Вы находитесь на странице: 1из 57

Эукариотический геном организован в большие (50 - 250 т.п.н.

) петли ДНК,
разделенные участками прикрепления к ядерному матриксу
Области (участки) прикрепления ДНК к ядерному матриксу составляют специальный
компартмент генома. В этом компартменте находятся участки начала репликации и
большинство регулаторных последовательностей
В участках (областях) прикрепления к ядерному матриксу реализуются
множественные контакты ДНК с ДНК-топоизомеразой II

Гипотеза: области прикрепления к


ядерному матриксу являются
предпочтительными местами
незаконной рекомбинации, приводящей
к утрате или перемещению петель ДНК

ori ori ori

Topo II
ori
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном
расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной
близости в физическом пространстве
Перенос цепей ДНК
путем обмена
Расщепление ДНК топоизомеразой II субъединиц
топоизомеразы II

ДНК

релаксация и Релаксация ДНК и накопление


лигирование ДНК комплексов TOPO II-ДНК
Экспериментальные данные, косвенно подтверждающие модель
В геноме существуют предпочтительные места хромосомных перестроек ("hot spots; 
горячие точки рекомбинации). Они бывают часто разделены фрагментами ДНК,
Протяженностью 20 – 100 т.п.н., которые редко участвуют в рекомбинациях 
(Henglein et al., 1989; Geng et al., 1993). 

Анализ фрагментов ДНК, участвующих в реципроктных рекомбинациях, 
продемонстрировал присутствие MAR элементов и участков предпочтительного 
расщепления ДНК топоизомеразой II  (Sperry et al., 1989; Aplan et al., 1996). 

Эукариотическая ДНК топоизомераза II способна осуществлять незаконную
рекомбинацию ДНК in vitro (Gale and Osheroff, 1992). 

Обработка культивируемых клеток агентами, ингибирующими ДНК топоизомеразу II, 
стимулирует образование делеций, дупликаций и транслокаций 
(Maraschin et al., 1990; Shibuya et al., 1994).

При лечении опухолей агентами, ингибирующими активность ДНК топоизомеразы II
(VP16, амсакрин, m­AMSA) часто развиваются вторичные лейкозы, которые 
коррелируют с наличием хромосомных перестроек (Auxefants et al., 1992; Super et al., 1993

«Горячие точки» рекомбинаций часто бывают относительно короткими и 
включают участки расщеплении ДНК топоизомеразой II (Aplan et al., 1996)
ВОПРОС: Существует ли корреляция между «горячими
точками» хромосомных перестроек и участками прикрепления
ДНК к ядерному матриксу
Транслокации между 8 и 21 хромосомами, затрагивающие гены AML-1 (21 хромосома)
и ETO (8 хромосома) часто наблюдаются при острых лейкозах
Транслокации между 8 и 21 хромосомами, затрагивающие гены AML-1 (21 хромосома)
и ETO (8 хромосома) часто наблюдаются при острых лейкозах
А – AML-BCR3 проба

B – ETO-BCR2 проба

процентное содержание AML-BCR3 и ETO-BCR2


в границах ядерного матрикса и в короне петель
ДНК
Проба Количество Процентное Процентное
проанализированн содержание содержание
ых клеток сигналов в сигналов в
границах короне петель
ядерного ДНК
матрикса
AML-BCR3 99 77 23

ETO-BCR2 52 89 11
ETO-BCR2 и AML-BCR3 содержат MAR элементы
Тотальная ДНК BCR2 AML-1 гена предпочтительно
представлен в ДНК ядерного матрикса
Метод, основанный на полу-
ДНК ядерного матрикса
количественной ПЦР, позволяет
оценить относительную
представленность изучаемого
фрагмента ДНК в препарате ДНК
ядерного матрикса
ВЫВОД

Горячие точки перестроек генов AML-1 и ETO содержат MAR элементы


и предпочтительно связаны с ядерным матриксом в пролиферирующих
клетках Hel

Это же характерно и для ряда других изученных «горячих точек»


рекомбинации

локус гена GNA3 китайского хомячка


(Svetlova E.Yu., Razin S.V. and Debatisse M. 2001. Mammalian recombination hot spot in a DNA loop
anchorage region: A model for the study of common fragile sites. J. Cell. Biochem. 81(S36), 170-178).

локус гена c-myc человека


(Gromova I.I., Thomsen B., and Razin S.V. 1995. Different topoisomerase II antitumor drugs direct similar
specific long-range fragmentation of an amplified c-myc gene locus in living cells and in high-salt extracted
nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA v. 92, p. 102-106).
Если не границы петель ДНК, то что разграничивает
хроматиновые домены?

Могут ли эту роль выполнять инсуляторы?


