. Nekateri mikroorganizmi se lahko na nosilec pritrdijo e s flagelami, pili, fimbriji in z ekstracelularnimi polimeri, ki dokonno utrdijo poloaj celice na nosilcu. V ustreznem sistemu se vzpostavi ravnoteje med izgubo (strine sile, abrazija, odmiranje) in rastjo celic biofilma (Marinek-Logar, 1999). eprav je opisana metoda izredno preprosta, je njena uporaba omejena v tejih reakcijskih pogojih (hitrost meanja, pH vrednost, ionska jakost). Stabilnost samega biofilma je pogojena tudi s samo vrsto in fiziolokim statusom imobilizirane biomase. Fizikalna adsorpcija z adhezijo celic na nosilni material je v uporabi v kolonskem ienju odpadnih vod. Uveljavlja se tudi na podroju proizvodnje zdravilnih biolokih uinkovin z mikrosferinimi, makroporoznimi in monolitnimi polimernimi nosilci (Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Ionskavez Elektrostatini naboj celice (npr izrazito negativen pri kvasovkah) tvori z ionsko povrino nosilca stabilni kompleks. Nosilni material v uporabi so sintetini ionski izmenjevalci, razni anorganski materiali in modificirani celulozni derivati. Stabilnost imobilizacije je odvisna od pH vrednosti, ionske jakosti, starosti celice in sestave povrine nosilca. Kovalentnavez Kovalentno povezovanje celic z nosilnim materialom je sicer mogoe, vendar v praksi ni razirjeno. Sredstva, ki inducirajo kovalentno vezavo so namre zelo reaktivna in pogosto povzroijo znianje celine aktivnosti in/ali viabilnosti (Ullmann's Biotechnology ..., 2007). 6.4.2 Ujetjecelic Zamreevanje Zamreevanje celic je razirjena tehnika imobilizacije, pri kateri celice omejimo v strukturne vrzeli med oblikovanjem nosilnega materiala. Celice v pripravljeni strukturi niso vezane na nosilec, temve je njihovo gibanje omejeno z velikostjo intersticije. Zaradi milih reakcijskih pogojih, pri katerem poteka zamreevanje, je ta tehnika primerna za vse oblike celic in celinih delov. Konni preparat je v rinfuzi peletov, kroglic oz. podobnih oblik, z visoko koncentracijo aktivnih celic. Mosbach in Mosbach (1966) sta razvila osnovno metodo zamreevanja celic v poliakrilamidnem gelu. Postopek temelji na polimerizaciji prostih radikalov
Slika17:Sodzahitroproizvodnjokisa
Asod:h2,4m;dz1,1;ds0,9m, Bperforiranapregrada, Cprezraevalneodprtine, Dodtoniventil Efiksnidelpokrova, Gpokrovzadolivanjesubstrata Imobilizacijacelicjevpraksipoznanaodleta 1823, odkar je v uporabi Schutzenbachov hitri postopekproizvodnjekisa. Scutzenbach je za proizvodnjo kisa uporabil pokonnopostavljensodsperforiranopregrado v njegovi notranjosti. Zgornji del soda je tesno zapolnil z lesnimi oblanci, na obodu spodnje komorepajevenakomernihpresledkihnamestil prezraevalneodprtine. Na oblancih se med procesom razraa acetogena mikrobna zdruba. Substrat tee preko oblancev skozi perforirano dno v spodnji zbiralnik. Tekoino je potrebno recirkulirati dokler ni doseena ustrezna koncentracija ocetnekislinevkisu. Tovrstnisistemisodandanesopremljeniz avtomatskoobtonorpalko,razprilnoenotoza enakomerninanossubstratanaoblancein napravozaaktivnoprezraevanje(Wood,1988).
30
akrilamidnih monomer v vodni suspenziji celic pri nizki temperaturi. V procesu je mogoe nadzorovati tevilo prenih povezav med monomerami, ki vplivajo na poroznost in mehanine lastnosti materiala. Toksini akrilamidni derivati vplivajo na zmanjanje celine viabilnosti in encimske aktivnosti. Hackel in sodelavci (1975) so uvedli imobilizacijski postopek z zamreevanjem celic v aluminijevem alginatu. Alginat je polisaharid, ki ga pridobivamo z ekstrakcijo morskih alg. V prisotnosti multivalnetnih ionov (navadno aluminijevi in kalcijevi ioni) tvori inertno tridimenzionalno mreo, v katero se ujamejo imobilizirane celice. Nastali gel je mono porozen, z ustrezno velikostjo por, ki ne dovoljuje uhajanja celic. Kalcijev alginat se v okolju z kelatizirajoimi ligandi raztopi, zato je gel mogoe stabilizirati z naknadno substitucijo kalcijevih ionov. Struktura ni primerna za hitro rastoe celice, saj lahko zaradi poveevanja celine biomase alginatne kroglice razpadejo. Pri izdelavi alginatnih kroglic velja nameniti pozornost premeru kroglice in velikosti por, da proces ne bo pretirano omejen z difuzijo (Marinek-Logar, 1999). Membrane Pri membranski imobilizaciji gibanje posameznih celic ni omejeno s strogem smislu, temve celice v reaktorju zadruje membranska prepreka. Celice so v taknem sistemu izpostavljene topnim komponentam reakcijske meanice. V praksi so najbolj razirjeni reaktorski moduli s poroznimi vlakni, pri katerih se dosega vije celine gostote kot v zamreenih nosilcih. Hitrost rasti in razmnoevanja celic vpliva na trajnost procesa, saj prekomerno namnoena celina biomasa pokoduje membrano (Ullmann's Biotechnology ..., 2007). Mikroenkapsulacija Mikroenkapsulacija celic je uporabna v procesih, kjer se elimo izogniti neposrednem kontaktu med imobiliziranim organizmom in reakcijskim okoljem, bodisi zaradi kodljivih vplivov imobiliziranih celic (uporaba v terapevtiki), bodisi zaradi mone infekcije aktivne celine biomase z nesterilnim substratom. Osnovna tehnika temelji na zaetni imobilizaciji elenega tipa celic v raznovrstnem naboru polimernih kroglic (premera ~ 20nm do 2 mm) in naknadni tvorbi semipermeabilne membrane na povrini kroglice. Matriks kroglic je najpogosteje sestavljan iz razlinih vrst alginata, uporabljajo pa se tudi hitozan, kolagen, dekstran, agaroza in razni sintetini polimeri. Razliica mikroenkapsulacije vkljuuje dodatno raztapljanje polimernega matriksa po tvorbi membrane. Nastanejo votle strukture, ki vsebujejo prosto gibljive celice (Murua in sod., 2008). 6.4.3 Celiniagregati tevilne suspendirane kulture teijo k agregaciji pri visoki celini gostoti. e se celice po delitvi ne morejo loiti, govorimo o pasivni agregaciji, e pa agregat nastane z gibanjem in zdruitvijo celic, pa pravimo, da je agregacija aktivna. Razline vrste kvasovk, nitastih gliv, rastlinskih celic in bakterij tvorijo v reaktorju z lebdeim slojem (fluidized bed reactor) agregate, ki so odporni na strine sile (Scott, 1987). Med tipi celinih agregatov razlikujemo flokule, pelete in granule. Kosmii ali flokuli so krhke strukture nepravilnih oblik, ki po usedanju tvorijo navidezno homogeno plast. Granule in peleti so grudiaste strukture, ki po usedanju ohranijo svojo obliko. Granule se razlikujejo v obliki, kemini strukturi in bioloki aktivnosti (Marinek-Logar, 1999).
31
Umetno agregacijo celic sproimo z dodatkom polielektrolitov, ali pa s sredstvi za kovalnetno preno povezovanje (Hua in sod., 2004; Hu in sod., 2007). V nekaterih primerih agregacijo inducira tudi e samo prepihovanje s kisikom (Marinek-Logar, 1999). 6.4.4 Imobilizacijacelinihorganel Raba imobiliziranih celinih organel je zanimiva predvsem zaradi energetsko-metabolnih procesov, ki jih ohranjajo v izolirani obliki (npr. ATP regeneracija, proizvodnja H2 in oksidacija metabolitov). V osemdesetih letih prejnjega stoletja so raziskovalci posveali veliko pozornost potencialu imobilizacije kloroplastov za izdelavo alternativnih oblik fotovoltainih celic. Dandanes so raziskave usmerjene v razvoj novih oblik gorivnih celic s pomojo imobilizacije mitohondrijev (Bhardwaj in sod., 1981; Arechederra in sod., 2008).
6.5 LASTNOSTIIMOBILIZIRANIHBIOKATALIZATORJEV
Zadrevanje biokatalitskih komponent v reakcijski meanici, doseemo z vezavo, ujetjem ali agregacijo biokatalizatorjev. Razline tehnike imobilizacije v razlino vplivajo na zmanjanje biokatalitske aktivnosti. Slika 18 predstavlja osnovne razloge za nianje katalitske sposobnosti vezanega biokatalitskega materiala.
abcde
encim
substrat nosilec
Slika18:Vplivvezavenaaktivnostencimov(poUllmann'sBiotechnology...,2007)
Pri uspeni vezavi se tvori kovalentna vez med funkcionalnimi skupinami nosilca in biokatalizatorja, ki niso del katalitsko aktivnega mesta ali veznega mesta za substrat (Slika 18, a). Napaen izbor oz. napana predpriprava nosilnega materiala se lahko odraa v spremenjeni strukturi (b), inhibiciji (c in d) in sterinem oviranju aktivne katalitske komponente. Primerjava aktivnosti prostih in imobiliziranih biokatalizatorjev je teavna naloga, saj je as pretvorbe v imobilizacijskem ogrodju odvisen tudi od transporta snovi. Pri encimih vezanih na nosilni material je aktivnost bolj ohranjena v primeru veje obremenitve nosilca. V razmerah, kjer je prisoten upor transporta snovi, lahko koliino imobiliziranega proteina doloimo natanno le s titracijo aktivnih mest. Stabilizacija Delovanje prostih in imobiliziranih biokatalizatorjev v osnovi omejujejo isti faktorji okolja. Vendar se neredko dogaja, da postopek imobilizacije dodatno stabilizira encimsko strukturo, da ta postane bolj odporna v reakcijskih pogojih. Ve-tokovna kovalentna vezava encima utrdi njegovo terciarno in kvartarno strukturo. Vezava aminokislinskih ostankov, ki niso del katalitske regije encima, pa stabilizira strukturo e zaradi njene manje reaktivnosti (Fernndez-Lafuente in sod., 1999).
32
pHoptimum
Encimi, ki so imobilizirani na ionske nosilce, doseejo maksimalno aktivnost pri drugani vrednosti, kot njihovi prosti homologi. V neposredni bliini povrine nosilca z negativnim nabojem je pH vrednost nija, kot meri pH ostale raztopine, zato je pH optimum biokatalitske molekule, merjen v reakcijski meanici, navidezno viji. Nosilno ogrodje s pozitivnim nabojem ima reciproni uinek, pH vrednost je v neposredni bliini nija, zato je izmerjeni pH optimum encima v reakcijski raztopini niji (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).
Polarnost
Polarnost imobilizacijskega matriksa doloa njegovo afiniteto do substrata. Privlane oz. odbojne sile vplivajo na koncentracijo substrata v bliini aktivnih mest biokatalizatorja, s imer je pogojena hitrost encimske pretvorbe. Pri polarnih substratih doseemo visoke hitrosti reakcije z uporabo polarnih nosilcev, pri nepolarnih substratih pa so uinkovite hidrofobne povrine (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).
7 REAKTORJIZAIMOBILIZIRANESISTEME
Pri nartovanju kemijskih reaktorjev moramo poznati termodinamiko in kinetiko reakcije, ki jo nameravamo aplicirati. Termodinamika napoveduje stopnjo kemijske pretvorbe oz. poloaj kemijskega ravnoteja med reaktanti in produkti. Kinetika pa je povezana z velikostjo reaktorja in ocenjuje, kako hitro bo mogoe kemijsko ravnoteje dosei. Fizikalna osnova dimenzioniranja vsakega procesa kemijske pretvorbe zajema mehanizme snovnega in toplotnega transporta med fazami ter mehanizem transporta toplote v okolico. Fizikalni in kemijski model skupaj predstavljata matematini model kemijskega reaktorja. S simulacijo procesa na laboratorijskem in pilotnem nivoju pridobimo potrebne kinetine podatke ter preverimo oz. popravimo matematini model, ki ga lahko neposredno uporabimo za nartovanje novega oz. optimizacijo obstojeega komercialnega reaktorja. Kemijske reaktorje v praksi dimenzioniramo na osnovi zakona o ohranitvi mase (snovna bilanca) in zakona o ohraniti energije (toplotna bilanca). Na podroju reakcijskega inenirstva se uveljavlja tudi raba zakona o ohranitvi gibalne koliine, s katerim je danes e mogoe napovedati enostavne geometrijske konfiguracije reaktorja (Levec in Pintar, 2008).
7.1 KINETIKA
Pojav katalize vpliva na kinetiko kemijskih reakcij, termodinamika pa ostaja nespremenjena. S prisotnostjo katalizatorja v reakcijski meanici se spremeni reakcijska pot od reaktanta do produkta, tako da se kemijsko ravnoteje vzpostavi hitreje. Kinetiko kataliziranih kemijskih reakcij opisujemo glede na zgradbo in organizacijo katalizatorjev (heterogen / homogena oblika), reda reakcije (koncentracija reaktantov) in tip procesa (arni, arni z napajanjem substrata, neprekinjeni) (Rothenberg, 2008). Na hitrost kataliziranih reakcij ima vpliv vrsta dejavnikov, od katerih so pomembneji koncentracija katalizatorja, koncentracija reaktanta in produkta, prisotnost promotorjev in katalizatorskih strupov, temperatura in pH. Za homogeno kemijsko reakcijo, ki poteka v arnem sistemu, lahko zapiemo:
aA + bB + L rR + sS + L
[2]
33
Stehiometrija doloa razmerje hitrosti akumulacij posameznih komponent:
1 dn A 1 dnB 1 dnR 1 dnS = = = a dt b dt r dt s dt
[3]
V zaprtem sistemu s konstantnim tlakom in temperaturo, bo hitrost reakcije definirana kot:

