Молекулярные механизмы

передачи клеточного сигнала

Cell Signal Transduction

Белки в клеточной сигнализации

Клеточная сигнализация –
составная часть многих дисциплин и
охватывает обширную информацию о
биохимических механизмах,
регулирующих клеточную
физиологию.
Достигнутый в последнее время
прогресс в этой области обязан
исследованию самых разнообразных
систем – от бактерий до человека.
Молекулярные механизмы передачи клеточного сигнала

Cell Signal Transduction

Введение.
• Клеточная сигнализация
• Сенсорные системы (восприятие света, боль, мышление, память, поведение)
• Молекулы, передающие сигналы
• Молекулы, воспринимающие и трансформирующие сигналы
Классификация рецепторов:
рецепторы на поверхности клеток и внутриклеточные рецепторы.
• Лиганд-управляемые каналы
• G-белок-зависимые рецепторы
• Рецепторы-ферменты и фермент-ассоциированные рецепторы
Общие принципы в передаче и регуляции сигнала:
• Фосфорилирование и дефосфорилирование, посттрансляционные модификации
• Протеолиз
• Амплификация сигнала.
• Адаптация и десенситизация
• Удаление трансмиттера и рецепторов (убиквитинилирование и эндоцитоз)

Взаимосвязанность различных путей передачи сигнала (cross-talk)

Структурная организация рецепторов и рецепторных комплексов.
• Топология полипептидной цепи в мембране
• Олигомеризация, кластеризация
• Домены и модули
• Аллостерия
• Модели: рецептор-имитирующие токсины

Примеры сложных систем передачи клеточного сигнала.

• Са-сигнализация • хемотаксис • апоптоз • циркадный ритм.

Медицина и клеточная сигнализация.

• Передача сигналов на близкие и далекие расстояния:
“близкие”: паракринная (и аутокринная) сигнализация
“средние”: синаптическая передача
“далекие”: эндокринная сигнализация (перенос гормонов током крови, в том числе
и к удаленным мишеням)

• Протеолитические каскады (апоптоз, активация системы комплемента)

• Каскады фосфорилирования (Tyr-киназы, Ser/Thr-киназы)
• Интеграция множественных поступающих сигналов
Для специфического ответа клетки комбинируют несколько поступающих сигналов

• Координация процессов в пространстве и времени

• Способы прикрепления к мембране:
• трансмембранные фрагменты,
• наличие в белках доменов (например, PH – plekstrin homogy), связывающихся с липидами или
их компонентами (PIP3 – phosphatidyl-inositol triphosphate, DAG-diacylglycerol),

• посттрансляционная модификация: наличие остатков жирных кислот,

прикрепление С-концевого GPI (glycosylphosphatidylinositol) якоря.
Основы общности механизмов передачи клеточных сигналов.

1. Общие свойства строения и функций белка: пространственная

организация (домены и модули), свойства функциональных группировок, типы каталитической
активности, аллостерические взаимодействия, принципы организации лиганд-связывающих
центров, белок-белковые, белок-нуклеотидные, белок-углеводные и белок-липидные
взаимодействия.
2. Закономерности транспорта через биологические мембраны
ионов, низкомолекулярных соединений и биополимеров.

3. Локализация и перемещение участников клеточной сигнализации

Компоненты, участвующие в клеточной сигнализации, находятся “на своих
местах”: в цитозоле, в клеточной мембране, ядре, в различных клеточных
органеллах (митохондрии, эндоплазматический ретикулум и др.)

Важный этап многих процессов клеточной сигнализации – перемещение

компонентов из цитозоля в ядро.
 Межклеточная сигнализация

B.Alberts, D.Bray, J..Lewis, M.Raff, K.Roberts, J.D.Watson. (1994) Molecular

biology of the cell.
 Клеточная сигнализация через
межклеточные контакты ( gap junctions)
 Three-dimensional structure of a recombinant Gap junction
membrane channel
V.M.Unger et al.(1999) Science 283, 1176-1180

The dodecameric channel is formed by head-to-head docking of two hexamers.The 24 observed

rods in the membrane correspond to 4 transmembrane helices of each connexin subunit
 Нейромедиаторы
Классические Пептидные
нейромедиаторы нейромедиаторы

ацетилхолин
вещество Р
глицин
γ-аминомасляная кислота
глутаминовая кислота Газообразные
серотонин нейромедиаторы

дофамин
NO
адреналин (эпинефрин)
______________________ CO?

