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Prcticas de Virologa.

ndice
Prctica 1: Deteccin y cuantificacin de bacterifagos de Escherichia coli. Introduccin Material y mtodo Resultados y discusin Prctica 2: Aislamiento, purificacin y titulacin de un stock fgico. Introduccin Material y mtodo Resultados y discusin Prctica 3: Estudio comparativo de distintos filtros de membrana en la adsorcin y recuperacin de bacterifagos. Introduccin Material y mtodo Resultados y discusin Prctica 4: Lisogenia e induccin al ciclo ltico. Introduccin Material y mtodo Resultados y discusin Prctica 5: Fagotipia de Salmonella. Introduccin Material y mtodo Resultados y discusin Anexo. Medios de cultivo ndice NMP

Prctica 1: Deteccin y cuantificacin de bacterifagos de Escherichia coli.


>> Introduccin: El objetivo de la prctica es detectar y cuantificar bacterifagos especficos de E. coli (colifagos) en una muestra de agua residual, utilizando las tcnicas de recuento directo (Doble abar layer, DAL) y nmero ms probable (NMP). Como cepa hospedadora se utilizar Escherichia coli C (ATCC 13706). Por la tcnica DAL se detectan bacterifagos por placas de lisis. Una calva o placa de lisis es una zona de lisis o de inhibicin celular causada por la infeccin vrica en un cultivo de clulas sensibles. Para favorecer la adsorcin del fago en la clula hospedadora se usar medio agar Luria, el cual es un medio rico enriquecido en iones divalentes como Mg++ y Ca++. La tcnica DAL es poco util para muestras muy contaminadas: interferencias por parte de microorganismos diferentes al hospedador del bacterifago de interacciones de los fagos con materia orgnica particulada provocan que se subestime el ttulo vrico. Para eliminar el error por subestimacin debido a la contaminacin de la muestra, que nos puede impedir distinguir placas de lisis, someteremos a sta a distintos tratamientos fsicos o qumicos para eliminar los elementos contaminantes. Estos son los siguientes: - Medio selectivo: utilizacin del medio mFC como agar soporte en la tcnica de DAL. El medio mFC es un medio selectivo de bacterias coliformes fecales (como E. coli). - Pretratamiento de la muestra (a realizar sobre 10 ml de la muestra). Este paso permite eliminar la microbiota acompaante sin eliminar los bacterifagos, evitando que los microorganismos presentes nos oculten al crecer las calvas de lisis. Estos son los diferentes pretratamientos que se aplicarn: - centrifugacin: 3000 xg, 20 min. En el sobrenadante estarn los bacterifagos, el cual se recoger y se analizar por la tcnica DAL. - filtracin por membrana: filtros de policarbonato de 0.45 mm de tamao de poro. - filtros sin tratar: el tamao de poro del filtro impide que bacterias atraviesen el filtro, pasando solamente los bacterifagos. El inconveniente es que algunos fagos quedan adsorbidos a las membranas. - filtros tratados con solucin estril de extracto de carne al 3%, pH 9.0: este pretratamiento del filtro cubre las cargas negativas de este, disminuyendo la capacidad de retener los bacterifagos. - tratamiento con cloroformo: 10% de cloroformo, 4C durante 20 min. El cloroformo rompe las membranas lipdicas de bacterias Gram negativas. Tras incubacin se deja que precipiten las bacterias y se recoge el sobrenadante con los fagos. El inconveniente de esta tcnica es que tambien elimina los bacterifagos envueltos. - Control: como control usaremos la tcnica DAL sobre muestras sin tratar.

Para expresar los resultados se cuentan las placas de lisis y se procede a la titulacin de bacterifagos. Una placa de lisis procede a una partcula fgica, por lo que el nmero de placas que aparecen en el cesped bacteriano despus de la incubacin es directamente proporcional a la cantidad de fago sembrado. Si se producen y placas al sembrar un volumen v (en ml) de una dilucin x, el ttulo n de unidades formadoras de placas por mililitro (ufp/ml) es: n = y / vx. El recuento de placas de fagos es completamente anlogo a una enumeracin de colonias bacterianas; la relacin entre el nmero de placas y la cantidad de fago sembrada es estrictamente lineal. Esta linearidad puede explicarse porque cada placa procede de una sola partcula viral. La tcnica del nmero ms probable (NMP) es ms larga que la de DAL pero es tambin ms sensible ya que presenta un paso de enriquecimiento. Es un mtodo que se usa para aguas muy poco contaminadas. Este mtodo es muy sensible ya que con l somos capaces de detectar una sola partcula vrica en un volumen total de 33.3ml. Presenta tres fases: - Presuntiva: tendremos una batera de tres series de tres tubos a unos volmenes determinados. Con esta fase lo que pretendemos es conseguir un enriquecimiento de las partculas vricas presentes en la muestra. - Descontaminacin: la descontaminacin se puede hacer mediante centrifugacin o por adicin de cloroformo. Haremos uso de esta ltima. - Confirmativa: con esta ltima fase identificaremos qu tubo, de los sembrados en la prueba presuntiva, es positivo. Para ello haremos uso de la prueba de la gota de Adams, gracias a sta los positivos se detectarn por la formacin de placas de lisis. Una vez obtenida la combinacin de los positivos miraremos en las tablas del ndice NMP, basado en las distribucin de Poison, que nos dar el Nmero Ms Probable de partculas vricas en 100ml (NMP/100ml). >> Material y mtodo: Para la tcnica de DAL (Doble Agar Layer / Doble capa de agar) el material es el siguiente: - Cultivo en caldo de Escherichia coli C (ATCC 13706). - Solucin salina. - Agar Luria. - Agar blando. - Cloroformo. - Extracto de carne al 3%. - Medio mFC. - Filtros de policarbonato de 0.45 mm de poro. - Centrifugadora.

