Вы находитесь на странице: 1из 46

Fig. 1.

(a, b, and k) Soluble chromatin from chicken erythrocyte nuclei vitrified in [approx]5 mM
M+ and imaged unfixed and unstained in the frozen hydrated state

Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178

Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences


Fig. 3. (a) Stereo pair of a 3D model of a 9-nucleosome segment of a chicken erythrocyte
chromatin fiber imaged in [approx]5 mM M+

Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178

Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences


Намотанная на нуклеосомы ДНК организована в “скрытую” или
компенсированную суперспираль, которая может быть обнаружена после
удаления гистонового октамера. Феномен особенно хорошо изучать на
кольцевых молекулах

Linking number paradox


2М NaCl

топоизомераза

топоизомераза

2М NaCl
нагревание
Нагревание + релаксация

13
11
Разделение топоизомеров в
низковольтном агарозном форезе

Lk – linking number – число перекрещиваний


нитей ДНК

Tw – twisting – количество витков двойной


спирали ДНК
Wr – количество супервитков

Lk = Tw + Wr
Существуют различные способы оценки размеров петель ДНК,
закрепленных на ядерном матриксе. Согласно большинству имеющихся
данных, размер петель составляет от 50 до 200 т.п.н.
Петли ДНК в ядрах клеток CHO, экстрагированных
2M раствором NaCl
Для активных генов характерна предпочтительная
чувствительность к ДНКазе I при обработке последней
ядер или пермеабилизованных клеток

В эритроидных клетках глобиновые гены предпочтительно


чувствительны к ДНКазе I

ДНКаза I

ovalbumin

βA-globin
Существует целый ряд факторов, влияющих на степень
конденсации хроматина, среди которых наиболее изучено
ацетилирование гистонов
Как выделить транскрипционно-активную фракцию хроматина?

Выделение коротких фрагментов хроматина, солюбилизирующихся при


коротком нуклеазном переваре

Фракционирование на
ртутной колонке (Allfrey)
Ацетилирование лизиновых остатков в N­”хвостах” гистонов Н3 и Н4

N
Лизиновый остаток O
в аминокислотной C C γ C O
ε
цепи
O C
α β
C
δ
C
N+ - P ДНК
O O

Acétyl-CoA
C HAT (Histone HDAC
O C Acétyl- (Histone
- Transférase) Désacétylase)
O
CoA
N
Ацетлированный
C C C ε N C
остаток лизина
утрачивает заряд O C C C C
O
В нуклеосомной частице существует много доступных
для ацетилирования лизиновых остатков
Анализ уровня ацетилирования гистонов

электрофоретическая SDS AU (Acetic Acid – Urea)


система 1M acid, pH ~3 in 5-8 M urea
принцип разделения по размеру по размеру и заряду

electrode: _ +

++
++

H3 135 aa 135 aa
H3
++
+
H3
H4 H4 102 aa
H4 102 aa

electrode: + _

Densitometry of Coomassie dye


Для активного хроматина характерен повышенный уровень
ацетилирования гистонов
Ацетилирование гистонов не только препятствует
компактной упаковке нуклеосомной нити, но и приводит и
пространственной реорганизации самих нуклеосом.

Считается, что такая реорганизация облегчает транскрипцию


организованной в нуклеосомы ДНК

HAT

HDAC
Bazett-Jones DP, Mendez E, Czarnota GJ, Ottensmeyer FP, Allfrey VG.
Nucleic Acids Res. 1996 Jan 15;24(2):321-9.

Нуклеосомы не связавшиеся Нуклеосомы, связавшиеся с ртутной


с иммобилизированными на носителе колонкой
ионами ртути
Хроматин, собранный in vitro (в экстрактах из эмбрионов дрозофилы) с
использованием плазмидной ДНК и гиперацетилированных гистонов,
обладает всеми основными характеристиками активного хроматина
Krajewski and Becker, 1998

Ацетилированные
гистоны были получены Хроматин, собранный с использованием
из клеток CV1, обработанных ацетилированных гистонов, обладает
трихостатином А (TSA) повашенной чувствительностью к ДНКазе I
Хроматин, собранный с использованием ацетилированных гистонов, в меньшей
степени ограничивает конформационную подвижность ДНК, чем обычный
хроматин

-H1 +H1
Модификации гистона Н3

• N-концевой домен без модификаций


N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec deux sérines (S10, S28) phosphorylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec 3 lysines (K4, K9, K27) méthylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Onze des 30 résidus sont modifiables :
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
Модификации гистона Н3

