Вы находитесь на странице: 1из 38

Трехпетельные (3-finger) токсины змей

и их структурные гомологи в нервной и иммунной


системе млекопитающих.
11. Пептидные и белковые токсины из ядов
животных.
2. Аминокислотные последовательности и
организация генов 3-х-петельных токсинов.
3. Пространственная структура различных групп
3-х-петельных токсинов (α-нейротоксинов,
цитотоксинов, мускариновых токсинов и др.).
4. Анализ взаимодействия нейротоксинов с
рецепторами (аффинные модификации, мутагенез и
др.).
5. Анализ взаимодействия токсинов с фрагментами
рецепторов.
6. Модели токсин-рецепторных комплексов в свете
данных рентгеноструктурного анализа для
ацетилхолинсвязывающего белка.
7. “Слабые токсины” змей – наиболее близкие
структурные гомологи белков семейства Ly-6 и
«эндогенного» токсина млекопитающих.
Peptide and polypeptide toxins
Primary structure
Toxins number of a.a.residues disulfide bridges Target
Snakes
α-neurotoxins 60-75 4-5 nicotinic acetylcholine
receptors (nAChR)
muscarinic toxins 65 4 muscarinic acetylcholine
receptors (mAChR)
fasciculins 61 4 acetylcholinesterase (AchE)
calciseptins 60 4 Ca2+-channels
dendrotoxins 57-60 3 K+-channels
dendroaspin 58 4 cell
adhesion
cardiotoxins 60 4 membranes
Sea anemona
Toxin II Anemonia sulcata 47 3 Na+-
channels
Scorpions
α -scorpion neurotoxins 65 4 Na+-channels
leirutoxin I 31 3 K+-channels
charybdotoxin 37 3 K+-channels
Spiders
ω-atrachotoxin 36 3 Ca2+-channels (from
insects)
Bees
apamin 18 2 K+-channels
MCD-peptide 22 2 K+-channels
Marine snails
α-conotoxins 12-18 2 nAChR
Аминокислотные
последовательности
3-петельных токсинов и
родственных белков
Полная структура кДНК кардиотоксина 4
Naja naja atra:
Chang,L.S., Lin,J., Chou,Y.C. and Hong,E..Biochem. Biophys. Res. Commun.
239, 756-762 (1997)

signal peptide Intron I


1 atgaaaactc tgctgctgac cttggtggtg gtgacaattg tgtgcctgga cttag↓gatac

61 accaggaaat gtaacaaact cgttccttta ttctataaga cttgtccagc agggaagaac


Intron II
121 ttatgctata aaatgttcat ggtgtcgaat ttaacggt↓tc ctgtcaaaag gggatgtatt

181 gatgtttgcc ctaaaaacag tgccctagtg aagtatgtgt gttgcaatac agacagatgc

241 aactga
1. Tsetlin V.I. (1999). Snake venom α - D.Servent, A. Menez (2002) in:Handbook of
neurotoxins and other three-finger proteins. Neurotoxicology, vol.1.
Eur.J.Biochem. 264, 281-286
• размер петель
• расстояние между петлями
• межпетельные взаимодействия (H-связи,
гидрофобные взаимодействия )
• содержание гидрофобных и заряженных
остатков; их распределение на поверхности
• стабильность в целом и подвижность отдельных
петель
• тенденция к олигомеризации
•Comparative analysis of toxicity (or affinities for AChR)
for homologous naturally occurring toxins and their
chemically modified derivatives
• Electron microscopy of toxin-AChR complexes
•Binding of neurotoxins or their synthetic fragments to
isolated AChR α -subunit or to its fragments (or to
peptides from combinatorial libraries)
• Incorporation of reporter groups into neurotoxins and
monitoring of their interaction with the AChR
•Mutations in the AChR, in neurotoxins, or in both of
them
Spectral and photoaffinity labels in mapping the Torpedo AChR-binding
surface of snake venom α -neurotoxins
______________________________________________________________
Neurotoxin, Fluorescence Spin Photoaffinity

loop, and label position label type, presence (+) or absence (-) of contact with receptor

Dns SL1 SL2 SL3 AzBz SAED Diaz BzBz


______________________________________________________________
Neurotoxin II Naja oxiana
loop I Leu1 - + + - - -
Glu2 +
Lys15 - + + + +
loop II Lys25 + + + + + -
Lys26 + + + + + +
His31 +
loop III Lys44 - +, - + + +
Lys46 + + + + + +

Neurotoxin I Naja oxiana


loop II Lys37 +
loop III Lys56 +
C-tail His67 -

α -Cobratoxin Naja kaouthia


loop I Lys12 +, -
loop II Lys23 + + + +
Cys24-Cys30 +
Lys35 +
loop III Lys49 +
C-tail Lys69 -
Расположение и подвижность диазириновой фотометки
в CTX Lys23- производном