- Placas de Petri. - Pipetas. Detectaremos los bacterifagos por formacin de placas de lisis. Primeramente construiremos una batera de diluciones seriadas en solucin salina partiendo de nuestra muestra, que sern las que analizaremos: 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. El procedimiento para cada uno de los casos es el que se describe a continuacin: - Control: Nuestro control no pasar por ningn tratamiento de descontaminacin bacteriana por lo que directamente inocularemos los tubos de agar blando (en sobrefusin, mantenidos a 45C) con 0.2 ml de un cultivo en caldo en fase exponencial de crecimiento bacteriano de Escherichia coli, bacteria hospedadora, y 1 ml. de las respectivas diluciones a analizar. Agitamos suavemente sin que se formen burbujas y vertemos sobre una capa de Petri con una placa soporte de agar Luria, procurando una diseminacin uniforme. Una vez solidificada la doble capa la invertimos las placas y dejamos incubando a 18C durante 15 h. Pasado el tiempo de incubacin se desarrollar un csped bacteriano sobre el que aparecern placas de lisis que nos indicarn la presencia de colifagos. Realizaremos el recuento de las placas a partir del cual podremos calcular el ttulo de fagos en unidades formadoras de placas por mililitro (ufp/ml). - Centrifugacin: Cogeremos 5ml de las diferentes diluciones creadas a partir de la muestra y las sometemos a centrifugacin a 3000xg durante 20 min. Una vez centrifugadas tomaremos el sobrenadante que es donde se encuentran las partculas vricas. De ese sobrenadante inocularemos 1 ml. al tubo de agar en sobrefusin al que previamente le hemos aadido 0.2 ml del cultivo en caldo de la bacteria hospedadora. Verteremos sobre agar Luria en una placa, dejamos que solidifique. La incubacin se dar a 37C durante 24 h. Haremos un recuento de las placas una vez formadas.

- Cloroformo: Tomamos 5ml de cada una de las diluciones de la muestra a las que aadiremos 1 ml. de cloroformo (la concentracin de cloroformo debe ser del 10%). Agitamos y mantenemos a 4C durante 10min. Pasado ese intervalo de tiempo observaremos cmo las bacterias han precipitado quedndonos con el sobrenadante del que tomaremos 1ml que inocularemos en el tubo de agar en sobrefusin, ms 0.2 ml. del cultivo de la bacteria hospedadora. Agitamos y vertemos sobre una capa soporte de agar Luria. Dejamos solidificar e incubamos 24h a 37C, y volvemos a hacer un recuento de las placas de lisis.

- Filtracin por membrana: Pasaremos a travs de un filtro de 0.45mm de tamao de poro 10 ml. de cada una de las diluciones de la muestra. El volumen del filtrado ser en el que se encuentren las partculas vricas ya que la bacterias al ser de mayor tamao se quedan retenidas en el filtro. Del filtrado tomaremos 1 ml. que, junto con 0.2 ml. de la bacteria hospedadora, inocularemos en un tubo de agar blando que verteremos sobre una placa de Petri con agar Luria como base. Dejamos solidificar y se incuba a 37C, 24h. Tras este tiempo de incubacin se observarn y contarn las placas de lisis formadas por la infeccin de las partculas vricas existentes en nuestra muestra sobre las bacterias.

- Filtracin a travs de filtro tratado con solucin steril de extracto de carne: Tomamos 10ml de solucin extracto de carne al 3% que pasaremos a travs de un filtro de 0.45 mm. de tamao de poro. Con esto lo que provocamos es una colmatacin del filtro por las protenas que constituyen el extracto. Ahora filtraremos las diluciones de la muestra con el mismo filtro tratado. Obtendremos tanto las partculas vricas obtenidas con el tratamiento anterior (filtracin) ms aquellas que quedaban retenidas en los poros debido a que ahora el filtro est colmatado por las protenas. Del filtrado tomaremos 1ml y seguiremos los mismos pasos que los indicados en los tratamientos anteriores para formar una doble capa de agar. Incubamos y haremos, posteriormente el recuento de placas de lisis. - Empleo de medio mFC: Se har de la misma manera que con el control pero como agar soporte usaremos el medio mFC que es selectivo, en lugar del agar Luria. Expresaremos el % de recuperacin fgica, siendo el ttulo de las placas control el 100%. El mejor mtodo ser aquel que consiga mayor recuperacin y mayor descontaminacin. Para la tcnica del NMP (Nmero Ms Probable) el material requerido es el siguiente: - Cultivo en caldo de Escherichia coli C (ATCC 13706). - Caldo PAB (Ver Medios de cultivo). - Agar Luria (Ver Medios de cultivo). - Cloroformo. - Pipetas. - Asa de platino. El primer paso es el enriquecimiento: disponemos de tres series de tres tubos de PAB (la primera de ellas con medio doble concentrado) y aadiremos a cada uno de los tubos 0.2ml del cultivo en caldo de Escherichia coli C e inocularemos distintos volmenes de la muestra a analizar: - Serie n1 (caldo doble concetrado): 10ml - Serie n2: 1ml - Serie n3: 0.1ml Incubamos los tubos a 37C durante 18h. Pasado el tiempo de incubacin aadiremos a cada tubo un 10% de cloroformo, agitaremos vigorosamente y dejamos decantar a 4C durante 20min. Tomaremos el sobrenadante que es el que est constitudo por las partculas vricas. Como determinamos que existe ese microorganismo? Haciendo una prueba confirmativa: identificaremos cul de los tubos es positivo, el enriquecido en partculas vricas, haciendo uso de la prueba de la gota de Adams. sta consiste en sembrar una placa de agar Luria por la tcnica de la doble capa con el hospedador bacteriano y dejamos solidificar. Dividiremos la placa en tres sectores correspondientes a las distintas series (10, 1 y 0.1), y con el asa de platino flameada y fra depositaremos una gota de cada uno de los tubos ya crecidos y previamente descontaminados con

