BIOLOGIA I

LA PRODUCCION DE ENERGIA UTIL EN LOS MAMIFEROS: LA FOSFORILACION OXIDATIVA MITOCONDRIAL

Mecanismo de transduccin de energa en los animales

Los seres vivos son mquinas qumicas que utilizan la energa qumica del ATP para hacer espontneas a las reacciones endergnicas.

La energa qumica de los sustratos que se oxidan se utilizan para la generacin de un gradiente electroqumico de H+ en la membrana mitocondrial
El gradiente electroqumico de H+ se utiliza para la produccin de ATP. 2

Las mitocondrias, esas organelas subcelulares

REGULACIN DEL CONSUMO DE OXGENO MITOCONDRIAL: EFECTO DEL ADP El ADP aumenta el consumo de O2
ADP

La relacin: con ADP/sin ADP (est. 3/est. 4) es denominada Control Respiratorio

DO2

Dt

El control respiratorio, usualmente de 4 a 10, es el ndice mas sensible para juzgar la integridad y el acoplamiento mitocondrial y, por lo tanto, la calidad de las mitocondrias 4 aisladas.

Consumo de oxgeno = energa biolgica

El 95 % del oxgeno consumido se consume en las mitocondrias. El 99 % del oxgeno consumido por las mitocondrias es reducido por la citocromo oxidasa. El 100 % del oxgeno consumido por la citocromo oxidasa se utiliza para sintetizar ATP por el mecanismo conocido como fosforilacin oxidativa 5

REGULACIN DEL CONSUMO DE OXGENO CELULAR

CONCEPTO CLSICO

NUEVO CONCEPTO

ADP ______________
O2 no es limitante
[O2] celular = 5-30 mM

ADP O2 NO
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[O2]0.5 para la
respiracin mitocondrial = 0.02-0.3 mM

REGULACIN DEL CONSUMO DE OXGENO MITOCONDRIAL

F1-ATPasa
ATP

TRES PROTEINAS REGULAN LA RESPIRACION

1. La F1-ATPasa (factor limitante: ADP)

ADP

2 H+ 2 H+

2. La mtNOS (produce NO) 3. La citocromo oxidasa (factor limitante:NO/O2)

mtNOS

O2 NO

Citocromo oxidasa
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Ensayo polarogrfico estndar para acoplamiento mitocondrial

La respiracin se mide en natg O/min/mg prot.

ADP

Respiracion en estado 4a: Respiracin controlada,

definida por el flujo pasivo de protones a travs de la membrana interna.

Respiracin en estado 3: Respiracin activa, la Est. 4a

Est. 3 DO
mxima velocidad fisiolgica de consumo de O2 y de sntesis de ATP.

Respiracin en estado 4b. Idem 4a. Cuando es

mayor que 4a implica activacin de la ATPasa mitocondrial por desacoplamiento o exceso de Mg2+.

Control respiratorio (1 y 2): Las relaciones entre Est. 4b [O2] = 0.22 mM Dt

las respiraciones en: est. 3/ est.4a y est. 3/ est.4b. Normalmente, de 3 a 7 con succinato y de 4 a 10 con malato-glutamato.

Relacin ADP/O: Mide la fosforilacin oxidativa.

Normalmente, 1.7 con succinato y 2.7 con malato8 glutamato.

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Reacciones de los complejos mitocondriales

Complejo Reaccin DE

I II III IV

NADH2 => UQ Succ => UQ UQH2 => cit. c cit c => O2

260 mV 0 mV 200 mV 620 mV

Las diferencias de potencial elctrico de mas de 200 mV, definen los sitios de conservacin de energa. Se toma un DEde 0.23 V como potencial operacional para la conservacin (transduccin) de energa.
11

La cadena respiratoria mitocondrial (2002)

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La cadena respiratoria mitocondrial

NADH2 => Fp(FMN) => UQ => cit bKbT=> cit c,c1=> cit aa3 =>O2

Una serie de molculas con grupos prostticos redox con potenciales de oxidacin crecientes desde el NADH2 (-320 mV) al O2 (+ 820 mV) y DE = 1.14 V.

La oxidacin del NADH2 por el O2 genera 220 kJ/2 e(DG = -nF DE; -2 x 96500 x 1.14).

Las reacciones de transferencia de electrones (xidoreducciones) se realizan a alta velocidad por estar los transportadores de electrones incorporados en la 13 membrana interna y restringidos en sus movimientos .

Los potenciales redox (E) de los componentes de la cadena respiratoria

NADH2 FMNH2 Fe-S (Complejo I) FADH2 Fe-S (Complejo II) Ubiquinol (UQH2) Citocromo bk mV Citocromo bT mV Citocromo c (+c1) Citocromo a+a3 Oxigeno - 320 mV - 280 mV - 270 mV - 10 mV 20 mV 60 mV 40 190 230 mV 380 mV 820 mV

Los de mas arriba en la tabla reducen a los de mas abajo

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15

16

17

18

19

La teora quimiosmtica La membrana interna es mitocondrial impermeable a los H+. (Mitchell, 1965)
10 H+
2e-

La transferencia de electrones
en la cadena respiratoria produce la extrusin vectorial de H+ al citosol.

NADH ATP

O2 ADP

A ambos lados de la
membrana interna mitocondrial se establece un potencial protomotriz (Dp = 60 DpH + Dj).

3 H+

El potencial electroqumico de
los H+ determina su pasaje por la F1-ATPasa y la sntesis de 20 ATP.

