CAPTULO 3

MTODOS GENERALES

Captulo 3 Mtodos Generales

En este captulo se detallan slo aquellos mtodos utilizados en comn en los distintos captulos de la Tesis.

3.1. DETERMINACIONES SOBRE LA PULPA 3.1.1. Lavado de las pulpas 3.1.1.1. Intercambio de la pulpa a su forma cida Para remover los iones metlicos y para que todos los grupos cidos se encuentren de la misma manera (en su forma cida), la pulpa se lav dos veces consecutivas con HCl pH=2,0 durante 45 min al 4% de consistencia y luego con agua destilada hasta pH 4,5-5,0 (similar a la metodologa empleada por Fors 2000: duracin de los lavados de 30 min). Finalmente la pulpa se espes por centrifugacin, se dispers y se almacen a 4C hasta su uso. Cuando se trabaj con pulpa con finos, entre los lavados se filtr por un Bchner conteniendo un tejido textil y recirculando el filtrado por la mata de fibras para retener los finos.

3.1.1.2. Intercambio de la pulpa a su forma sodio Partiendo de la pulpa en su forma cida, se coloc en agua destilada al 2 % de consistencia, se neutraliz la suspensin con solucin diluida de NaOH (1 g/L) y se dej bajo esas condiciones durante 10 min. En ese tiempo el pH disminuye debido a que se produce el intercambio de iones Na+ por iones H+ de los grupos cidos carboxlicos presentes en la pulpa. Se ajust nuevamente el pH con NaOH y se dej otros 10 min. Se filtr la pulpa en bolsa de tela y luego se espes por centrifugacin. Cuando se trabaj con pulpa con finos, se recircul el filtrado por la mata de fibras para retener los finos.

3.1.1.3. Intercambio de la pulpa a su forma calcio

Partiendo de la pulpa en su forma sodio sin filtrar y estimando que la cantidad de grupos cidos presentes en la pulpa es aproximadamente 80 eq/g pulpa seca, se agreg CaCl2 5 g/L en un 50% en exceso respecto a la cantidad estequiomtrica y se dej bajo esas condiciones durante

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10 min. Finalmente se ajust el pH a 7,0 con una solucin de Ca(OH)2 1,8 g/L filtrada en papel de filtro y se dej en esas condiciones durante 15 min. Las condiciones finales de la suspensin fueron: Conductividad 250-270 S/cm y pH 7,0. Finalmente se centrifug en bolsa de tela. Cuando se trabaj con pulpa con finos, se recircul el filtrado por la mata de fibras para retener los finos.

3.1.2. Grupos cidos totales por titulacin conductimtrica Los grupos cidos totales se determinaron a travs de la titulacin conductimtrica propuesta por Lloyd y Horne (1993). Sobre la base de la tcnica desarrollada inicialmente por Katz y col. (1984), estos autores propusieron la sustitucin del titulante NaOH por NaHCO3. Se pesaron aproximadamente 3g de pulpa seca y se le realiz un lavado cido de acuerdo a la metodologa explicada en la seccin 3.1.1 de este captulo. De esta manera los grupos cidos pasan a su forma cida. Luego se lav la pulpa con agua destilada hasta que la conductividad en la solucin fue menor a 5 S/cm. Se coloc la pulpa en un vaso cerrado (Figura 3.1) conteniendo 450 mL de NaCl 10-3N. La conductividad inicial de 110 S/cm aument en ese momento debido a que se produce un intercambio entre los iones sodio de la solucin y una fraccin de los protones presentes en los cidos carboxlicos de la pulpa (Figura 3.2). Como la conductividad de los protones es mayor que la de los iones sodio, la conductividad de la suspensin aumenta. Luego, bajo continuo mezclado por agitacin magntica y paso de nitrgeno, se titul con NaHCO3 0,1N. Cada 5 min, se agregaron desde la microbureta 0,2 mL de titulante. Se detuvo la agitacin antes de agregar los siguientes 0,2 mL de titulante y se midi la conductividad (ajustada automticamente por temperatura) utilizando un termo/conductmetro ALTRONIX CTX-1. Finalizada la titulacin, se filtr la pulpa en filtro de vidrio poroso N2 y se lav dentro del mismo filtro con agua destilada hasta conductividad en el filtrado menor a 10 S/cm. Se determin finalmente el peso seco de la pulpa.

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NaHCO3

N2

110 S; T=25C

Conductmetro Pulpa Agitador magntico

Figura 3.1. Dispositivo utilizado para llevar a cabo la titulacin conductimtrica. La pulpa se agita continuamente y se agrega cada 5 min 0,2 mL del titulante previa lectura de la conductividad.

La Figura 3.2 muestra una curva de titulacin tpica. El punto de interseccin entre las lneas A y B corresponde a los mL de titulante utilizados para neutralizar los grupos cidos carboxlicos de la pulpa. El uso de NaHCO3 en reemplazo del NaOH evita la cuantificacin errnea de los grupos fenlicos de la lignina como grupos cidos (Lloyd y Horne 1993). Cuando se utiliza NaOH como titulante, cerca del punto de equivalencia la solucin alcanza un pH cercano a 11,0. A ese pH los grupos fenlicos de la lignina se ionizan parcialmente y por lo tanto son cuantificados errneamente como grupos cidos.