cloroformo de PAB (coger de a fase acuosa superior). La incubacin de la placa ser a 37C durante18h. Transcurrido el periodo de incubacin hay que anotar los resultados positivos en funcin del volumen de muestra analizado, es decir, las gotas que aparecen con calvas o lisis confluente o semiconfluente en funcin del volumen de muestra analizado. Determinaremos el NMP de colifagos en 100 ml. de muestra a partir de la combinacin de resultados positivos en la prueba confirmativa utilizando una tabla de NMP. >> Resultados y discusin: Los resultados obtenidos en la prctica del DAL fueron los que se indican en la siguiente tabla: -2 Control 130 / 146 mFC 89 / 221 Filtracin 2/2 F+BE 97 / 166 141 / 149 Centrifugacin 159 / 159 Cloroformo 4/0 Clculo del ttulo = Ttulo control = = 1.79 104 unidades formadoras de placas / ml. Ttulo mFC = = 8.95 103 ufp/ml. Ttulo filtracin = no calculado (bajo nmero de ufp). Ttulo filtracin + extracto de carne esteril = = 1.315 104 ufp/ml. Ttulo centrifugacin = = 1.785 104 ufp/ml. Ttulo cloroformo = no calculado (bajo nmero de ufp). ufp/ml % de recuperacin Contaminacin Control 1.79 104 100 +++ 3 mFC 8.95 10 50 Filtracin ? ? 4 F+BE 1.315 10 73.5 ++ Centrifugacin 1.785 104 99.72 + Cloroformo ? ? -3 21 / 23 20 / 17 1/0 0/6 15 / 22 20 / 28 1/3 -4 Contaminacin 5/2 +++ 5/4 0/0 0/1 0/1 ++ 5/9 + 1/0 -

Se observa un mayor porcentaje de recuperacin en el uso de la centrifugacin, pero si tenemos en cuenta que existe contaminacin con la centrifugacin vemos que el mejor tratamiento es el de la filtracin pretratada con extracto de carne ya que, adems de conseguirse un gran porcentaje de recuperacin de bacterifagos es capaz de eliminar la contaminacin de la muestra por parte de bacterias o de materia orgnica particulada. Esto contrasta con el filtrado sin pretratamiento, por lo que claramente nos indica que ha habido adsorcin por parte del filtro de las partculas fgicas. En cuanto a la prctica del NMP estas fueron las placas de lisis obtenidas por la prueba de la gota de Adams: Serie n 1 (10ml): 3 Serie n 2 (1ml): 1 3 - 1 - 0 Serie n 3 (0.1ml): 0 Dilucin: 10-5 4.3 106 NMP / 100 ml Lmite de confianza 95%: 7 (inf) - 210 (sup) En los otros grupos: 3 - 3 - 3 2.4 108 NMP / 100 ml 3 - 3 - 0 2.4 106 NMP / 100 ml 3 - 2 - 0 9.3 105 NMP / 100 ml 3 - 1 - 0 4.3 106 NMP / 100 ml 2 - 0 - 0 9 105 NMP / 100 ml Vemos que con la tcnica del DAL el ttulo era de 1.79 104 unidades formadoras de placas / ml, mientras que con la tcnica del NMP nos sale un valor de 4.3 104 NMP / ml, valores bastante aproximados aunque generalmente el NMP sobrevalora el ttulo del DAL.
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Prctica 2: Aislamiento, purificacin y titulacin de un stock fgico.


>> Introduccin: El objetivo es la obtencin de un stock fgico a partir de una de las placas de lisis del ensayo de deteccin de bacterifagos especficos de Escherichia coli, utilizando el mtodo en caldo. El stock fgico obtenido se titular por la tcnica DAL. Asumimos que cada calva procede de una nica partcula vrica, luego cogemos una porcin de cada calva. Si una calva de lisis crece indefinidamente todo el agar sera una gran calva, pero esto no sucede asi, pues hay un tamao mximo que viene determinado por cada sistema fago-hospedador (morfologa y tamao mas o menos constantes para cada fago-hospedador). Tambien depende del medio de cultivo, influyendo este en el tamao de la calva. Los fagos que son grandes y con morfologa completa tienen mas dificultades fsicas para difundir por el agar. Ademas, los fagos mas complejos tardan mas en multiplicarse. La concentracin de agar en el

