Espectroscopia RMN 2D

Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola dimension (osea, espectros 1D), pero vimos como una secuencia de pulsos multiple nos da distintos espectros en funcion de los periodos tD que usemos entre pulsos. Un experimento 2D basico seria repetir una secuencia de pulsos 1D con una vriacion sistematica del periodo de tiempo variable tD, y luego graficar todo encimado (stacked plot). Un ejemplo seria variar el tiempo antes de tomar la FID (DE):

tD1

tD2

tD3

tDn Ahora tenemos dos dominios de tiempo, uno que aparece durante la adquisicion como siempre, y otro que se origina a causa del periodo variable.

Las basicas de la RMN 2D

Tenemos que renombrar algunos de los parametros para estar a tono con la literatura: A la primera perturbacion del sistema (pulso) se le llama la preparacion del sistema de espines. Al tiempo variable tD lo renombramos tiempo de evolucion, t1. Tenemos un evento de mezclado, en el cual informacion de parte del sistema de espines pasa a otras partes. Finalmente, vamos a tener un periodo de adquisicion (t2) como en todos los experimentos 1D (la FID). Esquematicamente, lo podemos dibujar asi:

Preparacion

Evolucion

Mezclado

Adquisicion

t1

t2

t1 es el periodo variable, y t2 es el periodo de adquisicion normal. Vemos que vamos a tener frecuencias f1 y f2 Este formato es basicamente el mismo para todas las secuencias de pulsos 2D (y en realidad nD)...

Un experimento 2D rudimentario
Vamos a ver como esto con el esqueleto de lo que va a ser la secuencia de pulsos COSY. Imaginense estos pulsos, donde t1 es el tiempo de preparacion: 90y 90x t2 t1

Lo analizamos para una singulete fuera de resonancia (o), y para un monton de t1s diferentes. Empezando luego del primer pulso / 2:
y z

90x
x y y z

90x
x y

El 2D rudimentario (continuado)
y z

90x
x y y z

90x
x y

El segundo pulso / 2 actua solo sobre la componente de la magnetizacion que este en el eje y del plano <xy>. La componente en el eje x no es afectada, pero su amplitud va a depender de la frecuancia del pico.

A(t1) = Ao * cos(o * t1 )

El 2D rudimentario (mas)
Si hacemos un stacked plot, nos da:

A(t1)

t1 o f2 (t2)

t1

Ahora tenemos datos en frecuencia en un eje (f2, que viene del tiempo t2), y datos en funcion del tiempo en el otro (t1). Como la variacion de intensidad en t1 es tambien periodica, podemos hacer una seudo-FID mirando a los puntos para cada frequencia de los picos en f2. Una cosa que no estamos considerando durante todos estos pulsos, esperas, puslos, etc., es que la seal tambien va a estar afectada por relajacion T1 y T2.

El 2D rudimentario (y mas)
Ahora tenemos FIDs en t1, y podemos hacer una segunda transformada de Fourier en el dominio de t1 (la primera fue el dominio de t2), y obtenemos un espectro bi-dimensional: o

f1 f2

Tenemos cross-peaks donde las dos lineas se o interceptan en el mapa 2D, en este caso en la diagonal.

En un espectro real con un monton de seales mirar esto es imposible. Lo miramos desde arriba, y tenemos un espectro de contornos. Rebanamos los picos distintas alturas. o

o f1 f2

Cada rodaja tiene un codigo de color que depende de la altura del pico.

Lo mismo con datos reales

Esto es del COSY de la pulegona... tiempo-tiempo t1 t2

tiempo - frecuencia

t1 f2 frecuencia - frecuencia

f1 f2

Lo mismo con datos reales (continuado)

El espectro de contornos con todos los cross-peaks:

f1 f2 De donde salieron todos los picos fuera de la diagonal (off-diagonal), y que quieren decir? Voy a tratar de explicarlo, pero esto es algo para lo cual necesitariamos de un tratamiento matematico riguroso para entenderlo bien.

