Area de Toxicologa Universidad de Sevilla

PRCTICAS DE TOXICOLOGA
Curso 200 -200

Alumno/a: Asignatura: Toxicologa (L. Farmacia) Toxicologa Molecular (L. Bioqumica)

Profesorado: - Dra. Ana M Camen Fernndez - Dra. Isabel M Moreno Navarro - Dra. Angeles Menca Jos Gallego - Dra. Silvia Pichardo Snchez - Dra. Ana Isabel Prieto Ortega
Rev. 4

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PT01: SEGURIDAD EN EL MANEJO DE PRODUCTOS QUIMICOS

El riesgo que supone el manejo de sustancias qumicas viene determinado por la exposicin a las mismos y por el peligro que stas representan. Para poder protegernos adecuadamente nosotros mismos y el medio ambiente, hemos de poner en prctica medidas preventivas que tengan en cuenta ambos factores para asegurar su correcta y segura manipulacin, el adecuado almacenamiento y su correcta eliminacin. 1.1. - LA EXPOSICIN Las caractersticas de la exposicin incluyen fundamentalmente la duracin del periodo de contacto, junto con la intensidad (concentracin) y las circunstancias de la misma. En un anexo se incluyen las normas generales de seguridad en el laboratorio, cuyo fin primordial consiste en tratar de evitar la exposicin. Con relacin a las vas potenciales de entrada de los compuestos al ser humano, destacan: - Va respiratoria: Es la ms frecuente e importante en medios laborales. Los contaminantes (polvos, humos, aerosoles, gases, vapores) son inhalados y absorbidos rpidamente por los pulmones. - Va digestiva: suele producirse por aspiracin al pipetear, por conservar un producto en un envase de alimentos, o por comer o fumar con las manos contaminadas. - Va percutnea: Adems de provocar efectos corrosivos e irritantes, diversos compuestos modifican las barreras facilitando la entrada de otros, o atraviesan las membranas siendo absorbidos directamente hacia la sangre. 1.2. - EL ETIQUETADO: LEGISLACIN Todos los productos qumicos son caracterizados previamente a su comercializacin siguiendo las recomendaciones de la Unin Europea a travs de las Directivas relativas a la clasificacin, envasado y etiquetado de sustancias y preparados peligrosos, que estn traspuestas a las legislaciones nacionales. Las legislaciones nacionales incluyen de forma concreta las indicaciones de peligrosidad que deben aplicarse a cada sustancia. Ello incluye, por lo tanto, indicaciones para el correcto etiquetado de los mismos, para que cualquier persona pueda conocer de forma rpida cuales son los riesgos asociados a su uso. El Real Decreto 363/1995, de 10 de marzo, por el que se aprueba el Reglamento sobre notificacin de sustancias nuevas y clasificacin, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas (BOE de 5 de junio de 1995) supone la ttransposicin de la Directiva 67/548/CEE del Consejo, de 27 de junio de 1967, relativa a la aproximacin de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificacin, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (DO 196 16.08.67 p.1). Por otra parte, el Real Decreto RD 255/2003, publicado en el BOE de 4/03/2003, aprueba el Reglamento sobre Clasificacin, Envasado y Etiquetado de Preparados Peligrosos, transposicin de la Directiva 99/45/CEE, dndose en el mismo una gua para el correcto etiquetado de cada preparado considerado como peligroso. Las etiquetas de los productos fitosanitarios, qumicos y reactivos contienen una valiosa informacin toxicolgica que a menudo no es tenida en cuenta. Podran evitarse en gran medida los peligros para la salud y el medio ambiente siguiendo las recomendaciones que dichas etiquetas contienen. La sistemtica empleada por dichos reglamentos para la caracterizacin e indicacin de la peligrosidad, sea de sustancias o de preparados considerados como tales, se basa en la obligatoria inclusin en la etiqueta del envase de uno o dos smbolos o pictogramas de peligrosidad, segn corresponda, acompaado de los nmeros y textos de las indicaciones sobre los riesgos especficos (frases R) y las frases de seguridad o consejos de prudencia (frases S), relativos a la manipulacin de productos peligrosos. 1.3. - CRITERIOS DE TOXICIDAD La legislacin sobre sustancias qumicas peligrosas clasifica a las mismas en tres categoras. CL50 DL50 oral DL50 cutnea inhalatoria rata rata o conejo en rata mg/Kg. mg/Kg. mg/L, 4 hr <50 <25 <0.50 50-400 25-200 0.50-2 200-2000 400-2000 2-20

CATEGORIA Muy txicas Txicas Nocivas

DL50: dosis letal media; CL50: concentracin letal media

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1.4. - LOS PICTOGRAMAS O SMBOLOS DE PELIGROSIDAD Los smbolos de peligrosidad o pictogramas que aparecen en las etiquetas informan mediante un dibujo, del peligro que conlleva su manejo y de las precauciones que debern aplicarse. Existen 10 smbolos distintos. Los cuatro primeros estn relacionados con la posibilidad de provocar una explosin, iniciar un incendio o favorecer la amplitud de incendios ya declarados. Es fundamental que las sustancias que lleven cualquiera de estos smbolos se almacenen en el laboratorio en lugares convenientes, debidamente aislados y alejados de las fuentes de calor. Los otros seis smbolos estn relacionados con el potencial txico de las sustancias para los seres vivos, sus propiedades corrosivas e irritantes EXPLOSIVOS: Sustancias y preparados que pueden explosionar bajo el efecto de una llama o que son ms sensibles a los choques o a la friccin que el dinitrobenceno. COMBURENTES: Sustancias y preparados que en contacto con otros, particularmente con los inflamables, originan una reaccin fuertemente exotrmica. INFLAMABLES: Sustancias y preparados cuyo punto de destello sea igual o superior a 21C e inferior o igual a 55C. EXTREMADAMENTE INFLAMABLES: Sustancias y preparados lquidos cuyo punto de destello sea inferior a 0C, y su punto de ebullicin inferior o igual a 35C. TXICOS: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan entraar riesgos graves, agudos o crnicos e incluso la muerte. MUY TXICOS: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan entraar riesgos extremadamente graves agudos o crnicos e incluso la muerte. CORROSIVOS: Sustancias y preparados que en contacto con los tejidos vivos puedan ejercer sobre ellos una accin destructiva. NOCIVOS: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan entraar riesgos de gravedad limitada. IRRITANTES: Sustancias y preparados no corrosivos que por contacto inmediato, prolongado o repetido con la piel o mucosas puedan provocar una reaccin inflamatoria. PELIGRO BIOLGICO: bacterias y virus que entraen peligro para personas y/o animales. PELIGROSOS PARA EL MEDIO AMBIENTE: Sustancias y preparados cuya utilizacin presenta o puedan presentar riesgos inmediatos o diferidos para el medio ambiente.