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200,0

Conductividad S /cm

180,0

ml de titulante en exceso

160,0
Meseta de conductividad donde no existen practicamente protones

140,0

120,0

A
100,0
ml de titulante gastados para neutralizar los grupos cidos

80,0 0 1 2 3 4 5 6 7

mL NaHCO3 0,1N agregados

Figura 3.2. Curva de titulacin conductimtrica tpica de pulpas kraft. La interseccin de las lneas A y B corresponde a los mL de titulante utilizados para neutralizar los grupos cidos carboxlicos

3.1.3. Grupos cidos superficiales por adsorcin polielectroltica Para esta determinacin se utiliz el mtodo de adsorcin de polielectrolitos puesto a punto en el Captulo 4. En forma breve: Muestras de 0,5 g de pulpa, llevadas previamente a su forma sodio se agregaron a soluciones del polielectrolito catinico (cloruro de polidimetildialilamonio, pDMDAAC de masa molecular mayor de Mw: 105) a distintas concentraciones, en NaCl 0,01 N. Las mezclas fueron agitadas magnticamente durante 30 min a 25 C para alcanzar el equilibrio de adsorcin. Luego se determin en el filtrado la concentracin del polielectrolito no adsorbido mediante la titulacin coloidal usando polivinil sulfato de potasio (PVSK) y o-toluidina como indicador. El contenido de grupos cidos superficiales se determin a partir de grficas de isotermas de adsorcin (cantidad adsorbida versus cantidad de pDMDAAC en equilibrio en la solucin) ajustadas con la ecuacin 4.20 propuesta en el Captulo 4.

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3.1.4. Extractivos De acuerdo a las Normas Tappi T204 cm-97 y Tappi 264 cm-97, se determin la cantidad de material no voltil soluble presente en la siguiente secuencia de solventes: 1) ter, 2) diclorometano, 3) etanol 95%: tolueno (1:2 v/v), 4) etanol 95% y 5) agua destilada en ebullicin. Se ha probado que la mezcla etanol/tolueno extrae el mismo tipo de material que la mezcla etanol/benceno (Tappi T264 cm-97). Las extracciones se realizaron en extractor Soxlhet sobre 2,0 g de pulpa y durante 4h, excepto con el agua destilada que se dej en reflujo durante una hora solamente para evitar degradacin de carbohidratos. Finalizadas las extracciones se evapor el solvente en un rotavapor bajo vaco a 45C, se sec en estufa a 100-105C y se pes el residuo seco. Se calcul el porcentaje de cada fraccin en relacin a la masa original de pulpa seca. La suma de todas estas fracciones corresponde al contenido de extractivos totales. Para la determinacin de holocelulosa, lignina Klason; lignina soluble y para la aislacin de la lignina se utiliz esta pulpa libre de extractivos.

3.1.5. Holocelulosa Se determin el contenido de holocelulosa utilizando el mtodo propuesto por Guerra (2002). Se coloc en un bao termostatizado a 75C y bajo continua agitacin, un Erlenmeyer conteniendo 2 g de pulpa libre de extractivos y 64 mL de agua destilada. Cada media hora se agregaron 0,2 mL cido actico glacial y 0,6 mL de clorito de sodio 40% (p/v). Esta operacin se repiti cuatro veces (total: 2 h). A pesar de que el clorito de sodio es poco reactivo, in situ se forman compuestos ms agresivos como cido hipocloroso y dixido de cloro (Vuorinen y Aln 1999). Luego la holocelulosa resultante se filtr, se lav con agua, luego con acetona y finalmente se sec en estufa a 50C. Se determin el peso seco de la holocelulosa y se determin su contenido en relacin a la masa de pulpa original. Una fraccin de esta holocelulosa se utiliz para determinar el contenido de lignina residual utilizando el mtodo de lignina Klason.

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El contenido de holocelulosa se corrigi por extractivos y por lignina residual para expresar el contenido de holocelulosa como porcentaje de holocelulosa en la pulpa original.

3.1.6. Lignina Klason y lignina soluble. Se aplic el mtodo de lignina Klason propuesto por Gomide y Demuner (1986), el cual es ms sencillo y ms rpido que el mtodo Klason tradicional (Norma Tappi 222-om 02). A 300 mg de pulpa libre de extractivos se le agreg 3 mL de cido sulfrico al 72% (p/p) para hidrolizar los carbohidratos. Para ello, se coloc en un bao termostatizado a 20C durante 1h y se agit continuamente. Luego se diluy, reduciendo la concentracin de cido sulfrico hasta 3 % (p/p). Esta solucin se coloc en autoclave a 118C durante 1h en un recipiente cerrado no hermticamente. El residuo slido se filtr en filtro de vidrio N 2 de peso conocido y se sec en estufa hasta pesada constante. En el filtrado qued la lignina soluble y los azcares. Para determinar el contenido de lignina soluble, se utiliz la tcnica TAPPI Useful Method UM-250 (1985) citada y descripta por Dence (1992). El filtrado anterior, conteniendo la lignina soluble en medio cido, se pas por un filtro de nylon de 0,45 m de tamao de poro y se midi la absorbancia de la solucin a 205 nm, tomando como blanco una solucin de 3% (p/p) de H2SO4. Luego, considerando la absortividad de la lignina de 110 L g-1 cm-1 se determin el contenido de lignina soluble. En el filtrado como productos de degradacin de los carbohidratos se encuentra presente furfural y el hidroximetilfurfural que absorben fuertemente a 280 nm. Sin embargo, a 205 nm esta interferencia es despreciable (Dence 1992). La lignina insoluble y soluble se corrigieron por extractivos para expresar estos contenidos como porcentajes de lignina en la pulpa original.

3.1.7. Aislacin y caracterizacin de la lignina. La aislacin de lignina se realiz sobre la pulpa libre de extractivos. Las muestras de pulpa se colocaron en un extractor Soxhlet y la lignina se extrajo durante 6 h utilizando una solucin 9:1

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de dioxano:HCl 2 M. Luego se removi el solvente en un rotavapor, se suspendi la lignina en agua y se neutraliz la solucin con bicarbonato de sodio. La lignina aislada fue filtrada, nuevamente suspendida en agua y liofilizada. Se determin el rendimiento de este proceso de aislacin.