medio tambien influye, favoreciendo que las partculas vricas difundan mas o menos. Entonces, si tenemos todos los parmetros fijos y vemos dos placas distintas entonces estamos con dos fagos diferentes. Las calvas se pueden diferenciar en: - dimetro de las calvas. - bordes regulares o lisos. - calvas claras o turbias. - presencia o ausencia de anillos concentricos (los anillos pueden ser causa de variacin en el crecimiento bacteriano o bien porque al lisarse las bacterias se liberen enzimas que lisas a bacterias vecinas). - presencia o ausencia de halos (los halos son consecuencia de la liberacin de enzimas de degradacin por parte de las bacterias lisadas, enzimas que difunden en el agar). Para el aislamiento y purificacin utilizamos la caracterstica de las placas de lisis, las cuales se forman a partir de un fago. Elegiremos una placa de lisis, lo ideal ser tomar la de la dilucin mayor ya que ser la que presente menor contaminacin al no encontrarse las placas cerca unas de otras, la purificacin se obtendr de forma ms fcil. Debemos apuntar las caractersticas de la placa a aislar, lo cual nos servir para compararlas con las placas formadas en nuestro stock, comprobando si verdaderamente hemos aislado y purificado la placa. >> Material y mtodo: - Agar Luria. - Agar blando. - Caldo TSB, suplementado con 1.2mM de SO4Mg-7H2O y 5mM de Cl2Ca, con cultivo de Escherichia coli y sin nada. - Centrifugadora. - Asa de platino. - Pipetas. El procedimiento es el siguiente: hay que seleccionar una placa de lisis individualizada de la que anotaremos sus caractersticas. Con el asa de platino rasparemos esa placa, incluso podemos llegar a introducirla en el interior del agar ya que las partculas vricas tambin se encuentran ah. Este inculo fgico se transfiere a un tubo de cultivo en fase exponencial de crecimiento del hospedador bacteriano en caldo TSB, suplementado con 1.2 mM de SO4Mg - 7 H2O y 5 mM de Cl2Ca. Agitamos vigorosamente e incubamos a 37C durante 12-18 h., periodo durante el cual se da un enriquecimiento del inculo. Tras la incubacin eliminamos las bacterias por centrifugacin (3000xg, 20 min) quedndonos con el sobrenadante que es donde se encuentran las partculas vricas.

Dos notas: por un lado, el uso de la centrifugacin se hace preferentemente al del cloroformo, ya que el fago puede ser sensible a este compuesto. Por otro, todo este proceso generalmente se repite dos o tres veces mas, pero por falta de tiempo solo lo haremos una vez. Con esa fraccin vamos a hacer una titulacin realizando una batera de diluciones: - 10-2 (que se consigue aadiendo 9.9 ml. de solucin salina a 0.1 ml. de sobrenadante). - 10-4, 10-6 y 10-7 (a partir de la dilucin 10-2). Por duplicado, realizaremos la tcnica DAL de las diluciones 10-6 y 10-7 (aadiendo 1 ml. de cada una de estas dos diluciones en dos placas en cada caso), y de una nueva dilucin 10-8 (esto se consigue aadiendo 0.1 ml. de la dilucin 10-7 en las dos placas correspondientes). Incubamos a 24 h. a 37C. Transcurridas las 24 h. observaremos las placas de lisis formadas y calcularemos el ttulo fgico. >> Resultados y discusin: La placa a aislar era una calva clara de borde regular, sin anillos ni halos y cuyo dimetro era de aproximadamente 4 mm. Hacemos el recuento de las placas obtenidas en cada una de las diluciones: Dilucin N de placas de lisis Ttulo (ufp / ml) 10-6 62 / 73 6.75 10-7 10-7 11 / 13 -8 10 2/0 Observaciones: las placas coinciden perfectamente en la morfologa de la calva que aislamos. Asi hemos aislado, purificado el stock fgico y enriquecido la muestra.
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Prctica 3: Estudio comparativo de distintos filtros de membrana en la adsorcin y recuperacin de bacterifagos.


>> Introduccin: El mtodo de concentracin de virus se usan para muestras muy diludas, pues gracias a este mtodo es posible detectar contaminacin a pesar de estar a muy baja concentracin. Asi, si hay que analizar la presencia de virus en un volumen de 10-100 l. de una muestra de origen animal se procede a la concentracin debido al gran volumen del que se dispone. El objetivo de esta prctica es ensayar y evaluar dos mtodos empleados para la concentracin de virus: filtracin simple y VIRADEL (virus/adsorcin/elucin), aplicados al anlisis cuantitativo de una muestra de colifagos de bajo ttulo. Para evaluar la eficiencia de los mtodos de concentracin utilizados se estimar el nmero de colifagos presentes en la muestra mediante recuento directo, utilizando las tcnicas de la capa de agar simple (SAL) y la doble capa de agar (DAL). Los resultados deben expresarse como:

