Вы находитесь на странице: 1из 400

Л.

Страйер
Second Edition

BIOCHEMISTRY

Lubert Stryer
Stanford University

W.H.Freeman and Company


San Francisco
Л.Страйер В 3-х томах

Перевод с английского канд. биол. наук М.Д.Гроздовой


и канд. биол. наук А.М.Колчинского

Под редакцией академика С.Е.Северина

том

Москва «Мир»
1985
ББК 28.072
С 83
УДК 577.1

Страйер Л.
С 83 Биохимия: В 3-х т. Т.3 Пер. с англ.- М.: Мир, 1985,-
400 с., ил.

В книге ученого из США на самом современном научном уровне рассмотрены ос-


новные проблемы биохимии и молекулярной биологии.
Третий том посвящен хранению, передаче и реализации генетической информации,
а также молекулярным основам ряда физиологических процессов (иммунной защите, дей-
ствию гормонов, транспорту веществ в клетке, работе биологических мембран).
Предназначена для биохимиков, молекулярных биологов, физиологов, химиков, меди-
ков, для студентов, аспирантов и преподавателей биологических, химических и медицин-
ских специальностей.

2001040000-372 ББК 28.072


С св. пл. подп. изд., 1985 57.04
041(01)-85

Редакция литературы по биологии

1975, 1981 by Lubert Stryer


перевод на русский язык, «Мир»,
1985
Информация
Хранение, передача и экспрессия
Часть генетической информации

Модель пары дезоксирибону-


клеотидных мономеров двой-
ной спирали ДНК. В этой паре
аденин связан водородной
связью с тимином.
ГЛАВА 24 группой соседнего сахара фосфодиэфирной
связью. Вариабельной в ДНК является по-
ДНК: генетическая роль, следовательность оснований. ДНК содер-
жит четыре типа оснований: два пури-
структура и репликация новых основания - аденин (А) и гуанин (G);
два пиримидиновых основания - тимин (Т)
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - и цитозин (С). Строение цепи ДНК показа-
молекула наследственности. ДНК - очень но на рис. 24.2.

Аденин Гуанин Тимин Цитозин


(А) (G) (Т) (С)

длинная нитевидная молекула, состоящая Строение ДНК можно изобразить и бо-


из большого числа рибонуклеотидов. Пу- лее кратким путем. В этом случае для обо-
риновые и пиримидиновые основания ДНК значения четырех основных нуклеотидов
несут генетическую информацию, тогда используются следующие символы:
как сахарные и фосфатные группы вы-
полняют структурную роль. В настоящей
главе обсуждаются структура, генетическая
роль и репликация ДНК, причем основ-
ное внимание уделяется ДНК прокариот,
так как эти организмы устроены про-
ще и подчиняются общим для всех ор-
ганизмов законам. Хромосомы эукариоти- Вертикальные линии в приведенных сим-
ческих клеток рассматриваются в гл. 29. волах соответствуют остаткам сахара,
буквы A, G, С и Т - основаниям. Диаго-
нальная линия с символом (на схеме,
приведенной ниже), обозначает фосфоди-
24.1. Ковалентная структура эфирную связь. Эта диагональная линия
и номенклатура ДНК соединяет конец одной вертикальной ли-
Остов ДНК имеет одинаковое строение на нии с серединой другой. Точки соедине-
всем протяжении молекулы. Он состоит из ния соответственно означают 5'-ОН- и
остатков дезоксирибозы, связанных фосфо- 3'-ОН-группы. В приведенном ниже приме-
диэфирными мостиками. 3'-гидроксильная ре символ указывает, что дезоксиаде-
группа остатка сахара одного дезоксирибо- нилат связан с дезоксицитидином фосфо-
нуклеотида соединена с 5'-гидроксильной диэфирным мостиком. 3'-ОН-группа дезок-
сиаденилата присоединена к 5'-ОН-группе
Часть IV. дезоксицитидина через фосфорильную груп-
6 Информация пу:
бактерий. Они вызывают пневмонию у че-
ловека и других чувствительных млекопи-
тающих. Мутанты, лишенные полисаха-
ридной оболочки, не патогенны. Бактерии
дикого типа обозначают буквой S (от англ.
Предположим теперь, что с дезоксицити- smooth - гладкий), так как они образуют
дином этого динуклеотида связан дезокси- гладкие колонии, а мутантные бактерии, не
гуанилат. Соответствующий тринуклеотид имеющие капсулы,- буквой R (от англ.
можно представить следующим образом: rough - шероховатый), так как они обра-
зуют шероховатые колонии. У одной
группы R-мутантов отсутствует фермент
дегидрогеназа, превращающий UDP-глю-
козу в UDP-глюкуронат. Фермент необхо-
дим для синтеза капсульного полисахари-
да, который у этих пневмококков состоит
Сокращенное обозначение этого трину- из чередующейся последовательности
клеотида - pApCpG или ACG. остатков глюкозы и глюкуроната:

Глюкуронат Глюкоза Глюкуронат Глюкоза

Цепь ДНК характеризуется поляр- В 1928 г. Фред Гриффит (Fred Griffith)


ностью. Один конец цепи несет 5'-ОН- обнаружил, что непатогенный R-мутант
группу, а другой - 3'-ОН-группу, которая не можно трансформировать в патогенную
связана с другим нуклеотидом. Согласно S-форму следующим путем. Он инъециро-
принятым сокращениям, символ ACG оз- вал мышам смесь живых бактерий R-
начает, что свободная 5'-ОН-группа при- формы и убитых нагреванием пневмокок-
надлежит дезоксиаденозину, а свободная ков S. Поразительное открытие Гриффита
3'-ОН-группа - дезоксигуанозину. Итак, по- состояло в том, что эта смесь вызывала
следовательность оснований пишется в на- гибель мышей, хотя ни живые R-пневмо-
правлении 5'—>3'. Напомним, что амино- кокки, ни убитые нагреванием S-пневмо-
кислотная последовательность белка пи- кокки мышей не убивали. Кровь погибших
шется в направлении от N-концевой ами- мышей содержала живые S-пневмококки.
нокислоты к С-концевой аминокислоте. Следовательно, убитые нагреванием S-
Следует отметить, что ACG и GCA - раз- пневмококки каким-то образом трансфор-
ные соединения, точно так же, как Glu-Phe- мировали живые R-пневмококки в живые
Ala отличается от Ala-Phe-Glu. S-пневмококки. Это изменение было ста-
бильным: трансформированные пневмо-
кокки давали патогенное потомство
24.2. Трансформация пневмококков S-формы. Затем было установлено, что та-
с помощью ДНК показала, что гены кая трансформация R—>S может происхо-
состоят из ДНК дить in vitro. Некоторые клетки в растущей
Бактерии пневмококки сыграли важную культуре R-формы трансформировались
роль в открытии генетической функции в S-форму при добавлении бесклеточного
ДНК. экстракта убитых нагреванием пневмокок-
Пневмококки обычно окружены слизи- ков S. Это открытие заложило основу для
стой блестящей полисахаридной капсулой.
Этот наружный слой имеет существенное 24. ДНК: генетическая роль,
значение для проявления патогенности структура и репликация 7
чала результат был близок к расчетному
для ДНК; 2) оптические, электрофоретиче-
ские свойства, поведение при ультрацен-
трифугировании и диффузия очищенного
материала соответствовали свойствам
ДНК; 3) при экстрагировании белков или
липидов не происходило потери трансфор-
мирующей активности; 4) трипсин и химо-
трипсин не влияли на трансформирующую
активность; 5) рибонуклеаза (которая, как
известно, гидролизует рибонуклеиновую
кислоту) не влияла на трансформирующее
начало; 6) при добавлении дезоксирибону-
клеазы трансформирующая активность, на-
оборот, терялась.
Эта работа - памятная веха в истории
биохимии. До 1944 г. считалось, что гене-
тическую информацию несут хромосомные
белки, а ДНК играет вторичную роль. Та-
кая преобладающая точка зрения была ре-
шительно опровергнута открытием строго
доказанного факта, что очищенная ДНК
обладает генетической специфичностью.
В 1943 г. Эйвери (Avery) живым языком
описал это исследование и его последствия

Рис. 24.1. Схема структуры ДНК. Саха-


рофосфатный остов показан
черным цветом, а пуриновые
и пиримидиновые основания
разноцветные. (Kornberg A.,
The synthesis of DNA; Scientific
American, Inc., 1968.)

изучения химической природы трансфор-


мирующего начала.
Исследователи стали фракционировать
бесклеточный экстракт убитых нагрева-
нием пневмококков S и определять транс-
формирующую активность его компонен-
тов (рис. 24.3). В 1944 г. Освальд Эйвери,
Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти
(Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn
McCarty) опубликовали результаты своей
работы. Оказалось, что «нуклеиновая кис-
лота дезоксирибозного типа - основное дей-
ствующее начало трансформирующего эк-
стракта пневмококка типа III.» Экспери-
ментальные доказательства этого заключе-
ния состояли в следующем: 1) при эле-
ментном химическом анализе очищенного,
высокоактивного трансформирующего на-

Часть IV. Рис. 24.2. Строение одной цепи ДНК.