1.5. - OTRAS DENOMINACIONES DE PELIGROSIDAD - ASFIXIANTES: Capaces de afectar a las personas por asfixia. Dos grupos: Simples: Porque desplazan el oxgeno del aire. Slo son peligrosos a concentraciones elevadas. Qumicos: Impiden la llegada del oxgeno a los sitios requeridos. - CARCINOGNICOS: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea, pueden producir cncer o aumento de su frecuencia. 1 Categora: Mediante estudios epidemiolgicos se ha visto una relacin causa-efecto entre exposicin y cncer humano. 2 Categora UE o 2A segn IARC: Sustancias probablemente carcinognicas en el hombre, despus de realizar estudios a largo plazo en animales y de otras informaciones. 3 Categora UE o 2B segn IARC: Sustancia sospechosa, o posiblemente carcinngena. Pero no se dispone de datos y los estudios en animales no aportan pruebas suficientes para clasificarlos en la 2. - MUTAGNICOS: Sustancias que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea pueden producir alteraciones en el material gentico de las clulas. Categoras igual que en los carcinognicos. - TERATOGNICOS: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea pueden producir alteraciones en el feto durante su desarrollo intrauterino, causando malformaciones. 1 Categora: Asociacin causa-efecto 2 Categora: Se dispone de suficientes elementos de juicio. - ALERGENOS: Sustancias qumicas que al contacto con la piel y las mucosas o su entrada en el organismo, provoca una reaccin anormal del sistema de defensa inmunolgico.
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Debe tenerse en cuenta que aunque muchas sustancias o preparados no requieran indicacin de peligrosidad, no por ello deben considerarse inocuas, sobre todo si se tiene en cuenta su capacidad de reaccin con otros productos. Por todo ello, es recomendable que al manipular cualquier producto qumico, se tomen las debidas precauciones, tanto en los considerados como peligrosos, como en los no considerados como tales. 1.6. - PRODUCTOS FITOSANITARIOS Son productos fitosanitarios los insecticidas, bactericidas, fungicidas, desinfectantes, herbicidas, abonos, tratamientos postcosecha, fitorreguladores, productos nutricionales y fertilizantes. En cualquier caso su almacenamiento y eliminacin estarn controlados. Teniendo en cuenta que la toxicidad de los productos fitosanitarios puede variar para productos con la misma riqueza y presentacin, por motivos tales como las caractersticas del producto, los disolventes u otros coadyuvantes que contengan y la fase de recalificacin en que se encuentren, aparecen las siguientes notaciones en las etiquetas de los productos: - Peligrosidad para el hombre y animales domsticos: Despus del trmino "hombre" aparecen una o ms de las notaciones siguientes, en orden creciente de peligrosidad: Baja, Irritante Xi, Nocivo Xn, Txico T, Muy + Txico T . Si el producto fuera explosivo o inflamable aparecen las letras E o F. - Peligrosidad para la fauna terrestre: Despus del trmino "terrestre" pueden aparecer las letras siguientes; A, B, C. - Peligrosidad para la fauna acucola: Despus del trmino "acucola " pueden aparecer las letras siguientes; A, B, C. - Peligrosidad apcola: Despus del trmino "apcola" pueden aparecer una o ms de las letras siguientes; A, B, C, D. En todos los casos la peligrosidad de un producto aumenta segn la serie: A, B, C, D. 1.7. - FRASES R (Riesgo) o INDICACIONES SOBRE RIESGOS ESPECFICOS Las frases de riesgo especifican el peligro que conlleva el manejo de los productos qumicos, tanto a corto como a largo plazo. Constituyen una ampliacin de la informacin proporcionada por el smbolo de peligrosidad. Existen 64 frases de riesgo distintas, numeradas correlativamente (R1). R64) y cerca de 50 frases de riesgo combinadas (Ver anexo). 1.8. - FRASES S (Seguridad) o CONSEJOS DE PRUDENCIA Las frases de seguridad o consejos de prudencia dan indicaciones sobre la manera adecuada de almacenar y manejar los productos qumicos. Existen 62 frases distintas de seguridad numeradas correlativamente (S1). S62) y unas 40 frases de seguridad combinada (ver anexo) 1.9. - ALMACENAMIENTO DE SUSTANCIAS PELIGROSAS Tan importante como manejar correctamente los productos qumicos es almacenarlos adecuadamente. Desde el punto de vista de la toxicidad, aquellas sustancias que sean muy txicas deben ser almacenadas de forma que se limite su extensin tras una rotura accidental del recipiente. Es importante prestar especial atencin en el caso de slidos y lquidos voltiles ya que una de las vas de intoxicacin ms comn en los laboratorios es la inhalatoria. Debe tenerse en cuenta adems la posibilidad de que dos productos inocuos, mezclados dejen de serlo, o de que en ocasiones un producto aumente la toxicidad de otro. Hay sustancias cuyo efecto es acumulativo, por lo que exposiciones prolongadas a bajas dosis pueden ser muy peligrosas. Hay que asegurarse de que los recipientes que contienen este tipo de productos estn bien cerrados. 1.10. - ELIMINACIN DE RESIDUOS Debido al peligro que suponen los residuos qumicos para la salud y preservacin del medio ambiente, se hace necesaria una adecuada eliminacin de los mismos. Como norma general, los residuos se acumularn en recipientes que convenientemente etiquetados se eliminarn como ordena la ley, atendiendo a sus caractersticas qumicas y toxicidad. Es importante recordar que los recipientes que los contienen tambin estn clasificados como residuos. La informacin especfica sobre un compuesto puede encontrarse en catlogos o solicitarse a las firmas que lo producen. Desde el punto de vista prctico, los residuos pueden clasificarse como: Residuos txicos y peligrosos: - Acidos y disoluciones cidas - Bases y disoluciones bsicas - Residuos orgnicos no disolventes - Sales y disoluciones de sales - Aceites minerales - Metales y disoluciones de metales - Disolventes orgnicos clorados - Disolventes orgnicos no clorados Mercurio y sus derivados Otros compuestos no clasificados