r= 1 1 dn j V v j dt [4]
n j mnoina molov j te komponente v j stehiometrijski koeficient j te komponente V prostornina sistema t as
Imobilizirani sistemi so pogosto omejeni s prenosom (difuzijo) snovi iz reakcijske meanice do aktivnega mesta katalizatorja, kar lahko prikaemo z enabo:
S razt Prazt
b b S katal + K SK K + Pkatal
[5]
S substrat P produkt K katalizator
MichaelisMentenovkinetinimodel
Michaelis-Mentenov model sorazmerno dobro opisuje veino eno-ino dvosubstratnih encimskih reakcij (Michaelis in Menten, 1913) ter se pogosto uporablja tudi za opisovanje zgradbe encimov kinetike homogenih reakcij (Rothenberg, 2008). Kadar imajo encimi ve aktivnih mest / podenot, je potrebno uporabiti pomone modele. Za encimsko katalizirano reakcijo sta Michaelis in Menten zapisala;

k 1 k +1 k2
E+S
ES P + E
[6]
k + 1, k 1, k 2 = hitrostne konst. reakcije
Katalizator se v prvi fazi vee na substrat. V naslednji fazi se med ireverzibilno razgradnjo intermediatnga kompleksa sprostijo nastali produkti in obnovljen encim. Zaetna koncentracija encima je zato ob vsakem asu enaka vsoti prostega in vezanega katalizatorja. Hitrost reakcije je torej omejena s koncentracijo katalizatorja. Michaelis-mentenov model predpostavlja, da je encim (E) nacien s substratom (S), oz. da je ves encim vezan v intermediatni kompleks (ES). Nastanek kompleksa je reverzibilen, nastanek produkta (P) pa ireverzibilen proces.
34
Pri teh pogojih velja:

rS = Vmax
[S ] K M + [S ]
[7]
rS hitrost pretvorbe substrata Vmax maks. hitrost reakcije K M Michaelis Mentenova konst.
Michaelis-Mentenova konstanta (KM) predstavlja tisto koncentracijo substrata, pri kateri je hitrost reakcije enaka polovini vrednosti maksimalne hitrosti pri konkretnih pogojih. KM je potrebno doloiti za vsak substrat posebej, in je obratno sorazmerna afiniteti encima za doloen substrat. Rezultati Mihaelis-Mentenove enabe so razporejeni vzdol hiperbole (Slika 19), iz katere je razvidno logaritemsko naraanje hitrosti reakcije v odvisnosti koncentracije substrata (linearno naraanje pri nizkih koncentracijah substrata, upoasnjeno naraanje pri visokih vrednostih do asimptote Vmax). Vrednosti KM in Vmax sta znailni za vsak par encim-substrat pri doloeni temperaturi, pH in ionski sestavi raztopine.
Slika19:MichaelisMentenovgraf
Pri imobiliziranih katalizatorjih je potrebno upotevati e upor transporta snovi. V enabo uvedemo faktor uinkovitosti :
rS = Vmax [S ] K M + [S ]
[8]
LangmuirHinshelwoodovkinetinimodel
Hineshelwoodow model prerazporeditve atomov, osnovan na Langmuirjevi teoriji idealnih povrin (Murzin, 2005), opisuje najbolj pogost mehanizem delovanja heterogenih katalizatorjev (adsorpcija, reakcija, desorpcija). Model je uporaben tudi za opisovanje tistih homogenih katalizatorjev in biokatalizatorjev, kjer mora substrat / reaktant najprej koordinirati s kovinskim atomom / encimom, preden lahko potee reakcija (Rothenberg, 2008). Na povrinsko vezanem heterogenem katalizatorju je Askupno aktivnih mest. Med procesom katalize se reagent (R) adsorbira na povrino katalizatorja in tvori z aktivnim mestom intermediat RA. Po pretvorbi je na katalitsko mesto vezan preoblikovan intermediat PA. Produkt (P) se nato desorbira in omogoi ponovni zaetek katalize na tem aktivnem mestu. Hitrostne konstante reakcij (k1, k2, k3) so prikazane v enabi 9.
35
R + A RA hitrost = k1 [R ] A k 1 R RA PA
k 2 k2 k 1
k1
hitrost = k 2 A k 2 P PA P + A hitrost = k 3 P k 3 [P ] P
k 3 k3
[9]
R dele aktivnih mest zasedenih z reagentom P dele aktivnih mest zasedenih s produktom A dele prostih aktivnih mest
Ob predpostavki, da reakcija na povrini katalizatorja omejuje hitrost reakcije, potem velja:
hitrost =
(k 2 K R [R ] k 2 K P [P ]) 1 + K R [R ] + K P [P ] [10]
K R adsorpcijska ravnotena konst. reagenta K P adsorpcijska ravnotena konst. produkta
7.2 PRENOSSNOVI
V reakcijski meanici se reaktanti z difuzijo prehajajo iz raztopine v neposredno bliino aktivnega mesta katalizatorja. Zunanji transportni upor lahko bistveno zmanja aktivnost katalizatorja. Aktivno mesto imobiliziranih katalitskih komponent se lahko nahaja tudi v notranjosti nosilnih materialov, npr. znotraj gelov, poroznih struktur, filmov, flokul, ipd. V tem primeru pravimo, da je prenos snovi omejen z notranjim transportnim uporom (Ullmann's Biotechnology ..., 2007).
Zunanjitransportniupor
Med prenosom reaktantov iz raztopine do aktivnega mesta katalizatorja in produktov iz povrine katalizatorja v raztopino se med katalizatorjem in raztopino vzpostavi difuzijski sloj. V stacionarnem stanju je mogoa hitrost reakcije:
hitrost = k SL ( R A R B ) = k S R B R A koncentrac ija reagenta na mestu A R B koncentrac ija reagenta na mestu B k SL koeficient prenosa snovi na fazni meji k S hitrostna konst . reakcije , ki poteka na povrini katalizato rja
[11]
36
e je koncentracija reagenta v raztopini RB, potem velja: hitrost = kS RA (k S / k SL ) + 1

[12]
Zaradi vpliva zunanjega transportnega upora celokupna kinetika procesa navidezno ne ustreza Michealis-Mentenovem modelu glede na koncentracijo substrata v raztopini. Pravilno predstavo o kinetiki dobimo zato v odsotnosti difuzije, kjer je vmax/kSL razmerje ozko. V ta namen je v reaktorskih pogojih potrebni pospeiti prenos snovi (pretok oz. hitrost meanja), uporabiti manjo koncentracijo katalizatorjev in zniati reakcijsko temperaturo. Koeficient prenosa snovi (kSL) je v sistemih z nasutim ali lebdeim slojem je v veji meri odvisen od gostote, viskoznosti ter hitrosti linearnega toka raztopine. Doloevanje hitrosti gibanja raztopine v reaktorjih z mehanskim meanjem je izredno zahtevno in kompleksno opravilo. Za oceno prenosa snovi komponento hitrosti nadomestimo s podatkom o korelaciji s vhodno mojo mealca, ali z Reynoldsovim tevlom mealne geometrije (Garcia-Ochoa in Gomez, 2004).
Notranjitransportniupor
Zaradi koncentracijskih gradientov, ki se vzpostavijo med povrino in notranjostjo nosilnega matriksa, poteka prenos snovi skozi strukturo nosilca z difuzijo. Hitrost reakcije je v matriksu odvisna od koncentracije substratov, reaktantov in produktov. Zaradi sprotne pretvorbe substrata/regenta med difuzijo skozi nosilni matriks, je v notranjosti nosilnega materiala vedno manja koncentracija teh snovi kot na fazni meji. Tako v arnih kot pretonih je hitrost difuzije s fazne meje v notranjost imobilizacijskega matriksa odvisna od koncentracije substrata v reaktorju. V pretonih sistemih ostaja koncentracija substratov enaka, medtem ko se v arnem reaktorju koliina substrata spreminja (porablja) s asom. Uinkovitost prehoda snovi je veja, kadar je debelina oz. velikost delcev nosilca manja. Celokupni vpliv difuzije opiemo s faktorjem uinkovitosti :
celokupna hitrost reakcije hitrost ekvivalentne reakcije v raztopini
[13]
Za potrebe kinetinih tudij je tudi notranji transportni upor potrebno docela izniiti ( = 1). Vejo prehodnost nosilca doseemo z uporabo manjih nosilnih delcev, nijo koncentracijo katalitskega materiala v meanici, z uporabo bolj poroznih (veji premeri por) nosilnih materialov in z vodenjem procesa pri nijih temperaturah.
7.3 LABORATORIJSKIREAKTORJI
Kinetine parametre in meritve aktivnosti imobiliziranih katalizatorjev opravljamo v strnjenem sloju katalizatorja (reaktor s strnjenim slojem stolpni / cevni reaktor), v homogeni suspenziji katalizatorjev (reaktorji z meanjem), ali z razirjeno katalitsko plastjo (reaktor z lebdeim slojem). V kolonskih reaktorjih se vzpostavijo vzdolni gradienti substratov / reaktantov in produktov, prihaja pa lahko tudi do nepopolne razporeditve sestavin vtoka (t.i. channeling). Tem nezaelenim uinkom se je mogoe izogniti z visokim pretokom in uporabo tankih slojev
37
katalizatorja. Z meanjem reaktorske vsebine se koncentracijskim gradientom v raztopini sicer izognemo, vendar moramo upotevati vpliv strinih sila na odpornost in aktivnost katalizatorja. Inenirski kompromis med strnjenimi in suspendiranimi katalizatorji predstavljajo reaktorji z lebdeim katalizatorskim slojem, kjer je za pravilno obratovanje sistema potrebno zagotoviti zadostno gostoto delcev v fluidizirani plasti. Prednosti lebdeega sloja so: zanemarljiv padec talka pri prehajanju tekoine skozi sloj, majhna obraba lebdeih delcev, enakomerna disperzija vtoka in prepreeno maenje sloja.
7.4 VRSTEREAKTORJEV
V splonem izbiro ustrezne vrste reaktorja pogojujejo tevilni pogoji, od katerih je odvisen reaktorski uinek (Laskin, 1985; Moo-Young, 1988; Buchholz in sod., 2005; Najafpour, 2007; Ullmann's Biotechnology ..., 2007): koncentracija reagentov in produktov / biomase v sistemu, komercialna dostopnost substrata, stabilnost in inhibitornost produkta, kinetika kemijskih reakcij / lastnosti metabolizma, koncentracije in aktivnost katalitske komponente, meanje reaktorske vsebine, vpliv strinih sil, vzdrevanje temperature, uvajanje raznih plinov, poraba energije, arno / pretono delovanje, zahteve po sterilnosti, zahtevana stopnja nadzorovanja procesnih pogojev, zakljuni postopki (separacija produkta), ravnanje z odpadki / odpadnimi vodami.
Pri bioreaktorjih z imobilizirano biomaso se reaktorske konfiguracije in kapacitete razlikujejo e glede na lastnost same imobilizirane snovi (lastnosti katalitske komponente; lastnost imobilizacijskega matriksa; velikost, odpornost, aktivnost delcev ...) ter lastnosti transportnega upora. Veina reaktorjev lahko deluje v arnem, pol-arnem ali pretonem nainu. Industrijski reaktorji so tlane posode (veinoma do 3 atm), opremljene z lino za opazovanje procesa in sondami za spremljanje pH vrednosti, temperature in raztopljenega kisika. Ustrezno meanje reaktorske vsebine zagotavljajo meala, nameena na vrha ali dnu reaktorja. V industrijskih aplikacijah zasledimo tri osnovne oblike delovanja bioreaktorjev: (i) stacionarno delovanje brez dodatnega prezraevanja vsebine (~70 %, v proizvodnji fermentiranih ivil), (ii) stacionarno delovanje s prezraevanjem vsebine (~10 %) in (iii) prezraevanje in meanje bioreaktorske vsebine (~20 %, kjer je potrebna rast organizmov v procesu).
Bilanco zadrevanja neke komponente v reaktorskem sistemu lahko zapiemo kot:
38
hitrost hitrost hitrost hitrost hitrost akumulacije dovajanja odvajanja nastajanja porabljanja + = komponente komponente komponente komponente komponente v sistemu v sistemu iz sistema v sistemu v sistemu
[14]
Za komponente v mealnem reaktorju torej velja:
d (VC j )1 dt
= ( FC j ) 0 ( FC j )1 + (r jV )1
C i koncentracija j te komponente F pretok V prostornina sistema r hitrost reakcije