Аденозин, АТФ
Белки, участвующие в
построении синапсов.

Роль нейролигинов (neuroligins) в сборке

синапсов.

Слева: В возбуждающих синапсах транс-

синаптические взаимодействия между β-
нейрексином (β-neurexin, β-NXN) и
нейролигинами – 1 и 3 (NL-1,3) позволяют
выравнять пресинаптическую и
постсинаптическую мембраны. Таким
образом, пресинаптическая структура,
содержащая глутаматные
нейротранспортеры, оказывается напротив
постсинаптической структуры, содержащей
глутаматные рецепторы (GluR) и PSD-95
каркасные белки.

Справа: ингибиторный (GABA-

высвобождающий) синапс. NL-2 может
выполнять сходную функцию, связываясь с
β-нейрексином и приводя в соприкосновение
пре- и постсинаптические мембраны.
Три класса рецепторов на поверхности клеток

B.Alberts, D.Bray, J..Lewis, M.Raff, K.Roberts, J.D.Watson.

(1994) Molecular biology of the cell.
Открытие (закрытие) ионных каналов –
распространенный путь передачи сигнала и
активации клеточных процессов

Обоняние
Одорант→ G-белокзависимый рецептор → активация G-белка →
активация аденилатциклазы → синтез сАМР → открытие сАМР-
управляемого канала.

Зрение
Квант света → G-белокзависимый рецептор (родопсин) →
активация трансдуцина →
активация cGMP-фосфодиэстеразы → расщепление cGMР →
снижение уровня cGMP приводит к уходу cGMP из GMP-
управляемого Na+ канала → канал закрывается
 Два класса рецепторов
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ligand receptor topology superfamily

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Acetylcholine muscarinic 7TM G-coupled (G)
nicotinic 4TM ligand-gated (LG)
Adenosine (A1, A2A… A2B) 7TM G

Adrenoceptors (α, β… ) 7TM G

Dopamine D1, … D5 7TM G

Glutamate NMDA, AMPA, kainate 3TM? LG

metabotropic 7TM G
GABA GABAA 4TM LG

GABAB 7TM G

Histamine H1 , H3 7TM G

5-HT (serotonine) 5-HT1A, 1B

, 7TM G

5-HT3 4TM LG

Opioid µ δ κ 7TM G
Tachykinins NK1, NK2, NK3 7TM G
Bradykinin BB1, BB2 7TM, G
Трансмембранная топология полипептидных цепей рецепторов, каналов и транспортеров
Белок-белковые взаимодействия и димеризация G-
белокзависимых рецепторов.

G.Milligan, J.H.White (2001). Trends in Pharm.Sci. 22, 513-518.

 Кристаллические структуры ретиналь-содержащих
мембранных белков
Бaктериородопсин Родопсин

Lueke H. et al. (1999). Structural changes in

bacteriorhodopsin during ion transport at 2 Å Palczewski K. et al. (2000). Crystal structure
resolution. Science 286, 255-260 of rhodopsin, a model of G-protein-coupled
receptors. Science 289, 739-745
Основные пути генерации внутриклеточных медиаторов с
участием G-белоксопряженных рецепторов
 Ca2+ сигнализация

Участие в элементарных событиях Глобальные Ca2+ волны

(межклеточные процессы)
• Рост нервного окончания
• заживление ран
• Мембранная возбудимость
• функционирование глиальных
• Метаболизм митохондрий
клеток
• Секреция везикул
• секреция инсулина
• Релаксация гладкой мускулатуры
• синтез NO в эндотелии
• Синаптическая пластичность

Увеличение концентрации внутриклеточного Ca2+ (Ca2+ c )

Вход «внешнего» Ca2+
• рецептор-управляемые Ca2+ каналы (ROC) (в ответ на связывание
нейротрансмиттеров)
• через потенциалуправляемые Ca2+ каналы возбудимых клеток (VOC)
• запас-управляемые Ca2+ каналы (SOC) невозбудимых клеток

Выход Ca2+ из депо

эндоплазматического ретикулума (Ca2+ER) при активации IP3 рецепторов
Са2+-сигнализация в клетках иммунной системы.