Otros tipos de residuos: - Residuos radioactivos - Residuos biolgicos peligrosos - Residuos biolgicos asimilables a urbanos - Otros residuos asimilables a urbanos - Objetos cortantes y punzantes

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NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Generales Las instalaciones deben ser adecuadas para prevenir accidentes y exposiciones El acceso debe ser restringido. Nunca quedarse solo en el laboratorio Disponer de informacin clara sobre operaciones de riesgo Recordar siempre los riesgos fsicos, qumicos y biolgicos, las vas de entrada de los mismos, y tratar de prevenir la exposicin y accidentes Hbitos personales Es imprescindible el uso de la bata, mantenindola abrochada. No fumar, comer, beber ni aplicarse cosmticos, ni guardar alimentos ni bebidas en los frigorficos del laboratorio Es conveniente el uso de gafas protectoras. Emplear guantes, mascarillas y bata desechable cuando se manipulen productos muy peligrosos, o cuando se prevea la posibilidad de exposicin (polvos finos, aerosoles). Poner suma atencin en cuanto a la presencia de llamas abiertas u otras posibles fuentes de ignicin No colocar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas. Llevar recogidos los cabellos. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas por el peligro de engancharse. Avisar si se padece alguna alergia. Lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, y quitarse la bata Hbitos laborales No exponerse ni exponer a los dems: ante la menor duda, preguntar No tocar con las manos ni probar los productos qumicos. Evitar inhalar los productos qumicos, sus polvos, vapores o aerosoles. Utilizar la vitrina de gases cuando sea necesario. No pipetear con la boca. No mezclar reactivos a menos que se tenga seguridad de que puede hacerse. No llenar los tubos de ensayo ms de dos centmetros por debajo del borde. En las valoraciones no llenar los recipientes por encima de la mitad de su capacidad. Cerrar las botellas inmediatamente con su tapn correspondiente. Calentar los tubos de ensayo inclinados y utilizando pinzas. No dirigir hacia uno mismo ni hacia los dems, tubos de ensayo, matraces, etc. que estn calentndose o emitiendo vapores. Utilizar gradillas y soportes. No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos de la bata. Tomar los tubos de ensayo con los dedos nunca con la mano. No reintegrar reactivos a su recipiente de origen para no contaminarlo. No tomar reactivos en exceso. Trabajar siempre sobre la mesa o poyata. Utilizar encendedores piezoelctricos largos; no emplear cerillas ni encendedores de bolsillo. No abandonar los mecheros encendidos sin atender. Cuando se quiera hervir lquidos (p. ej. destilacin), se deben calentar con plato poroso en su interior. Si se debe calentar algn disolvente orgnico, se emplear manta o placa calefactora, nunca mechero. Tratar con delicadeza el material de vidrio, y con cuidado los equipos elctricos, y los gases a presin o vaco. El empleo de material radioactivo exige autorizacin del manipulador y las instalaciones. La utilizacin de animales debe hacerse por personal competente en centros registrados Preparacin de disoluciones Limpiar antes la balanza si estuviera sucia, y despus de usarla. Usar una brocha o un papel, nunca soplar. Pesar el reactivo slido sobre papel no absorbente, de aluminio o directamente en un vaso de precipitados. Disolverlo en vaso de precipitados. Verter la disolucin en un matraz aforado y enrasar con el disolvente. Lavar inmediatamente la esptula Los cidos se aaden diluidos, y muy lentamente, sobre las bases o el agua. Los agentes oxidantes se aaden diluidos y muy lentamente, sobre los agentes reductores, y viceversa. Para terminar Al finalizar una reaccin u operacin, recoger materiales, reactivos, equipos etc., evitando acumulaciones innecesarias. Asegurarse de la desconexin de aparatos, agua, gases, etc. Limpiar el lugar de trabajo. Fregar con mucha precaucin todo el material de vidrio usado, que tendr que ser aclarado con agua destilada. Por ltimo, eliminar correctamente los residuos producidos.
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NATURALEZA DE LOS RIESGOS ESPECIFICOS ATRIBUIDOS A LAS SUSTANCIAS Y PREPARADOS PELIGROSOS (FRASES R)
R1 Explosivo en estado seco. R2 Riesgo de explosin por choque, friccin, fuego u otras fuentes de ignicin. R3 Alto riesgo de explosin por choque, friccin, fuego u otras fuentes de ignicin. R4 Forma compuestos metlicos explosivos muy sensibles. R5 Peligro de explosin en caso de calentamiento. R6 Peligro de explosin, en contacto o sin contacto con el aire. R7 Puede provocar incendios. R8 Peligro de fuego en contacto con materias combustibles. R9 Peligro de explosin al mezclar con materias combustibles. R10 Inflamable. R11 Fcilmente inflamable. R12 Extremadamente inflamable. R14 Reacciona violentamente con el agua. R15 Reacciona con el agua liberando gases extremadamente inflamables. R16 Puede explosionar en mezcla con sustancias comburentes. R17 Se inflama espontneamente en contacto con el aire. R18 Al usarlo pueden formarse mezclas airevapor explosivas/inflamables. R19 Puede formar perxidos explosivos. R20 Nocivo por inhalacin. R21 Nocivo en contacto con la piel. R22 Nocivo por ingestin. R23 Txico por inhalacin. R24 Txico en contacto con la piel. R25 Txico por ingestin. R26 Muy txico por inhalacin. R27 Muy txico en contacto con la piel. R28 Muy txico por ingestin. R29 En contacto con agua libera gases txicos. R30 Puede inflamarse fcilmente al usarlo. R31 En contacto con cidos libera gases txicos. R32 En contacto con cidos libera gases muy txicos. R33 Peligro de efectos acumulativos. R34 Provoca quemaduras. R35 Provoca quemaduras graves. R36 Irrita los ojos. R37 Irrita las vas respiratorias. R38 Irrita la piel. R39 Peligro de efectos irreversibles muy graves. R40 Posibilidad de efectos irreversibles. R41 Riesgo de lesiones oculares graves. R42 Posibilidad de sensibilizacin por inhalacin. R43 Posibilidad de sensibilizacin en contacto con la piel. R44 Riesgo de explosin al calentarlo en ambiente confinado.