- porcentaje de recuperacin fgica: respecto al ttulo obtenido en el ensayo directo de la muestra. - porcentaje de adsorcin de las partculas vricas a los distintos tipos de filtros ensayados: se estimar a partir del ttulo fgico del filtrado. - porcentaje de elucin: se estimar considerando como 100% el nmero de fagos adsorbidos al filtro ensayado. Existen varias tcnicas de concentracin de muestras diluidas, entra las cuales distinguimos las siguientes: - ultracentrifugacin. - precipitacin diferencial con polietilenglicol. - adsorcin a distintas sustancias y elucin en bajo volumen (por ejemplo 5 ml.). En las tcnicas de adsorcin se presentan dos problemas: como adsorbemos y como despegamos. Para la adsorcin hay que usar un tipo de soporte en el que el virus pueda unirse por interacciones electrostticas. Los filtros que existen en el mercado son: - filtros electronegativos: policarbonato o estereocelulosa. - filtros electropositivos: son mas difciles de conseguir. En los filtros electronegativos, a pH 7.0 los virus tienen carga neta negativa y no sera posible una buena adsorcin. Los filtros electropositivos estn hechos de materiales difciles de utilizar (no estn aun muy perfeccionados) porque son muy gruesos y se colmatan muy pronto. A su desuso por estas causas hay que aadirle su alto coste en el mercado. Distinguimos una primera fase en el mtodo de concentracin: la fase de adsorcin. Hay que conseguir las condiciones idneas para que los bacterifagos queden retenidos en las membranas de los filtros. Hay que tener en cuenta que los filtros que utilizamos presentan carga neta negativa y que la mayor parte de los virus presentan, a pH 7.0 carga negativa. Asi no es posible que se den interacciones electrostticas entre los virus y la membrana. Hay 3 mecanismos para evitar esto y favorecer la adsorcin de las partculas fgicas por parte del filtro: - bajando el pH de la muestra cambiamos la carga del virus a un valor de pH de aproximadamente 4.0 la carga del virus es positiva. Los enterovirus (virus resistente al pH cido del estmago) son resistentes a la acidificacin, pero estos virus son una excepcin: la mayora de los virus no soportan valores bajos de pH, asi que una disminucin en el pH puede inactivar a bacterifagos. - modificando la carga del filtro, tratando estos con polmeros catinicos que se encargarn de modificar la carga. En este caso se usar una resina llamada PEI (polietilnimina). Gracias a este cambio de carga del filtro los virus se sentirn atrados/adsorbidos, por el filtro. - mediante puente salino entre la partcula vrica y el filtro (ambos cargados negativamente), usando una sal anticaotrpica (como sales de calcio y magnesio): la adicin a la muestra iones divalentes, como Mg++, permite la unin al filtro, ya que sus dos cargas sirven como puente de unin entre la partcula vrica y el filtro.

En la prctica vamos a ensayar y evaluar el proceso de concentracin con un mismo filtro electronegativo de 0.45 mm de dimetro de poro en los casos de: filtro y muestra sin tratar, filtro tratado con PEI y muestra tratada con Cl2Mg. Todos los filtrados obtenidos por los tres tratamientos se analizarn por la tcnica SAL. Una vez tengamos los virus adsorbidos a la membrana, se procede a la elucin (separacin de los virus que han quedado adsorbidos en el filtro). La elucin implica dos tcnicas que lo que hacen es debilitar las fuerzas de unin partcula vrica-filtro. Esos dos tratamientos son: - filtracin simple: esta tcnica consiste en poner en contacto a la membrana de policarbonato con una placa de medio de cultivo donde vaya una sustancia capaz de romper estas interacciones electrostticas (detergente, urea, etc...). La urea es txica en un medio de cultivo, pero hay componentes no txicos para el crecimiento bacteriano, como Tween-80. Asi pues las placas de agar Luria presentan Tween-80, detergente que acta rompiendo las interacciones hidrofbicas y, por tanto, eluir a los virus. Hay que anotar que el medio presenta TTC que favorece la visualizacin de las placas de lisis ya que cuando lo reduce la bacteria toma color rojo - tcnica del VIRADEL (virus-adsorcin-elucin): esta tcnica puede aplicarse para cualquier virus, pero est optimizada para bacterifagos. Se aade un pequeo volumen de lquido/sustancia sobre el filtro (en este caso haciendo pasar un volumen de extracto de carne a pH 9.0). Gracias a esto las protenas que constituyen el extracto compiten con los virus por los sitios de unin, adems el pH 9.0 proporciona carga positiva a los virus, separndose stos del filtro y se logra romper las fuerzas hidrofbicas. A partir de aqu analizaremos la muestra mediante la tcnica DAL. >> Material y mtodo: - Filtros electronegativos (filtros de policarbonato de 0.45 mm de dimetro de poro). - Filtros electronegativos tratados con polietilenimina (PEI) al 1% en agua destilada estril. - Muestra adicionada con una sal anticaotrpica (5% de una solucin 1M de MgCl2). - Medio PAC en sobrefusin. - Agar blando. - Agar Luria. - Agar Luria suplementado con un 0.3% (p/v) de Tween-80 y 0.04% (p/v) de TTC. - Solucin al 13% de Cl2Ca -2H2O. - Solucin de extracto de carne al 3%, pH 9. - Cultivo del hospedador bacteriano ( Escherichia coli). - Matraz. - Placas de Petri.

