Вы находитесь на странице: 1из 37

Мышечные и нейрональные

никотиновые ацетилхолиновые
рецепторы :

от электрического ската Torpedo до пресноводной


улитки Lymnaea за 30 лет.
Идентификация и выделение рецепторов и ионных каналов
с помощью нейротоксинов
____________________________________________________________________________________________
рецептор/канал токсин
____________________________________________________________________________________________

никотиновый холинорецептор α-нейротоксины змей


Na+-канал нейротоксины скорпиона
К+-канал апамин (нейротоксин из яда пчелы)
рецептор глицина стрихнин
Cа2+-каналы ω-конотоксин (нейротоксин из яда
ракушек Conus)
____________________________________________________________________________________________
___
План лекции
– АХР ската: прообраз всех никотиновых холинорецепторов и ряда других лиганд-управляемых
каналов.

– пространственная структура рецептора Torpedo: 1981-2001 гг. (до установления


кристаллической структуры ацетилхолин-связывающего белка).

– мышечные, нейрональные и «прочие» холинорецепторы; разнообразие комбинаций


субъединиц и функции различных подтипов рецепторов.

– заболевания, связанные с нарушением функций холинорецепторов.

– структура и функции доменов холинорецепторов.

– 2001 г.: открытие ацетилхолин-связывающего белка и установление его кристаллической


структуры;

построение моделей лиганд-связывающих доменов холинорецепторов


улучшение разрешения электронной микроскопии рецептора Torpedo.
Схема межнейронных и нервно-мышечных синапсов.

Межнейронный синапс Электрический синапс. Нервно-мышечный синапс


Проходят ионные токи и
низкомолекулярные соединения
(ATP, вторичные мессенджеры)
Общая форма молекулы ацетилхолинового рецептора из электрического
органа ската Torpedo californica по данным электронной микроскопии

R.Stroud et al., 1981


Основные этапы исследования никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

1940 (D.Nachmanson) : Установление холинергической природы ответа электрического органа ската


Torpedo
1957 ( (B.Katz, S.Thesleff): Использование микроэлектродных методик и доказательство кооперативности в
активации рецептора ацетилхолином
1975-1978 : Исследование «доза-ответ» для ацетилхолиновых рецепторов методом пэтч-клэмпа
1972-1974 (J.-P.Changeux) :Выделение рецептора с помощью аффинной хроматографии на нейротоксинах
змей
1978 (A.Karlin): Определение молекулярной массы (250 kDa) и субъединичного состава (α2βγδ)
1980 (M.Raftery) : Определение N-концевых последовательностей субъединиц
1981 ( R.Stroud) : Установление общей формы рецептора Torpedo с помощью электронной микроскопии
1978-1985 (A.Karlin, J.-P.Changeux) : Аффинные модификации
1982 (S.Numa): Клонирование субъединиц, модель топологии (М1-M4)
1986-1987 (F.Hucho, J.-P.Changeux) : Идентификация остатков, связывающих блокаторы канала, модель
организации канала из MII спиралей
Модель структуры ацетилхолинового рецептора Torpedo
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы

Рецепторы мышечного типа

из электроцитов Torpedo α 2βγδ cвязывают α-бунгаротоксин и другие


нейротоксины змей,
из мышц млекопитающих блокируются α-конотоксинами G1 и M1

эмбриональная форма α 2βγδ

зрелая форма α 2βεδ


Нейрональные рецепторы

(α 2-10)x(β2-4)y связывают ‘нейрональные” бунгаротоксины, α-конотоксин MII

x +y =5

(α7)5 связывают α- бунгаротоксин, α-конотоксин ImI

(α8)5 , (α9)5

Проблемы: мышечные дистрофии, нейродегенеративные заболевания,


никотиновая зависимость, создание новых инсектицидов
Модели структурной организации гетеромерных
и олигомерных нейрональных никотиновых
ацетилхолиновых рецепторов
Субъединичная структура никотиновых рецепторов
Химерный никотиновый-серотониновый рецептор, сочетающий
лиганд-связывающие свойства и канальные характеристики этих
рецепторов.
Eisele JL, Bertrand S, Galzi JL, Devillers-Thiery A, Changeux JP, Bertrand D. (1993) Nature 366,479-83
Мутации в канальной части нейронального никотинового рецептора
превращают катионную ионную селективность в анионную.
Galzi JL, Devillers-Thiery A, Hussy N, Bertrand S, Changeux JP, Bertrand D 1992. Nature 359,500-505
Локализация генов субъединиц никотиновых рецепторов на хромосомах
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы

