Вы находитесь на странице: 1из 14

SsrA-mediated peptide

tagging caused by rare


codons and tRNA scarcity.

Roche ED, Sauer RT


Модель SsrA-опосредованного
мечения белков, синтезируемых
с мРНК, не содержащих стоп-
кодонов
• Рибосома останавливается на 3`-конце
деградированной мРНК, т.к. не может
связаться с факторами терминации.
• Аланил -SsrA РНК связывается с
остановившейся рибосомой, имитируя
тРНК.
• Реакция транспептидации – пептидная
цепь переносится на аланил-SsrA.
• Транслокация и замещение мРНК на
SsrA РНК.
• Трансляция продолжается по
матричной части SsrA РНК,
завершающейся стоп-кодоном
SsrA РНК кодирует пептид-маркер
AANDENYALAA - данная
последовательность на С-конце белка
является сигналом к протеолизу.
В данной работе:

• описан чувствительный анализ SsrA-опосредованного мечения белков

• показано, что мечение белков происходит по позициям, которые


кодируются редкими аргининовыми кодонами AGA и CGA.

Основные этапы:

1. Анализ SsrA-опосредованного мечения белков

2. Кластер редких кодонов индуцирует DD-мечение

3. Определение минимального количества редких кодонов, необходимых для


индукции DD-мечения

4. Сверхпродукция тРНКAGA супрессирует DD-мечение

5. Истощение пула тРНК индуцирует DD-мечение

6. Характеристика мРНК, содержащих редкие кодоны


Анализ SsrA-опосредованного
мечения белков
•Сконструировали мутант SsrA-DD, в
котором 2 последних кодона
заменены и кодируют аспартат,
маркированные такой пептидной
последовательностью белки
устойчивы к деградации.
•Получили и очистили
поликлональные антитела к пептиду
AANDENYALDD – для детекции
меченых белков.
•Активность SsrA-DD РНК изучали в
клетках, не имеющих SsrA дикого типа
и содержащих λN-trpAt мРНК – мРНК,
не содержащая стоп-кодонов и
кодирующая N-концевой домен λ-
репрессора.
Western-blot лизатов (С):
а-b дорожки – отсутствует
меченный продукт λN-trpAt
при отсутствии генов SsrA-
DD или λN-trpAt.
c-e дорожки –
присутствкет полоса,
соответствующая DD-
меченному λN-trpAt белку.
Его уровень растет с
увеличением времени
после индукции гена λN-
trpAt.
b-c дорожки – присутствует полоса, соответствующая DD-меченным клеточным
белкам с более высокой мол.массой.
Вывод: SsrA-DD анализ позволяет обнаружить и изучать эндогенное мечение
белков в E.coli.
Кластер редких кодонов
индуцирует DD-мечение
Сконструировали ген (λN-4AGA),
кодирующий:
• His6-таг,
• N-концевой домен λ-репрессора,
• сегмент, содержащий четыре
последовательных аргинина
(кодируются редкими AGA
кодонами),
• M2 Flag эпитоп
• и кодон терминации трансляции.

А. λN-4AGA ген, содержащий 4 последовательных


AGA кодона и стоп-кодон внутри рамки считывания.
В. Последовательности и ожидаемые мол.массы
λN-4AGA белка нормальной длины и DD-меченный.
С.Western-blot лизатов
D. MALDI-TOF масс-спектр
полноразмерного белка λN-
4AGA и основного продукта
DD-мечения.
Основные меченные белки были
очищены Ni –NTA
хроматографией, ИОХ и
хроматографией с обращенной
фазой.
Очищенный белок был
проанализирован с помощью
MALDI-TOF масс-спектрометрии.

•Масса исследуемого белка, соответствовала массе белка λN-4AGA, к которому


присоединен DD-пептид сразу после первого аргинина (кодируемого первым из
четырех AGA в кластере).
•Белок содержал His6 и DD-пептид, но не содержал M2 Flag эпитоп.

Вывод: SsrA-опосредованное мечение индуцируется последовательно


идущими редкими кодонами.
Определение минимального количества редких кодонов,
необходимых для индукции мечения

Сконструировали гены, аналогичные


λN-4AGA, содержащие один или два
AGA кодона.

Western-blot лизатов:
e-f дорожки (верхняя часть) – меченные
белки наблюдаются только в случае λN-
4AGA и λN-2AGA, но не в случае λN-AGA.