• N-концевой домен без модификаций


N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec 3 lysines (K4, K9, K27) méthylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Onze des 30 résidus sont modifiables :
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
Модификации гистона Н3

N-концевой домен без модификаций


N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
3 lysines (K4, K9, K27) мишени для метилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Avec 3 arginines (R2, R17, R26) méthylées
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Onze des 30 résidus sont modifiables :
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
Модификации гистона Н3

N-концевой домен без модификаций


N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 4 lysines (K9, K14, K18, K23) мишени для ацетилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 2 sérines (S10, S28) мишени для фосфорилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
3 lysines (K4, K9, K27) мишени для метилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• 3 arginines (R2, R17, R26) мишени для метилирования
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
• Onze des 30 résidus sont modifiables :
N-ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP
Расположение сайтов, по которым могут
осуществляться модификации гистонов
утверждение о том, что в активном
хроматине гистоны ацетилированы, а
в неактивном метилированы не является
верным

Метилирование по некоторым позициям


(например K4 гистона Н3) является
типичным для активного хроматина
Распределение ацетилированных форм гистонов
в протяженных доменах генома можно изучать с
использованием метода иммунопреципитации
хроматина (ChIP)
Области, характеризующиеся повышенным уровнем
ацетилирования гистонов Н3 и Н4, в первом приближении
совпадают с областями, характеризующимися
предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I.
Для активных доменов хроматина характерен повышенный
уровень ацетилирования гистонов.

Распределение ацетилированных форм гистонов


в протяженных областях генома можно изучать с помощью
иммунопреципитации хроматина CHIP

В доменах бета-глобиновых генов и других доменах


ткане-специфичных генов области, характеризующиеся
повышенным уровнем ацетилирования совпадают с
областями предпочтительной чувствительности к ДНКазе I
Динамика хроматиновых доменов регулируется ацетилазами и
деацетилазами
гистонов.

Как гистон-ацетилазы, так и гистондеацетилазы входят в состав больших


мультисубъединичных комплексов
HAT
Охарактеризован ряд ферментов, избирательно модифицирующих
индивидуальные остатки лизина в гистонах H3 и Н4

Murine G9a is H3-K9 methyltransferase

SUV39H1 and murine Suv39h1--mammalian homologues of


Drosophila Su(var)3-9 and of Schizosaccharomyces pombe
clr4--encode histone H3-specific methyltransferases that
selectively methylate lysine 9 of the amino terminus of histone H3 in vitro

MOF is Drosophila site-specific MYST family histone acetyltransferase that


acetylate H4 at specific positions in male X-chromosome
РНК-полимераза может служить
“транспортным средством”, обеспечивающим
прогрессивное ацетилирование протяженного
геномного домена
Travers, 1999
Cуществует мнение, что ацетилированные гистоны в транскрипционно-активном хроматине
постепенно замещаются вариантными формами гистонов. Это замещение может иметь
процессивный характер, причем процессивность может обеспечиваться белками, связанными с
элонгирующей РНК-полимеразой II

Workman, Jerry L. and Abmayr, Susan M. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 1429-1430

Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences


Для анализа распределения вариантных форм гистонов в протяженных
областях генома используют метод иммунопреципитации и последующую
гибридизацию с олигонуклеотидными чипами (ChIP on CHIP)

Genome-scale profiling of histone H3.3 replacement patterns.

Mito Y, Henikoff JG, Henikoff S.

H3.3 замещает H3 в местах активной транскрипции, особенно, если H3


метилирован по лизину 4
Distributions of H2A.Z and AcH2A.Z at two housekeeping genes, GAPDH and vimentin and the
tissue-specific gene carbonic anhydrase in HD37 erythroblasts

Характерные для активного хроматина вариантные формы


гистонов также могут ацетилироваться, причем присутствие
ацетилированных вариантных форм гистонов (в частности
H2A.Z, хараткерно для промоторов активных генов

Distributions of H2A.Z and AcH2A.Z at two housekeeping genes,


GAPDH and vimentin and the tissue-specific gene carbonic anhydrase
in HD37 erythroblasts. The bottom panel shows four amplicons at inactive
sequences in HD37 cells and 15DCE. B/I values (the ratio of the Bound
to the Input signal for an amplicon) above the unity lines represent
‘fold enrichment’ achieved by the antibodies. I/B values are plotted
below the unity lines when the Bound signal is less than that of the
Input: this ratio represents ‘fold depletion’.