8 Информация Показана часть цепи.
зяином и, возможно, ферментативно про-
делывает небольшое отверстие в наружной
мембране (рис. 24.5). Затем нуклеиновая
кислота из головки вируса перетекает
внутрь клетки». Чтобы проверить это
предположение Альфред Херши и Марта
Чейз (Alfred Hershey, Martha Chase) поста-
вили следующий опыт. Фаговую ДНК по-
метили радиоактивным изотопом 32Р,
а белковую оболочку - изотопом 35S. Эти
метки весьма специфичны, так как ДНК не
содержит серы, а в белковой оболочке нет
фосфора. Культуру Е. coli заразили поме-
ченным фагом, который за непродолжи-
тельное время инкубации прикреплялся
к бактерии. Суспензию обрабатывали в те-
чение нескольких минут в гомогенизаторе
Уоринга при 10000 об/мин. В этих усло-
виях зараженные фагом клетки подверга-
лись воздействию значительных сил сдви-
га, которые разрушали связи между виру-
сами и бактериями. Затем суспензию цен-
трифугировали, чтобы осадить бактерии на
дно пробирки. Полученный осадок содер-
жал зараженные бактерии, а надосадочная
фракция - более мелкие частицы. Исследуя
содержание 32Р и 35S в осадке и надоса-
дочной фракции, определяли локализацию
фаговой ДНК и белка оболочки. В ре-
зультате были получены следующие
Рис. 24.3. Трансформация непатогенного данные.
пневмококка R (мелкие коло- 1. Большая часть фаговой ДНК обнару-
живалась в бактериях.
нии) и возникновение патоген-
2. Большая часть фагового белка обна-
ного пневмококка S (крупные
блестящие колонии) под дей- руживалась в надосадочной фракции.
ствием ДНК из убитых нагре- 3. Обработка в гомогенизаторе почти не
ванием пневмококков S. влияет на способность зараженных бакте-
[Avery О. Т., MacLeod С. М., рий продуцировать вирусное потомство.
McCarty M., J. Exp. Med., 79, Дополнительные эксперименты показа-
158 (1944).] ли, что менее 1% 35S было перенесено из
родительских фаговых частиц фаговому
потомству; 30% родительской 32Р-метки,
наоборот, обнаруживалось в потомстве.
в письме, направленном брату в другой Эти простые, убедительные эксперименты
университет (рис. 24.4). показали, что фаг Т2 можно физически
Новое подтверждение генетической ро- разделить на генетическую и негенетиче-
ли ДНК было получено при изучении од- скую части... Серусодержащий белок по-
ного вируса (бактериофага), заражающего коящихся фаговых частиц содержится
Е. coli. Бактериофаг Т2 состоит из сердце- только в защитной оболочке, которая
вины (ДНК), заключенной в белковую обо-
обеспечивает прикрепление фаговой ча-
лочку. В 1951 г. Роджер Херриот (Roger
стицы к бактериальной клетке и функцио-
Herriott) предположил, что «вирус, очевид- нирует в качестве приспособления для вве-
но, действует, как крошечный шприц для
дения фаговой ДНК в клетку. Этот белок,
подкожных инъекций, наполненный транс- возможно, не несет никакой функции, необ-
формирующим началом; вирус как тако-
вой никогда не проникает в клетку; только 24. ДНК: генетическая роль,
отросток вступает в контакт с клеткой-хо- структура и репликация 9
В течение последних двух лет, вначале с Мак-Леодом, а в настоящее время с д-ром Мак-Кар-
ти, я пытаюсь выяснить, какова химическая природа того вещества в бактериальных экстрак-
тах, которое вызывает это специфическое изменение. В неочищенном экстракте бактерий типа
III полно капсульных полисахаридов, углевода С (соматического), нуклеопротеинов, свободных ну-
клеиновых кислот дрожжевого и тимусного типа, липидов и других клеточных компонентов. По-
пробуй найти в таких сложных смесях активное начало! Попробуй выделить и химически иден-
тифицировать именно то вещество, которое само, придя в соприкосновение с R-клетками типа II,
заставляет их вырабатывать капсульный полисахарид типа III и приобрести все аристократиче-
ские особенности того самого типа клеток, из которых был приготовлен экстракт! Вот это ра-
бота, полная проблем и неожиданных затруднений. Но, ВОЗМОЖНО, мы наконец достигли
своего.
...Если окажется, что мы правы - а это, разумеется, очень весомое «если»,- тогда можно счи-
тать, что нам известна и химическая природа индуцирующего начала, и химическая структура
вещества, которое в результате образуется. Первое - это тимусная нуклеиновая кислота, вто-
рое - полисахарид типа III. Оба они впоследствии воспроизводятся в дочерних клетках, и через бес-
численное множество переносов без повторного добавления индуцирующего агента можно выде-
лить то же самое активное и специфичное трансформирующее начало в количестве, значительно
превышающем то, которое было использовано в самом начале для индуцирования реакции. Это
напоминает вирус. Возможно, это - ген. Но механизм явления меня сейчас не интересует. Всему
свое время, и первым шагом должно быть выяснение химической природы трансформирующего
начала. Остальные вопросы пусть решает кто-нибудь еще. Конечно, с каждым шагом работа
обрастает трудностями. Она затрагивает биохимию нуклеиновых кислот тимусного типа, ко-
торые, как известно, составляют основную часть хромосом, но которые до сих пор считали
сходными независимо от их происхождения. Она затрагивает генетику, энзимологию, клеточный
метаболизм и синтез углеводов. Но сегодня, только располагая множеством надежно обосно-
ванных данных, можно убедить кого бы то ни было в том, что натриевая соль дезоксирибозной
нуклеиновой кислоты, свободная от белка, могла бы обладать специфической биологической ак-
тивностью. Именно такие данные мы и пытаемся теперь получить. Тут хватает всяких весе-
леньких неожиданностей, чтобы пойти на дно, но разумнее справиться с ними самому, прежде
чем кто-нибудь другой попытается это сделать.