Анализ активности инсулятора (блокирование энхансера) на
кольцевых EBV минихромосомах, реплицирующихся в клетках К562
Инсулятор подавляет формирование гиперчувствительного сайта на
промоторе репортерного гена
Инсулятор подавляет распространение домена ацетилирования гистонов,
которое инициируется в области энхансера

HS4 in
out
Инсулятор подавляет трансфер РНК полимеразы II от энхансера к
промотору (эксперимент по иммунопреципитации хроматина антителами
против РНК полимеразы II)

Р
Подавления прогрессивного распространения домена ацетилирования H3
и трансфера РНК полимеразы II от энхансера к промотору зависит от
связывания CTCF

CTCF

acet-H3 Pol II
Защита от позиционных эффектов может быть связана с образованием
независимых хромосомных доменов
Существует ли соответствие между MAR элементами и инсуляторами ?
Visualization of chromatin domains created by
the gypsy insulator of Drosophila У дрозофилы большинство инсуляторов
работают с привлечением белков
Keith Byrd and Victor G. Corces Su(Hw) и Mod(Mdg4)
J Cell. Biol. (2003) 162, 565-574 Эти белки колокализуются на ядерном
матриксе в так называемых «инсуляторных
тельцах»

окраска ядер на ламины и


Mod(Mdg4)

окраска ядерных гало на


ламины и Mod(Mdg4)

окраска ядерных гало на


Su(Hw) (красный сигнал)
и Mod(Mdg4) (зеленый сигнал)
В геномном фрагменте, не
содержащем инсерции gypsy,
проба B локализована между
двумя инсуляторами

После инсерции gypsy возникает


дополнительный “band”,
содержащий Su(Hw) и все три
инсулятора, равно как и проба B
колокализуются
Инсуляторы взаимодействуют друг с другом, замыкая петлю

нормальные
клетки

клетки с
инсерцией
Gypsy в середину
домена
Инсуляторы позвоночных, работающие при участии CTCF также
связаны с ядерным матриксом.
CTCF локализован предпочтительно в HSIV инсулятор обладает свойствами MAR
ядерном матриксе элемента

HSIV инсулятор связан с ядерным матриксом in vivo

cвязывание HSIV инсулятора с ядерным матриксом


зависит от связывания CTCF
Human matrix attachment regions insulate transgene expression
from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster.

Namciu SJ, Blochlinger KB, Fournier RE.


Mol Cell Biol. 1998 Apr;18(4):2382-91

5’MAR и 3’ MAR из локуса аполипопротеина В и MAR из локуса


а1 антитрипсина защищали ген white от позиционных эффектов в
клетках дрозофилы

Блокирующая энхансеры активность не анализировалась


The effect of matrix attached regions (MAR) and specialized chromatin structure (SCS)
on the expression of gene constructs in cultured cells and in transgenic mice.

Attal J, Cajero-Juarez M, Petitclerc D, Theron MC, Stinnakre MG, Bearzotti M, Kann G,


Houdebine LM.

Mol Biol Rep. 1995-96;22(1):37-46

MARs in cultured cells located in the 3' OH region of the human apolipoprotein B100 (Apo B100) and within the
SV40 genome were unable to stimulate and insultate transgene expression directed by the promoters from a rabbit
whey acidic protein (WAP) gene or from human cytomegalovirus (hCMV) early genes. In transgenic mice, the MAR
from the Apo B100 and SV40 genes did not enhance the expression of a transgene containing the rabbit whey acid
protein (WAP) promotor, the late gene SV40 intron (VP1 intron), the bovine growth hormone (bGH) cDNA and the
SV40 late gene terminator. This construct was even toxic for embryos. When added before the CMV enhancer and
after the transcription terminator in the CMVTKCAT construct, the SCS sequence was unable to insulate the
integrated gene as seen by the fact that the level of CAT in cell extracts were by no means correlated with the number
of copies in individual clones.
From these data, it is concluded that

i) a MAR containing the canonical AT rich sequences does not amplify the expression
of all gene constructs

ii) At rich MAR sequences do not have per se an insulating effect

iii) Drosophila SCS from the 87A7 HSP70 gene has no insulating effect in all gene
constructs (at least in mammalian cells)
SCS элементы дрозофилы не обладают активностью MAR

Ряд тестированных MAR элементов не обеспечивал блокирования энхансера


в стандартном тесте

Многие тестированные MAR элементы защищали (в большей или меньшей


степени) трансгены от позиционных эффектов
Нужны ли инсуляторы ?
Делеция HS4 не имеет выраженных последствий
В домене гена лизоцима кур 5’-концевой МАR-инсулятор не
нужен для защиты гена от позиционных эффектов в
эктопических позициях
Импринтинг - селективная инактивация аллеля в материнской, либо
отцовской хромосоме. Эта инактивация как правило сопровождается
метилированием ДНК в соответствующей области.