Yu.N.Utkin, A.V.Krivoshein, V.L.Davydov, I.E.Kasheverov, P.Franke, I.V.Maslennikov, A.S.Arseniev, F.Hucho,


V.I.Tsetlin. . Eur. J.Biochem. 253, 229-235 (1998)
Связывание нейротоксинов змей на поверхности раздела
субъединиц ацетилхолинового рецептора
Генетическая инженерия токсинов змей

Tremeau O., Lemaire C., Drevet P., Pinkasfeld S., Ducancel F., Boulain J.-C., and
Menez A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 9362-9369
“Snake neurotoxins
that interact with
nicotinic
acetylcholine
receptors.”
D.Servent, A. Menez.(2002)
in:Handbook of
Neurotoxicology, vol.1.

Residues whose mutations


caused affinity decrease for
AChRs less than5-fold are in
green, 5-10-in yellow, 10-100-
in orange, 100 and more-red.
Electron microscopy of the
acetylcholine receptor complexes
with neurotoxins and antibodies

AchR and α-
bungarotoxin
Zingsheim, Barrantes et al.
(1982) Nature 299, 81-84

AchR and fragments of an MIR-directed


antibody
Beroukhim & Unwin (1995) Neuron 15, 323-331

Crosslinked AchR, biotinylated α-cobratoxin and


avidin. Karlin, Holtzman et al. (1983) J.Biol.Chem. 258, 6678-6681
Трехмерная структура комплексов α-
бунгаротоксина с синтетическими пептидами

Basus et al. (1993) Biochemistry 32, Scherf et al. (1997) Proc. Natl. Acad.
12290 Sci.USA 94, 6059

185 190 195


K H W V Y Y T C C - - - - P D T фрагмент α-субъединицы
MRYYESSLKSYPD пептид из библиотеки
Crystal structure of the ACh-binding protein reveals the ligand-
binding domain of nicotinic receptors.
K.Brejc et al (2001) Nature 411, 269-276
The binding site of acetylcholine receptor as visualized in the X-ray structure of a
complex between α-bungarotoxin and a mimotop peptide.
Hare M. et al. (2001) Neuron 32, 265-275

Comparison of spatial structures of


combinatorial peptide (red) and the
loop 182-193 of AChBP

A model of α-Bgt insertion between HAP M-R-Y-Y-E-S-S-L-L-P-Y-P-D


the two subunits of AChBP
AChBP 182-194 S-V-T-Y-S-C-C-P-E-A-Y-E-
D
Модель связывания α-бунгаротоксина с AChBP и
α7-никотиновым ацетилхолиновым рецептором (AChR)

Модель связывания α-бунгаротоксина с AChR Torpedo californica


Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake
alpha-neurotoxins and nicotinic receptors.
Bourne Y, Talley TT, Hansen SB, Taylor P, Marchot P. EMBO J. 24(8),1512-22 (2005)
α -Bungarotoxin Binding to Acetylcholine Receptor Membranes Studied by Low
Angle X-Ray Diffraction

Howard S. Young, Leo G. Herbette and Victor Skita


Biophysical Journal 85:943-953 (2003)
FIGURE 7 (a) Comparison of the average
difference electron density profile (z) (black
line) and the profile structure for the nAChR
membrane in the absence of toxin (gray line)
with the 3D models of Harel et al. (2001) and
Moise et al. (2002). In these two models, the
AChBP is in gray and α-toxin is in green (Harel
et al, 2001) and red (Moise et al., 2002). (b) A
complex of AChBP (Brejc et al., 2001) and two
toxin molecules (Moise et al., 2002) was
constructed and the number of electrons was
projected onto the z axis parallel with the
channel for AChBP alone (thick gray line), two
-toxin molecules alone (thick black line), and
the complex of AChBP and two α -toxin
molecules (thin black line). The resultant
electron density profiles are atomic resolution
models of the nAChR synaptic domain in the
absence and presence of two α -toxin molecules.
Emulsification of the lipidic phase results in growth of micrometersized AChR-{alpha}BTx crystals

Paas, Yoav et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11309-11314

(A) A few thin crystal plates that grew on slow liquefaction of MO cubic phase that harbored AChR– BTx
nanocrystals. Shown is a picture taken under a regular light. The dimensions of the largest crystal are: 300 µm
x 30 µm x 15 µm. (B) The same crystals as shown in A but under polarized light.
Copyright ©2003 by the National Academy of Sciences
Expression in HEK 293 cells of glutamate receptor subunits tagged with GFP and α-bungarotoxin
–binding site (BBS)

Sekine-Aizawa, Yoko and Huganir, Richard L. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 17114-17119

Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences


Detection of surface-expressed BBS-tagged GluR2 with rhodamine-BTX in cultured cortical and
hippocampal neurons

Sekine-Aizawa, Yoko and Huganir, Richard L. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 17114-17119
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
Кристаллическая структура
комплекса фасцикулина с
ацетилхолинэстеразой мыши
Y.Bourne, P.Taylor , and P.Marchot.Cell 83, 503-512
(1995)
Первый триптофансодержащий “слабый нейротоксин” из яда кобры.
Utkin Y.N., Kukhtina V.V., Maslennikov I.V., Eletsky A.V, Starkov V.G., Weise C., Franke P., Hucho F.,
Tsetlin V.I. Toxicon 39(7), 921-927 (2001)
Взаимодействие α- нейротоксинов и α- конотоксинов
с внеклеточным доменом α7- холинорецептора

α-conotoxin ImI
α-cobratoxin

weak neurotoxin

Utkin Y.N., Kukhtina V.V., Kryukova E.V., Chiodini F., Bertrand D., Methfessel C., Tsetlin V.I.
Weak toxin from Naja kaouthia is a nontoxic antagonist of alpha 7 and muscle-type nicotinic
acetylcholine receptors. J. Biol. Chem. 276, 15810-15815 (2001)
Utkin Yu.N., KukhtinaV.V., Kryukova E.V., Chiodini F., Bertrand D.,
Methfessel C., Tsetlin V.I. J. Biol. Chem. 276, 15810-15(2001)
Конформационно-зависимые антитела против нативного WTX различают
несколько групп 3-петельных токсинов, но не их денатурированные формы

OWT
2,2 WTX
2,0 MTLP-2
1,8 CTX
1,6 CT1
1,4 CT2
1,2
NT1
rcmNT1
OD492

1,0
NT2
0,8
rcmNT2
0,6
vpOWT
0,4
G1
0,2

0,0

-0,2
1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2

-lgC
Филогенетическое древо трехпетельных токсинов
Трехпетельные белки семейства Ly-6.

1. UPAR –рецептор UPA


UPA (urokinase-type plasminogen activator) – это сериновая протеаза,
участвующая в деградации внеклеточного матрикса (ее мишень –
плазминоген, неактивный предшественник сериновой протеиназы –
плазмина). Плазмин расщепляет фибрин, фибронектин, ламинин.
Действие протеаз ограничивается выбросом соответствующих
ингибиторов в определенные области. Локализация (и ограничение
действия протеаз), благодаря связыванию с соответствующими
рецепторами на клеточной поверхности.
Пример: связывание UPA с UPAR (UPAR обнаруживается на конусах роста
нервов и на “переднем” крае мигрирующих лейкоцитов; блокирование
UPAR – путь к остановке метастазирования).
2. Продукт гена odr-2 C.elegans:
регулирует клеточную сигнализацию при хемотаксисе в ответ на действие
аттрактантов (обоняние). Chou et al. (2001) Genetics 157, 211-224.
Lynx1 – эндогенный прототоксин или токсиноподобный
модулятор никотиновых ацетилхолиновых рецепторов.
- белок связан с мембраной с помощью GPI якоря

- ранее показано действие на nAChR растворимого lynx1, экспрессированного в E.coli.


- совместная локализация на нейронах ЦНС и физическая ассоциация (образование
устойчивых комплексов lynx1 с α4β2 и α7 AChR).
Модулирующие эффекты lynx1 на α4β2 AChR:
- увеличение доли токов с высокой амплитудой
- снижение чувствительности к ACh (увеличение ЕС50)

- увеличение скорости и степени десенситизации, замедление реактивации после


десенситизации (действие lynx1 может компенсировать хроническое воздействие
никотина).

Мутации: для активности lynx1 необходим S-S мостик в N-концевой петле (С2С3) и
дисульфид С4С6 (фиксирующий эту петлю относительно всего остова).
Miwa J.M. et al (1999) Neuron 23, 105-114; Ibanez-Tallon I. Et al. (2002) Neuron 33, 893-903
Прикрепление природных токсинов к мембране для автономного in vivo
модулирования рецепторов и ионных каналов
Ibanez-Tallon I. et al (2004). Neuron 43, 305-311
HPLC/MALDI MS identification of new
three - fingered toxins in cobra venoms

- muscarinic-toxin like proteins,


- glycosylated cytotoxin
MS detection and isolation of glycosylated protein
from N. kaouthia cobra venom

Vydac C 18 column (4.6x250 mm) , aqueous acetonitrile gradient from 15 to


45% in 0.1% TFA ion 30 min, 1ml/min
The first representative of glycosylated three-fingered toxins.

Cytotoxin from the N. kaouthia cobra venom.

Osipov A.V., Astapova M.V., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. Eur.J.Biochem.271, 2018-27(2004)