3.1.7.1. Grupos hidroxilos fenlicos El porcentaje de hidroxilos fenlicos se determin utilizando dos mtodos: 1) el mtodo de Wexler (1964) (utilizado recientemente por Guerra 2002), 2) el mtodo de Goldschmid (1954). En ambos mtodos, la determinacin de los hidroxilos fenlicos se realiz sobre la base de las absortividades medias de compuestos modelos de lignina. # Mtodo Wexler El espectro UV diferencial se obtuvo de sustraer el espectro de la lignina en medio alcalino respecto de su espectro en medio cido. Para la obtencin del espectro en medio bsico se prepar una solucin de lignina (0,5 mg /mL de dioxano 96%) y se ajust el pH a 13 con NaOH 1,0 N. Para la obtencin del espectro en medio cido se prepar una solucin de lignina a la misma concentracin pero a pH 1,0 utilizando HCl 1,0 N. El 250 se obtuvo de trazar una lnea recta desde el mximo de absorbancia a 250 nm hasta la lnea de base. La lnea de base se obtuvo de trazar una recta entre los valles a 229 nm y a 278 nm aproximadamente como se muestra en la Figura 3.3. El porcentaje de hidroxilos fenlicos se obtuvo utilizando la ecuacin (3.1):

% OH fenli cos =
donde,

250 0,192 C

(3.1)

250 = Absorbancia de la solucin alcalina luego de sustraer la absorbancia de la solucin cida tomando como lnea de base la lnea recta entre los valles a 229 y a 278 nm. C= concentracin de la lignina en g/L. 0,192 = relacin entre el porcentaje de hidroxilos fenlicos y las absortividades de compuestos modelos a alrededor de 250 nm (Wexler 1964) .

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0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8

250 nm

Absorbancia

270

320

370

Longitud de onda (nm)

Figura 3.3. Ejemplo de un espectro UV diferencial de ligninas aisladas de P. taeda (extrado de Guerra 2002)

# Mtodo Goldschmid El contenido de hidroxilos fenlicos se determin a partir del mismo espectro UV diferencial obtenido utilizando el mtodo Wexler, excepto que se midi la absorbancia a 300 nm (Figura 3.4) y se utiliz la ecuacin 3.2.

0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8

300 nm

Absorbancia

270

320

370

Longitud de onda (nm)

Figura 3.4. Ejemplo de un espectro UV diferencial de ligninas aisladas de P. taeda (extrado de Guerra 2002) donde se muestra cmo se determin el contenido de hidroxilos fenlicos midiendo a 300 nm

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La ecuacin (3.2) es la siguiente:

% OH fenli cos =

300 0,414 C

(3.2)

donde, 300 = Absorbancia de la solucin alcalina luego de sustraer la absorbancia de la solucin cida a 300 nm.
C= concentracin de la lignina en g/L. 0,414 = relacin entre el porcentaje de hidroxilos fenlicos y la absortividades de compuestos modelos a alrededor de 300 nm (Goldshmid 1954)

3.1.7.2. Grupos cidos en la lignina El contenido de grupos cidos en la lignina aislada se determin utilizando el mtodo propuesto por Zakis (1994). A 40-60 mg de la lignina aislada se le agregaron 5 mL de LiOH 0,1 N valorado y en exceso y 2 mL de etanol 96 %, ambos medidos con micropipeta. Se agit y se coloc en un bao a 85C durante 3 min. Luego se agreg 1 mL de BaCl2 10% y se dej enfriar 15 min (se produce un intercambio de los iones litio por los iones bario). Las sales de Ba-lignina precipitan. La disminucin de la concentracin de iones hidroxilos del LiOH es equivalente al nmero de grupos cidos que se determinan por titulacin. La suspensin obtenida se diluye con agua destilada a un volumen total de 25 mL, se agita y centrifuga 2-3 min. Con volpipeta se toman 20 mL del sobrenadante y se agregan 5 mL de HCl 0,1 N y gotas de indicador rojo de metilo. El exceso de cido se titula con LiOH 0,1 N y el porcentaje de grupos cidos se determina usando la ecuacin (3.3) propuesta por Zakis, 1994.

COOH % =
donde,

(b a ) N 212.5 W

(3.3)

a : mL de LiOH utilizados para titular la muestra b : mL de LiOH utilizados para titular el blanco
N: la normalidad de la solucin de LiOH W: peso de la muestra seca de lignina, mg

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3.1.7.3. Grupos carbonilos Se determinaron segn Zakis (1994). En un tubo se colocan 80 mg de lignina aislada, 2 mL de dimetilsulfxido (DMSO) y 5 mL de una mezcla de 0,2 M de NH2OHHCl y 0,08 M de trietanolamina para producir una reaccin de oximacin (Figura 3.5). Cuando reacciona la NH2OHHCl con los grupos carbonilos, se libera una cantidad de HCl equivalente a los grupos carbonilos que reacciona con la trietanolamina.

R C R1
O +

R NH2OH HCl
.

NOH

HCl + H2O

R1 Figura 3.5. Reaccin de oximacin.

Los tubos se colocaron en un bao a 80C por 2 h, y luego se trasvas cuantitativamente a un Erlenmeyer con ayuda de un mnimo de agua destilada. Luego, el exceso de trietanolamina se titul con HCl 0,1M hasta pH 3,3 y la cantidad de grupos carbonilos se determin utilizando la ecuacin (3.4).

%=

(b a ) N 280.1 W

(3.4)

donde,

a = mL de HCl utilizados para titular la muestra b = mL de HCl utilizados para titular el blanco
N = Normalidad del HCl W= masa seca de lignina, en mg

3.1.8. Cenizas Para esta determinacin se utiliz la Norma Tappi T211 om-02. Una cantidad conocida de pulpa se coloc en un crisol previamente tarado y se calcin en mufla a 525C por un perodo de una hora. Con otra fraccin de la pulpa se determin el contenido de humedad.

