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EXTRACCIN DE RNA Mantener siempre todo en hielo, usar guantes y material preparado especialmente para RNA. 1.

- Inocular precultivos de las cepas toda la noche. 2.- Inocular 25mL de medio fresco con estos precultivos para que quede a D.O600 = 0,18 y crezca hasta D.O600 0,6. 3.- Centrifugar a 4C, 5 minutos a 3500rpm, los 100mL del cultivo en cornings de 50mL. 4.- Lavar con H2O de RNA. (unos 10mL) 5.- Congelar el pellet a -80C toda la noche. (opcional) 6.- Se descongelan las muestras en hielo. 7.- Preparar eppendorfs de 2mL con perlas de vidrio. 8.- Poner las celulas y aadir 500 L de LETS y 500 L de fenol para RNA. 9.- Romper las clulas en el aparato fast-prep, 6 agitaciones de 30 segundos con periodos de 30 segundos en hielo entre los distintos pases. 10.- Centrifugar a 4C durante 5 minutos a 13000rpm. 11.- Recoger el sobrenadante en eppendorfs de RNA y extraer con fenol-cloroformo de RNA. Vortex. 12.- Centrifugar a 4C durante 5 min a 13000rpm. 13.- Recoger el sobrenadante y extraer con cloroformo.Vortex. 14.- Centrifugar a 4C durante 5 min a 13000rpm. 15.- Recoger el sobrenadante y precipitar con 1volumen de LiCl 5M. 16.- Guardar a 20C durante 3 horas (preferentemente toda la noche). 17.- Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 13000rpm. 18.- Lavar con EtOH al 70%. (unos 500 L) 19.- Dejar secar el pellet. 20.- Resuspender en 500 L de H2O de RNA. 21.- Precipitar con 1/10 del volumen AcNa 3M de RNA y 2 volumenes de EtOH absoluto. 22.- Guardar a 20C hasta su utilizacin (toda la noche). 23.- Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 13000rpm. 24.- Lavar con EtOH al 70%. 25.- Secar 1-2 minutos en speed-back. 26.- Resuspender en un volumen pequeo i cuantificar una dilucin 1/50 en el espectrofotmetro. LETS: LiCl 0,1M; EDTA 10mM; SDS 0,2%, Tris.HCl 10mM pH=7,4.