Correlacion homonuclear - COSY

COSY significa COrrelation SpectroscopY, y en este caso en particular en que lidiamos con acoples homonucleares, espectroscopia de correlacion homonuclear. Cuando desarrollamos la idea del espectro 2D consideramos un espin aislado sin acoples a nada mas. Obviamente, esto no es muy util. El COSY es util para averiguar que espin esta acoplado con otros espines. Los picos fuera de la diagonal indican esto, osea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados. Con esta idea basica vamos a tratar de ver el efecto de la secuencia de pulsos COSY 90y - t1- 90y - t2 en un par de espines acoplados. Si recordamos el diagrma de energia de este sistema:

I S I S

J (Hz)

I S

S
I S

I
I S

Si miramos al nucleo I y aplicamos los dos pulsos / 2 (un seudo-pulso ), invertimos parte de la poblacion del espin S, y esto tiene un efecto en I (transferencia de polarizacion ).

Correlacion homonuclear (continuado)

Como la tranferencia de polarizacion de I a S o de S a I es lo mismo, lo explicamos de I a S y asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I y vemos lo que pasa con S. Despues del primer / 2, tenemos dos vectores de I en el eje x, uno moviendose a I + J / 2 y el otro a I - J / 2. El del segundo pulso va a poner componentes de la magnetizacion alineada con +y en el eje -z, lo que quiere decir que tenemos una inversion parcial de las poblaciones de I. Para t1 = 0, tenemos inversion completa de los espines I (es un pulso ) y la intensidad de la seal de S no cambia. Para todos los otros tiempos va a haber un cambio en la inensidad de S que depende periodicamente de la frecuencia de resonancia de I. La variacion en la inversion de poblacion de I depende del coseno (o el seno) de su frecuencia de resonancia. Considerando que estamos en resonancia con una de las lineas y que t1 = 1 / 4 J:
y z

90y
x y

J/2

Correlacion homonuclear (mas)

Para el caso general (nada en resonancia), llegariamos a esta relacion para el cambio de la intensidad de la seal de S (depues del pulso / 2) en funcion de la frecuencia del espin I y el acople JIS: AS(t1,t2) = Ao * sin( I * t1 ) * sin (JIS * t1 ) * sin( S * t2 ) * sin (JIS * t2 ) Despues de la transformada de Fourier en t1 y t2, y teniendo en cuenta tambien al espin I, nos da: S I I

f1 f2

Esta es la huella tipica de un doblete en un COSY con fase sensitiva (phase-sensitive COSY). Los senos hacen que las seales sean dispersivas en f1 y f2.

Correlacion heteronuclear - HETCOR

El COSY (o experimento de Jenner) fue uno de los primeros 2D (1971), y es una de las secuencias de pulso 2D mas utiles para elucidacion estructural. Tiene miles de variaciones y mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc.). De manera similar podemos hacer un experimento 2D para determinar conectividad heteronuclear, osea, que 1H esta conectado a que 13C. Se le llama espectroscopia de correlacion heteronuclear (HETeronuclear CORrelation spectroscopy, o HETCOR). En este caso, la secuencia involucra tanto 13C como 1H, ya que de alguna manera tenemos que marcar las intensidades de los 13C con lo que le hacemos a las poblaciones de 1H. La secuencia basica es: 90

13C:

90

90

1H:

t1

{1H}

HETCOR (continuado)
Analizamos primero lo que le pasa a los 1Hs en un CH (osea, vamos a ver como afectamos a las poblaciones de 1H), y despues vemos como afectamos a la seal de 13C. Para diferentes valores de t1 tenemos:
y z