- Pipetas. El procedimiento a seguir es el que se describe a continuacin: - Filtracin / adsorcin: Realizaremos la tcnica de SAL, para ello tomaremos los filtrados obtenidos al filtrar 100 ml. de la muestra por los distintos tratamientos (filtro y muestra sin tratar, filtro tratado con PEI al 1% en agua destilada estril durante 2 horas y muestra adicionada con una solucin 5% de otra solucin de 1M de Cl2Mg). Los volmenes filtrados los introduciremos en un recipiente estril, y adicionaremos 1 ml. de una solucin al 13% de Cl2Ca - 2H2O a 100 ml. de filtrado. Inocularemos la muestra con 5 ml. del cultivo del hospedador bacteriano. Mezclamos bien e incubamos 3 minutos a 45C. Adicionamos dicha mezcla a un matraz que contiene 100 ml. del medio PAC en sobrefusin. A continuacin se mezcla y se reparte el medio en placas estriles de 14 mm. de dimetro y dejamos solidificar. La incubacin ser a 37C durante 18-24h. - Elucin / VIRADEL: pasamos por los mismos filtros utilizados en el apartado anterior 3-5 ml. de extracto de carne a pH 9.0 y analizamos ese filtrado por la tcnica DAL. Para ello tomaremos 1 ml. de cada muestra de filtrado obtenida tras cada uno de los tratamientos que inocularemos junto con 0.2 ml. de cultivo en caldo de hospedador bacteriano en un tubo de agar blando. La mezcla la vertemos en una placa de Petri con agar Luria como base. Una vez solidificada la doble capa dejamos incubando de 18 a 24 horas a 37C. - Elucin / filtracin simple: los filtros utilizados en los distintos tratamientos de adsorcin, especificados en el proceso de adsorcin, se dispondrn al revs sobre placas de agar Luria suplementado con Tween-80 (detergente que rompe las interacciones hidrofbicas) y TTC (compuesto que favorece la visualizacin de las placas de lisis). Se siembra por la tcnica DAL y se incuba a 37C durante un periodo de 18 horas. Tendremos controles negativos para cada uno de los ensayos en los cuales la muestra no ha sido sometida a ningn tratamiento, pero s filtrada. A la vez tambin sembraremos el filtrado de 100 ml. de la muestra con la tcnica SAL, y de 10 ml. con la DAL. Estas placas nos darn el nmero total de partculas vricas presentes en la muestra. >> Resultados y discusin: Transcurrido el correspondiente tiempo de incubacin pasaremos a hacer un recuento del nmero de placas de lisis formadas tras cada uno de los tratamientos: Filtrado Filtrado simple VIRADEL Filtro y muestra sin tratar 188 ufp/100 ml 15 ufp / 100 ml 34 4 ufp / 100 ml Filtro - PEI 12 ufp / 100 ml 50 ufp / 100 ml 95 4 ufp / 100 ml Muestra con Cl2MG 0 ufp / 100 ml 30 ufp / 100 ml 62 4 ufp / 100 ml SAL muestra (100 ml): 422 ufp/100ml. DAL muestra: 4 ufp/ml - 2 ufp/ml - 6 ufp/ml.

El porcentaje de recuperacin fgica es el nmero de partculas fgicas que han eluido (tanto en el caso de la filtracin simple como en el del VIRADEL) respecto al total de partculas fgicas de la muestra (que corresponde al SAL aplicado a la muestra directamente). Estos son los resultados: - filtro y muestra sin tratar: 3.5% en filtracin simple y 32.2% en VIRADEL. - filtro-PEI: 11.8% en filtracin simple y 90.0% en VIRADEL. - muestra-Cl2Mg: 7.1% en filtracin simple y 58.7% en VIRADEL. Porcentaje de adsorcin: Si restamos el nmero total de placas de lisis presentes en la muestra menos el nmero de placas de lisis obtenidos tras la filtracin, tendremos el nmero de virus adsorbidos. De ah sacaremos el porcentaje de adsorcin, tomando como 100% el nmero de virus en la muestra (el dato que debemos tomar es el obtenido con la tcnica de DAL, ya que el de SAL es un error experimental). Los resultados son los siguientes: - 55% en filtro sin tratar. - 97.1% en filtro-PEI. - 100% en muestra-Cl2Mg. Porcentaje de elucin: se obtienen los porcentajes de elucin de cada uno de los tratamientos considerando como 100% el nmero de placas de lisis obtenidos en la muestra. El porcentaje de elucin es igual a los fagos eludos respecto a los virus adsorbidos. Aqui se ofrecen los resultados: - filtro y muestra sin tratar: 6.4% en filtracin simple y 58.1% en VIRADEL. - filtro-PEI: 12.2% en filtracin simple y 92.7% en VIRADEL. - muestra-Cl2Mg: 7.1% en filtracin simple y 58.7% en VIRADEL. Los datos nos muestran como el filtro tratado con PEI es el mejor mtodo de concentracin y recuperacin de, en este caso, bacterifagos T6 de Escherichia coli. Estos valores de recuperacin son especialmente altos cuando se emplea la tcnica re recuperacin de partculas vricas VIRADEL.
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Prctica 4: Lisogenia e induccin al ciclo ltico.


>> Introduccin: El objetivo de esta prctica es comprobar la inmunidad de una bacteria lisognica a la infeccin por bacterifagos similares al profago que tiene integrado (del mismo grupo de incompatibilidad), pero no a otros fagos. Aunque una bacteria lisgena puede ser susceptible de infectarse por otros virus, no puede ser infectada por partculas virales del tipo para el cual sta es lisgena. Esta inmunidad es conferida gracias al mecanismo de represin intracelular que est bajo el control de los genes del virus. Como cepa lisognica se utilizar Salmonella LT2, que contiene el profago P22. Tambin utilizaremos una