7.4.1 arnireaktorspopolnimpremeanjem(batchstirredtankreactor)
[15]
Mealni reaktor je najpogosteje uporabljen reaktor v industriji. Obratuje lahko v arnem (Qvtok=0, Qiztok=0), pol-arnem (Qvtok>0, Qiztok=0) ali v pretonem (Qvtok>0, Qiztok>0) reimu. arni reaktor s popolnim premeanjem (Slika 20) ponuja preprosto osnovno opremo in enostavno zagotavljanje aseptinosti v proizvodnjah manjega obsega. Slabosti sta zamudnost delovnih postopkov med arami (praznitev, ienje, polnitev) in zahtevno vodenje procesa med potekom, zaradi nestacionarnih pogojev in spreminjanja okolja med procesom (Pavko, 1996). Za arni mealni reaktor s konstantnim volumnom se enaba 15 poenostavi:
dC j dt
= rj
[16]
Hitrost reakcije (rj) ima pozitiven predznak v primeru nastajanja (sinteza produktov, rast celic) in je negativna v primeru izginevanja (poraba reaktantov) j-te komponente v sistemu. V procesu katalize je hitrost reakcije navadno odvisna od koliine katalizatorja (mc):
dC j dt
rm , j mc V
[17]
Z integracijo enabe 16 nato izraunamo potrebni zadrevalni as ():
Cj
dC j rj
Cj 0
[18]
Zadrevalni as je odvisen od tipa reakcije in se razlikuje za npr. reakcijo, ki poteka po Michaelis-Mentenovi krivulji, reakcijo z inhibitornimi produkti in avtokatalitsko reakcijo (Ullman's Biotechnology ..., 2007)).
39
Qvtok
vodnafaza
arnireaktor
polarnireaktor
Slika20:arniinpolarnireaktorspopolnimpremeanjem
arnem reimu, kjer med samim procesom v reaktor dodajamo substrat oz. reaktante (Slika 20), pravimo arno obratovanje z napajanjem (semi-batch reactor). Glede na volumen je ta proces nestacionaren, vendar se v procesu zaradi sprotne pretvorbe lahko vzpostavi kvazistacionarno stanje substrata/reaktantov. Ta nain obratovanja omogoa nadzor procesa s primerno izbiro pretoka in koncentracije vnosa limitnega faktorja v sistem. V bioprocesih lahko po sterilni izpraznitvi ohranimo del medija, ki ga uporabimo za ponovno napajanje. Pri neustreznih mealnih izvedbah prihaja pri visokih koncentracijah substrata/reaktantov v reaktorju do razlinih koncentracijskih predelov (Pavko, 1996).
7.4.2 Kontinuiranireaktorspopolnimpremeanjem(continiousstirredtankreactor,CSTR)
Kontinuirani mealni reaktor (Slika 21) obratuje z neprekinjenim pretokom medija skozi reaktor. Na ta nain ob konstantni prostornini reakcijske meanice in koncentracije vhodnega substrata v reaktorju doseemo stacionarno stanje.
Qvtok
vodnafaza
Qiztok
Qvtok
Qiztok Qrecikel
usedalnik
Qiztok'
CSTR CSTRzreciklom
Slika21:CSTRinkontinuiranireaktorzreciklom
Pri stalnih pogojih lahko iz enabo 15 izrazimo zadrevalni as komponente v CSTR sistemu:
C j 0 C j1 r j1
[19]
Z reciklom biomase (biomass recycle reactor) v kontinuiranem postopku gojenja doseemo vejo stabilnost sistema. V kontaktnem postopku iz reaktorskega iztoka v zunanjem usedalniku pridobivamo aktivno biomaso za povratno bogatenje reaktorske vsebine (Slika 21). Na ta nain v reaktorju nekajkrat poveamo koncentracijo aktivne biomase. V praski se postopek uporablja za ienje odpadnih voda z izredno nizkimi vsebnostmi organske snovi oz .suine.
7.4.3 Cevnireaktor(plugflowtubularreactor)
V idealnih pogojih je v reaktorju z vzdolnim tokom (Slika 22) v prenem prerezu enako stanje, kot v arnem reaktorju s popolnim premeanjem. V tem primeru, ko j-ta komponenta
40
potuje s tokom in se pri tem vzdolno ne disperzira, prav tako velja enaba 15. Takno laminarno gibanje predstavimo s prispodobo nevidnega epa, ki potuje s tokom (plug-flow). V primeru neidealnega toka fluida za opis meanja uporabljamo model disperzno-epastega toka (Levec in Pintar, 2009). Veinoma se odklon epastega toka se demonstrira glede na obliko porazdelitvene funkcije zadrevalnih asov. Pri simetrini porazdelitvi poleg epastega toka upotevamo e molekularno in turbilnetno difuzijo (eddy diffusion). Zaradi tovrstne longitudinalne disperzije je hitrost prenosa snovi mnogo veja kot ob odsotnosti tega pojava.
Qtok
Qvtok Qiztok Qkronitok
cevnireaktor sklenjencevnireaktor
Slika22:Cevniinpolcevnireaktor
Sklenjen oz. zakljuen cevni reaktor (semi-plug flow) je kombinacija cevnega in popolnoma premeanega reaktorja z neprekinjenim pretokom (Slika 22). Glede na razmerje kronega pretoka proti pretoku vtoka in iztoka doloimo prevladujoe karakteristike (oje razmerje - cevni sistem, ire razmerje - CSTR).
ire razmerje pretokov dodatno stabilizira sistem (vaja puferska kapaciteta sistema, bolja odpornost na sunkovite spremembe obremenitve). Zato se v istilnih napravah, ki obratujejo v sklenjenem reimu, uinkovitost ienja ob deevju bistveno zmanja (kraji zadrevalni as, izplakovanje biomase, slaba kinetika, slabe usedanje).
7.4.4 Reaktorjiznasutimalistrnjenimslojem(packedbedreactors,fixedbedraectors)
Veino kontinuiranih industrijskih aplikacij heterogenih katalizatorjev spada v skupino cevnih reaktorjev z nasutim ali strnjenim slojem (Slika 23). Reaktor z nasutim slojem je v celoti napolnjen s polnilom iz katalitskih zrn. V reaktorju s strnjenim slojem so zrna zdruena / vgrajena v eno ali ve preno predelnih pregrad, ki so nameene v enakomernih presledkih vzdol cevnega reaktorja. Zaradi sprotne pretvorbe reagentov, se pri prehajanju reaktorja ustvarijo koncentracijski gradienti reaktanta in produkta vzdol reaktorske strukture in znotraj samih katalitskih struktur. Reaktor s strnjenim slojem se pogosto uporablja za dvofazno katalitsko reakcijo. e je v sistemu prisotna e kapljevinasta faza, tak reaktor imenujemo kapalni reaktor (plin-trdna snov).
Kapalni reaktor (trickle bed reactor) je vefazni reaktor, v katerega uvajamo kapljevino na vrhu reaktorja, nato pa ta pronica navzdol skozi nasuti / strnjen sloj, plin, ki ga uvajamo v reaktor na spodnji strani, pa potuje navzgor (Slika 23). Takne naprave se veinoma uporabljajo v petrokemini industriji in pri ienju industrijskih odpadnih vod z oksidacijo.
41
Qtoktekoine
nasutisloj
Qvtok
Qiztok
strnjenisloj
Qtokplina
kapalnireaktor
Slika23:Primerpostavitvereaktorjevznasutiminstrnjenimslojemterkapalnegareaktorja
7.4.5 Reaktorjizvstopnimcurkomzraka(airliftpressurecyclereactors)
Reaktorji z meanjem s curkom vstopnega zraka so uporabni predvsem v aerobnih procesih z intenzivno dinamiko. Reaktorsko vsebino meamo z uvajanjem plina v tekoo fazo s pomojo dinaminih ali statinih prezraevalnikov. Statini prezraevalniki (obe, perforirane in porozne ploe, ...) zrak med uvajanjem v raztopino le razprijo, medtem ko dinamini prezraevalniki (injektorji, Venturinijeve in odbojne obe, ...) omogoajo soasno uvajanje plinaste in tekoe faze v reaktor (Berovi, 1996).
Kolona z mehurki (Slika 24) je tipini predstavnik reaktorja z meanjem s vstopnim curkom zraka. To je izredno vitek stolpni rektor z razmerjem premera proti viino od 1:3 do 1:15. Reaktorji z lebdeim slojem (fluidized bed reactors) so stolpni rektorji, v katerih vzdrujemo razirjen sloj trdnih katalitski delcev (Slika 24). S curkom vstopnega zraka in tekoine doseemo zadrevanje trdnih katalitskih delcev v lebdeem poloaju.
Qtekoina Qplin
Qtekoina Qplin
kolonazmehurki
lebdeislojbiomase