Bruce, K. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33:5633-5639; doi:10.1093/nar/gki874

Copyright restrictions may apply.


Distributions of H2A.Z, AcH2A.Z, AcH4, AcH3 and AcH2B at the lysozyme locus in HD37
erythroblasts

Bruce, K. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33:5633-5639; doi:10.1093/nar/gki874

Copyright restrictions may apply.


Гистон-деацетилазы также входят в состав больших мультисубъединичных
белковых комплексов

NuRD (2 MDa) SIN3


(Nucleosome Remodeling and (млекопитающие и
histone Deacetylation
дрожжи)
(млекопитающие и ксенопус)
связывание с
метилированной ДНК

MeCP2

nucleosome
remodeling

Помимо HDAC 1 и 2 известно еще 4 гистондеацетилазы


Удаляются ли нуклеосомы при транскрипции? Метод белковых теней
Работающая РНК-полимераза
раскручивает ДНК, создавая домен
позитивной суперспирализации перед
собой и домен негативной
суперспирализации позади себя.

Нуклеосома связывает негативные


супервитки в силу чего с чисто
энергетичесой точки зрения она
будет стремиться переместиться в
негативно суперспирализованный
домен
Перенос кор-частицы за полимеразу (модель Фельзенфельда, подтвержденная
Студицким в экспериментах с использованием РНК полимеразы фага Т7)
Ключевую роль в обеспечении возможности транскрипции полимеразой II ДНК,
организованной в нуклеосомы играет временное удаление димера H2A-H2B

Взаимодействие димера H2A.Z-H2B с тетрамером (H3-H4)2 слабее, чем


взаимодействие с тетрамером димера Н2A-H2B в нормальной нуклеосомной
частице (вывод, сделанный на основе анализа кристаллической структуры
нуклеосом, построенный из нормальных и вариантных форм H2A)

Экспериментально продемонстрировано, что РНК-полимераза II избирательно


связывается с хроматином, в котором нуклеосомы не солержат одного из
димеров H2A-H2B.
H3-H4
В модельном эксперименте Pol II H2A-H2B
H2A-H2B
продемонстрировано, что
транскрипция через нуклеосому Элонгационный H3-H4
комплекс
приводит к практически полной
утрате одного из димеров Н2A-H2B

H3-H4
H2A-H2B Pol II

H3-H4 H2A-H2B
Главную роль в удалении димера H2A-H2B (H2A.Z-H2B) играет фактор элонгации
транскрипции FACT, выполняющий функцию шаперона

SSRP1 (HMG-box-containing protein


FACT
p140/hSpt16 (человеческий гомолог дрожжевого Spt16./Cdc68)
С-концевая часть Spt16 обогащена кислыми аминокислотами, что является
характерной особенностью всех переносчиков гистонов)

FACT физически взаимодействует с нуклеосомами. Для оптимальной


эффективности транскрипции FACT должен присутствовать в
эквимолярном количестве по отношению к нуклеосомам (в модельной
системе)
FACT участвует как в дестабилизации
и разрушении нуклеосом перед
продвигающимся транскрипционным
комплексом, так и в сборке нуклеосом
после прохождения транскрипционного
комплекса.

FACT взаимодействует с димерами


H2A-H2B (зеленые прямоугольники)

Другой фактор (Spt6) служит переносчиком


димеров Н3-Н4 (желтые прямоугольники)

Фактор Сhd1, участвующий в сборке


нуклеосом, физически взаимодействует с
одной из субъединиц FACT (SSRP1)
АКТИВНЫЙ ХРОМАТИН

1. Повышенный уровень ацетилирования гистонов

3. Частичная утрата димеров Н2А-Н2В (при участии белкового комплекса


FACT (Facilitated Chromatin Transcription)

6. Частичное разворачивание нуклеосом (разрушение дисульфидного


мостика между двумя молекулами Н3 и экспозиция свободных SH групп)

9. Присутствие специфических вариантов «коровых» гистонов (H2A.Z, H3.3)

11. Недопредставленность Н1 и некоторое обогащение различными типами


HMG белков.

Нуклеосомы, построенные при участии H2A.Z


могут удерживать на поверхности ион металла
(Mn++, Zn++, Cu++). Наличие иона металла на
поверхности нуклеосом обеспечивает возможность
связывания факторов ремоделирования хроматина,
содержащих PHD домены
Транскрипционно-активная фракция хроматина характеризуется
реорганизацией

1. индивидуальных нуклеосом

2. 30 нм фибриллы