Рис. 24.4. Из письма Освальда Эйвери клетках с диплоидным набором хромосом.


брату Рою, написанного в мае Гаплоидные клетки имеют вполовину мень-
1943 г. (Из статьи Hotchkiss ше ДНК.
R. D. In: Phage and the Origin of
Molecular Biology, J. Cairns, 24.3. Гены некоторых вирусов состоят
S. Stent, eds., Cold Spring из РНК
Harbor Laboratory, 1966, pp. Гены всех прокариотических и эукариоти-
185-186.) ческих организмов построены из ДНК,
гены вирусов - из ДНК или из РНК. Вирус
табачной мозаики, заражающий листья

ходимой для роста фаговых частиц внутри


клетки. ДНК же выполняет какую-то функ-
цию в размножении фага. Представленные
эксперименты не позволяют сделать более
далеко идущие выводы относительно хи-
мической природы наблюдаемых явлений».
Осторожный тон этого вывода не дол-
жен умалять его значения. Вскоре генети-
ческая роль ДНК стала общепризнанной.
Эксперименты Херши и Чейз убедительно
подтвердили факты, открытые восемью го-
дами раньше Эйвери, Мак-Леодом и Мак-
Карти на другой системе. Дополнительные
доказательства были получены при иссле-
довании содержания ДНК в отдельных Рис. 24.5. Схема бактериофага Т2, вводя-
клетках. Они показали, что для данного щего свою ДНК в бактериаль-
вида содержание ДНК одинаково во всех ную клетку. (Wood W.B.,
Edgar R.S., Building a Bacterial
Часть IV. Virus, Scientific American. Inc.,
10 Информация 1967.)
растений табака,- один из наиболее изу- Межплоскостное расстояние 3,4 А
ченных РНК-содержащих вирусов. Он
образован одной молекулой РНК, окру-
женной белковой оболочкой из 2130 одина-
ковых субъединиц (обсуждение структуры
и сборки вирусов см. в гл. 30). Обработав
вирус фенолом, можно отделить белок от
РНК. Изолированная вирусная РНК инфек-
ционна, тогда как изолированный белок ли-
шен инфекционности. Использование син-
тетических гибридных вирусных частиц
еще раз показало, что генетическая специ-
фичность вируса заключается только в его
РНК. Существует множество штаммов ви-
руса табачной мозаики. Был получен син-
тетический гибридный вирус из РНК
штамма 1 и белка штамма 2. Другой такой
вирус был приготовлен из РНК штамма
2 и белка штамма 1. После заражения
клетки гибридным вирусом вирусное по- Рис. 24.6. Фотография дифракции рент-
томство всегда состояло из РНК и белка, геновских лучей на влажной ни-
соответствующих специфичности РНК ги- ти ДНК (В-форма). Крест в се-
бридного вируса, использованного для зара- редине картины характерен для
жения. спиральной структуры. Интен-
сивные меридианальные ре-
флексы возникают в результа-
24.4. Двойная спираль ДНК Уотсона-Крика те дифракции на стопке пар
В 1953 г. Джеймс Уотсон и Френсис Крик оснований, расположенных на
(James Watson, Francis Crick) установили расстоянии 3,4 А друг от друга.
трехмерную структуру ДНК и сразу же (Печатается с любезного разре-
предложили возможный механизм ее ре- шения д-ра Maurice Wilkins.)
пликации. Это блестящее достижение
стоит в ряду важнейших событий в исто-
рии биологии, так как оно открыло путь между соседними основаниями вдоль оси
к пониманию функции гена на молекуляр- спирали 3,4 А, они повернуты относитель-
ном уровне. Уотсон и Крик проанализиро- но друг друга на 36°. Таким образом, на
вали картины дифракции рентгеновских один виток спирали каждой из цепей при-
лучей на нити ДНК (рис. 24.6), полученные ходится 10 нуклеотидов, что соответствует
Розалиндой Франклин и Морисом Уилкин- 34 А.
сом (Rosalind Franklin, Maurice Wilkins), 4. Две цепи удерживаются вместе водо-
и предложили структурную модель, кото- родными связями между парами основа-
рая в основных своих чертах оказалась ний. Аденин всегда спаривается с тимином,
верной. Характерные особенности этой мо- гуанин - с цитозином (рис. 24.9 и 24.10).
дели сводятся к следующему. 5. На последовательность оснований
1. Две спиральные полинуклеотидные в полинуклеотидной цепи не накладывает-
цепи закручены вокруг общей оси. Цепи ся никаких ограничений. Определенная по-
направлены в противоположные стороны следовательность оснований несет кон-
(рис. 24.7). кретную генетическую информацию.
2. Пуриновые и пиримидиновые основа- Важнейшее свойство двойной спирали -
ния расположены внутри спирали, а остат- специфичность спаривания оснований. Ис-
ки фосфата и дезоксирибозы - снаружи ходя из стерических ограничений и способ-
(рис. 24.8). Плоскости оснований перпенди- ности к образованию водородных связей,
кулярны оси спирали. Плоскости остатков Уотсон и Крик постулировали, что аденин
сахара расположены почти под прямым
углом к основаниям. 24. ДНК: генетическая роль,
3. Диаметр спирали 20 А. Расстояние структура и репликация 11
Формы ДНК -
А-форма ДНК: двухспиральная ДНК, содержащая примерно 11 остатков на
один оборот спирали. В этой правозакрученной спирали плоскости пар осно-
ваний повернуты примерно на 20° относительно перпендикуляра к оси спира-
ли. Образуется при дегидратации В-формы ДНК.
В-форма ДНК: классическая уотсон-криковская двойная спираль, содержащая
примерно 10 остатков на один оборот спирали. В этой правозакрученной спи-
рали плоскости пар оснований перпендикулярны оси спирали.
Z-форма ДНК: левозакрученная двухспиральная форма ДНК, содержащая
около 12 остатков на один оборот. Эта структура предложена Александром
Ричем (Alexander Rich) и его сотрудниками на основе изучения кристалличе-
ской структуры d(CG)3.