R45 Puede causar cncer. R46 Puede causar alteraciones genticas hereditarias. R48 Riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposicin prolongada. R49 Puede causar cncer por inhalacin. R50 Muy txico para los organismos acuticos. R51 Txico para los organismos acuticos. R52 Nocivo para los organismos acuticos. R53 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acutico. R54 Txico para la flora. R55 Txico para la fauna. R56 Txico para los organismos del suelo. R57 Txico para las abejas. R58 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente. R59 Peligroso para la capa de ozono. R60 Puede perjudicar la fertilidad. R61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R62 Posible riesgo de perjudicar la fertilidad. R63 Posible riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R64 Puede perjudicar a los nios alimentados con leche materna. R65 Nocivo: si se ingiere puede causar dao pulmonar. R66 La exposicin repetida puede provocar sequedad o formacin de grietas en la piel. R67 La inhalacin de vapores puede provocar somnolencia y vrtigo

Combinacin de las Frases R Las frases R se combinan entre s siempre que es necesario.

CONSEJOS DE PRUDENCIA RELATIVOS A LAS SUSTANCIAS Y PREPARADOS PELIGROSOS (FRASES S).

S1 Consrvese bajo llave. S2 Mantngase fuera del alcance de los nios. S3 Consrvese en lugar fresco. S4 Mantngase lejos de locales habitados. S5 Consrvese en (lquido apropiado a especificar por el fabricante). S6 Consrvese en. (gas inerte a especificar por el fabricante) S7 Mantngase el recipiente bien cerrado. S8 Mantngase el recipiente en lugar seco. S9 Consrvese el recipiente en lugar bien ventilado. S12 No cerrar el recipiente hermticamente. S13 Mantngase lejos de alimentos, bebidas y piensos. S14 Consrvese lejos de. (materiales incompatibles a especificar por el fabricante). S15 Conservar alejado del calor. S16 Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas. No fumar. S17 Mantngase lejos de materiales combustibles.
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S18 Maniplese y brase el recipiente con prudencia. S20 No comer ni beber durante su utilizacin. S21 No fumar durante su utilizacin. S22 No respirar el polvo. S23 No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominacin(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante]. S24 Evtese el contacto con la piel. S25 Evtese el contacto con los ojos. S26 En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S27 Qutese inmediatamente la ropa manchada o salpicada. S28 En caso de contacto con la piel, lvese inmediata y abundantemente con. (productos a especificar por el fabricante). S29 No tirar los residuos por el desage. S30 No echar jams agua a este producto. S33 Evtese la acumulacin de cargas electrostticas. S35 Elimnense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S36 sese indumentaria protectora adecuada. S37 sense guantes adecuados. S38 En caso de ventilacin insuficiente, sese equipo respiratorio adecuado. S39 sese proteccin para los ojos/la cara. S40 Para limpiar el suelo y los objetos contaminados por este producto, sese. (a especificar por el fabricante). S41 En caso de incendio y/o de explosin no respire los humos. S42 Durante las fumigaciones/pulverizaciones, sese equipo respiratorio adecuado. [Denominacin(es) adecuada(s)a especificar por el fabricante]. S43 En caso de incendio, utilizar. (los medios de extincin los debe especificar el fabricante).(Si el agua aumenta el riesgo, se deber aadir: "No usar nunca agua").

S45 En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustrele la etiqueta). S46 En caso de ingestin, acdase inmediatamente al mdico y mustrele la etiqueta o el envase. S47 Consrvese a una temperatura no superior a. C (a especificar por el fabricante). S48 Consrvese hmedo con. (medio apropiado a especificar por el fabricante). S49 Consrvese nicamente en el recipiente de origen. S50 No mezclar con. (a especificar por el fabricante). S51 sese nicamente en lugares bien ventilados. S52 No usar sobre grandes superficies en locales habitados. S53 Evtese la exposicin. Recbense instrucciones especiales antes del uso. S56 Elimnense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida pblica de residuos especiales o peligrosos. S57 Utilcese un envase de seguridad adecuado para evitar la contaminacin del medio ambiente. S59 Remitirse al fabricante o proveedor para obtener informacin sobre su recuperacin/reciclado. S60 Elimnense el producto y su recipiente como residuos peligrosos. S61 Evtese su liberacin al medio ambiente. Recbense instrucciones especficas de la ficha de datos de seguridad. S62 En caso de ingestin no provocar el vmito: acdase inmediatamente al mdico y mustrele la etiqueta o el envase. S63 En caso de accidente por inhalacin, alejar a la vctima fuera de la zona contaminada y mantenerla en reposo. S64 En caso de ingestin, lavar la boca con agua (solamente si la persona est consciente).

Combinacin de las Frases S Las frases S tambien se combinan como ocurra con las R.

Referencias: - Bello J, Lpez de Cerain A, Ezpeleta O, Jimnez A, Prez C, Alvarez L (2000) Toxicologa. Gua de Practicas, Newbook, Navarra - Camen AM, Moreno IM, Lpez-Artguez M, Repetto G y Repetto M (2000) Preparacin y realizacin de un programa de prcticas experimentales para asignaturas del Area de Toxicologa: motivacin positiva en el aprendizaje teorico-prctico de Toxicologa. Instituto de Ciencias de la Educacin, Universidad de Sevilla. - Repetto M (2001) Evolucin, Estado Actual, Retos y Tendencias de la Toxicologia al Iniciar el Milenio. CDROM. Area de Toxicologa. Universidad de Sevilla. Sevilla Para saber ms: http://www.msc.es/salud/ambiental/ http://www.forpas.us.es/uma http://www.us.es/sgprl/ http://www.mtas.es/insht/ipcsnspn/spanish.htm http://www.tc.gc.ca/canutec/erg_gmu/erg2000_menu.htm
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Realizacin de la prctica de seguridad en el manejo de productos qumicos. Contesta las siguientes preguntas:
Es inocuo un producto etiquetado sin pictogramas?