meanjezreakcijskimcurkom
Slika24:Primerdvehreaktorjevzvstopnimcurkomzraka terreaktorjazobtonorpalko(odleveprotidesni)
Ustrezno hitrost vtoka doloimo glede na gostoto tekoine in velikost delcev. Uinkovitost pretvorbe je obratno sorazmerna velikosti reaktorja, zato so laboratorijske razliice tovrstnih reaktorjev pogosto opremljene z reciklom. Visok pretok tekoine omogoa hiter transport substrata in produktov iz imobiliziranih katalitskih komponent (Berovi, 1996).
42
Reaktorji z lebdeim slojem se veinoma uporabljajo v procesih, kjer je potrebna rast celic. Aplikacije vkljuujejo rabo v istilnih postopkih odpadnih voda in v proizvodnji kisa (Najafpour, 2007).
Reaktorji z obtono rpalko (loop reactors) kot nain meanja in prezraevanja uporabljajo kroenje same procesne brozge (Slika 24). 7.4.6 Membranskireaktorji
Membranski reaktorji so reaktorji, pri katerih zadrujemo katalitsko komponento v reakcijski raztopini z membransko separacijo (Slika 25). Perfuzijski reaktorji izkoriajo membransko pregrado za pomnoevanje produkcijske biomase, medtem ko dializni rektorji odvajajo toksine produkte in nizko molekularne inhibitorje. (Vasi-Raki in Berovi, 1996).
Qiztok Qvtok
Slika25:Primerimobilizacijeaktivnebiomasezmembranskopregrado
Razvoj membran je omogoil njihovo integracijo v tevilne tipe reaktorjev, zato lahko tipe membranskih reaktorjev razdelimo glede na tevilne kriterije (Ullmann's Biotechnology ..., 2007): vrsta membrane (ultrafiltracijska, mikrofiltracijska, dializna, pervaporacijaska, ...), tevilo razlinih membran, prepustnost (za substrat / produkt), oblika membrane (ploata, cilindrina, votla, spiralna, monolitna, lamelna, ...), gonilo transporta skozi membrano (pritisk / koncentracijski gradient), tevilo tekoih faz, vrsta katalizatorja (heterogeni katalizatorji, encimi, celice), nain imobilizacije katalizatorja (v raztopini / v membrani), sterilnost. Mikroinnanoreaktorskeperspektive
7.4.7
Z razvojem novih materialov in novih ter natannejih tehnik obdelave materialov postaja v aplikacijah vedno bolj pomembna uporaba mikroreaktorjev. Katalitski mikroreaktorji se uveljavljajo v izdelavi analitskih ipov (t.i. laboratorij na ipu, lab-on-chip), zdravnikih pripomokov (npr. srnih spodbujevalcev, prenosnih dializnih modulov ipd.) in proizvodnji energentov (metan, biodiesel, ter ostalih kemikalij. e posebno zanimiva aplikacija je uporaba mikroreaktorjev za izdelavo nanodelcev (Jovanovi, 2009). Zaradi izredno majhnih razdalj, ki jih morajo premagati reaktanti v reakcijski meanici, da doseejo katalitsko aktivno mesto, ti sistemi praktino niso omejeni z uporom transporta in imajo
43
veliko razmerje med volumnom in povrino (105-106 m2/m3). Zaradi veje uinkovitosti same pretvorbe (Slika 26), dosegamo z 10-100krat manjimi reaktorskimi volumni in 5-50krat manjo maso ostale strojne opreme identine proizvodne kapacitete kot v konvencionalnih proizvodnih procesih. Omogoena sta tudi uinkovita rabe energije (enostavna namestitev toplotnih izmenjevalcev ipd.) in veinoma enostavneji separacijski postopek.
Slika26:Faktoruinkovitostigledenarazlineoblikeinvelikostikatalizatorja(poLevenspiel,1998) [Thielovmodul()jerazmerjemedosnovnohitrostjoreakcijevodsotnostitransportnegaupora inmedhitrostjodifuzijeskozidelec]
Pri prehodu na proizvodni nivo pri mikroreaktorjih ne govorimo ve o poveevanju obsega proizvodnje (upscalling), temve kar s pomnoevanjem (vzporedno/zaporedno vezavo) mikroreaktorskih modulov doseemo eleno proizvodno kapaciteto (numbering-up). Obstojea tehnologija omogoa design reaktorjev e nije od mikro-metrinih velikosti. Raziskave samo-organizirajoih nano-reaktorjev postavljajo nove izzive podroju reakcijskega inenirstva. Vriezema in sodelavci (2005) so opravili obiren pregled uporabe nano-reaktorskih struktur, v katerem so opisali tudi njihov potencial na podrojih vseh predstavljenih katalitskih sistemov.
8 ZAKLJUEK
Osnovni pregled nainov priprave heterogenih katalizatorjev, heterogenizacije homogenih katalizatorjev in imobilizacije biokatalitskih komponent razkrije nekaj osnovnih principov zadrevanja katalitske komponente v reakcijskem okolju: 1. imobilizacija brez nosilnega materiala (filtracija), 2. imobilizacija na pripravljen nosilni material, 3. imobilizacija med sintezo nosilnega materiala, 4. imobilizacija z nadzorovano sintezo katalizatorja / rastjo celic. Pri tem je uinkovitost imobilizacije odvisna od tehnike imobilizacije, vrste nosilnega materiala, koncentracije katalitske komponente in reakcijskih pogojev med imobilizacijo in aplikacijo imobiliziranega materiala (vrednost pH, temperatura, vrsta reaktorja, kinetika). Odpirajo se tevilna nova podroja imobilizacije, ki se morajo sooiti e z izgubo katalitske selektivnosti in/ali aktivnosti, preden bo moen prenos teh sistemov v prakso.
44
Uspenost aplikacije izbrane imobilizacijske tehnike je odvisna od cene in kvalitete komercialno dostopne katalitske komponente, strokov same imobilizacije, uinkovitosti sistema, investicijskega kapitala ter strokov ienja (Laskin, 1985). Kapaciteto proizvodnega sistema oz. samo reaktorsko prostornino doloimo na podlagi aktivnosti katalizatorja oz. koncentracije imobiliziranih aktivnih mest. Pomembna je tudi kvaliteta katalizatorja. Neredko v laboratoriju razpolagamo s istimi katalizatorji, ki so komercialno dostopni v raznih oblikah istosti, od esar je odvisna tudi njihova cena. Na ceno katalitske komponente vpliva e njena stabilnost med skladienjem in med delovanjem, ter sposobnost obnavljanja imobiliziranega katalizatorja. Ponovna uporaba nosilnega materiala je nujno potrebna za komercialno uspeno aplikacijo. Ta predpostavka seveda ne velja v primeru, ko nosilni material predstavljajo same celice. Stroki izvedbe imobilizacije so odvisni od potrebnega delovnega obsega in potrebnih kemikalij in so veji za bolj zapletene postopke. Katalizatorji, ki so imobilizirani s pomojo kovalentnih vezi so manj izpostavljeni izpiranju iz matriksa, vendar pa je njihova priprava draja od adsorpcijskih metod. Stroki investicije so v veji meri pogojeni s stroki izdelave reaktorske posode, opreme za avtomatizacijo procesa in nosilnega materiala za imobilizacijo. Dolgorono predstavlja znesek investicije na enoto proizvoda manji dele strokov proizvodnje. V primeru, da neka obstojea tehnologija e proizvaja podoben proizvod, so investicijski stroki e posebno pomembni. Obstojee aplikacije imobiliziranih sistemov vkljuujejo rabo v analitiki (v diagnostiki, senzorjih stanja okolja, laboratorijskih ipih ...), terapevtski medicini (senzorji za klinine tudije, dostava zdravilnih uinkovin), proizvodnji kemikalij in keminih izdelkov (naftni derivati; etanol, fruktozni sirupi, aminokisline, ocetna kislina, aspartam, ...) in v istilnih tehnologijah (proizvodnja bioplina, nitrifikacija & denitrifikacija, ienje izpunih plinov). Z vzporednim razvojem designa umetnih celic in mikro-reaktorjev ter samo-organizirajoih nano-reaktorskih struktur, lahko priakujemo, da bodo imobilizirani sistemi v prihodnosti posegli na marsikatero podroje naega ivljenja.