90, t1 = 0
x

90
y y z

90, t1 = J / 4
x

90
y y z

90, t1 = 3J / 4
x

90
y

HETCOR (mas)
Como en el COSY, vemos que dependiendo del tiempo t1 que usemos, tenemos una variacion periodica en la inversion de poblacion de los 1H. Podemos ver claramente que la inversion depende del acople JCH. A pesar de que lo hicimos en resonancia para simplificar, podemos ver que esta variacion tambien va a depender de la frecuencia de los 1H (). De lo que sabemos de IPS e INEPT, podemos predecir que la variacion en las poblaciones de 1H va a tener el mismo efecto periodico en la transferencia de polarizacion a 13C. En este caso, el diagrama de energia para dos espines (1H y13C) seria:
13C

C H

2
1H

C H
1H

1,2

3,4

C H

1,3 2,4 C H
13C

Ahora, como la intesidad de la seal de 13C que detectamos en t2 esta modulada por la frecuencia del 1H acoplado, la FID de 13C tiene informacion sobre las frecuencias de 13C y de 1H.

HETCOR (y mas)
De nuevo, la intensidad de las lineas de 13Cs va a depender de la inversion de poblacion de 1Hs, osea, de 1H. Si graficamos a distintos t1s, nos da:

t1 (1H)

La intensidad de las dos lineas de 13C va a variar con 1H y JCH entre +5 y -3 como en el caso de la secuencia INEPT.

13C

f2 (t2)

Matematicamente, la intensidad de una de las lineas de 13C del multiplete va a ser una ecuacion que depende de 13C en t2, de 1H en t1, y de JCH en las dos dimensiones:

A13C(t1, t2) trig(1Ht1) * trig(13Ct2 ) * trig(JCHt1) * trig(JCHt2)

HETCOR (y mas)
Una transformada de Fourier en las dos dimensiones nos da es espectro de correlacion 2D (como contornos): 13C

JCH f1 f2

1H

La diferencia principal con el COSY es que el espectro 2D no es simetrico, porque un eje tiene frecuencias de 13C y el otro de 1H. Barbaro, pero todavia tenemos acople JCH en todas las seales del espectro 2D que aparecen como cuadrados. El rango de JCH es 50 - 250 Hz, y por lo tanto vamos a tener un monton de superposicion de cross-peaks de distintos sistemas de espines CH. Vamos a ver como eliminamos esto sin desacoplar (si desacoplamos todo el tiempo eliminamos la transferencia de polarizacion de 1H a 13C...).

HETCOR sin acople JCH

La idea es basicamente hacer lo mismo que hicimos en el experimento INEPT reenfocado. 180 t1 / 2
13C:

90 t1 / 2 90 1 2

90

1H:

t1

{1H}

El pulso de en 13C es para reenfocar la magnetizacion de 1H, y los dos periodos variables estan para maximizar la transferencia de polarizacion de 1H a 13C y para tener reenfoque de los vectores de 13C antes de desacoplar. Como en el INEPT, la efectividad de la transferencia va a depender del periodo y del tipo de carbono. Usamos un valor promedio. Analizamos el caso de un carbono CH...

HETCOR sin acople JCH (continuado)

Para cierto valor de t1, el comportamiento de la magnetizacion de 1H es: z
y

90
y

(1H - J / 2) (1H + J / 2)
y x

t1 / 2
y

18013C
x

t1 / 2
x

Si hacemos que 1 sea 1 / 2J, los dos vectores de 1H van a desfasarse exactamente 180 grados. Aca es que tenemos la mayor inversion de poblacion para este t1 en particular, y ningun efecto JCH:
y z

1
x y

90
x

HETCOR sin acople JCH (mas)

Que pasa con la magnetizacion de 13C? Despues del / 2 en 1H vamos a tener dos vectores de 13C separados en un radio 5 / 3 en el eje z. Despues del segundo periodo 2 (que lo hacemos 1 / 2J) se van a reenfocar:
z