Cules son los dos factores fundamentales que condicionan la exposicin?

Qu significa la notacin Xn? Definir el significado del pictograma

Qu significa la frase de seguridad S51?

Cul es la clave de riesgo que identifica a los compuestos capaces de causar quemaduras? Cmo se clasifica un compuesto con una DL50 de 300 mg/Kg. ? Cules son los riesgos de un producto etiquetado con R18?

Por qu no debe fumarse en presencia de compuestos qumicos?

Qu

indica el smbolo? Qu precauciones deben tomarse?

Qu claves identifican a la frase de riesgo siguiente? : Txico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposicin prolongada por inhalacin, contacto con la piel e ingestin. En que contenedor de residuos debe depositarse un frasco con restos de cloroformo?

Cul es el significado de

Xi?

Qu indican los consejos de prudencia S3/9/49?

Cul es la principal va de entrada al organismo de contaminantes en el laboratorio?

Dibuja el pictograma correspondiente a comburente.

Qu precauciones de manejo deben tomarse para un compuesto etiquetado con el consejo de seguridad S 18?

Qu

significa

T+?

Puede tirarse por el desage un producto cuya etiqueta no tiene pictogramas, frases R ni S?

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PT02: EXTRACCION DE TXICOS ORGNICOS

OBJETIVOS. 1. Aplicar los procesos de extraccin en medio cido y medio bsico para extraer alcaloides y barbitricos en muestras biolgicas. 2. Aplicar la cromatografa en capa fina (CCF) para identificar txicos no voltiles (alcaloides) en muestras biolgicas. La extraccin que se describe a continuacin slo es til en el caso de muestras sencillas, exentas de lpidos y prtidos. Si la muestra es compleja se recurrir a otros procedimientos Stas-Otto, electrodilisis, ultrafiltracin, etc. TCNICA: A 10 ml de la disolucin problema, se aaden 2 ml de HCl 1N. Se agita con 10 ml de diclorometano en vitrina durante aproximadamente 2 minutos, aliviar los gases que se forman en la reaccin. Se separa la fase orgnica (inferior), que puede contener drogas de carcter cido. La fase acuosa cida se alcaliniza con 3 ml de NaOH 1N, se extrae durante 2 minutos, con 10 ml de diclorometano, se separa la fase orgnica (inferior) y se deseca. Este residuo contendr las drogas de carcter bsico. La fase orgnica donde han quedado retenidas las drogas cidas, se agita con 10 ml de una disolucin tampn de pH=5.6. Los barbitricos, al tener un carcter cido dbil se ionizan a partir de un pH=5, y por tanto permanecern en la fase orgnica, pasando los cidos orgnicos ms fuertes como el saliclico a la fase acuosa. A esta fase acuosa se adicionan 5 ml de HCl 1N y se agita durante 2 minutos con 10 ml de diclorometano. Ambas fases orgnicas se evaporan a sequedad, en tubos de ensayos, para su posterior utilizacin.
10 ml de Problema
2 ml de ClH 1N 10 ml de Diclorometano

Fase orgnica (saliclico y barbitrico)

10 ml de tampn fosfato pH=5.6

Fase acuosa
(alcaloides y txicos bsicos) 3 ml NaOH 1N 10 ml de diclorometano

Fase acuosa
5 ml de HCl 1N 10 ml de diclorometano

Fase orgnica

Fase orgnica

Fase acuosa

Concentrar residuo B

Concentrar residuo A

Fase acuosa Fase orgnica

Concentrar residuo C

cido Saliclico: Reactivo de Trinder 3+ Los compuestos fenlicos con el Fe dan lugar a complejos coloreados. Reactivos: a) Reactivo de Trinder: Cloruro mercrico

40 g

Agua destilada ..850 ml Calentar hasta disolucin, enfriar y aadir Nitrato frrico .40 g cido clorhdrico 1 N 120 ml

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b) Disolucin patrn de cido saliclico: Disolver 250 mg de cido saliclico 290 mg de salicilato sdico anhidro en 1 litro de agua. Esta solucin contiene 250 ppm de cido saliclico. Conservar en nevera. Tcnica: Disolver el residuo C en 5 ml exactos de NaOH 0.1N. En tubos de ensayo colocar 0, 0.5, 1, 2, y 3 ml de la disolucin patrn de cido saliclico y en otro tubo 2 ml del residuo C disuelto. Completar todos los tubos hasta 3 ml con agua destilada y adicionar 5 ml de reactivo de Trinder. Medir absorbancia a una de 535 nm. Expresar el resultado en ppm de la disolucin problema inicial.

Barbitricos. Reaccin de Parri. Se basa en la formacin de complejos coloreados de barbitricos con sales de cobalto, en un medio protoflico. El color vara de un barbitrico a otro. Reactivos: Acetato de cobalto en metanol al 0.1%, e isopropilamina en metanol al 5%. Tcnica: Disolver el residuo B en 2 ml de cloroformo y comprobar la existencia de barbitricos aadiendo 0.2 ml de acetato de cobalto y 0.6 ml de solucin de isopropilamina. En caso positivo se obtiene una coloracin violeta que se compara con la de un patrn de barbitrico. La reaccin de Parri debe realizarse en un medio estrictamente anhidro, por lo que se debe operar con material absolutamente seco.

Alcaloides. Investigacin por CCF Reactivos: Fase estacionaria: silicagel-G con indicador de fluorescencia Fase mvil: cloroformo/dietilamina (9:1) Tcnica: Disolver el residuo A en 0.5 ml de acetona y depositar varias gotas en la placa de cromatografa. En la misma placa depositar varias gotas de los distintos patrones de alcaloides. El orden de elucin de algunos alcaloides en estas condiciones es el siguiente: quinina, atropina y estricnina.

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CUESTIONARIO 1. Esquematice la forma no ionizada de sus txicos

2. Cmo identific los alcaloides de su muestra problema?

3. Cmo identific los barbitricos de su muestra problema?

4. Qu tcnica se ha usado en la prctica para la determinacin de cido saliclico?

5. Desde el punto de vista qumico cmo se comportan los alcaloides (atropina, quinina y estricnina en un medio cido y en un medio bsico?

