Вы находитесь на странице: 1из 48

А.С.

Спирин

2006 г.

Лекции по молекулярной биологии:

Биосинтез белков
А.С. Спирин

2006 г.

Лекция № 1

«Центральная догма» молекулярной биологии


и мир РНК
Двойная
Д в о й н а я спираль
с п и р а л ь ДНК
ДНК
(J.D. Watson & F.H.C. Crick, 1953)
ПРИНЦИП КОМПЛЕМЕНТАРНОСТИ:
пары оснований в двойной спирали ДНК

T A

C G
РЕ ДУ П Л И К А Ц И Я
РЕДУПЛИКАЦИЯ
ДН К ДНК
ПРИНЦИП КОМПЛЕМЕНТАРНОСТИ
РНК: ДНК:

U A

C G
ТРАНСКРИПЦИЯ
Т РА Н С К Р И П Ц И Я
(С и н т ез Р Н К н а Д Н К )
(Синтез РНК на ДНК)
Белок-синтезирующая функция РНК:
история открытий

(1) Обнаружена прямая корреляция между количеством РНК (но не ДНК!) в клетках
и интенсивностью биосинтеза белка (T. Caspersson, 1941; J. Brachet, 1942).
(2) Показано, что подавляющая часть РНК клеток локализуется в гранулах (РНП-
частицах), участвующих в биосинтезе белков (G. Palade and P. Siekevitz, 1056).
РИБОСОМЫ НА УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗАХ
КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ
РИБОСОМЫ НА УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗАХ БАКТЕРИЙ
Vibrio alginolyticus
Белок-синтезирующая функция РНК:
история открытий

• Обнаружена прямая корреляция между количеством РНК (но не ДНК!) в клетках


и интенсивностью биосинтеза белка (T. Caspersson, 1941; J. Brachet, 1942).
• Показано, что подавляющая часть РНК клеток локализуется в гранулах (РНП-
частицах), участвующих в биосинтезе белков (G. Palade and P. Siekevitz, 1056).
• РНП-частицы («гранулы Паладе») выделены из клеток, охарактеризованы
физически, идентифицированы как белок-синтезирующие частицы и названы
рибосомами (Schachman, Tissieres, Zamecnik, Roberts, 1956 – 1958).
CENTRAL DOGMA OF MOLECULAR BIOLOGY
(F. Crick, 1953 – 1958)

DNA
Transcription

RNA
Translation

PROTEIN

“It has long believed that structural information was transferred from the genes to stable
templates, such as ribosomal RNA, copied along the genes and maintaining in the
cytoplasm the information necessary for protein synthesis. Every gene was supposed to
determine the production of a particular type of ribosomal particles which in turn ensured
the synthesis of a particular protein (see Crick, 1958).”
F. Jacob and J. Monod (1961).
CENTRAL DOGMA OF MOLECULAR BIOLOGY
(F. Crick, 1953 – 1958)

DNA

RNA

PROTEIN

“It has long believed that structural information was transferred from the genes to stable
templates, such as ribosomal RNA, copied along the genes and maintaining in the
cytoplasm the information necessary for protein synthesis. Every gene was supposed to
determine the production of a particular type of ribosomal particles which in turn ensured
the synthesis of a particular protein (see Crick, 1958). In recent years, however, this
hypothesis has encountered several difficulties …”
F. Jacob and J. Monod (1961).
“The diversity of base composition found in the DNA of different bacterial species is not reflected in the
base composition of ribosomal RNA (Belozersky and Spirin, 1960), as would be expected if ribosomal
RNA were transcript of DNA.”
F. Jacob and J. Monod (1961).

Вариации нуклеотидного состава ДНК у бактерий

Species DNA, RNA,


(G+C)/(A+T) (G+C)/(A+U)

Sarcina lutea 2.57 1.32


Mycobacterium tuberculosis 2.08 1.45
Corynebacterium diphtheriae 1.20 1.24
Salmonella typhosa 1.13 1.21
Escherichia coli 1.09 1.21
Proteus vulgaris 0.68 1.22
Staphylococcus aureus 0.53 1.05
Clostridium perfringens 0.45 1.06

.S. Spirin, A.N. Belozersky, N.V. Shugayeva and B.F. Vanyushin (1957) A studies of species specificity of nucleic acids in
bacteria. Biokhimiya 22: 744-754.