Представлены каналы, участвующие в инициировании и модулировании

кальциевого ответа в Т-лимфоцитах после связывания Т-клеточных рецепторов
(TCR) с лигандом и активации Т-клеточной сигнализации.

В состоянии покоя в лимфоците KV1.3 каналы выкачивают К+ из клетки, а

SERCA (sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-АТФазы) закачивают Са 2+ в запасы
эндоплазматического ретикулума (ER).
Результирующий потенциал покоя – 65 mV.

Стимуляция TCR → активация фосфолипазы PCL-γ → продукция липидного

вторичного мессенджера InsP3 → связывание последнего с InsP3-рецептором на
мембране ER(A) → высвобождение внутриклеточного Са 2+(завершение стадии
А). Каналы СаV1 (В) активируются по неизвестному механизму после
стимуляции TCR и дают вклад в начальное увеличение [Ca2+]i. Затем
открываются Са 2+ release-activated Са2 каналы (CRAC), стадия (С), и наружный
Са 2+ поступает в клетку. Когда [Ca2+ ]i достигает порогового уровня, каналы
TRPM4 (D) активируются, и CRAC каналы ингибируются: в клетку входит Na+ и
деполяризируется мембрана. Ca2+ -активируемые KCa каналы (Е) также
активируются, что приводит к реполяризации клеток и последующему подъему
[Ca2+ ]i

Вставка: диаграмма типичного [Ca2+ ]i профиля, следующего за стимуляцией

TCR. Каналы, активные на каждой стадии, указаны под профилем.
Са2+-сигнализация в клетках
иммунной системы.
TCR - Т-клеточные рецепторы
SERCA (sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-
АТФазы) закачивают Са 2+ в запасы
эндоплазматического ретикулума (ER).
CRAC - Са 2+ release-activated Са 2+ каналы
A:Стимуляция TCR → активация PCL-γ →
продукция InsP3 → его связывание InsP3-
рецептором на мембране ER →
высвобождение внутриклеточного Са 2+.
B:Каналы СаV1 активируются; С: затем
открываются каналы CRAC; D - каналы
TRPM4 активируются, и CRAC каналы

ингибируются; Е - активируются Ca 2+
-активируемые KCa каналы

Вставка: диаграмма типичного [Ca2+]i

профиля, следующего за стимуляцией
TCR. Каналы, активные на каждой стадии,
указаны под профилем.
Winslow M., Crabtree G.R.
От фосфатидилинозита до активации протеинкиназы С и
высвобождения Са2+
Внутриклеточные пути инициации транскрипции генов
с участием активированной протеинкиназы С
Семейство рецепторных тирозинкиназ
Конструирование необратимых ингибиторов
киназ на основе структурной биоинформатики

Анализ активных участков 491 консервативных доменов

протеинкиназ человека → идентификация двух фильтров
селективности (остатки Thr и Cys) в активном центре р90
рибосомной протеинкиназы S6 (RSK) → дизайн
фторметилкетонного ингибитора (направленного против
обоих фильтров) → избирательное ингибирование RSK1
и RSK2.

Cohen M.S. et al .Structural bioinformatics – based design of selective,

irreversible kinase inhibitors Science 308, 318 (2005)
Новые методы идентификации белок-белковых
взаимодействий, участвующих в передаче клеточного
сигнала.

Тысячи дрожжевых белков (~ 5000-6000), нанесенных на микрочипы

Aнализ взаимодействия с набором киназ (экспрессировано и

определено 87 из 122 известных)
Белки на микрочипе + киназа + [ATP]* → некоторые белки на
микрочипе радиоактивно метятся → идентификация (по полжению
на чипе) меченых белков

~ 150 известных партнеров , > 4000 новых партнеров

(т.е. указание на вовлеченность новых сигнальных путей)

Протеинкиназы – один из наиболее важных классов

мишеней лекарств.
 Хемотаксис
Репеллент Аттрактант
Активация Инактивация
Лиганд-связывающие белки

Рецептор хемотаксиса

Цитоплазматические белки

Протеинкиназы (фосфатазы) Метилтрансферазы (метилэстеразы)