6. Desde el punto de vista qumico cmo se comportan los barbitricos en un medio cido y en un medio bsico?

7. Teniendo en cuenta que valores de salcilico en orina de 500 mg /L son letales, Cul es la interpretacin toxicolgica del resultado?

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PT03: LA COLINESTERASA PLASMATICA COMO BIOMARCADOR; LA BIOACTIVACION DE UN PLAGUICIDA

OBJETIVOS 1. Distincin entre diana y biomarcador 2. Medida de la actividad enzimtica por una tcnica colorimtrica 3. Ensayo in vitro de la inhibicin de la enzima colinesterasa plasmtica por insecticidas organofosforados 4. Comprobar la bioactivacin de un plaguicida: Observar la diferente actividad anticolinestersica del insecticida paratin y su metabolito paraoxn FUNDAMENTO Los insecticidas organofosforados deben su actividad biolgica a la inhibicin de la Acetilcolinesterasa (AChE), enzima fijada a la membrana plasmstica responsable de la hidrlisis fisiolgica del neurotransmisor acetilcolina liberado en el espacio sinptico, impidiendo la normal degradacin de ste, que producira una sobreestimulacin del sistema nervioso. Por lo tanto, su funcin biolgica in vivo en sistema nervioso y en otros muchos tejidos es: AChE Acetil-colina ----------- Ac. actico + colina El centro activo de la enzima es muy caracterstico y presenta dos lugares de unin. El primero de ellos, el lugar aninico, es una zona con carga negativa que se combina con la positiva del tomo de nitrgeno cuaternario del sustrato. El segundo, o sitio esterico, tiene carga positiva y se combina con el grupo carboxlico del enlace ster y es el responsable de la afinidad y de la actividad hidroltica. Los inhibidores de la AChE pueden dividirse en dos grupos segn que la accin sea reversible o irreversible. La inhibicin es reversible cuando la actividad enzimtica se recupera al eliminar el inhibidor. Se comportan como tales muchos compuestos, entre los que destacan la propia ACh en exceso, fisostigmina, cocana, morfina, codena, cafena, otros opiceos; metales como el sodio, cinc, cobre, plomo, mercurio, y litio; toxinas como la botulnica y venenos de serpientes y araas; anestsicos; bloqueantes musculares; antihistamnicos H2; benzodiocepnicos, barbitricos y cardiotnicos; plaguicidas organoclorados como lindano, endosulfn y dieldrin, y el paraquat. Los carbamatos son el modelo de inhibidores reversibles y pueden usarse preventivamente frente a otros inhibidores. Se conocen tambin compuestos capaces de inducir la actividad de la enzima. Entre ellos figuran disolventes orgnicos como etanol, hexano, tricloroetileno, cloruro de metileno, y tolueno; metales como aluminio, magnesio, calcio, estao y vanadio; micotoxinas como la ocratoxina A, citrinina y zearalenona; agentes fsicos como las radiaciones ionizantes y los campos magnticos de baja frecuencia; salicilatos, hipolipemiantes, antidepresivos, vitamina A, insulina, adrenalina, histamina, prostaglandina, e incluso algunos organofosforados a bajas dosis. Aunque el mecanismo de induccin no est bien establecido, se postula la activacin de tipo alostrico en el caso del aluminio, induccin de la sntesis enzimtica por agentes de tipo hormonal como la sustancia P, o facilitacin de la unin enzima-sustrato por fluidificacin de la membrana para la AChE. Aunque la AchE se encuentra distribuida en muchos tejidos (eritrocitos, rin, pncreas, bazo, linfocitos), su localizacin preferente es en la placa motora y en el sistema nervioso central, concretamente en la sustancia gris, ya que en la blanca predomina la pseudocolinesterasa. A pesar de que la AChE (EC 3.1.1.7) es la diana de accin de estos compuestos conocidos como anticolinestersicos, la determinacin de la butirilcolinesterasa, pseudocolinesterasa o colinesterasa plasmtica (ChE) (EC 3.1.1.8) se emplea de forma tradicional como biomarcador para la intoxicacin por organofosforados. Aunque no se conocen bien las funciones fisiolgicas de la ChE, que es sintetizada en el hgado, su inhibicin suele producirse de forma paralela a la de la AchE. En el ensayo utilizado, la butiriltiocolina (BuSCh) es hidrolizada especficamente por la pseudocolinesterasa, formndose cido butrico y tiocolina. ChE Butiril-tiocolina ----------- Ac. butrico + tiocolina enzima

Esta reaccin se pone de manifiesto en presencia de cido 5,5-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) que reacciona estequiomtricamente con la tiocolina dando 5-tio-2-nitrobenzoato (TNB), un compuesto de color amarillo. El aumento en la absorbancia a 410 nm tras la incubacin de la muestra biolgica con el sustrato (BuSCh) puede usarse como una medida de la actividad de la enzima. Algunos organofosforados como los steres fsforotionato y fosforoditioato son dbiles agentes anticolinestersicos, debiendo su actividad biolgica a la biotrasformacin que tiene lugar en el hgado de los vertebrados y en el tracto digestivo y cuerpo graso de los invertebrados. Un ejemplo tpico de activacin metablica es la del paratin, un dbil inhibidor de las colinesterasas, que se reduce a paraoxn, un fuerte agente
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anticolinestersico formado por desulfuracin oxidativa en el enlace P-S, en una reaccin catalizada por oxidasas de funcin mixta [Paration, O,o-dietil-o-(4-nitrofenil)fosforotioato, C10H14NO5PS, Paraoxon, para-nitrofenil dietilfosfato, C10H14NO6P]

En la prctica se pretende determinar la actividad enzimtica de sueros expuestos in vitro a paratin y paraoxn, comparndola con la del suero control no tratado. El paraoxn puede prepararse por derivatizacin del paratin con vapor de bromo, siguiendo la tcnica RTLC (reaction thin layer chromatography) que requiere cantidades mnimas del compuesto. Reactivos - Tampn fosfato, pH 7.4, 0.2 M
Sol A: 17.8 g de Na2HPO42H2O en 500 mL de agua; Sol B: 6 g de NaH2PO4 en 250 mL de agua Aadir aproximadamente 81 mL de la sol B a 19 de la A para ajustar el pH a 7.4