. N. Belozersky and A. S. Spirin (1958) A correlation between the compositions of deoxyribonucleic and ribonucleic acids.
Nature 182: 111-112.
“The diversity of base composition found in the DNA of different bacterial species is not reflected in the
base composition of ribosomal RNA (Belozersky and Spirin, 1960), as would be expected if ribosomal
RNA were transcript of DNA.”
F. Jacob and J. Monod (1961).

Сравнение нуклеотидного состава ДНК и РНК у бактерий


Species DNA, RNA,
(G+C)/(A+T) (G+C)/(A+U)

Sarcina lutea 2.57 1.32


Mycobacterium tuberculosis 2.08 1.45
Corynebacterium diphtheriae 1.20 1.24
Salmonella typhosa 1.13 1.21
Escherichia coli 1.09 1.21
Proteus vulgaris 0.68 1.22
Staphylococcus aureus 0.53 1.05
Clostridium perfringens 0.45 1.06

.С. Спирин, А.Н. Белозерский, Н.В. Шугаева и Б.Ф. Ванюшин (1957) Изучение видовой специфичности
нуклеиновых кислот у бактерий. Биохимия 22: 744-754.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ:
Разнообразие нуклеотидного состава ДНК различных видов бактерий не отражается в
нуклеотидном составе рибосомных РНК, как можно было бы ожидать, если бы
рибосомные РНК были транскриптами генов ДНК.
НЕКОДИРУЮЩАЯ РНК

Исследования химической специфичности РНК бактерий вскрыли неожиданный факт:


при громадных вариациях состава ДНК
нуклеотидный состав тотальной РНК клетки мало менялся от вида к виду.
Спирин А.С., Белозерский А.Н., Шугаева Н.В., Ванюшин Б.Ф. (1957) Изучение видовой
специфичности нуклеиновых кислот у бактерий. Биохимия 22, 744-754.
Belozersky A.N., Spirin A.S. (1958) A correlation between the compositions of the
deoxyribonucleic and ribonucleic acids. Nature 182, 111-112.

Эти результаты были первым экспериментальным свидетельством того, что


преобладающая доля тотальной клеточной РНК не отражает генную специфику видов
и скорее всего является некодирующей РНК.
МАЛАЯ ФРАКЦИЯ ДНК-ПОДОБНОЙ (КОДИРУЮЩЕЙ?) РНК

A. N. Belozersky and A. S. Spirin (1958) A correlation between the compositions of deoxyribonucleic


and ribonucleic acids. Nature 182: 111-112.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:
Обнаруженная положительная корреляция между нуклеотидным составом ДНК и РНК,
при низкой величине зегрессии, указывает на существование малой фракции ДНК-подобной
РНК на фоне основной массы эволюционно консервативной РНК.
ISCOVERY OF MESSENGER RNA

1961)

. Brenner, F. Jacob and M. Meselson (1961) An unstable intermediate carrying information from
genes to ribosomes for protein synthesis. Nature 190: 576-581.

. Gros, W. Gilbert, H. Hiatt, C. Kurland, R.W. Risebrough and J.D. Watson (1961) Unstable
ribonucleic acid revealed by pulse labeling of Escherichia coli. Nature 190: 581-585.

. Spiegelman (1961) The relation of informational RNA to DNA. Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 26: 75-90.

. Jacob and J. Monod (1961) Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol.
Biol. 3: 318-356.
On the regulation of gene activity. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 26: 193-209.