suspensin del fago m2 (especfico de Salmonella pero de distinto grupo de incompatibilidad que el P22), con el que si tendremos lisis. Tambien demostraremos la induccin del ciclo ltico de esa misma cepa lisognica por exposicin a la luz UV (15, 30 y 60 segundos). En la induccin el virus abandona el genoma bacteriano y comienza el ciclo ltico (esto lo hace de forma espontnea o inducido por agentes fsicos o qumicos como radiacin ultravioleta, mostaza nitrogenada, rayos X, etc...). Tras la incubacin la presencia o ausencia de placas de lisis nos indicar la induccin, o no, de la cepa lisognica; es decir, si se producen placas de lisis significa que la radiacin ha inducido en el profago el inicio del ciclo ltico. >> Material y mtodo: Para la induccin del ciclo ltico en bacterias lisognicas el material es el siguiente: - Cultivo en caldo de Salmonella LT2. - Agar Luria. - Agar blando. - Lmparas U.V. - Pipetas. Prepararemos tres placas con csped de Salmonella segn la tcnica de la doble capa. Expondremos las placas a radiacin de U.V. a distintos tiempos: 15, 30 y 60 segundos. Una vez dada la radiacin dejaremos incubar a 37C durante 24h. Tras la incubacin observaremos las placas y podremos calcular el tiempo mnimo de induccin (tiempo de exposicin que ha de transcurrir para que se ponga de manifiesto la presencia de placas de lisis). Para la parte de la prctica consistente en comprobar la inmunidad de una bacteria lisognica a la infeccin por bacterifagos similares al profago que tiene integrado el material es el siguiente: - Suspensin de bacterifago P22. - Cultivo en caldo de Salmonella LT2. - Agar Luria. - Agar blando. - Pipetas. Haremos uso de la tcnica de la doble capa (DAL), con ella haremos dos ensayos: uno en el que inocularemos el agar blando con 0.2 ml.de Salmonella LT2 y 1 ml. del bacterifago P22 (bacterifago que nuestra bacteria tiene ya integrado en su genoma) y un segundo ensayo en el que el bacterifago inoculado sea el m2. >> Resultados y discusin:

Se observa que aparecen calvas de lisis en la placa expuesta a 60 segundos a luz U.V. (en concreto12 calvas). Si hicieramos exposiciones superiores observaramos un aumento del nmero de placas de lisis a mayor tiempo de exposicin a la radiacin ultravioleta (induccin del ciclo ltico del fago en lisogenia): a mayor tiempo de exposicin a la radiacin, mayor nmero de fagos que inician crecimiento ltico. En cuanto a la parte de inmunidad, vemos que con el bacterifago P22 no aparecen calvas de lisis, debido a que Salmonella es inmune a l ya que lo presenta integrado en su genoma, pero en cambio si es susceptible a la infeccin por el fago m2, provocando la aparicin de placas de lisis.
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Prctica 5: Fagotipia de Salmonella.


>> Introduccin: La fagotipia es un mtodo de tipificacin bacteriana que permite realizar una diferenciacin intraespecfica en base a la especificidad de infeccin por bacterifagos. El patrn de susceptibilidad de una cepa bacteriana a un conjunto determinado de bacterifagos es lo que se denomina fagotipo. Para realizar el fagotipado de una cepa bacteriana se utiliza la prueba de la gota de Adams. La sensibilidad de una cepa bacteriana a un determinado fago se demuestra por la aparicin de un rea de lisis que puede variar desde placas aisladas o lisis semiconfluente (placas de lisis individualizadas) a lisis confluente (una zona grande de lisis). Esta tcnica se utiliza mucho para el estudio de brotes alimentarios. En esta prctica utilizaremos un set de tipado constitudo por 5 fagos, especficos de Salmonella enterica: Cepa propagadora Fago S. ohio 1079M 7 S. london 4F 11 S. typhi 1448M 17 S. typhi 1448M 18 S. enteritidis 7F 21 Antes de realizar el fagotipado, hay que calcular la dilucin rutinaria de prueba (RTD o Rutinary Test Dilution) de cada uno de los fagos del esquema de tipado. La RTD se define como la mxima dilucin de un determinado stock fgico que en la prueba de la gota produce lisis, confluente o semiconfluente sobre la capa de propagacin, siendo la cepa propagadora la que se utiliz en el aislamiento del bacterifago. Este clculo nos sirve para estandarizar el resultado ya que no es igual el nmero de bacterifagos que hay en cada suspensin de muestra. Para identificar los fagotipos, suelen asignrseles cdigos alfanumricos (regla de Farmer et al., 1970, modificada por Castro et al., 1992):