Мышечные рецепторы

1. Миастения (myasthenia gravis): аутоантитела гл.обр. против области 67-76 лиганд–


связывающего домена α-субъединицы
2. Конгенитальные миастенические синдромы («каналопатии»): мутации в канальной
части
рецептора.
Нейрональные рецепторы
1. Эпилепсия :
(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE) - мутация Ser248Phe или вставка Leu259 в α4
АХР.
2. Повышенная реакция на звуковые сигналы (auditory gating deficit):
уменьшение содержания α7 АХР
3. Болезнь Альцгеймера:
нарушение холинергической передачи и когниционных способностей, уменьшение числа никотин-
связывающих центров; непосредственное взаимодействие α7 АХР с β-амилоидным пептидом, активация
МАРК каскада
4. Болезнь Паркинсона:
утрата дофаминовых нейронов и никотин-связывающих центров
5. Никотиновая зависимость:
индуцирование никотином увеличения содержания определенных подтипов АХР и их десенситизация
6. Боль:
поиск новых избирательных агонистов АХР; разработка анальгетиков: агонистов α4β2 АХР (Abbot) и α7
селективных агонистов (TS21, Taiho Pharmaceuticals)
Мышечные никотиновые ацетилхолиновые
рецепторы
• Миастения (myasthenia gravis):
аутоиммунное заболевание: антитела против AChR способствуют деградации
рецепторов. MIR (main immunogenic region) –а.к. остатки 67-76 (главная
иммуногенная область)
Диагностика: ИФА с использованием радиоактивных токсинов.
Домен 1-210, экспрессированный в E.coli: диагностика и лечение (пероральное и
интраназальное введение).
AMC (arthrogryposis multiple congenita) – у матери антитела против AChR плода (т.е.
антитела против α/γ участков рецепторов).

• «Каналопатии» (channelopathies, congenital myathenic


syndromes):
мутации в самих ацетилхолиновых рецепторах вызывают нарушения мышечной
деятельности
Мутации в холинорецепторах при миастении и эпилепсии
Электронная микроскопия комплекса рецептора Torpedo с
антителами против MIR (главной иммуногенной области)

Beroukhim & Unwin (1995) Neuron 15, 323-331


Мутации в нейрональных AChRs и психические
заболевания

•ADNFLE – autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy


Мутации в α4 AChR:
- Ser248 Phe – ускорение десенситизации и замедление ре-сенситизации
- Инсерция Leu259 (снижение проницаемости для Са2+)
Механизм действия: снижение скорости выброса ингибирующих
трансмиттеров?

•Шизофрения (auditory gating deficit): уменьшение содержания


α7 AChR.
Нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы в
норме и при патологиях
Knockout отдельных субъединиц у мышей:
α3 -/- дефекты нервной системы, летальна 1-7 дней постнатально
α4 -/- утрата способности связывать никотин и эпибатидин;
снижение чувствительности к антиболевому действию никотина
α7 -/- исчезновение быстро десенситизирующихся никотиновых токов в
гиппокампе, поведенческие реакции не изменяются
β2 -/- утрата высокоаффинных центров связывания никотина и ухудшение
способности к обучению
β3 -/- утрата чувствительности к α-конотоксину MII, ингибирующему
стимулируемое никотином высвобождение дофамина, увеличение
локомоторной подвижности
β4 -/- уменьшение вызываемых никотином токов
β2 и β 4 -/- дефекты нервной системы, летальна 1-3 недели постнатально
Вызываемое никотином увеличение числа
никотиновых рецепторов

• Увеличение числа центров связывания никотина и/или


α-бунгаротоксина.
• Различие этого эффекта для разных подтипов АХР:
α4β2 - наиболее сильная положительная регуляция
(ингибирование при хроническом воздействии)
α7 - положительная регуляция
α3β2 - не ингибируются при хроническом действии

• Быстрая десенситизация (уцелеет только α3)

• Возможность необратимой инактивации рецепторов


Разноообразие нейрональных
никотиновых ацетилхолиновых
рецепторов.

