Вы находитесь на странице: 1из 22

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра молекулярной биологии

Исследование влияния мутаций в активном центре


РНК-полимеразы на субстратную специфичность
фермента
Дипломная работа

Выполнил: Пупов Данил Владимирович


Научный руководитель: к.б.н. А.В. Кульбачинский
Институт молекулярной генетики РАН

Москва, 2007
Транскрипционный цикл
σ Кор
Кор (α2
ββ’) σ
+
ДНК
Инициационный
комплекс
Эндонуклеазная
активность РНКП

Кор Кор

«Откатившийся» Элонгационный
элонгационный 3’ комплекс
комплекс
Структура элонгационного
комплекса РНКП
активный
центр
β

ДНК

РНК
β′
Korzheva et al., 2000
Структура активного центра РНКП

PНК

NTP
Консервативный
мотив:

458-NADFDGD-464
Белок Cgl1702 C. glutamicum

Белок Cgl1702 имеет области гомологии с участками β- и


β’- субъединиц РНКП E.coli
Предполагаемый активный центр Cgl1702 C. glutamicum:
1593-DGDFDGD-1599
Белок Cgl1702 обладает слабой ДНКП-активностью
Цель работы
Установить, приводят ли замены первых
двух аминокислот мотива NADFDGD в
активном центре РНКП к изменению
дискриминации рибо- и
дезоксирибонуклеотидов.
PНК
NADFDGD DADFDGD
NADFDGD DGDFDGD
Установить, приводят ли
замены двух аминокислот NTP
мотива DGDFDGD в
предполагаемом активном
центре белка Cgl1702 к
появлению у него РНКП-
активности.

DGDFDGD NADFDGD
Выяснить, как влияет аминокислотная
замена A455β’E на связывание
нуклеотидов и нуклеазную активность
РНКП.
Этапы работы
• Получение мутаций в последовательности активного центра в
гене rpoC β′-субъединицы РНКП E. coli: мутация N458β’D,
мутация NA458,459β’DG, а также мутацию A455β’E.
• Получение мутации в гене сgl1702 в области предполагаемого
активного центра белка Сgl1702: DG1593,1594NA.
• Экспрессия мутантных генов rpoC и сgl1702 в клетках E. coli и
получение очищенных препаратов белков.
• Получение методом сборки in vitro препаратов РНКП,
содержащих мутантные β′-субъединицы.
• Исследование РНК- и ДНК-полимеразной активности собранной
РНКП, а также мутантного варианта белка Cgl1702 в системе
транскрипции in vitro на разных типах матриц. Исследование
эндонуклеазной активности собранных РНКП E. coli.
Связывание кор-ферментов РНКП E.coli
с минимальной матрицей
РНК/ДНК

ДНК/ДНК
Связывание кор-ферментов РНКП E.coli
с минимальной матрицей

Kd, нМ:
Связывание, %

WT 2
D 5
DG 29
E 1

[Кор], нМ
Исследование плавления промотора
lacUV5 РНКП E.coli
Измерение активности РНКП E.coli
на промоторе Т7А1

CAU

Субстраты:
UTP
Субстраты: СрА + UTP ATP
GTP
CTP
Анализ различий во включении рибо- и
дезоксирибонуклеотидов РНКП E.coli
РНК/ДНК

ДНК/ДНК
Анализ различий во включении рибо- и
дезоксирибонуклеотидов РНКП E.coli
Кол-во удлиненной РНК, %

Кол-во удлиненной РНК, %


[rNTP], мкМ [dNTP], мкМ
Анализ различий во включении рибо- и
дезоксирибонуклеотидов РНКП E.coli
Исследование влияния мутаций в активном
центре РНКП E.coli на скорость расщепления РНК
Эндонуклеазная
активность РНКП
Кор

«Откатившийся»
элонгационный
комплекс
Исследование влияния мутаций в активном
центре РНКП E.coli на скорость расщепления РНК

Кол-во укороченной РНК, %

Время, с
Исследование влияния мутаций в активном
центре РНКП E.coli на скорость расщепления РНК

Кол-во укороченной РНК, % kobs, c-1:


WT 0,008
D 0,0004
DG 0,006
E 0,024
Время, с
Анализ ДНК- и РНК- полимеразной
активности белка Cgl1702 C. glutamicum
Анализ ДНК- и РНК- полимеразной
активности белка Cgl1702 C. glutamicum
Заключение
Замены в РНКП E.coli:
NADFDGD DADFDGD
NADFDGD DGDFDGD
Не приводит к появлению ДНКП активности, но влияет на
дискриминацию нуклеотидов

Замены в Ggl1702:
DGDFDGD NADFDGD
Не приводят к появлению РНКП активности
Выводы

• Замены аминокислотных остатков N458β’D и


NA458,459β’DG в области активного центра РНКП E.coli
приводят к нарушению эффективности сборки кор-
фермента РНКП.
• РНКП E.coli с заменами N458β’D и NA458,459β’DG в
области активного центра обладают большей
активностью, чем РНКП E.coli, что обусловлено
дефектами на стадии инициации и элонгации синтеза
РНК. В то же время мутации не нарушают
взаимодействия с промотором.
Выводы
• Замена аминокислотного остатка N458β’ в области
активного центра РНКП E.coli на аспартат нарушает
включение рибонуклеотидов РНКП и снижает
эффективность дискриминации рибо- и
дезоксирибонуклеотидов. РНКП с двойной заменой
NA458,459β’DG обладает меньшими дефектами в
связывании и дискриминации нуклеотидов.
• Замена аминокислотного остатка А455β’ в области
активного центра РНКП E.coli на глутаминовую кислоту
приводит к увеличению эндонуклеазной активности
РНКП
• Замены аминокислотных остатков DG1593,1594NA в
области предполагаемого активного центра белка
Cgl1702 приводят к исчезновению ДНК-полимеразной
активности. Следовательно, данный участок, по-
видимому, действительно является активным центром,
обладающим ДНК-полимеразной активностью.