Triplete Dgito asignado +++ 1 ++2 +-+ 3 -++ 4 +-5 -+6 --+ 7 --0

Fago Dgito asignado ++ A +B -+ C -D

El objetivo de esta prctica es determinar el patrn de sensibilidad o resistencia a una serie de bacterifagos de Salmonella, mediante la prueba de la gota de Adams. Obtendremos el fagotipo, diferenciacin intraespecfica, de cada una de las cepas de Salmonella. >> Material y mtodo: - Cultivo en caldo del hospedador bacteriano (Salmonella). - Agar Luria. - Agar blando. - Solucin salina. - Pipetas. - Asa de platino. Se siembra sobre agar la bacteria a fagotipar haciendo un cesped homogeneo por la tcnica de la doble capa (con agar blando que permita la dispersin de partculas vricas). Se aaden gotas de las 5 suspensiones fgicas y despues de la incubacin vemos si la bacteria es infectada o no por cada una de las gotas. Hay que utilizar los bacterifagos con la misma concentracin. La manera de estandarizar es poniendo a todos los fagos a un mismo nivel de infectividad. Primero tenemos que calcular la RTD (infeccin rutinaria de prueba). Para ello realizaremos una batera de diluciones de nuestros fagos (7,11,17,18,21), de la 10-2 a la 10-6. Prepararemos un csped bacteriano segn la tcnica de la doble capa de agar con 0.2 ml. del cultivo de la bacteria hospedadora ( Salmonella); haremos tantas placas como fagos tenemos, es decir, 5 placas. Una vez solidificadas aadiremos, con la ayuda del asa de platino, una gota de cada dilucin del fago correspondiente ms una gota de la muestra sin diluir como control. El proceso de incubacin es de 24h a 37C. Transcurrido este tiempo observaremos las placas de lisis formadas en las distintas diluciones, anotando la mxima dilucin donde se produce lisis siendo sta la RTD. Una vez sabida la RTD sabemos que dilucin de cada fago tenemos que utilizar: aadiremos 0.2ml de Salmonella a un tubo de agar blando y lo vertemos en una placa con una capa soporte de agar Luria. Dejamos solidificar y con el asa de platino vamos poniendo cada una de las gotas que corresponden a

las diluciones respectivas de cada fago (diluciones calculadas por la RTD). Incubamos de nuevo a 37C durante 24 h. y dejando que se desarrolle un csped bacteriano ms placas de lisis. >> Resultados y discusin: Estos son las medias de los diferentes grupos de prcticas de todos los datos que obtuvimos cuando calculamos la RTD para los distintos fagos: Fago 7 11 17 18 21 RTD 10-3 10-2 10-5 10-3 10-4 Una vez hecha la prueba de la gota de Adams estos fueron los resultados (el + simboliza la formacin de placas de lisis, y el smbolo - indica la no evidencia de infeccin por parte del fago): Grupo A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 7 11 + + 17 + + + + + + + + + + + + + 18 + + + + + + + + + + + + + 21 Fagotipos 6D + 7A + 7A + 7A + 7A + 7A + 7A + 7A + 7A + 7A 7B 6D 7B 7B 7B

Este tipo de pruebas permite hacer una historia epidemiolgica del origen de la infeccin atendiendo a la fagotipia obtenida (origen de las cepas: misma cepa y serotipo). Por ejemplo, y usando estos datos, si se aisl un brote de origen alimentario y se analizaron a dos personas del restaurante (A3 como manipulador n1 y A11 como manipulador n2) y a diversos alimentos (A1 como carne, A2 como mayonesa y A12 como salsa) podramos concluir que fue el manipulador n1 el que provoc dicha infeccin, al corresponderse la fagotipia de las muestras del manipulador n1 con la de la mayonesa (y no corresponderse en absoluto las fagotipias del resto de alimentos con ninguno de los dos manipuladores).
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Medios de cultivo.

>> Solucin salina - 0.85% (p/v) NaCl pH 7.2 >> Caldo triptona soja (TSB) - Peptona de casena 17 g - Peptona de soja 3 g - Cloruro sdico 5 g - Fosfato dipotsico 2.5 g - Glucosa 2.5 g - Agua destilada 1000 ml pH 7.3 0.2 a 25C >> Agar Luria - Triptona 10 g - Extracto de levadura 5 g - Cloruro sdico 5 g - Sulfato magnsico heptahidrato 0.125 g - Agar 15 g - Agua destilada 1000 ml pH 7.2 Tras esterilizar (121c,15min), enfriar aproximadamente a 50C y aadir 10ml/l de una solucin al 5% de Cl2Ca-2H2O estril. >> Agar blando - Triptona 10 g - Cloruro sdico 5 g - Sulfato magnsico heptahidrato 0.12 g - Agar 8 g - Agua destilada 1000 ml pH 7.2 >> Agar mFC (Difco) Composicin por litro de medio: - Triptosa 10 g - Proteosa peptona No.3 5 g - Extracto de levadura 3 g - Lactosa 12.5 g - Sales biliares No.3 1.5 g - NaCl 5 g - Azul de anilina 0.1 g - Agar 15 g - Agua destilada 1000 ml pH 7.4 0.2 a 25C

>> Medio PAB (Phage Assay Broth) - Extracto de carne 3 g - Peptona 5 g - ClNa 5 g - Sulfato magnsico heptahidrato 0.2 g - Sulfato mangansico 0.05 g - Agua destilada 1000 ml pH 7.2 Tras esterilizar (121C, 15min) y enfriar, aadir 1ml/l de una solucin al 3% de Cl2Ca-2H2O estril. >> Medio PAC (Phage Agar Concentrate) - Extracto de carne 14 g - Extracto de levadura 4 g - Cloruro sdico 4 g - Peptona 12 g - Carbonato sdico 1 g - Cloruro magnsico hexahidrato 1 g - Agar 12 g - Agua destilada 1000ml pH 7.2

Indice NMP y lmites de confianza del 95% para combinaciones de resultados positivos empleando series de 3 tubos por dilucin (10 ml, 1 ml, 0,1 ml). Combinacin de positivos 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 NMP / 100 ml <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 Lmite superior de confianza (95%) < 0.5 < 0.5 Lmite inferior de confianza (95%) 9 13

< 0.5 1 1 3 3 1 3 3

20 21 23 36 36 36 37 44

2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3

20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 2400

7 4 10

89 47 150

4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

120 130 380 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800

Volver al ndice 1999 - Manuel B. A.