ONCLUSIONS: (1) “The primary product of structural genes is messenger RNA, which brings
structural information from genes to ribosomes”.
ПРЕДСКАЗАНИЕ И ОТКРЫТИЕ АДАПТОРНОЙ,
ИЛИ ТРАНСПОРТНОЙ РНК (тРНК)

• Ввиду отсутствия явного стереохимического соответствия между


аминокислотами синтезируемого белка и нуклеотидами матричной РНК
была предсказана необходимость адапторов в виде коротких РНК,
способных присоединять к себе аминокислоты и комплементарных
кодонам матричной РНК
(F. Crick, 1955).
• РНК с предсказанными свойствами были открыты, выделены и названы
transfer RNA (транспортные РНК, тРНК)
(M.B. Hoagland & P.C. Zamecnik, 1957; K. Ogata, 1957).
КОДИРУЮЩИЕ И НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК
Общая схема биосинтеза белков
Д Н К

ТРАНСКРИПЦИЯ

Р Н К

ПРОЦЕССИНГ И
ТРАНСПОРТ РНК
5' 3'

м Р НК

ТРАНСЛЯЦИЯ
РИБОСОМА РИБОСОМА
3'

РИБОСОМА
5'

РАСТУЩИЙ
ПЕПТИД

т РН К

т РН К т РН К

СВОРАЧИВАНИЕ
ПРОЦЕССИНГ И
ТРАНСПОРТ
ПОЛИПЕПТИДА

БЕЛОК
РАЗНООБРАЗИЕ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

DNA

RNA
Coding function:
programming the protein synthesis

Protein
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

(1) Показано, что РНК (как и ДНК!) могут служить матрицей для
собственного воспроизведения через комплементарные цепи РНК:
1962-1964 – открытие самовоспроизведения полиовирусной РНК
в животных клетках (D. Baltimore).
1965-1966 – открытие самовоспроизведение РНК бактериофагов
типа R17 и MS2 в бактериальных клетках (S. Spigelman).
(2) Показано, что РНК могут служить матрицей для синтеза ДНК:
1970 – открытие обратной транскрипции (H.M. Temin, D.
Baltimore)
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ РНК

DNA
Replication function:
copying of genes,
reverse transcription,
self-replication

RNA
Coding function:
programming the protein synthesis

Protein
БИОПОЛИМЕРЫ

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ:
Линейная последовательность мономеров в цепи →
→ кодирование,
→ репликация.

ПОЛИПЕПТИДЫ (БЕЛКИ):
Свернутая структура → трехмерный рисунок поверхности →
→ трехмерное узнавание лигандов,
→ катализ.
ПРИНЦИПЫ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ РНК
(1960 - 1962)

1) РНК, в отличие от ДНК, одноцепочечна.

2) Высокомолекулярные РНК представляют собой


ковалентно непрерывные цепи.

3) РНК формирует вторичную структуру за счет в основном


попарного антипараллельного взаимдействия смежных участков цепи.
ОДНОЦЕПОЧЕЧНОСТЬ РНК И
ФОРМИРОВАНИЕ КОРОТКИХ ДВОЙНЫХ СПИРАЛЕЙ ВНУТРИ ЦЕПИ

«ШПИЛЬКИ»
Канонические (Уотсон-Криковские) пары в РНК
ААииВВформы
формыДНК
ДНК(атомные
(атомныемодели)
модели)

А форма В форма
РНК ДНК
ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА РНК:
«ДЕФЕКТЫ» ДВОЙНЫХ СПИРАЛЕЙ
И ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ДВУСПИРАЛЬНОЙ СТРУКТУРЫ

(1) Нестандартные спаривания и «противостояния» в двойной спирали.