должен спариваться с тимином, а гуа- лены периодическим строением спираль-


нин - с цитозином. Стерические ограниче- ной структуры сахарофосфатного остова
ния на расположение основания обуслов- обеих полинуклеотидных цепей. Глико-
зидные связи, которыми присоединяется
к остову пара оснований, отстоят друг от
друга на расстояние 10,85 А (рис. 24.11).
Пара пиримидин—пурин прекрасно
укладывается в это пространство. В то же
время для двух пуринов этого расстояния
недостаточно. Для двух пиримидинов мес-
та более чем достаточно, но они оказались
бы слишком далеко друг от друга, чтобы
образовать водородные связи. Следова-

Рис. 24.8. Схема одной из цепей двойной


спирали ДНК (вид по оси спи-
рали). Основания - в данном
Рис. 24.7. Схема модели двухспиральной случае только пиримидины -
ДНК. Вся структура повто- расположены внутри, а сахаро-
ряется через 34 А, что соответ- фосфатный остов - снаружи.
ствует 10 остаткам в каждой Отчетливо видно, что структу-
цепи. ра имеет ось симметрии деся-
того порядка. Основания обо-
Часть IV. значены зеленым цветом, саха-
12 Информация ра - красным.
Рис. 24.9. Модель пары оснований аде-
нин—тимин.

Рис. 24.10. Модель пары основании гуа-


нин—цитозин.