9 VIRI
Arechederra R., Minteer S.D. 2008. Organelle-based biofuel cells: Immobilized mitochondria on carbon paper electrodes. Electrochimica Acta, 53, 23: 6698-6703 Baricelli P., Morfes G., Pez D.E.. 2001. Synthesis, characterization and catalytic activity of the water-soluble tungsten complex [W(CO)3(MeCN)(TPPMS)2], TPPMS=(C6H5)2P(m-C6H4SO3Na)2H2O: the unprecedented transformation of the complex into a hybrid (homogeneous/heterogeneous) catalyst precursor during two-phase catalytic hydrogenation upon changes in reaction conditions. Journal of Molecular Catalysis, A: Chemical, 176, 1-2: 1-10 Barteling S.J., Vreeswijk J. 1991. Developments in foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine, 9, 2: 75-88 Bayer E.A., Belaich J.P., Shoham Y., Lamed R. 2004. The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annual Review of Microbiology; 58: 521-54. Berovi M. 1996. Bioreaktorji za aerobne procese. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 437-458. Bhardwaj R., Pan R.L., Gross E.L. 1981. Solar energy conversion by chloroplast photoelectrochemical cells. Nature 289: 396 - 398 Bond C.G. 1987. Heterogeneous Catalysis: Principles and Applications, 2nd ed. New York, Oxford University Press: 176 str. Bowker M. 2008. The Basis and Appliactions of Heterogeneous Catalysts. Reprint. Oxford, Oxford University Press: 92 str.
45
Breaker R.R. 2002. Engineered allosteric ribozymes as biosensor components. Current Opinion in Biotechnology, 13, 1: 31-39 Bruun L., Koch C., Jakobsen M.H., Aamand J. 2000. New monoclonal antibody for the sensitive detection of hydroxy-s-triazines in water by enzyme-linked immunosorbent assay. Analytica Chimica Acta, 423, 2: 205-213 Bucke C. 1983. Immobilized Cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B 300: 369389 Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U.T. 2005. Biocatalysts and Enzyme Technology. Weinheim, Willey-VCH: 447 str. Chakrabarty D.K., Viswanathan B. 2009. Heterogeneous Catalysis. Kent, New Age Science, 315 str. Chen Y., Kang E.T., Neoh K.G., Tan K.L. 2000. Covalent immobilization of invertase onto the surface-modified polyaniline from graft copolymerization with acrylic acid. European Polymer Journal, 36, 10: 2095-2103 Chiola V., Ritsko J.E., Venderpool C.D. 1971. Processes for producing low-bulk density silica. US patent 3556725 Corma A. 1995. Inorganic Solid Acids and Their Use in Acid-Catalyzed Hydrocarbon Reactions. Chemical Reviews, 95, 3: 559-614 Corma A. 1997. From Microporous to Mesoporous Molecular Sieve Materials and Their Use in Catalysis. Chemical Raviews, 97, 6: 23732420 Corma A., Garcia H. 2004. Supramolecular Host-Guest Systems in Zeolites Prepared by Ship-in-a-Bottle Synthesis. European Journal of Inorganic Chemistry, 2004, 6: 1143-1164 Cubillos Lobo J.A. 2005. Heterogeneous asymmetric epoxidation of cis-ethyl cinnamte over Jacobsens catalyst immobilized in inorganic porous materials. Doctoral dissertation. Aachen, Fakultt fr Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-Westflischen Technischen Hochschule Aachen, 144 str. De Vos D.E., Dams M., Sels B.F., Jacobs P.A. 2002. Ordered Mesoporous and Microporous Molecular Sieves Functionalized with Transition Metal Complexes as Catalysts for Selective Organic Transformations. Chemical Reviews, 102, 10: 36153640 Deinhardt F., Jilg W. 1986 Vaccines against hepatitis. Annales de l'Institut Pasteur. Virologie, 137: 79-95 Demain A.L., Vaishnav P. 2009. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 27, 3: 297-306 Fett W.F., Cooke P.H. 2005. A survey of native microbial aggregates on alfalfa,clover and mung bean sprout cotyledons for thickness as determined by confocal scanning laser microscopy, Food Microbiology, 22, 2-3: 253-259 Fernndez-Lafuente R., Rodrguez V., Mateo C., Fernndez-Lafuente G., Arminsen P., Sabuquillo P., Guisn J.M. 1999. Stabilization of enzymes (D-amino acid oxidase) against hydrogen peroxide via immobilization and postimmobilization techniques. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 7: 173179 Filoche S., Wong L., Sissons C.H. 2010. Oral Biofilms: Emerging Concepts in Microbial Ecology. Journal of Dental Research; 89: 8-18 Garcia-Ochoa F.F., Gomez E. 2004. Theoretical prediction of gasliquid mass transfer coefficient, specific area and hold-up in sparged stirred tanks. Chemical Engineering Science, 59: 2489-2501 Gordon C.M. 2001. New developments in catalysis using ionic liquids. Applied Catalysis A: General, 222, 1-2: 101117 Hagen J. 2006. Industrial catalysis : A practical approach. 2nd, completely revised and extended ed. Weinheim : Wiley-VCH: 507 str. Hanson C.V., Nishiyama Y., Paul S. 2005. Catalytic antibodies and their applications. Current Opinion in Biotechnology, 16, 6: 631-636 van Heerbeek R. Kamer P.C.J., van Leeuwen P.W.N.M., Reek J.N.H. 2002. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews, 102, 10: 37173756 Ho F., Li S.Y., Lin S.C., Hsu W.H. 2004. Integrated enzyme purification and immobilization processes with immobilized metal affinity adsorbents. Process Biochemistry, 39, 11: 1573-1581 Hoffmann R.1998. Dbereiner's Lighter. American Scientist, 86, 4: 326
46
Horvth I.T., Rbai J. 1994. Facile Catalyst Separation Without Water: Fluorous Biphase Hydroformylation of Olefins. Science, 266, 5182: 72 75 Hu Y. Du Y., Yang J., Tang Y. Li J. Wang X. 2007. Self-aggregation and antibacterial activity of N-acylated chitosan. Polymer, 48, 11: 3098-3106 Hua L., Sun Z.H., Zheng P., Xu Y. Biocatalytic resolution of -pantolactone by glutaraldehyde cross-linked cells of Fusarium moniliforme CGMCC 0536. Enzyme and Microbial Technology, 35, 2-3: 161-166 Jain K.K. 2006. Nanoparticles as targeting ligands. Trends in Biotechnology, 24, 4:143-145 Jschke A. 2001. Artificial ribozymes and deoxyribozymes. Current Opinion in Structural Biology, 11, 3: 321-326 JCBN. Enzyme Nomenclature. Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). London, School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London (01. jan. 2010). http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (12. jan. 2010). Jovanovi G. 2009. Microtecnology One likely future of chemical processes. Predavanje v okviru doktorskega tudija Kemijska znanost, 16.12.2009, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo. Kirstein D. 1996. Chelate Mediated Immobilization Of Proteins. Advances in Molecular and Cell Biology, 15, 1: 247-256 Klemet I., Ltjens H., Knochel P. 1997. Transition Metal Catalyzed Oxidations in Perfluorinated Solvents. Angewandte Chemie International Edition in English, 36, 13: 1454-1456 Koch D., Leitner W. 1998. Rhodium-Catalyzed Hydroformylation in Supercritical Carbon Dioxide. Journal of the American Chemical Society, 120, 51: 13398-13404 Kwan E.E. 2005. Factors affecting the relative efficiency of general acid catalysis. Journal of Chemical Education, 82, 7:1026-1030 Laskin A.I. 1985. Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology. Menlo Park, The Benjamin/Cummings Publishing Company: 317 str. Lee C.H., Lin T.S., Mou C.Y. 2009. Mesoporous materials for encapsulating enzymes. Nano Today, 4: 165-179 Levec J., Pintar A. 2008. Analiza in nartovanje kemijskih reaktorjev. Uvod v reakcijsko inenirstvo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo. 20 str. Levec J., Pintar A. 2009. Analiza in nartovanje kemijskih reaktorjev. Reaktorji z neidealnim tokom fluida. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo. 43 str. Levenspiel O. 1998. Chemical Reaction Engineering, 3rd Edition. , Willey-VCH: 688 str. Lewis C.A.Jr.; Wolfenden R. 2008. Uroporphyrinogen decarboxylation as a benchmark for the catalytic proficiency of enzymes. PNAS 105/45: 17328-17333 Lilley D.M.J. 2005. Structure, folding and mechanisms of ribozymes. Current Opinion in Structural Biology, 15, 3: 313-323 Linder M., Teeri T.T. 1997. The roles and function of cellulose-binding domains. Journal of Biotechnology, 57, 1-3: 15-28 Marinek-Logar R. 1999. Imobilizacija v anaerobnih istilnih tehnologijah (tudijsko gradivo za predmet Varstvo okolja v ivinoreji). Domale, Biotehnika fakulteta, Oddelek za zootehniko, Intitut za mikrobiologijo in mikrobno biotehnologijo: 18 str. McGovern P.E. 2004. Fermented beverages of pre- and proto-historic China. PNAS 101/51: 17593-17598 McGovern P.E. 2009. Homo Imbibens. V: Uncorking The Past. The quest for Wine, Beer, and other Alcoholic Beverages- McGovern. P.E. Berkeley, University of California Press: 1-27 Mehnert C.P. 2005. Supported Ionic Liquid Catalysis. Chemistry - A European Journal, 11, 1: 50-56 Michaelis L., Menten M.L. 1913. Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49: 333 Mosbach, K.; Mosbach, R.. 1996. Entrapment of Enzymes and Microorganisms in Synthetic Cross-linked Polymers and their Application in Column Techniques. Acta Chemica Scandinavica, 20: 2807-2810 Moo-Young M. 1988. Bioreactor immobilized enzymes and cells: fundamentals and applications. Essex, Elsevier Applied Science Publishers: 327 str.
47
Mouret G., Mozet K., Muhr H., Plasari E., Martin M. 2009. Production of Al2O3TiO2 catalyst supports with controlled properties using a co-precipitation process. Powder Technology, 190, 1-2: 84-88 Murzin D.Y. 2005. On surface heterogeneity and catalytic kinetics. Industrial Engineering and Chemistry Research, 44, 6: 1688-1697 Mller J., Niemeyer C.M. 2008. DNA-directed assembly of artificial multienzyme complexes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 377, 1: 62-67 Murua A., Portero A., Orive G., Hernndez R.M., de Castro M., Pedraz J.L. 2008. Cell microencapsulation technology: Towards clinical application. Journal of Controlled Release, 132, 2: 76-83 Najafpour, G. D. 2007- Biochemical engineering and biotechnology, 1st ed. Amsterdam, Elsevier, 421 str. Nekrep F.V. 1996. Bakterije in Arheje. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 15-49 Nelson J.M., Griffin E.G. 1916. Adsorption of Invertase. Journal of the American Chemical Society, 39: 1109-1115 Noritomi H., Sasanuma A., Kato S., Nagahama K. 2007. Catalytic properties of cross-linked enzyme crystals in organic media, Biochemical Engineering Journal, 33, 3: 228-231 Olivier-Bourbigou H., Magna L., Morvan D. 2010. Ionic liquids and catalysis: Recent progress from knowledge to applications. Applied Catalysis A: General, 373, 1-2: 1-56 Palmer, T., Bonner, P.L.R. 2007. Enzymes : biochemistry, biotechnology and clinical chemistry, 2nd ed. Chichester : Horwood: 416 str. Pavko A. 1996. Masne balance in naini vodenja bioprocesov. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 425-435. Pechini M.P. 1967. Method of preparing lead and alkaline earth titanates and niobates and coating method using the same to form a capacitor. US patent 3330697. Peters J.M., Franke W.W., Kleinschmidt J.A. 1994. "Distinct 19 S and 20 S subcomplexes of the 26 S proteasome and their distribution in the nucleus and the cytoplasm". Journal of Biological Chemistry, 269, 10: 7709-7718 Raney M. 1940. Catalysts From Alloys. Industrial and Engineering Chemistry, 32, 9: 1199-1203 Rios G.M., Belleville M.P., Paolucci D., Sanchez J. 2004. Progress in enzymatic membrane reactors a review. Journal of Membrane Science, 242, 1-2: 189-196 Rodnina M.V. 2007. Beringer M., Wintermeyer W. How ribosomes make peptide bonds. Trends in Biochemical Sciences, 32, 1: 20-26 Rothenberg G. 2008. Catalysis. Concepts and Green Applications. Weinheim, Willey-VCH: 279 str. Santen R.A., Van Leuwen P.W.N.M., Moulijn J.A. Averill B.A. 2000. Catalysis: An Integrated Approach Series. 2nd ed. Amsterdam, Elsevier Science B.V.: 582 str. Scott C.D. 1987. Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme and Microbial Technology, 9, 2: 66-72 Sellin M.F., Webb P.B., Cole-Hamilton D.J. 2001. Continuous flow homogeneous catalysis: hydroformylation of alkenes in supercritical fluidionic liquid biphasic mixtures. Chemical Communications: 781-782 Serralheiro M. L. M., Prazeres D. M. F., Cabral J. M. S. 1999. Continuous production and simultaneous precipitation of a dipeptide in a reversed micellar membrane reactor. Enzyme and Microbial Technology, 24, 8-9: 507-513 Takimoto C.H., Calvo E. 2008. Principles of Oncologic Pharmacotherapy. V: Pazdur R., Wagman L.D., Camphausen K.A., Hoskins W.J. Cancer Management: A Multidisciplinary Approach, 11. ed., CMP Healthcare Media LLC: Chapter 3: 1-9 The Nobel Prize in Chemistry 1989. Stockholm, The Nobel Foundation. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1989/ (20. dec. 2009). Ullmanns Biotechnology and Biochemical Engineering. Volume 1 & 2. 2007. Weinheim, Willey-VCH: 855 str. Vasi-Raki D., Berovi M. 1996. Integrirani bioreaktorji. V: Biotehnologija. Osnovna znanja. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 551-567. Vriezema D.M., Comellas Aragone`s M., Elemans J.A.A.W., Cornelissen J.J.L.M., Rowan A.E., Nolte R.J.M. Selfassembled nanoreactors. Chemical Reviews, 105, 4: 14451490 Walker J. M., Rapley R. 2009. Molecular Biology and Biotechnology. 5th ed. Cambridge, RSC: 604 str.
48
Welton T. 2004. Ionic liquids in catalysis. Coordination Chemistry Reviews 248 (2004) 24592477 Wood B.J.B. 1998. Microbiology of Fermented Foods. Volume 1. 2nd ed. London, Thomson Science: 440 str. Zheng X., Jiang J., Liu X., Jin Z. 1998. Thermoregulated phase transfer ligands and catalysis. III. Aqueous/organic two-phase hydroformylation of higher olefins by thermoregulated phase-transfer catalysis. Catalysis Today, 44: 175-182 Zhu H., Ding Y., Yin H., Yan L., Xiong J., Lu Y., Luo H., Lin L. 2003. Supported rhodium and supported aqueousphase catalyst, and supported rhodium catalyst modified with water-soluble TPPTS ligands. Applied Catalysis, A: General, 245: 111-117 Yu X., Acehan D., Mntret J.F., Booth C.R., Ludtke S.J., Riedl S.J., Shi Y., Wang X., Akey C.W. 2005. A Structure of the Human Apoptosome at 12.8 Resolution Provides Insights into This Cell Death Platform, Structure, 13, 11:1725-1735