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3.1.9. Valor de retencin de agua porcentual. Forma calcio El hinchamiento de las fibras se determin por el WRV (water retention value) porcentual. Esta propiedad es la capacidad de retencin de agua de la pulpa luego de ser sometida a centrifugacin durante un perodo de tiempo establecido. Segn la ecuacin (3.5) se define como: WRV % = (g pulpa centrifugada g pulpa seca) . 100 = g agua retenida g pulpa seca 100 g pulpa seca (3.5)

Debido a que el hinchamiento de la pulpa es dependiente de su forma inica y de la fuerza inica del medio, la determinacin del WRV se realiz con los grupos cidos siempre en su forma calcio, es decir, con el ion calcio como contrain, y en un medio neutro de CaCl2 10-3 N.

3.1.9.1. WRV de la fraccin fibrosa Se parti de la pulpa (fraccin R30 de la clasificacin Bauer McNett) en su forma cida y se realiz el pasaje a la forma calcio como se explica en la seccin 3.1.1. de este captulo. Una vez obtenida la suspensin en su forma calcio a pH 7,0 y 2% de consistencia de pulpa se dividi en tres fracciones iguales por pesada de la suspensin en balanza de 0,01 g. Cada una de estas fracciones se filtr por los dispositivos de WRV (Figura 3.6) diseados segn Zanuttini y col. (1996). stos contienen un disco de filtro de vidrio N2 (frita). Luego, se centrifugaron durante 30 min a 1750 g. Finalmente se pes la pulpa centrifugada (peso hmedo) y la pulpa luego de secada en estufa a 105C + 2C por 12 h.

Figura 3.6. Dispositivo utilizado para determinar WRV. El agua libre presente en la pulpa se desplaza por centrifugacin a travs del orificio de salida inferior.

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3.1.9.2. WRV de la pulpa completa Para la determinacin del valor de retencin de agua de una pulpa con finos, se procedi de la misma manera, excepto que se recircul el filtrado para que los finos queden retenidos en la mata de fibras formada sobre el filtro.

3.1.10. Clasificacin por longitud de fibra Se aplic la Tcnica SCAN M6:69 utilizando el equipo Bauer McNett. El tiempo de clasificacin fue de 15 min. Se utilizaron las mallas estndares americanas 30; 50; 100 y 200.

3.1.11. Drenabilidad. La drenabilidad se determin utilizando la Tcnica SCAN C21:65. Este ensayo da una medida de la velocidad con que drena una suspensin diluida de pulpa al 0,3% de consistencia. Se informa como mL CSF (Canadian Standard Freeness).

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3.2. FORMACIN DE LAS HOJAS DE LABORATORIO EN FORMA CALCIO. Para la formacin de las hojas de laboratorio, se asegur que la pulpa se encuentre en su forma calcio. Esto se debe a que en el Instituto de Tecnologa Celulsica el agua utilizada para la formacin de las hojas de laboratorio es agua de canilla filtrada en filtro de 25 m, la cual contiene principalmente iones calcio y sodio. Se determinaron las caractersticas en promedio de esta agua y se muestran en la Tabla 3.1. Si la pulpa se acondicionara a su forma sodio, los iones calcio presentes en el agua podran desplazar los iones sodio, modificando las condiciones en que se encuentra la pulpa y consecuentemente las propiedades finales del papel. Scallan y Grignon (1979) encontraron que los iones que ms prevalecen en las pulpas qumicas son los iones calcio y magnesio y concluyeron que es posible que los iones monovalentes sean desplazados durante el lavado de las pulpas por los iones divalentes presentes en el agua de canilla. Tabla 3.1. Caractersticas generales del agua utilizada para la formacin de las hojas de ensayo. Conductividad 165 - 225 S/cm Valor de pH Contenido de Na Contenido de Ca Contenido de Fe
a

8,0 8,5
a

15-17 ppm 13-15 ppm Menor a 0,1 ppm

Determinado por absorcin atmica.

La tcnica estndar Tappi para formacin de hojas especifica el uso de agua deionizada la cual no garantiza la permanencia de la pulpa en su forma calcio ya que esta agua presenta normalmente un pH 5,5-6,0. La tcnica SCAN no especifica el tipo de agua a utilizar. Haynes (1998) para la formacin de las hojas de laboratorio utiliz agua deionizada a pH 6,0. Propuso que a ese pH algunos grupos carboxlicos de la lignina de pKa = 5,5 se protonan e intervienen de forma diferente en el enlace entre fibras. Propuso utilizar agua a mayor pH. Es as que antes de la formacin de las hojas de laboratorio se intercambi la pulpa a su forma calcio segn tcnica descripta en seccin 3.1.1. Las hojas se realizaron de acuerdo a la

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Tcnica SCAN-C 26:79 y se acondicionaron segn Tcnica SCAN P2 (50 + 2% de Humedad y 23 + 1C). Cuando se trabaj con pulpa con finos, se utiliz una malla 200 en la formadora (en lugar de la malla 100 estndar) y una restriccin a la velocidad de drenaje durante la formacin de la hoja para minimizar la prdida de finos. La restriccin al drenaje elev el tiempo de drenaje del agua sola desde 4 a 15 segundos. Para una pulpa de drenabilidad 625 mL CSF se logra as una retencin del 97%. Se formaron hojas de ensayo de 60 g/m2 o de 130 g/m2 segn las propiedades que se deseaban estudiar. Ventajas de las hojas de ensayo de 60g/m2 Posibilita la determinacin del coeficiente de dispersin de luz s.

Ventajas de las hojas de ensayo de 130 g/m2 Mejor formacin Mejor retencin de los finos Posibilidades de determinacin de la resistencia CMT.