Импринтинг можно рассматривать как один из ярких примеров


регулируемого создания неактивного домена

В настоящее время в ряде геномных доменов, которые являются мишенями


для импринтинга, обнаружены регуляторные элементы (ICR, Imprinting
Choice Regions) которые контролируют статус (активный или
репрессированный) данных доменов. Ключевую роль в работе ICR играют
инсуляторы, инактивируемые посредством метилирования ДНК

Igf2/H19 locus
CTCF
Igf2 H19 enh enh

DMR

Igf2 H19 enh enh

CmpG methylation CTCF


Не все домены имеют четко определенные границы

LCR домена альфа-глобиновых генов находится в интроне другого гена

Даже “классический домен” бета-глобиновых генов человека расположен


внутри неродственного домена генов одорантных рецепторов

5’ HS sites
–111 7 6 5 4 3 2 1 3’HS1
HOR HOR HOR HOR HOR HOR HOR
5’β7 5’β5 5’β4 5’β2 ε Gγ Aγ δ β ERV-9 3’β2 3’β3 3’β5

~30 kb HOR HOR ERV-9 HOR ~35 kb HOR


5’β3 5’β1 3’β1 3’β6

5 kb
В домене гена лизоцима кур находится также ген «домашнего хозяйства»
“четкие” и “размытые” домены
Инсуляторы оказываются на границах доменов потому что там они
ничему не мешают

Если бы инсуляторы оказались внутри домена, то была бы нарушена


коммуникация между энхансерами и промоторами

По-этому в ходе эволюции инсуляторы убираются в “безопасные”


места

Регуляторные системы доменов с четкими границами


Примеры доменов с «четкими» границами

Drosophila 87A7 heat-shock locus Chicken β-globin gene domain

Human β-globin gene domain HMR domain of the yeast mating


type locus
Festenstein and Kioussis, 2000
В доменах, содержащих перекрывающиеся неродственные
гены важную роль играет функциональная изоляция
регуляторных механизмов. Одним из механизмов такой
функциональной изоляции является существенное повышение
специфичности влияния энхансера на определенный промотор
или группу промоторов.

dpp oaf

P dpp EI P oaf

dpp oaf

P dpp EI P hsp
В перманентно открытых (ДНКаза-чувствительных)
областях домены ткане-специфичных генов могут

отличаться по уровню ацетилирования гистонов

Anguita et al., 2001, PNAS 98, 12114-12119


фибробласты

эритробласты
H4 Lys5

H4 Lys16
В доменах с четко определенными границами
отдельные субдомены могут существенно
различаться по уровню ацетилирования гистонов
Домен гиперацетилирования гистонов

Домен альфа-глобиновых генов кур является


типичным примером доменов с невыраженными
границами
РНК-полимераза может служить
“транспортным средством”,
обеспечивающим распространение
активационных сигналов от LCR
к промоторам индивидуальных генов
Travers, 1999

Активация альфа-глобинового домена в эритроидных клетках может происходить в соответствии


с моделью Траверса. При этом удаленный регуляторный элемент включает промотор доменного
транскрипта
Полнодоменный транскрипт не является После начала активной транскрипции
предшественником глобиновых мРНК и индивидуальных глобиновых генов
концентрируется в ядре распределение глобиновых транскриптов
в клетке резко изменяется
Между LCR-подобным регуляторным элементом и промоторами глобиновых гнов
расположен СTCF-зависимый инсулятор

MAR/insulator

Е С Е

ChIP
-6.6 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 kb
αEHS-1.4

βA β/ε
promoter enhancer
CAT
Sal I Hind III
“between” “outside”

Fold-reduction αEHS-1.4
1 P E
2.39
2 P E
2.85
P E
3 12.25
4 P E
9.69
0 5x103 1x104 1.5x1042x104 2.5x104 3x104
Normalized CAT activities
неэритроидные клетки
домен гиперацетилирования гистонов

Пре-эритробласты
домен гиперацетилирования гистонов

Эритробласты
(активная экспрессия глобинов на уровне мРНК и белков)
Регуляторные системы, активирующие экспрессию глобиновых генов
могут влиять на экспрессию гена «домашнего хозяйства» ggPRX. Это
активирующее влияние подавляется СTCF-зависимым сайленсером

домен гиперацетилирования гистонов

Эритробласты
(активная экспрессия глобинов на уровне мРНК и белков)
НЕЭРИТРОИДНЫЕ КЛЕТКИ PggPRX

met-CpG

ЭРИТРОИДНЫЕ КЛЕТКИ
CTCF-сайленсер
PggPRX

CpG

домен ацетилирования гистонов