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Teora Quimiosmtica (Mitchell, 1962-1978)

H+ 2 1 Formulacin del potencial electroqumico del H+ en la matriz mitocondrial (1) y en el espacio intermembranas (citosol) (2)

~ Dm(2-1) = RT ln (aH+(2)/ aH+(1) + F.Dj(2-1)

~

Dividiendo por F, y tomando Dp = Dm/F; y pH = -log aH+

Dp = Dj + 59 DpH
La fuerza protomotriz (Dp), expresa en mV (normalmente 220 mV) el potencial electroqumico del H+ que es utilizado en la sntesis endergnica de ATP a partir de ADP y Pi. 22

La teora quimiosmtica: Dp = Dj + 59 DpH Determinacin experimental

Determinacin de Dp en mitocondrias en estado de reposo (estado 4)
Dp
220 mV

Df
50 mV

60DpH
170 mV

En mitocondrias respirando, el pH de la matriz 8.0, para un pH del citosol 7.2

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Consideraciones energticas para cada sitio de conservacin de energa (1) DG = - n . F. DE

para 2 e- (reaccin redox) y H+ (F1-ATPasa)

DG = - 2 x 96500 x 0.23 = - 44.3 kJ/2 H+

ADP + Pi ==> ATP DG = 32.6 kJ/mol

Reaccin redox (DE= 0.23 V) DG = - 44.3 kJ Reaccin total acoplada DG = - 10.8 kJ/mol
Eficiencia (qumica redox /qumica fosforilacin): 32.6/44.3 = 74 %

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25

ADP + Pi

ATP

DG = 32.6 kJ

El flujo de H+ por dentro de la protena de la F1-ATPasa (un rotor molecular) produce la sntesis de ATP a partir de ADP y Pi
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27

28

29

(1) La reaccin redox NADH2 + O2 => NAD + H2O DG = - 220 kJ DE = 0.82 - (- 0.32) = 1.14 V DG = - n . F . DE ( - 2 x 96500 x 1.14) = - 220 kJ
(2) La fuerza protomotriz (el potencial electroqumico del H+) 220 mV (medido); para 10 H+) DG = - n . F . DE ( - 10 x 96500 x - 0.22) = 212 kJ Eficiencia (Dp / DE) = 212 /220 = 96 % (3) La sntesis de ATP ADP + Pi => ATP DG = 32.6 kJ para 3 H+ por vuelta del rotor de la F0 DG = - n . F . DE ( - 3 x 96500 x 0.22) = - 63.7 kJ Eficiencia = 32.6/ 63.7 = 51 %
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FRACCION DE LA MASA MITOCONDRIAL EN ESTADOS 4 Y 3 EN ORGANOS PERFUNDIDOS

--- Consumo de oxgeno --Mitocondrias Organo Contenido de est. 4 est. 3 perfundido mitocondrias
(nmol O2/min/ mg prot.) (mmol O2/min/ (mg prot./ g rgano) g rgano)

Fraccin de mitocondrias est. 4 est. 3

---- ( % ) ----

Hgado

10

88

1.3

35

65

35

Corazn

28

135

3.1

53

72

28

La fraccin de mitocondrias en estado 3 (x), se calcula de: Consumo del rgano/contenido de mitocondrias = (1-x) est. 4 + (x) est. 3 31

REGULACIN DEL SUMINISTRO DE OXGENO POR EL XIDO NTRICO. 1. El efecto vasodilatador.

El NO generado por la eNOS del

NO endotelio vascular activa a la GMP ciclasa del musculo liso, aumenta el cGMP, y produce vasodilatacin. El aumento del Mensajero intercelular dimetro de los vasos, permite un mayor tiempo de equilibracin y aumenta la liberacin de O2 de la HbO2 a los tejidos.
1998 a Forschgott, Murad e Ignarro por su descubrimiento del papel de mensajero intercelular del NO en el sistema cardiovascular
Vasodilatacin endotelio-msculo liso
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Premio Nobel de Fisiologa y Medicina

REGULACIN DEL CONSUMO DE OXGENO POR EL XIDO NTRICO. 2. Inhibicin de la citocromo oxidasa por el NO

Inhibicin competitiva con el O2: depende de la relacin O2/NO

150 O2 = 1 NO

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Competicin en el centro activo de la citocromo oxidasa

Fe2+
Hemo a3
Protena

CuB+

Fe2+
Hemo a3

N=O

CuB+

Protena
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OXIDO NITRICO SINTASA MITOCONDRIAL (mtNOS): el descubrimiento

mtNOS

La actividad de mtNOS, determinada como produccin de NO, fue original y simultneamente observada en mitocondrias de hgado de rata por Ghafourifar y Richter (1997) y por Giulivi, Poderoso y Boveris (1998).
Previamente se haba informado la existencia de una protena mitocondrial reactiva con anticuerpos anti-eNOS (Kobzik et al. (1995) y Bates et al. (1995; 1996).

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LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LA mtNOS EN LA REGULACION DE LA RESPIRACION DE MITOCONDRIAS DE HIGADO DE RATA. Efectos del sustrato (arginina) y de un inhibidor (NMMA).

Respiracin en estado 3
(ng-at O/min.mg prot.) + malato-glutamato con ADP 113 (a) id. + 0.3 mM arginina 101 (b) id. + 1 mM NMMA 135 Actividad functional de la mtNOS (b-a) 34 + succinato con ADP id. + 0.3 mM arginina id. + 1 mM NMMA Actividad functional de la mtNOS (b-a) 178 160 205 45 (%) 84 75 100 25 87 78 100 22
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