Butiriltiocolina 24 mM (76.08 mg en 10 mL de agua) DTNB 0.5 mM (9.90 mg en 50 ml tampn fosfato) Paratin 1 g / L Paraoxon 1 g / L Plasma diluido 1:100; 0.1 mL de plasma en 10 mL de tampn fosfato

Aparatos y Material - 3 Tubos de ensayo, 1 Tubo de centrfuga, Pipetas o micropietas 1 y 0.1 mL, Cubetas 1 cm paso de luz, Bao termosttico a 30 C, Espectrofotmetro visible, Gradillas, Cronmetro Normas de seguridad: La utilizacin de muestras humanas y de dos plaguicidas exige adoptar estrictas medidas de seguridad, as como el control de los residuos. Procedimiento experimental Consiste en el ensayo enzimtico de la actividad colinestersica tras la exposicin a los plaguicidas: 1. Preparar 3 tubos de ensayo rotulados P1 ("Suero No tratado"), P2("Paratin") y P3 ("Paraoxn"). 2. Aadir 1 mL de suero diluido a cada uno de los tres tubos. 3. Aadir 1 mL de agua destilada al tubo P1; 1 mL de la disolucin de paratin al tubo P2 y 1 mL de paraoxn al tubo P3. 4. Incubar los tubos en bao termosttico a 30 C durante 20 minutos. 5. Aadir 1 mL de DTNB 0.5 mM a todos los tubos. 6. Preparar el espectrofotmetro para leer la absorbancia a 410 nm. 7. Iniciar la reaccin enzimtica en el primer tubo, aadiendo 0.1 mL del sustrato (BuSCh 24 mM); mezclar y trasvasar rpidamente el contenido a una cubeta. Ajustar la referencia a cero (blanco), y con ayuda de un cronmetro, anotar las absorbancias cada 30 seg. durante un periodo de 3 min (anotar el momento exacto de la lectura si no se hace a los tiempos predeterminados). 8. Repetir el paso anterior para el tubo P2 y luego para el tubo P3 Tiempo / 0 seg. 30 60 90 120 150 180
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Absorbancias:

Tubo P1 (suero) 0

Tubo P2 (suero+paratin) 0

Tubo P3 (suero+paraoxn) 0

Clculos 1. Representar grficamente la absorbancia de cada tubo frente al tiempo, comprobando su linealidad. 2. Calcular la velocidad de hidrlisis enzimtica (actividad enzimtica) del sustrato en la mezcla de reaccin, a partir de la frmula siguiente: R=velocidad de hidrlisis en la mezcla de reaccin ( mol/L/min) = A/min 10 13600
6

mol/L/min

3. Calcular el porcentaje de actividad enzimtica con paratin y paraoxn, en las condiciones experimentales del ensayo, con respecto al control. 4. Qu hubiramos obtenido de haber determinado acetilcolinesterasa cerebral con los reactivos correspondientes para esta enzima? 5. Podramos haber ensayado acetilcolinesterasa en suero? 6. Son relevantes los resultados con lo que ocurrira in vivo?

Referencias: - Arufe MI, Romero JL, Gamero JJ, Vizcaya MA, Moreno MJ (1997) Oxidacin de insecticidas anticolinestersicos: un experimento sencillo para ilustrar la importancia de la bioactivacin en toxicologa. Revista de Toxicologa 14: 84 - Repetto G, Sanz P, Repetto M. In vivo and in vitro Effect of Trichlorfon on esterases of the Red Crayfish Procambarus Clarkii. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 41: 597-603 (1988) - Repetto G, Sanz P, Repetto M. Comparative in vitro effects of sodium arsenite and sodium arsenate on neuroblastoma cells. Toxicology 92: 143-154 (1994).

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PT04: DETECCION DE CANNABINOIDES CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

EN

MUESTRAS

VEGETALES

POR

Objetivos: Es preciso realizar rpidamente la identificacin presuntiva de la posible presencia de cannabis en dos muestras vegetales. Se sugiere el empleo de una reaccin coloreada y una tcnica de cromatografa en capa fina. Introduccin: La planta Cannabis sativa, variedad ndica, pertenece a la Familia Cannabinceas, originaria de Asia Central y cultivada en extremo Oriente desde tiempos remotos. Las denominaciones ms generalizadas del "polvo" son "Has" (Jas), "Haschish" (Jachis), "Chocolate". Corresponde esta fraccin a unos pelillos huecos de tamao microscpico alojados en las hojas y flores femeninas, cuyo interior est relleno de una sustancia aceitosa que contiene los principios activos, entre ellos, los tres fundamentales: cannabinol (CBN), tetrahidrocannabinol (THC) y cannabidiol (CBD). Este polvillo untuoso al tacto, cuyo colorido vara desde el amarillo limn hasta el verde oscuro o marrn, es frecuentemente prensado formando pastillas de consistencia dura que sern protegidas por plstico o papel de aluminio. Son muy numerosos los sistemas colorimtricos y de cromatografa en capa fina que se han descrito en la literatura para la separacin e identificacin analtica de los constituyentes cannbicos. Reactivos - Eter de petrleo - Reactivo de Duquenois: Acetaldehido 1 mL, Vainillina 1 g y Alcohol etlico100 mL. - Azul B: 0.25 g de azul B (dicloruro de 3,3-dimetoxibifenil-4,4-bis (diazonium)) en 50 mL de Na OH 0.2 M. Es extemporaneo - HCl Concentrado - Hexano / Eter dietlico (80:20); preparar 200 mL - Cloroformo. - Patrn: solucin en ter de petrleo de CBD, THC y CBN Material: - Placas de aluminio recubiertas de gel de slice de 0.2 mm de espesor de capa. - 2 Tubos de ensayo - 2 Tubos de centrifuga de 12 mL - 2 Embudos - Papel de filtro - Bao de agua en caliente - Probetas - Pipetas 5 mL - Tanque de desarrollo - Pulverizador - Secador de pelo - Capilares Normas de seguridad Se emplean compuestos corrosivos, irritantes, nocivos e inflamables Procedimiento 1 Extraccin Las muestras vegetales se encuentran en tubos de ensayo en la gradilla. Aadir aproximadamente 5 mL de ter de petrleo y calentar a ebullicin en la vitrina de gases, introducindolo intermitentemente en un bao de agua a unos 80 C (dirigir siempre la boca del tubo hacia donde no haya nadie).