Una vez formadas las hojas de ensayo en forma calcio, se determin por absorcin atmica el contenido de iones Ca y iones Na. Se encontr que el papel contena 70 % de iones Ca y 30 % de iones Na y que el contenido total de iones era mayor al contenido de grupos cidos totales de la pulpa. As, de estos resultados no se puede concluir que el pasaje a forma calcio haya sido total, sin embargo la relacin cantidad de iones Ca / cantidad de iones Na se mantuvo en las distintas hojas analizadas.

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3.3. DETERMINACIONES SOBRE LAS HOJAS DE ENSAYO 3.3.1 Nmero kappa El nmero kappa se determin segn Norma Tappi 236 om-99. Es el volumen (en mililitros) de una solucin 0,1N de permanganato de potasio en medio cido consumido por un gramo de pulpa seca bajo condiciones establecidas: 25C; 10 min. A la pulpa se le agrega KMnO4 de tal manera que quede un exceso entre 30%-70%, el cual se titula con tiosulfato de sodio 0,2N. Clculos: El nmero kappa se calcula de la siguiente manera:

K=

p f w

(3.5)

p=

(b a ) N 0,1

(3.6)

donde:
K = Nmero kappa f = factor de correccin al 50 % de consumo de permanganato, de tablas segn el valor de p w = peso de muestra seca, g p = cantidad de permanganato 0,1N consumidos por la pulpa, mL b = cantidad de tiosulfato consumido en la determinacin del blanco, mL a = cantidad de tiosulfato consumido por la pulpa, mL N = normalidad del tiosulfato

Ragnar (2000) cita a Li (1999) quien mostr que el nmero kappa es una medida no slo de la cantidad de lignina, sino que tambin es una medida de la cantidad total de estructuras oxidables presentes en la pulpa. Es importante tener en cuenta que los dobles enlaces de los cidos hexenurnicos de las hemicelulosas generados durante el pulpado kraft tambin son reactivos hacia el permanganato de sodio utilizado para la determinacin del nmero kappa.

3.3.2. Densidad Aparente La densidad aparente se calcula luego de determinar el espesor de las hojas y el gramaje de las mismas utilizando la Norma Tappi T220 sp-01.

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Gramaje (Norma Tappi T410 om-02): se define como el peso de la hoja acondicionada por unidad de rea. Espesor (Norma Tappi T411 om-97): se mide el espesor de la hoja utilizando un micrmetro automtico, el cual aplica a una velocidad especfica una presin mecnica de 0,1 MPa sobre la hoja. El valor es afectado por la rugosidad por lo que, para minimizarlo, se determina el espesor de cinco hojas medidas simultneamente. Luego se calcula la densidad aparente:

Densidad aparente ( g / cm 3 ) =

5 Gramaje( g / m 2 ) 1000 Espesor (mm)

(3.7)

3.3.3. Resistencia a la traccin La resistencia a la traccin es la carga de rotura sobre una probeta de papel. Para esta determinacin se utiliz un equipo del tipo pndulo (Norma Tappi T404 cm-92) el cual aplica una carga creciente. Probetas de papel de 15 mm de ancho se sujetaron en el equipo entre mordazas separadas 100 mm. Se estableci una velocidad constante de 150-200 mm/seg (para las hojas de gramaje 60 g/m2) para que la ruptura de la probeta ocurra entre los 10 15 seg. Luego, se expresa la resistencia a la traccin como ndice:

ndicede traccin ( Nm / g ) =

Carga ( N ) 0,015m Gramaje( g / m 2 )

(3.8)

3.3.3.1. Resistencia a la traccin zero-span Esta propiedad determina la resistencia a la traccin en el momento en que ocurre la falla a la traccin de las fibras orientadas aleatoriamente en una hoja. Es una medida de la mxima resistencia de la pulpa y relacionada con la resistencia de las fibras propiamente dichas. Para realizar este ensayo se utiliz la Norma Tappi 231 cm-96.

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3.3.4. Resistencia al aplastamiento de onda (CMT) Se aplic la Norma Tappi T809 om-99 por la cual una vez ondulada la tira de papel, se fija con una cinta adhesiva y se somete a un ensayo de compresin en el plano mediante una prensa. El ensayo determina el esfuerzo mximo (N) de aplastamiento de 10 ondas. En esta Tesis se ensay sin tiempo de espera entre ondulacin y compresin (CMT0).

3.3.5. Resistencia a la compresin de columna corta (SCT) Se determin segn Norma Tappi 826 pm-92. Compresin de la tira de papel de 15 mm sujeta con mordazas separadas inicialmente 0,7 mm. La baja relacin de alto de columna de compresin a espesor de papel (baja relacin de esbeltez) hace que se produzca compresin pura y no exista pandeo de la columna. Numricamente, el valor calculado como resistencia por unidad de longitud transversal resulta siempre superior al valor de aplastamiento de anillo (RCT). El ensayo de SCT presenta menor dispersin que el RCT.

3.3.6. Coeficiente especfico de dispersin de luz (s) El coeficiente de dispersin de luz (s) se determin segn Norma SCAN C 27:76 pero a partir de medidas de reflectancia a 681 nm (Filtro 1) del equipo Carl Zeiss Elrepho. Sobre la base de que este coeficiente es relativamente independiente de la longitud de onda, se eligi 681 nm en lugar de la longitud de onda 557 nm propuesta en la Norma Tappi para incrementar la diferencia entre los valores de R y Ro necesarios para el clculo de s. Haynes (1998) adopt esta longitud de onda para mediciones sobre pulpas kraft no blanqueadas. Para este ensayo se utilizaron hojas de laboratorio de 60 g/m2 bajo condiciones estndares de temperatura y humedad. Para el clculo se utiliz la siguiente ecuacin:

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s (m 2 / kg ) =

( R R 2 R0 ) 10 3 R ln (1 R 2 ) W ( R R0 )

(3.9)

s= coeficiente de dispersin de luz (m2/kg)

R = factor de reflectancia intrnseco; siendo el factor de reflectancia la relacin de radiacin reflejada por
un cuerpo a la reflejada por un difusor reflectante perfecto, el factor de reflectancia intrnseco es la reflectancia medida de modo que no haya transmisin de luz a travs del objeto. Referido a papel significa cantidad de hojas suficientes de modo que el agregado de una ms no modifica la reflectancia.