(2) Выпетливания 1 – 3 нуклеотидов одной из спаренных цепей в двойной спирали.
(3) Большие боковые выпетливания и «разветвления» двойных спиралей.
(4) «Прерывающиеся» («составные») двойные спирали.
(5) Псевдоузлы (Preudoknots).
(6) «Тетрапетли» (Tetraloops).
(7) Однотяжевые спирали.
(8) Тройные спиральные участки.
Пары оснований в РНК (A – U, G – C и G – U)
Вторичная структура тРНК

Yeast tRNA Ala

I G C
U m 1I
U Ψ
C G
C G
C G
U A
C G A
G hU m 22 G G G
G A
GCGC C U
C •
UCCGG T Ψ C
hU UGCG
G A m 1G G
U G C AGGCC U U A
U U
G C
Неканонические C G
пары G • U
G C
pG C
A
C
C
A OH
RICIN/SARCIN LOOP OF 23S/28S rRNA

RICIN/SARCIN LOOP OF 23S/28S rRNA

apurinic site
tritin specific lyase
A
2660 A G
G A G GNRA tetraloop
C
A
G
G G A
U A
G C G
A C
U C A G
C G Side G loop
C G
2650 U A 2670

Non-canonic pairs

Y. Endo and K. Tsurugi (1987) J. Biol. Chem. 262, 8128-8130;


(1988) J. Biol. Chem. 263, 8735-8739.
T. Ogasawara et al. (1999) EMBO J. 18, 6522-6531.
COMPACT FOLDING OF RNA

A. S. Spirin (1960) On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol. 2: 436-446.
A. S. Spirin (1962) Some aspects of macromolecular structure of high-polimer RNA in solution. In Acides Ribomucléiques et
Polyphosphates: Structure, Synthèse et Fonctions (M. Grunberg-Manago et J. P. Ebel, eds.), p.p. 73 – 87. C.N.R.S., Paris.
ПРИНЦИПЫ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ РНК
(1960 - 1962)

1) РНК, в отличие от ДНК, одноцепочечна.

2) Высокомолекулярные РНК представляют собой


ковалентно непрерывные цепи.

3) РНК формирует вторичную структуру за счет в основном


попарного антипараллельного взаимдействия смежных участков цепи.

4) РНК способна образовывать компактные структуры за счет


дальних парных взаимодействий внутри цепи и межспиральных
взаимодействий.

5) РНК обладает значительной конформационной подвижностью


(конформационные переходы).
СХЕМА СКЛАДЫВАНИЯ «КЛЕВЕРНОГО ЛИСТА»
В L-ОБРАЗНУЮ СТРУКТУРУ тРНК

AC arm AC arm

Cm A A Gm A A
U Y U Y
Cm A Cm A
A Ψ A Ψ
G m 5C G m 5C
A U A U
C G C G
V arm
C G A G C G V arm
G G A m 22 G m 7G m 2G 2
G GAGC A
C U C m 2G G 7
hU
2 5
m CUGUG T Ψ C m G
hU C U Cm G G C
G A A G U
GACAC m 1A A U A
U U A C U C
D arm G C
U A T Ψ arm A A
D arm U
A U G G
G hU
G U G hU
G C
C G C Ψ T G U G Um 5 CU U A G G C Gp
pG C G
A m 1A CACA G AAUUCGCACCA
U C OH
C
T Ψ arm AA arm
C
A OH

AA arm
СХЕМА ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ тРНК
SELF-FOLDING OF THE LINEAR POLYRIBONUCLEOTIDES
INTO UNIQUE COMPACT CONFORMATIONS

Atomic model of yeast phenylalanine tRNA

J.D. Robertus, J.E. Ladner, J.T. Finch, D. Rhodes, R.S. Brown, B.F.C. Clark and A. Klug (1974)
Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature 250: 546-551.

S.H. Kim, F.L. Suddath, G.J. Quigley, A. McPherson, J.L. Sussman, A.H.-J. Wang, N.C. Seeman
and A. Rich (1974) Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA.
Science 185: 435-440.
SELF-FOLDING OF THE LINEAR POLYRIBONUCLEOTIDES
INTO UNIQUE COMPACT CONFORMATIONS

16S ribosomal RNA 23S ribosomal RNA


.D. Vasiliev, O.M. Selivanova and V.E. Koteliansky (1978) Specific self-packing of the ribosomal 16S RNA. FEBS Letters 95: 273-276.

.D. Vasiliev and O.M. Zalite (1980) Specific compact self-packing of the ribosomal 23S RNA. FEBS Letters 121: 101-104.