Фосфорилирование Метилирование

CheA, CheY-гистидинкиназы
CheW -способствует фосфорилированию
CheZ - способствует дефосфорилированию
Различные способы взаимодействия аттрактантов с
рецепторами хемотаксиса
Хемотаксис бактерий
Сравнение молекулярных выключателей CheY и Ras

ON ON

CheA +P GNRP +GTP

CheY Ras

CheZ -P GAP +GDP

OFF OFF
 Адаптация

(десенситизация) -

важный процесс, обеспечивающий

завершение передачи конкретного
сигнала и возможность восприятия
нового сигнала.
 Направленное движение лейкоцитов млекопитающих (хемотаксис)

Хемоаттрактанты: интерлейкин 8, Form-MetLeuPhe и др. Рецепторы: G-белок зависимые .

Субъединицы βγ активируют р110γ-каталитическую субъединицу фосфоинозитид-3-киназы (PI3 киназы)
(другие субъединицы р110α, β, δ других киназ активируются тирозин-киназными рецепторами через адапторные
молекулы) . Процесс сопровождается перераспределением многих клеточных компонентов (особенно
цитоскелета ) к лидирующему краю клетки (индуцируемая аттрактантом морфологическая полярность).
Миграция белков, имеющих РН-домены. Dekker L. V., Segal A.W. Science 287, 982 (2000)
Фототаксис и ретиналь-содержащие белки.

Science 26.05.00
Рецепторы семейства TRP (transient receptor potential)
Рецептор, активируемый
ментолом и низкой температурой
TRPM8 - ментол, t ~ 25-15°С
При понижении температуры и действии ментола
канал открывается, ионы Ca2+ и Na+ входят в
нейроны и деполяризуют их.
В некоторых нейронах присутствуют одновременно
TRPM8 и TRPV1.
TRPV1 (VR1) рецептор капсаицина, t > 43°С
TRPV2 (VRL1) t > 52°С
Киназная и фосфатазная активности TRP
(transient receptor potential)-каналов.

Первый обнаруженный TRP-канал: это Са2+

проницаемый канал, ответственный за
деполяризацию фоторецепторных клеток
дрозофилы в ответ на квант света. Недавно
открыта группа TRP-каналов, обладающих
киназной активностью. Их обширный
цитоплазматический домен имеет подобие с
Ser/Thr-протеинкиназами.
Влияние киназной активности на свойства
каналов.
Одна из функций – Са2+ регуляция
активности Т-лимфоцитов.

Runnels et al, Science 293, 1043 (2001) ;

Sano et al, Science 293, 1327 (2001)
Ассоциация кальмодулина с потенциал-зависимым кальциевым
каналом (VGCC-voltage-gated calcium channel)

Взаимодействие
кальмодулина с IQ-
кальмодулин-
связывающим
мотивом в
цитоплазматическом
домене канала.
R.E.Dolmetsch et al,
Science 294, 333 (2001)
 Фосфорилирование различными киназами
кальмодулина – внутриклеточного сенсора Сa2+
 Внутриклеточные рецепторы.

Примеры: рецепторы эстрогенов (ER)

Почему различные клетки отвечают на один и тот же гормон по-
разному?

1) разные типы экспрессии для двух генетически и функционально

различных типов ER (ERα и ERβ)

2) взаимодействие ER с различными транскрипционными кофакторами

(ко-активаторами и ко-репрессорами) приводит к положительной и
отрицательной регуляции транскрипционной активности
3) кофакторы различаются по функции и локализации в клетке.
В ERα имеются домены, ответственные за:

• связывание лиганда • димеризацию

• связывание ДНК • трансактивацию (AF1 и AF2)
AF1 – в N-концевой области, AF2 (в лиганд-связывающем домене).
Роль шаперонов в функционировании рецепторов стероидов

• связывание гормона с
рецептором, вытеснение
шаперонов
• взаимодействие гормон-
рецепторного комплекса с ДНК,
образование регуляторного
комплекса
• АТР-зависимая разборка
комплекса при участии
шаперонов, возвращение
рецептора в исходное состояние

Freeman B.C., Yamamoto K.R.

Disassembly of transcriptional
regulatory complexes by molecular
chaperones. Science 296, 2232
(2002)