R0 = Reflectancia de una hoja simple contra un cuerpo negro.

W= gramaje (g/m2)

3.3.7. Coeficiente especfico de absorcin de luz (k) Este coeficiente depende fuertemente de la longitud de onda de iluminacin y de la composicin qumica del material. Es proporcional a la presencia de cromforos en el papel. Excepto cuando se indique, este coeficiente se midi a 681 nm. Para el clculo se utiliz la siguiente ecuacin (Giertz 1986):

k (1 R ) 2 = s 2 R
donde:

(3.10)

k = coeficiente especfico de absorcin de luz (m2/kg)

s y Roo estn definidos en la seccin 3.3.6.

3.3.8. Teora de la resistencia del papel. Ecuacin de Page La resistencia del papel deriva tanto de la resistencia de las fibras individuales como de la resistencia de los enlaces que mantienen unidas a las fibras.

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Page (1969) propuso una ecuacin que permite relacionar la resistencia a la traccin del papel con la resistencia a la traccin de las fibras individuales y la capacidad del enlace entre ellas. La teora presenta ciertas consideraciones: 1) Analiza solamente el estado de las fibras que cruzan la lnea de ruptura. 2) Establece una relacin entre la cantidad de fibras que se rompen y la cantidad de fibras que se desprenden sin romperse durante el esfuerzo de tensin. La ecuacin es:

1 9 12 Ag = + T 8Z bPL( RBA)
T = ndice de traccin, Nm/g Z= ndice de traccin de mordazas juntas (zero-span), Nm/g

(3.11)

A = seccin transversal de las fibras promedio

= densidad del material fibroso

g = aceleracin debido a la gravedad L = longitud de las fibras

b = resistencia especfica de enlace al cizallamiento

P = permetro de la seccin transversal de una fibra RBA = rea de enlace relativa
Para una determinada pulpa los valores de A; ; L pueden considerarse constantes y la ecuacin puede escribirse como sigue:

1 9 1 = + T 8Z (b / k )( RBA)
Donde:

(3.12)

k=

12c PL

(3.13)

c : Coarseness de la fibra (peso por unidad de longitud). b/k: proporcional a la resistencia especfica de enlace

Por otro lado, el RBA puede estimarse a partir de:

RBA =

s0 s s0

(3.14)

donde S y So : Coeficientes de dispersin de luz de la hoja y de la hoja no unida, respectivamente

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Captulo 3 Mtodos Generales

Finalmente la ecuacin (3.15) muestra que la resistencia a la traccin depende de un trmino relacionado con la resistencia de la fibra propiamente dicha y un trmino relacionado con la resistencia del enlace:

1 1 1 = + T F B
F= relacionado con la resistencia de las fibras a la rotura

(3.15)

B= ndice de resistencia de enlace de Page. Relacionado con la resistencia del enlace a la rotura en el cual interviene tanto el RBA como el b.

Gurnagul y col. (2001) enfatizaron que el modelo slo puede ser aplicado sobre la fraccin fibrosa de la pulpa y cuando el ndice de curvado es constante. Destacaron adems que si la resistencia a la traccin zero-span es constante, cambios en resistencia a la traccin son adjudicables exclusivamente a cambios en resistencia de enlace.

3.3.9. Anlisis de la fraccin fibrosa considerando la ecuacin de Page El uso de la fraccin fibrosa respecto a la pulpa completa presenta algunas ventajas: 1) Permite una mejor identificacin de efectos. En principio es favorable su mayor

homogeneidad dado que, desde el punto de vista qumico, fibras y finos presentan diferencias como, por ejemplo, distinto contenido de lignina y extractivos. 2) Se evita la prdida de material (finos) durante los tratamientos, los lavados de la pulpa

y en la formacin de las hojas. 3) 4) Permite aplicar la Teora de Page de la resistencia a la traccin. La menor capacidad de enlace de la pulpa sin fracciones medias y finos hace que su

falla en el papel ante una solicitacin mecnica, sea en gran parte dependiente de la capacidad de enlace de las mismas. A continuacin se fundamenta esta afirmacin.

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Teniendo en cuenta la ecuacin (3.15) y considerando que la resistencia zero-span es 133 Nm/g (como es el caso de la pulpa utilizada en esta Tesis) se puede graficar el ndice de resistencia a la traccin (T) en funcin del ndice de resistencia del enlace de Page (B) (Figura 3.7.).

120 8.Z / 9

Indice de traccin, Nm/g

100

80

60
zona en la cual el ndice de traccin depende fuertemente del ndice de Page de la resistencia de enlace.

40

20

200

400

600

800

1000

1200

ndice de resistencia de enlace de Page, Nm/g

Figura 3.7. ndice de traccin en funcin del ndice de resistencia de enlace de Page para un valor de Z = 133 Nm/g De esta grfica se observa que cuando los niveles de resistencia a la traccin son bajos (caso en que las hojas se realizaron a partir de pulpa sin finos), sta depende fuertemente de la resistencia del enlace, y cuando la resistencia a la traccin es elevada depende ms de la resistencia de las fibras individuales. La ecuacin de Page nos permite incluso estimar la proporcin de fibras que cruzan la zona de rotura del papel y que absorben la carga hasta que se rompen (nf) en relacin a la proporcin de fibras que se desprenden intactas (np):

nf (n f + n p )

9T 8Z

(3.16)

n f = nmero de fibras que cruzan la zona de ruptura y toman la carga hasta la ruptura y luego se rompen.
n p = nmero de fibras que cruzan la zona de ruptura que salen intactas debido a que primero se rompe el
enlace entre ellas.