OsojnikG 2009 Imobilizacija

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

OsojnikG 2009 Imobilizacija

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

Imobilizacija

difuzija vplinskifazi povrinska difuzija disociativna adsorpcija

obarjanje (oksidiAl2O3,SiO2) hidrotermalnasinteza (zeoliti)

solgelsinteza (meanioksidi,nosilci) plamenskahidroliza (meanioksidi,nosilci)

natrijev silikat/aluminat H2SO4 ablona

filtriranje spiranje avtoklav 100150C gel suenje kalciniranje

CH3Br oksidativna adicija reduktivna eliminacija

2arilpropionska kislina benzilklorid

C13C20 aldehidi alilalkohol

4hidroksi butanal diacetoksibuten

izocianati Oksidativna karbonilacija fenol

izocianati Amidna karbonilacija

produkti reaktanti katalizator

O2 produkti katalizator reaktanti

1.cifra:Gledenareakcijo,kijoencimkatalizira: 1.oksidoreduktaze 2.transferaze 3.hidrolaze 4.liaze 5.izomeraze 6.ligaze zdruevanjemolekulskovalentnoCC,CN,CO,CS vezjoobporabiATP.

redoksreakcije, prenosskupinmedmolekulami, prenosskupinnaH2O(hidroliza), odstranjevanjeskupin, prenosskupinznotrajmolekule,

2.cifra:Vezpodvrenahidrolizi: 1ester, 2glikozidna, 3peptid(CONH), 4nepeptidneCNvezi.

2.cifra:Gledenaskupinovprenosu: 11Cskupina, 2aldehidialiketoni(>C=O), 3acil(COR), 4glikozil, 5fosfat.

2.cifra:Gledenadonorvodika/elektronov: 1alkoholi(>CHOH), 2aldehidialiketoni(>C=O), 3CHCH, 4primarniamini(>CHNH2ali>CHNH3), 5sekundarniamin(>CHNH), 6NADHaliNADPH(samozdrugimredoxakceptorjem). 3.cifra:Veinomaopisujenadaljnjiznaajskupinev prenosu.

3.cifra:Gledenaakceptorvodika/elektronov: 1NAD+aliNADP+, 2Fe3+, 3O2, 99drugakceptor.

5.Izomeraze 2.cifra:Vrstaizomeracije: 1racemizacijaaliepimerizacija, 2cistransizomerizacija, 3redoxreakcijeznotrajmolekule, 4prenosskupinznotrajmolekule.

2.cifra:Razcepljenavez: 1CC, 2CO, 3CN, 4CS.

2.cifra:Nastalavez: 1CO, 2CS, 3CN, 4CC.

3.cifra:Odcepljenaskupina: 1karboksilna, 2aldehidna(CH=O), 3ketokislinska(CO.CO2).

ultrafiltracijske membrane kapilarne membrane

preno povezovanje ko polimerizacija vezavana nosilec

mikro enkapsulacija ujetjev reverznemicele

HNH NC NH2 N NH SS N H CH3S CH2OH

imidazolnidelfunkcionalneskupine Lhistidina disulfidnaskupinaLcisteina imidazolnidelfunkcionalneskupine Ltriptofana tioeterskaskupinaLmetionina hidroksilnaskupinaLserinainL treonina

H20 nepolarnirep polarnaglava nepolarnotopilo Slika15:Strukturareverznemicelevnepolarnemtopilu

Stehiometrija doloa razmerje hitrosti akumulacij posameznih komponent:

1 dn A 1 dnB 1 dnR 1 dnS = = = a dt b dt r dt s dt

V zaprtem sistemu s konstantnim tlakom in temperaturo, bo hitrost reakcije definirana kot:

n j mnoina molov j te komponente v j stehiometrijski koeficient j te komponente V prostornina sistema t as

Pri teh pogojih velja:

K R adsorpcijska ravnotena konst. reagenta K P adsorpcijska ravnotena konst. produkta

e je koncentracija reagenta v raztopini RB, potem velja: hitrost = kS RA (k S / k SL ) + 1

celokupna hitrost reakcije hitrost ekvivalentne reakcije v raztopini

Bilanco zadrevanja neke komponente v reaktorskem sistemu lahko zapiemo kot:

Za komponente v mealnem reaktorju torej velja:

C i koncentracija j te komponente F pretok V prostornina sistema r hitrost reakcije

Z integracijo enabe 16 nato izraunamo potrebni zadrevalni as ():

Qvtok Qiztok Qkronitok

Slika26:Faktoruinkovitostigledenarazlineoblikeinvelikostikatalizatorja(poLevenspiel,1998) [Thielovmodul()jerazmerjemedosnovnohitrostjoreakcijevodsotnostitransportnegaupora inmedhitrostjodifuzijeskozidelec]

Вам также может понравиться