• Постсинаптические
• Пресинаптические: являются кальциевыми каналами,
способствуют выбросу везикул с нейромедиаторами.
• Существует популяция пресинаптических α7
холинорецепторов, для которых медиатором служит холин.
• Нейрональные или «нейрональноподобные» ацетилхолиновые
рецепторы присутствуют и в других тканях:в кератиноцитах
кожи, эпителиальных клетках, в клетках карциномы легких
Структурно-функциональные
исследовния изолированных доменов
ацетилхолинового рецептора
“Reductionist approach” in structural studies on acetylcholine receptor

Removal of the
extramembrane domains PAGE/HPLC
separation of individual
subunits
Proteinase K

Goerne-Tschelnokov et al (1994)
EMBO J. 13, 338-341
Heterologous
Peptide synthesis and NMR expression

C
1
M3
Kasheverov et al. (1998) Protein
M1 M2 M3 M4 Expression and Purification 12,
226-232.

Lugovskoy et al. (1998)


Eur.J.Biol. 255, 455-461
Alexeev et al. (1998) Eur.J.Biochem. 259, 310-319
ЭМ домена АХР, собранного из доменов 1-210 α, β, γ и δ
субъединиц, экспрессированных в клетках насекомых

M.L.Tierney and N. Unwin. (2000) J.Mol.Biol. 303, 185-196


Кривые КД белков , сборка которых проведена в разных условиях

Detergent content Concent- Calculated secondary


Protein in refolding ration, structure, %
buffer mg/ml α β R
GST-α7(1-208) - 0.20 43 12 45
- 0.10 44 27 29
0.1% SDS 0.16 29 36 35
monomeric form 0.0005% SDS 0.13 39 23 38

GST-α7m(1-208) - 0.21 21 44 35
(C116S mutant)
- 0.84 20 47 33
0.1% SDS 0.20 19 47 34
monomeric form 0.0005% SDS 0.12 29 40 31

GST - 0.20 28 35 37
0.1% SDS 0.90 27 31 42

Tsetlin V., Dergousova N., Azeeva E., Kryukova E., Kudelina I., Shibanova
E., Kasheverov I., Methfessel C. Eur .J. Biochem.264, 2801-9(2002)
2001: Выделение и установление
кристаллической структуры
пентаолигомера ацетилхолин-
сязывающего белка из пресноводной
улитки
Ацетилхолин-связывающий
белок из глии L.stagnalis
модулирует нейропередачу.
A.B.Smit et al. (2001) Nature 411,
261-268
Кристаллическая структура ацетилхолин-связывающего
белка как модель лиганд-связывающих доменов.
K.Brejc et al (2001) Nature 411, 269-276
Замещение гидрофобной цистиновой петли 128-145 в α7 АХР на
гидрофильную петлю из АХСБ и экспрессия в дрожжах приводят к
растворимому олигомерному лиганд-связывающему домену

V.Avramopoulou, A.Mamalaki, S.J.Tsartos (2004) J.Biol.Chem. 279, 38287-38293.


Активация никотинового ацетилхолинового рецептора вызывает
изменения в конформации α-субъединиц.
N.Unwin et al. (2002). J.Mol.Biol.319, 1165-1176.
Miyazawa A, Fujiyoshi Y, Unwin N. (2003)
Structure and gating mechanism of the acetylcholine
receptor pore. Nature 424, 949-955.
Sine SM, Engel AG. Recent advances in Cys-loop receptor structure and function. Nature.
2006 ;440(7083):448-55. Review.

Unwin N. Refined structure of


the nicotinic acetylcholine
receptor at 4A resolution.
J Mol Biol. 2005 ;346(4):967-
89.