Вывод: DD-мечение по редким AGA


кодонам происходит после первого
AGA, но требует присутствия
последующего AGA.
Сверхпродукция тРНКAGA супрессирует DD-мечение

Cконструировали плазмиду, экспрессирующую SsrA-DD и тРНКAGA.


b-c дорожки (верхняя часть) - cверхэкспрессия предотвращает
маркировку продуктов генов λN-2AGA и λN-4AGA.
Вывод: остановка рибосомы вызывается дефицитом свободных
тРНКAGA и, как следствие, индуцирует SsrA-опосредованную
маркировку белка.
Истощение пула тРНК индуцирует DD-мечение

Исследовали эффект индукции


мРНК, кодирующей короткую
рамку считывани с 8
последовательными AGA
кодонами.
Сконструировали плазмиду,
экспрессирующую 8 AGA ORF под
контролем арабинозы и вторую
мРНК под контролем IPTG,
кодирующую λN-0AGA, λN-1AGA
или λN-2AGA белки.
Western-blot лизатов:
е дорожка (верхняя часть) – индукция 8
AGA ORF приводит к DD-мечению λN-1AGA
белка.
a, b и d дорожки (верхняя часть) – DD-
мечение не наблюдалось в конструкциях,
• не содержащие AGA кодонов
• или содержащие один AGA, но в которых
отсутствует 8 AGA ORF.
DD-мечение белка λN-2AGA наблюдалось и
в присутствии и в отсутствии 8 AGA ORF, но
при экспрессии 8 AGA ORF степень DD-
мечения была выше.

Вывод: Появление меченного продукта λN-1AGA гена говорит о том, что


единственным важным требованием для мечения по редким кодонам
является дефицит соответствующих тРНК. Экспрессия мРНК, содержащих
повторяющиеся AGA кодоны приводит к уменьшению количества свободных
тРНК и вызывает увеличение уровня DD-мечения.
Характеристика мРНК, содержащих редкие кодоны

Очистили тотальную РНК клеток, содержащих SsrA-DD РНК и λN-AGA ген (с одним, двумя
или четырьмя AGA кодонами), с добавлением или без тРНКAGA.
Мечение наблюдалось только в присутствии двух или четырех AGA кодонов и без
добавления тРНКAGA.
Nothern-blot анализ λN-AGA мРНК
проба – ДНК олигонуклеотид,
комплементарный 5`- концевой части
мРНК.
• Разрезанной мРНК ожидаемого размера
не наблюдалось во всех исследуемых
условиях.
• Наблюдали высокий постоянный
уровень полноразмерной мРНК λN-2AGA
и λN-4AGA. (d и e дорожки)

Такое увеличение уровня мРНК может быть результатом остановки рибосомы на


редких кодонах с последующей остановкой всех сотальных рибосом, что может
служить защитой мРНК от деградации.
RNase protection анализ:
Использовался как более чувствительный метод
поиска мРНК, заканчивающихся на первом AGA
кодоне.
•РНК пробы комплементарны 3`-концевой части
каждой λN-AGA мРНК.
•Полноразмерная мРНК и разрезанная после
первого AGA кодона.
c, e и h дорожки – детекция в пробах
контрольной разрезанной мРНК (2% по
количеству от полноразмерной мРНК)
f и i дорожки – пробы тотальной РНК из клеток,
где происходило DD-мечение, содержали
разрезанную РНК. Но ее уровень очень
незначительно превышал значения в пробах из
клеток, где DD-мечение не происходило
(дорожки g и j).
Вывод: мечение по редким кодонам
происходит на внутреннем участке, а не на 3`-
конце разрезанной мРНК.
Выводы:

• Разработан простой и чувствительный метод анализа SsrA-опосредованного


мечения белков

• Используя данный метод,показали, что белки, синтезируемые с мРНК, которая


содержит редкие кодоны, могут быть маркированы SsrA системой.

• SsrA-опосредованное мечение белков происходит по редким AGA и CGA


кодонам.

• Дефицит тРНК является необходимым условием для мечения, индуцируемого


редкими AGA кодонами.

• Увеличение концентрации тРНК AGA приводило к исчезновению мечения по


кластерам редких AGA кодонов. Уменьшение концентрации свободной тРНК AGA
приводило к значительному увеличению мечения и так же к мечению по
одиночным редким AGA кодонам.

Повторяющиеся редкие AGA кодоны вызывают SsrA-опосредованное


мечение, в результате истощения доступного пула тРНК.