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Z = Resistencia a la traccin zero-span.

T = Resistencia a la traccin de la probeta.

Para las fibras usadas en esta Tesis (ndice de resistencia a la traccin zero-span 133 Nm/g e ndice de resistencia a la traccin entre 20 y 40 Nm/g), entre el 66% y el 83% de las fibras se desprendern en la zona de ruptura durante el esfuerzo de traccin. La Figura 3.8 muestra que en la zona de ruptura del papel existe gran cantidad de fibras intactas que son desprendidas durante la ruptura (I), comportamiento contrario a cuando se realiza el ensayo de traccin zero-span donde todas las fibras se rompen (II).

II

Figura 3.8. Fotografas de probetas ensayadas a la traccin de un papel realizado a partir de la fraccin fibrosa de pulpa kraft de confera no blanqueada reciclada (gramaje 60 g/cm2). (I): ensayo a la traccin (21,9 Nm/g). La zona de ruptura del papel muestra que existe una gran cantidad de fibras intactas que fueron desprendidas durante la ruptura del papel. (II): ensayo zero span (133 Nm/g). Todas las fibras son cortadas y ninguna desprendida. Ancho de probeta 15 mm.

Este anlisis permite concluir que para las condiciones de trabajo de esta Tesis cuando se utiliz la fraccin fibrosa R30, la ruptura del papel a esfuerzos de traccin se debe principalmente a la falla en el enlace interfibrilar. As, incrementos en resistencia a la traccin pueden relacionarse con incrementos en la resistencia de enlace.

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3.3.10. Demanda qumica de oxgeno Indica la cantidad de oxgeno procedente del dicromato de potasio que, bajo determinadas condiciones de trabajo, reacciona con el contenido de sustancias oxidables. Se utiliza un kit de Hach. En forma breve, se colocan 2 mL de la solucin cuya DQO se desea determinar en tubos conteniendo H2SO4; K2Cr2O7 y sulfato de plata como catalizador. Se realiza una digestin a 160C y luego se mide en un espectrofotmetro la concentracin de iones Cr2O7-2 no consumidos durante la reaccin. Conociendo que 1 mol de K2Cr2O7 es equivalente a 1,5 mol de O2 se puede determinar los mg O2 / L solucin.

3.3.11. Valoracin de la actividad lacasa de un extracto crudo del hongo Trametes hirsuta. Se utiliz un extracto enzimtico extracelular con actividad lacasa aislado de cultivos del hongo de pudricin blanca Trametes hirsuta. Este extracto fue suministrado por el Instituto VTT, Espoo, Finlandia, como un extracto enzimtico parcialmente purificado y libre de actividad de otras enzimas oxidativas. Con la finalidad de mantener estable la actividad enzimtica del extracto, y as reducir la desnaturalizacin de las protenas lacasa, se fraccion el extracto en alcuotas de 5 mL que se almacenaron a -5 C, siendo slo una vez descongeladas previo al inicio de los experimentos. Segn lo informado por el Instituto VTT, la actividad lacasa del extracto fue de 5250 nkat/mL (un nanokatal (nkat) equivale a 1 nmol de sustrato oxidado por segundo) siendo valorada utilizando un espectrofotmetro UV-Vis bajo las siguientes condiciones: Temperatura de reaccin: 40C pH de la reaccin: 5,0 Sustrato 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ABTS.

En nuestro laboratorio, la actividad lacasa del extracto descongelado se determin segn el mtodo de Guilln y col. (1992), utilizando como sustrato guayacol (o-metoxifenol) (Figura 3.9). Se midi la absorbancia del producto de oxidacin del guayacol va la actividad lacasa a 465 nm

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(465=12100 M-1cm-1) utilizando un espectrofotmetro UV-Vis CECIL 3055. La actividad enzimtica se expres como nkat/mL.

OCH3 OH

Figura 3.9. Estructura del guayacol

A continuacin se describe cmo se determinaron las condiciones estndares para valorar la actividad lacasa utilizando guayacol como sustrato.

3.3.11.1 Determinacin de las condiciones estndares para valorar la actividad lacasa Para establecer las condiciones estndares para valorar la actividad lacasa utilizando guayacol, y en este sentido, garantizando la independencia de la velocidad de reaccin respecto a la concentracin de sustrato, se realizaron determinaciones con cantidades crecientes de este sustrato. En un bao a 25C se colocaron tubos de ensayo conteniendo sustrato guayacol (7,5; 10,0; 12,5 y 17,5 mM), buffer acetato de sodio-cido actico 38 mM y agua destilada, a los cuales se le agreg una alcuota del extracto enzimtico descongelado. Se agit y se midi la absorbancia en funcin del tiempo (Figura 3.10).

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2
17,5 mM y = 0,0172x + 0,747; R2 = 0,9996 y = 0,0175x + 0,7797 R2 = 0,9991 y = 0,0141x + 0,7089 R2 = 0,9996 y = 0,0122x + 0,7000 R2 = 0,9998

1,8 1,6

12,5 mM 10,0 mM

Absorbancia a 465 nm

7,5 mM

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0 10 20 30 40 50 60

Tiempo, s

Figura 3.10. Absorbancia a = 465 nm del producto de oxidacin del sustrato guayacol a distintas concentraciones (desde 7,5mM a 17,5 mM) en funcin del tiempo. Se muestran las pendientes de las lneas de regresin. Se observa en la Figura 3.10 que a mayor concentracin de sustrato el incremento de la absorbancia a 465 nm adquiere una mayor pendiente; sin embargo cuando se aument la concentracin desde 12,5 mM a 17,5 mM, la pendiente prcticamente no se modific. Las pendientes de las curvas se relacionaron con las velocidades iniciales de transformacin de reactivo a producto mediante la ecuacin (3.17):
9 = Pendiente Vreaccin 10 nkat vinicial mlenzima a b Venzima