Filtrar a travs de un embudo con papel de filtro a un tubo de ensayo. Se vuelve a aadir al residuo slido 5 mL de ter de petrleo y se calienta de nuevo a ebullicin en el bao Se filtra recogiendo este filtrado sobre el anterior. Se divide el lquido, pasando 1/3 del extracto a un tubo de centrfuga, que se evapora hasta pequeo volumen, aproximadamente 1 gota, y se destina a cromatografa en capa fina. Los 2/3 del tubo de ensayo se evaporan hasta casi sequedad.

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2 Anlisis cualitativo A) Reacciones Coloreadas Al residuo seco se le aade primero, 2 mL del reactivo de vainillina (Duquenois y Mustafa) y a continuacin en vitrina de gases otros 2 mL de HCl concentrado. Si se produce una fugaz sucesin de colores, amarillo, verde, azul, que termina en violeta, en la muestra haba cannabis. Para confirmarlo se aade al lquido un volumen igual de cloroformo y se agita; la capa inferior se colorea tambin en violeta si hay cannabis. Otras plantas dan colores diferentes en una o ambas fases lquidas. B) Cromatografa en capa fina (C.C.F.) Se corta un trozo de placa de aproximadamente 5 x 10 cm. Se siembra sobre la placa en una pequea lnea el extracto etreo de la muestra. Se desarrolla la placa en un tanque conteniendo Hexano / Eter dietlico (80:20), hasta que el frente alcance 3 cm del borde superior. Se retira la placa del tanque, se seca con un secador y se le somete una vez seca a un nuevo desarrollo. Se seca de nuevo y se revela en vitrina de gases pulverizando con solucin de Azul B en NaOH 0.2 M. Aparecen las manchas del CBD, THC y CBN con coloraciones que varan desde el rojo, naranja hasta el violeta sobre fondo blanco o ligeramente amarillo. Comparar con los factores de referencia tericos (Rf): CBN: violeta, Rf: 0,45-0,71 THC: rojo, Rf: 0,5-0,77 CBD: naranja, Rf: 0,55-0,82 Resultado Hay presencia de cannabis en las muestras?

Qu cannabinoide predomina?

Calcula los factores de referencia (Rf)

Dibuja la placa:

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PT05: DETERMINACION DE NITRATOS EN HOJAS DE LECHUGA

Objetivos: Determinar los nitratos presente en el alimento. De esta forma sabremos la cantidad de dicho alimento que se podra consumir para no superar la IDA, en el caso de que ste fuera la nica fuente de nitratos. Fundamento: El in nitrato es precursor del in nitrito, sustancia que tras exposicin aguda da lugar a metahemoglobinemia y tras exposicin crnica puede dar lugar a compuestos N-nitroso, que son reconocidos carcingenos. El in nitrato reacciona con la brucina para dar lugar a un producto de reaccin de color rojo, que pasa al anaranjado y se estabiliza en el amarillo. En medio sulfrico concentrado no interfieren los nitritos. Dan reaccin 2anloga a oxidantes enrgicos como IO 3, ClO 3 y CrO 4, sustancias que no se encuentran normalmente en los alimentos.

BRUCINA

Reactivos: Disolucin madre de 400 g/mL de NO 3, preparada a partir de KNO3 anhidro, previamente desecado a 105C durante 1 hora. Disolucin de trabajo de 80 g/mL de NO 3, preparada a partir de la anterior. H2SO4 30 N. Reactivo colorimtrico: Se disuelven 0'1 g de brucina y 0'01 g de cido sulfanlico en aproximadamente 7 mL de agua destilada caliente. Se aaden 0'3 mL de HCl concentrado y una vez a temperatura ambiente se completa hasta 10 mL. Mtodo: Se pesan exactamente 10 g de hojas de lechuga y se trituran. Se tratan con 200 mL de agua destilada y se pasa a un matraz erlenmeyer y se mantiene a 80C durante 20 min. Una vez fro el lquido extractivo, se filtra y se diluye hasta 250 mL. Se introducen 0, 0.25, 0.50, 0.75, y 1 mL de la disolucin de trabajo de NO 3 en matraces aforados de 25 mL, y se completa su volumen hasta 1 mL con agua destilada. En otro matraz se introducen 1 mL del lquido extrado. A continuacin se aade, a todos ellos, 0.5 mL de la disolucin de brucina y 5 mL de sulfrico, con pipeta y en la campana, lentamente y agitando. Se deja 10 min en oscuridad. Se aaden 12 mL de agua destilada y se llevan a oscuridad durante 10 min y seguidamente se mantiene a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente, se enrasan, agitan con cuidado y se mide la absorbancia a 410 nm frente al blanco. BIBLIOGRAFA K Fytianos, P Zarogiannis. Nitrate and nitrite accumulation in fresh vegetables from Greece. Bull Environ Contam Toxicol 62 (1999) 187.

Clculos: 1.- Cul es el fundamento de la determinacin de nitratos?

2.- Por qu se realiza la reaccin en medio cido?

3.- En condiciones normales podra haber interferencias en la determinacin de nitratos con sustancias como 2IO 3, ClO 3 y CrO 4?

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4.- Teniendo en cuenta que, segn la legislacin europea, el contenido mximo de nitratos expresado en mg NO3/kg de lechuga debe encontrarse entre 2000-4500, calcular los nitratos que hay en la muestra en mg/kg de lechuga.

5.- Teniendo en cuenta que la ingesta diaria admisible (IDA) para los nitratos es de 365 mg/Kg/da, calcular cunta cantidad del producto analizado se podra ingerir por da, si el peso estndar de un individuo es de 70 Kg y no tuviera otras fuentes de nitratos.

6.- Si slo tuviramos un mtodo de determinacin de nitritos, cmo podramos medir los nitratos en la muestra?

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