5 90
x y

2 3 5
x

5 3

Ahora podemos desacoplar 1H porque la magnetizacion de 13C esta reenfocada. El espectro 2D no tiene acoples J CH (pero aun tiene informacion de corrimientos quimicos), y lo vemos como un solo cross-peak centrado en los corrimientos quimicos de 1H y 13C:

1H f1 f2 13C

HETCOR de larga distancia

Los periodos 1 y 2 estan seleccionados de forma de maximizar la magnetizacion en antifase de 13C para acoples 1J . Osea, y estan en el rango de 2 a 5 ms (el 1J CH 1 2 CH promedio es ~ 150 Hz, y los periodos 1 y 2 eran 1 / 2J). Esto funciona para protones y carbonos directamente enlazados (1JCH). Si tomamos como ejemplo parte de lo que seria el HETCOR del alcanfor:
H3C CH3 H

b a
H3C O

Una expansion del espectro para los carbonos a y b seria mas o menos asi : f2 (13C) Hb f1 (1H) Ha Hc Ca Cb

HETCOR de larga distancia (continuado)

El problema es que los carbonos a y b son muy parecidos quimica y magneticamente: Solo con esta informacion no podemos determinar cual es cual. Seria bueno poder determinar cual de los dos carbonos esta mas cerca al proton en Cc, ya que de esa forma podriamos asignar inequivocamente los dos carbonos en el alcanfor:
H3C CH3 H

Hb Ha Hc

b a
H3C

Ca

Cb

Como podemos hacer esto? Hay, en principio, una experimento muy simple que se basa en acoples C-H de larga distancia. Aparte de los acoples 1JCH, los carbonos y protones van a and tener acoples de larga distancia, que van a ser de dos o tres enlaces (2JCH o 3JCH). Las magnitudes son mucho mas chicas que las de los acoples directos, pero igual son considerables, entre 5 y 20 Hz. Podemos modificar el HETCOR para que nos muestre nucleos correlacionados por acoples de larga distancia?

HETCOR de larga distancia (mas)

La clave esta en entender lo que hacen los periodos variables en la secuencia, en particular 1 y 2. Estos se usaban para reenfocar magnetizacion de 13C en antifase. Para la parte de la secuencia en 1H:
y z

1
x y

90
x

Para la parte en 13C:

z

5 90
x y

2 3 5
x

5 3

Para reenfocar, osea, para obtener los vectores -3 y +5 alineados, y en el caso de un CH, los periodos 1 y 2 tienen que ser 1 / 2 * 1JCH. Que pasaria si cambiamos los periodos 1 y 2 a 1 / 2 * 2JCH?

HETCOR de larga distancia (y mas)

Para empezar, 1 y 2 van a ser ~50 ms, mucho mas largos que antes (~5 ms). Lo que va a pasar ahora es que la magnetizacion de 13C que este en antifase debido a acoples 1J CH no se va a reenfocar, y va a tender a cancelarse. Para la parte del reenfoque de 1H:
y z

1
x

90
x y

Los periodos variables no tienen nada que ver con 1JCH, y no tenemos inversion completa de las poblaciones de 1H. Ahora, para la parte de 13C:
z y y

<5 90 <3
y x

<5 <3
x

2
x

Cuando desacoplemos 1H, vamos a eliminar casi toda la seal de 13C que evoluciono bajo efectos de 1JCH

HETCOR de larga distancia (y mas)

Al final, vemos que la mayor parte de la magnetizacion que eveoluciono bajo efectos de 1JCHs (tanto 1H o 13C) va a desaparecer. En cambio, la magentizacion de 13C en antifase que se origino debido a 2JCHs a tener los 1 and 2 correctos, y se va a comportar como vimos antes. Para 1H:
y z

1 (1 / 2 2JCH) Para 13C:

z y y

90
x y x

5 90
x y

2 (1 / 2 2JCH)

5 3

El resultado es que solo los 13C con acoples 2JCH van a dar correlaciones en el HETCOR y podemos ver los enlaces de larga distancia.