(3.17)

Donde;

vinicial = velocidad inicial [nkat/mL extracto enzimtico]

Pendiente = Pendiente de la recta Absorbancia vs. tiempo [1/seg] de la Figura 3.10 Vreaccin = volumen final de reaccin [mL] Venzima = volumen de extracto enzimtico agregado [mL]

a = coeficiente de absortividad = 12100 [M.cm]-1

b = longitud de camino ptico [cm]

La Figura 3.11 muestra las velocidades iniciales de reaccin reveladas por el extracto descongelado en funcin de la concentracin de sustrato. Se observa que al aumentar la

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concentracin de sustrato, la velocidad inicial aumenta hasta que alcanza un mximo a 12,5 mM de sustrato guayacol. Se considera que las protenas enzimticas del extracto revelan cintica de reaccin de tipo Michaelis-Menten, donde las velocidades iniciales de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato aumentan hasta un mximo. La actividad del extracto se defini como la velocidad inicial a la cual se alcanz ese mximo. Por lo tanto, bajo las condiciones de reaccin ensayadas (12,5 mM o 17,5 mM de sustrato guayacol, 38 mM de buffer NaAc-HAc y a 25C), la actividad enzimtica fue 1440 nkat/mL de extracto enzimtico.

1800

Velocidad Inicial, nkat /mL enzima

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20

25C

Concentracin guayacol, mM

Figura 3.11. Relacin entra la velocidad inicial de reaccin de oxidacin de guayacol va la actividad lacasa por mL de extracto y la concentracin de sustrato. Cuando la concentracin de sustrato es mayor a 12,5 mM la velocidad inicial alcanza un mximo (v mxima = 1440 nkat/mL). Puesto que los tratamientos enzimticos sobre las pulpas se realizaron a 40C, se determin tambin la actividad enzimtica y el efecto de la concentracin de guayacol (15; 20 y 25 mM) sobre la velocidad inicial a utilizando un bao termostatizado a 40C. La Figura 3.12 muestra las velocidades iniciales de reaccin lacasa en funcin de la concentracin de guayacol. Mientras que se observa un aumento de la actividad enzimtica desde 1440 a 1900-2000 nkat/mL extracto enzimtico acorde al incremento en la temperatura de reaccin,

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el extracto revel similares velocidades iniciales de reaccin (indicio de saturacin) a las concentraciones de sustrato ensayadas a 40C.

2500

Velocidad Inicial, nkat/mL enzima

40C 25C
2000

1500

1000

500

zona de concentraciones de sustrato a la cual se saturan los sitios activos de la enzima

0 0 5 10 15 20 25 30 35

Concentracin guayacol, mM

Figura 3.12. Velocidad inicial en funcin de la concentracin de guayacol a 25C y 40C. La actividad enzimtica a 25C fue 1440 nkat/mL y a 40C fue 1900 nkat/mL. Las barras de error muestran la desviacin estndar de la determinacin realizada por duplicado.

En base a estos resultados, antes de cada tratamiento enzimtico se control la actividad enzimtica inicial agregando esta enzima a tubos de 20 mL a 40C y pH 5,0 conteniendo: 20 mM de guayacol (concentracin mayor a 12,5 mM para asegurarnos que el reactivo limitante nunca sea el sustrato). 38 mM de buffer acetato de sodio-cido actico Agua destilada La actividad inicial determinada sobre guayacol siempre result en el rango de 19302080 nkat/mL extracto enzimtico a 40C y pH 5,0.

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3.3.11.2. Determinacin de la actividad enzimtica especfica Se determin la actividad enzimtica especfica del extracto (nkat / mg protena). Se calcul determinando el contenido de nitrgeno total Kjeldhal y multiplicndolo por un factor 6,25 para convertirlo a protenas. El contenido de nitrgeno total Kjeldhal en el extracto fue de 1,72.10-3 g N/mL, y por lo tanto, la concentracin de protenas fue de 10,75 mg protenas/mL extracto enzimtico. As, la actividad especfica fue de 193 nkat/mg protena.

3.3.12. Mtodo fenol/sulfrico para la cuantificacin del almidn catinico Este mtodo consiste en colocar en tubos de ensayo 1 mL de la solucin acuosa cuya concentracin de azcares se desea determinar y 1 mL de fenol 5% (p/v). Luego, desde un dispenser se agregan rpidamente 5 mL de H2SO4 concentrado (95,5 - 96,5 %). Se agita, se deja en reposo 10 min, luego se vuelve a agitar, y se coloca en un bao a 23-30C por 20 min. La generacin de color se mide por espectrofotometra a 490 nm. Para convertir los azcares a almidn se multiplica por 0,899 (relacin: PMmonomero del almidn/PMglucosa). La curva de calibrado se realiz con soluciones estndares de glucosa en NaCl 10-3N a distitintas concentraciones (Figura 3.13). El blanco se realiz de la misma manera excepto que se agreg a los tubos de ensayo 1 mL de solucin de NaCl 10-3N en lugar de 1 mL de solucin de glucosa.

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0,8

Absorbancia a 490 nm

0,6

0,4 y = 0,0099x - 0,0017 R2 = 0,9998 0,2

0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Concentracin de glucosa, mg/L

Figura 3.13. Curva de calibrado de glucosa. Se indica en la grfica la lnea de regresin y el coeficiente de determinacin.

Observacin: Las determinaciones de extractivos, holocelulosa, contenido de lignina y caracterizacin de la lignina aislada se realizaron en la Universidad Federal de Paran, Curitiba, Brasil en el marco del proyecto en cooperacin SECyT-CAPES. La DQO se determin en el INGAR, Santa Fe, Argentina. La SCT se realiz en INTI Celulosa y Papel, Bs.As.

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