.D. Vasiliev, I.N. Serdyuk, A.T. Gudkov and A.S. Spirin (1986) Self-organization of ribosomal RNA. In Structure, Function, and
Genetics of Ribosomes (Eds. B. Hardesty and G. Kramer), p.p. 128-142. Springer-Verlag, New York.

.T. Wimberly, D.E. Brodersen, W.M. Clemons Jr., R.J. Morgan-Warren, A.P. Carter, C. Vonrhein, T. Hartsch and V.
Ramakrishnan (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327-339.

”The shape [of the 30S ribosomal particle] is largely determined by the RNA component; none of the gross
Сравнение размеров и формы рибосомных субъединиц
и их изолированных РНК в компактной конформации

50S 23S РНК

30S 16S РНК


CATALYTIC FUNCTION OF RNA

1) Discovery of natural ribozymes:

. Kruger, P.J. Grabowski, A.J. Zaug, J. Sands, D.E. Gottschling and T.R. Cech (1982) Self-splicing RNA:
Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequences of Tetrahymena. Cell 31:
147-157.

. Guerrier-Takada,
(2) Artificial K. Gardiner,
selection T. Marsh, N. Pace and S. Altman (1983) The RNA moiety of ribonuclease P
of ribozymes:
is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857.

.L. Robertson and G.F. Joyce (1990) Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-
stranded DNA. Nature 344: 467-468.

eviewed in: T.R. Cech and B.L. Golden (1999) Building a catalytic active site using only RNA. In The RNA
World,
Activities of 2natural
nd
Editionand
(Eds.artificially
R.F. Gesteland et al.),ribozymes:
selected CSHL Press, New York.
•Phosphodiester bond hydrolysis
•Transesterification (concerted phosphodiester bond cleavage-ligation)
•Ligation of RNA chains
•Polymerization of ribonucleotides from NTPs on an RNA template
•Alkylation of nucleosides and nucleotides
•Synthesis of aminoacyl adenylates from amino acids and ATP
•Aminoacylation of nucleotides and tRNA
•Amide (peptide) bond formation between amino acids
•Transpeptidation
•Carbon-carbon bond formation
IGAND RECOGNITION FUNCTION OF RNA

1) E. Cundliffe (1986) Involvement of specific portions of ribosomal RNA in defined ribosomal functions: A study
utilizing antibiotics. In Structure, Function, and Genetics of Ribosomes (Eds. B. Hardesty and G. Kramer), p.p. 128-
142. Springer-Verlag, New York.

“A hitherto unsuspected capacity of RNA to recognize small molecules” was first proclaimed.

2)

PTAMERS:

A. Ellington and J. Szostak (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346:
818-822.
Three-dimensional structures of
ELEX: aminoglycoside-RNA complexes.
(a) Paromomycin-A-site RNA complex.
C. Tuerk and L. Gold (1990) Systematic evolution of ligands by exponential aptamers
(b) Tobramycin-RNA enrichment. Science 249: 505-510.
complex.
Reproduced from J.D. Puglisi and J.R.
Williamson (1999) In The RNA World,
3) D. Fourmy, M.I. Recht, S.C. Blanchard and J.D. Puglisi2Press,
Edition (Eds. R.F. Gesteland et al.), CSHL
nd
(1996) Structure of the A site of E. coli 16S rRNA
New York.
complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science 274: 1367-1371.
Мультифункциональность РНК

(1) Генетическая репликативная функция:


репликация генетического материала через комплементарные
полинуклеотидные последовательности.

(2) Кодирующая функция:


программирование белкового синтеза линейными
последовательностями нуклеотидов.

(3) Структурообразующая функция:


компактное сворачивание линейных полимеров (folding) с
формированием уникальных трехмерных структур.

(4) Функция узнавания:


высоко специфические пространственные взаимодействия с
другими макромолекулами и с малыми лигандами.

(5) Каталитическая функция:


специфических катализ химических реакций рибозимами.