Рис. 24.11. Наложение АТ-пары основа-


ний (обозначена желтым цве-
том) на GС-пару (обозначена
синим цветом). Обратите вни-
мание, что положения глико-
зидных связей и С'-1 атома де-
зоксирибозы (обозначен зе-
леным) в двух типах пар 24. ДНК: генетическая роль,
оснований почти одинаковы. структура и репликация 13
Рис. 24.12. Модель двухспиральной моле- тате проведенных ранее исследований ну-
кулы ДНК. Показаны три пары клеотидного состава ДНК разных видов.
оснований. Обратите внима- В 1950 гг. Эрвин Чаргафф (Erwin Chargaff)
ние, что две цепи ориентиро- обнаружил, что соотношение аденина с ти-
ваны в противоположном на- мином и гуанина с цитозином у всех иссле-
правлении. дованных видов было близко к 1. Значение
этого факта оставалось неясным, пока не
тельно, одно из оснований в паре в двой- была предложена модель Уотсона-Крика
ной спирали ДНК всегда должно быть пу- (рис. 24.12 и 24.13). Только тогда стало по-
рином, а другое - пиримидином. Кроме нятным, что эта закономерность отражает
того, на спаривание оснований наклады- важнейшее свойство структуры и функции
вают ограничения правила образования ДНК - специфичность спаривания основа-
водородных связей. Атомы водорода в пу- ний.
риновых и пиримидиновых основаниях за- 24.5. Комплементарные цепи служат
нимают вполне определенные положения. матрицами друг для д р у г а
Аденин не может спариваться с цитозином, при репликации ДНК
так как тогда на месте одной связи оказа- Модель двухспиральной молекулы ДНК
лось бы два атома водорода, а на месте позволила сразу же предложить механизм
другой - ни одного. Точно так же гуанин не репликации ДНК. Уотсон и Крик опубли-
может связываться с тимином. Аденин, на- ковали свою гипотезу через месяц после
оборот, образует с тимином две водо- того, как представили модель структуры
родные связи, а гуанин - три водородные ДНК в виде прекрасной статьи, отличав-
связи с цитозином (рис. 24.9 и 24.10). шейся простотой и ясностью.
Ориентация этих водородных связей и рас- «Если задан определенный порядок ос-
стояние между ними оптимальны для нований в одной из цепей, можно напи-
сильного взаимодействия между основа- сать точную последовательность основа-
ниями. ний в другой цепи, поскольку спаривание
Эта схема спаривания оснований получи- специфично. Таким образом, каждая из
ла убедительное подтверждение в резуль- цепей комплементарна другой цепи,
и именно это свойство подсказывает, ка-
Часть IV. ким образом может удваиваться молеку-
14 Информация ла дезоксирибонуклеиновой кислоты.
Прежние дискуссии о самоудвоении
всегда опирались на представление о не-
кой матрице или каком-то шаблоне.
Предполагалось, что матрица копирует
непосредственно самое себя, или должна
образовывать «негатив», который в свою
очередь действует в качестве матрицы
и образует исходный «позитив». Ни
в одном случае не было предложено де-
тального объяснения, как это могло бы
происходить на уровне атомов и моле-
кул.
В нашей модели дезоксирибонуклеино-
вой кислоты имеется, по существу, пара
матриц, причем каждая из них компле-
ментарна другой. Мы полагаем, что
перед удвоением водородные связи раз-
рываются и две цепи раскручиваются
и расходятся. Затем каждая цепь исполь-
зуется в качестве матрицы для образова-
ния на ней новой комплементарной цепи,
так что в конце концов у нас будет две
пары цепей, тогда как раньше была
только одна. Более того, при таком спо-
собе репликация последовательность пар
оснований будет в точности удвоена».