HETCOR de larga distancia (...y mas)

Considerando que todo esta en nuestro favor, obtenemos:
H3C CH3 H

Hb Ha Hc

b a
H3C

Ca

Cb

Barbaro. Ahora vemos el acople de larga distancia, y podemos determinar cual CH2 es cual en el alcanfor. La explicacion la hicimos para CHs, pero eso lo mismo para CH2s y CH3s. En realidad, nada funciona como queremos (Murphy). Esta secuencia tiene varios problemas. Primero, seleccionar los 1 y 2 para ver 2JCH en vez de 1JCH es un centro al area. Segundo, aparte del periodo de evolucion (que es del orden de 10 a 20 ms), los periodos 1 y 2 son bastante mas largos. Vamos a tener un monton de relajacion de los 13Cs, y las seales van a ser petizas. Mas importante aun, como los 1Hs se relajan mucho mas que los 13Cs, la transferencia de polarizacion va a ser minima, y por lo tanto no vamos a ver correlaciones fuertes.

HETCOR-COLOC
Como solucionamos esto? Si queremos usar la misma idea que hasta ahora, i.e., reenfocar la magnetizacion de 13C asociada con 2JCH, tenemos que mantener a 1 y 2. El unico periodo que podemos acortar, en principio, es el periodo de evolucion variable, t1. Como hacemos esto si necesitamos que este periodo crezca de experimento a experimento para obtener la segunda dimension? La solucion es hacer un experimento de tiempo constante. Esto involucra tener un tiempo de evolucion t1 que en total es constante e igual a 1, pero poner pulsos de 180 dentro del periodo de evolucion y que avanzen durante este tiempo. Un ejemplo de este tipo de secuencia es llamado COrrelations via LOng-range Couplings, o COLOC: 180 t1 / 2
13C:

90 1 - t1 / 2 2 90 1 - t1 / 2 1 2

90 t1 / 2
1H:

180

{1H}

HETCOR-COLOC (continuado)
Como se ve en la secuencia, el periodo 1 queda igual, asi como tambien el periodo t1 total. En cambio, logramos la evolucion en t1 avanzando de forma constante los dos pulsos de 180 durante el periodo t1 de experimento a experimento. Podemos analizar como funciona la secuencia de la misma forma en que analizamos el HETCOR comun. Hacemos el analisis para un C-C-H. El primer pulso de 90 en 1H pone a la magnetizacion de 1H en el plano <xy>, donde evoluciona bajo el efecto de JCH (2JCH en el caso de C-C-H) por un periodo t1 / 2, que es variable. La combinacion de pulsos de 180 en 1H y 13C invierte la magnetizacion de 1H y las marcas de los vectores de 1H:
y y

...

t1 / 2

18013C
x 1801H

HETCOR-COLOC (mas...)
Despues de 1 - t1 / 2, la magnetizacion continua desfasandose. Pero como el tiempo total es 1, vamos a tener inversion completa de la magnetizacion de 1H, y por lo el maximo de transferencia de polarizacion de 1H a 13C. Ademas, marcamos la magnetizacion de 13C con la frecuencia de 1H (que nos da la correlacion). Como siempre vamos a tener inversion completa de la magnetizacion de 1H y reenfoque, no tenemos acoples 2JCH en la dimension de 13C (f1). Finalmente, en el periodo 2 tenemos renfoque de la magnetizacion 13C en antifase, de la misma forma que en el HETCOR reenfocado, y podemos desacoplar durante la adquisicion para eliminar 2JCH en la dimension f2:
z

5 90
x y

2 3 5
x

5 3

La ventaja de esta secuencia es que hacemos lo mismo que en un HETCOR pero en mucho menos tiempo porque el periodo 1 esta incluido en la evolucion durante t1. Es mas, en vez de aumentar t1 de experimento a experimento, movemos sistematicamente los pulsos de 180 para obtener transferencia de polarizacion y marcado por frecuencias.