24.6. Репликация ДНК полуконсервативна Рис. 24.13. Пространственная модель


Уотсон и Крик предположили, что одна из двойной спирали ДНК. Отчет-
цепей каждой дочерней молекулы ДНК ливо видны большая бороздка
синтезируется заново, а другая происходит (показана красным цветом)
от родительской молекулы ДНК. Такое и малая бороздка (показана си-
распределение атомов родительской моле- ним цветом). Обратите внима-
кулы называют полуконсервативным. ние, что часть каждого основа-
Метью Меселсон и Франклин Сталь ния доступна для взаимодей-
(Matthew Meselson, Franklin Stahl) постави- ствия с другими молекулами.
ли принципиально важный эксперимент (Печатается с любезного разре-
для проверки этой гипотезы. Родитель- шения д-ра Sung-Hou Kim.)
скую ДНК пометили тяжелым изотопом
15
азота N, чтобы сделать ее более тяже-
лой, чем обычная ДНК. Для этого выра- ностью, близкой к плотности ДНК
щивали Е. coli в течение многих поколений ( ~ 1 , 7 г/см3). Этот раствор центрифуги-
в среде, содержавшей в качестве единствен- руют почти до равновесного состояния.
ного источника азота 15NH4Cl. Затем бак- Под действием противодействующих про-
терии быстро переносили в среду, содер- цессов седиментации и диффузии в центри-
жавшую 14 N-стабильный изотоп азота. фужной ячейке возникает градиент концен-
Этот эксперимент должен был показать, трации хлористого цезия. В результате
как распределяются изотопы 14N и I 5 N создается устойчивый градиент плотности
в молекулах ДНК в ходе последующих от 1,66 до 1,76 г/см3. Под действием цен-
циклов репликации. тробежной силы молекулы ДНК переходят
Распределение 14N и 15 N в потомстве в ту область градиента, в которой плот-
изучали с помощью только что разрабо- ность раствора равна их собственной пла-
танного метода равновесной седиментации вучей плотности. Высокомолекулярная
в градиенте плотности. Небольшое коли-
чество ДНК растворяют в концентриро- 24. ДНК: генетическая роль,
ванном растворе хлористого цезия с плот- структура и репликация 15
Рис. 24.14. Разделение 14N- и 15N-ДНК тов вывод, «что азот молекул ДНК рас-
при центрифугировании в гра- пределяется поровну между двумя физиче-
диенте плотности. А - фото- ски раздельными структурами, что после
графия центрифужной ячейки удвоения каждая дочерняя молекула полу-
в ультрафиолетовом свете; чает одну из этих структур и что эти
Б - денситометрическая кривая структуры сохраняются интактными
поглощения, полученная при в течение многих удвоений». Полученные
сканировании фотографии, результаты прекрасно согласовывались
приведенной на рис. А. с моделью репликации ДНК Уотсона—
[Meselson M., Stahl F. W., Proc. Крика (рис. 24.16).
Nat. Acad. Sci., 44, 671 (1958).]
24.7. Некоторые вирусы содержат
на определенных стадиях жизненного цикла
ДНК образует четко выраженную полосу, одноцепочечную ДНК
обнаруживаемую по поглощению ультра- ДНК не всегда двухцепочечная молекула.
фиолетового света. Молекулы 14N-ДНК и Роберт Синсхеймер (Robert Sinsheimer) об-
15
N-ДНК хорошо разделяются в таком наружил, что ДНК фага φ Х 1 7 4 , небольшо-
градиенте, поскольку их плотность разли- го вируса, заражающего Е. coli,- одноцепо-
чается примерно на 1% (рис. 24.14). чечная молекула. Несколько эксперимен-
ДНК выделяли из бактерий через раз- тальных фактов привели его к этому
личные промежутки времени после перено- неожиданному выводу. Во-первых, соотно-
са со среды, содержащей 15N, на 14N. Ана- шение оснований в ДНК фага φХ174 не
лиз этих образцов центрифугированием удовлетворяет правилу [А] = [Т] и [G] =
в градиенте плотности показал, что после = [С]. Во-вторых, вязкость раствора ДНК
одного цикла репликации ДНК дает одну фага φХ174 значительно меньше вязкости
полосу (рис. 24.15). Плотность этой полосы раствора ДНК Е. coli той же концентра-
была равна в точности среднеарифметиче- ции. Гидродинамические свойства ДНК
скому значению между плотностью 14N- и фага φХ174 соответствуют полимеру
15
N-ДНК. Отсутствие 15N-ДНК свиде- в конформации случайного клубка. В отли-
тельствовало о том, что целостность ро- чие от этого ДНК в форме двойной спира-
дительской ДНК в ходе репликации нару- ли ведет себя гидродинамически как очень
шается. Отсутствие 14N-ДНК показывало, жесткая палочка. В-третьих, аминогруппы
что часть атомов всех дочерних молекул оснований ДНК фага φХ174 легко реаги-
ДНК происходила от родительской ДНК. руют с формальдегидом, тогда как основа-
Соотношение 14N и 15 N в дочерних моле- ния в двойной спирали ДНК почти недо-
кулах должно составлять 1:1, так как плот- ступны для этого реактива.
ность гибридных молекул ДНК была сред- Обнаружение этой одноцепочечной ДНК
ней между 14N- и 15N-ДНК. породило сомнения в универсальности
После двух циклов репликации ДНК схемы полуконсервативной репликации,
распределялась поровну в двух полосах. предложенной Уотсоном и Криком. Одна-
Одна из них - гибридная ДНК, ко вскоре было показано, что ДНК фага
другая - 14N-ДНК. Меселсон и Сталь φХ174 находится в одноцепочечном со-
сделали из этих убедительных эксперимен- стоянии только на протяжении части жиз-
ненного цикла вируса. Синсхеймер обнару-
Часть IV. жил, что зараженные клетки Е. coli содер-
16 Информация жат двухцепочечную форму ДНК фага
Рис. 24.15. Доказательство полуконсерва-
тивной репликации в клетках Е.
coli с помощью центрифугиро-
вания в градиенте плотности.
Положение полосы ДНК зави-
сит от содержания 14N и 15N.
После 1,0 генерации все моле-
кулы ДНК представляют со-
бой гибриды, содержащие рав-
ное количество 14N и l 5 N.
Родительская ДНК ( 1 5 N) после
1,0 генерации не обнаруживает- Рис. 24.16. Схема полуконсервативной ре-
ся. [Meselson M., Stahl F.W., пликации. Родительская ДНК
Proc. Nat. Acad. Sci., 44, 671 изображена зеленым, а ново-
синтезированная - красным.
(1958).]
[Meselson M., Stahl F.W., Proc.
Nat. Acad. Sci, 44, 671 (1958).]

φ Х 1 7 4 . Эта двухцепочечная ДНК назы-


вается репликативной формой, так как она
служит матрицей для синтеза ДНК вирус-
ного потомства. Вирусы, содержащие 24. ДНК: генетическая роль,
одноцепочечную РНК, также реплици- структура и репликация 17
ческих структур, а диаметр 20 А находится
на уровне атомных размеров. Бруно Зимм
(Bruno Zimm) показал, что самая большая
хромосома у Drosophila melanogaster содер-
жит единую молекулу ДНК, состоящую из
6,2•107 пар оснований. Контурная длина
этой молекулы 2,1 см. Столь асимме-
тричные молекулы ДНК весьма чувстви-
тельны к разрыву под действием сил сдви-
га. Они легко разрываются на фрагменты,
масса которых в 1000 раз меньше, чем мас-
са исходной молекулы, если при манипуля-
циях с ней не принимаются особые меры
предосторожности.
Изображения молекул ДНК многих бак-
терий и вирусов были непосредственно по-
лучены с помощью электронного микро-
скопа (рис. 24.18). Размеры некоторых та-
ких молекул ДНК приведены в табл. 24.1
Следует отметить, что даже самые ма-
ленькие молекулы ДНК имеют весьма вы-
тянутую форму. Например, ДНК вируса
Рис. 24.17. Электронная микрофотогра- полиомы содержит 5100 пар оснований
фия частиц вируса φХ174. (Пе- и имеет контурную длину 1,7 мкм (17000
чатается с любезного разреше- А). Напомним, что диаметр молекулы ге-
ния д-ра Robley Williams.) моглобина составляет 65 А, а длина колла-
гена, одного из самых длинных бел-
ков,- 3000 А. Это сравнение подчеркивает
огромную длину и выраженную асимме-
руются через промежуточную двухцепочеч- трию молекул ДНК.
ную репликативную форму. Механизмы
этих процессов подробнее рассматривают-
ся в гл. 30. Здесь же важно лишь подчерк-
нуть, что эти исследования подтвердили
всеобщность схемы репликации Уотсона—
Крика. Двухцепочечная ДНК (или
РНК) - репликативная форма всех из-
вестных генов.
24.8. Молекулы ДНК очень длинные
Прежде чем перейти к механизму реплика-
ции ДНК, представляющему собой
сложный ферментативный процесс, рассмо-
трим некоторые свойства ДНК. Порази-
тельная особенность молекул ДНК, встре-
чающихся в природе,- их необычайная дли-
на. Хромосома Е. coli представляет собой
единую молекулу двухспиральной ДНК, со-
держащей 4 млн. пар оснований. Масса
этой молекулы ДНК 2,6•106 кДа. Она
имеет крайне асимметричную форму: ее
контурная длина 14•106 А, а диаметр 20 А.
Контурная длина (1,4 мм) этой молекулы Рис. 24.18. Электронная микрофотогра-
ДНК соответствует размерам макроскопи- фия молекулы ДНК бактерио-
фага λ (форма RFII). (Печатает-
Часть IV. ся с любезного разрешения
18 Информация д-ра Thomas Broker.)
Для измерения длин молекул нуклеиновых кислот применяется единица
длины, равная 1000 пар нуклеотидов в случае двухцепочечных молекул ну-
клеиновых кислот (т.п.н., или kb - от англ. kilobase) или 1000 нуклеотидов
в случае одноцепочечных молекул (т.н., или kb). 1 kb двухцепочечной ДНК
имеет контурную длину 0,34 мкм и массу примерно 660 кДа.

24.9. Двойная спираль может быть обратимо


расплавлена
Две цепи ДНК-спирали могут легко ра-
зойтись, если разрушить водородные свя-
зи, соединяющие спаренные основания.
Этого можно достичь, либо нагревая рас-
твор ДНК, либо добавляя в раствор кисло-
ту или щелочь для ионизации оснований.
Раскручивание двойной спирали называет-
ся плавлением, так как происходит мгно-
венно при строго определенной температу-
ре. Температура плавления (Тпл) - это та
температура, при которой разрушается по-
ловина спиральной структуры. Резкость
этого перехода показывает, что двойная
спираль ДНК - структура высококоопера-
тивная. Плавление ДНК легко регистриро-
вать, измеряя ее поглощение при 260 нм.
Нарушение межплоскостных взаимодей-
ствий пар оснований приводит к увеличе- Рис. 24.19. При плавлении двойной спира-
нию поглощения - эффект, называемый ги- ли, когда она переходит в одно-
перхромизмом (рис. 24.19). цепочечную форму, поглоще-
Температура плавления молекулы ДНК ние раствора ДНК при 260 нм
существенно зависит от ее нуклеотидного возрастает.
состава. Молекулы ДНК, богатые GС-па-
рами оснований, имеют более высокие зна-
чения Тпл, чем молекулы, богатые АТ-па-
рами оснований (рис. 24.20). В общем Тпл
Таблица 24.1. Размеры некоторых молекул ДНК
(Kornberg A., DNA replication, W. H. Freeman and Co.,
1980, p. 20)

Организм Число пар Контурная


оснований, длина, мкм
kb

Вирусы
Полиома или SV-40 5,1 1,7 Рис. 24.20. Кривые плавления различных
Фаг λ 48,6 17 ДНК. На графике отложено от-
Фаг Т2 166 56 носительное поглощение при
Вирус коровьей оспы 190 65 260 нм в зависимости от темпе-
Бактерии ратуры (поглощение при 25°С
Микоплазма 760 260 принято за 1). Тпл равна 69°С
E.coli 4000 1 360 для ДНК Е. coli (50% GС-пар)
Эукариоты
и 76°С для ДНК. P. aeruginosa
(68% GС-пар).
Дрожжи 13500 4600
Дрозофила 165000 56000
Человек 2900000 990000 24. ДНК: генетическая роль,
структура и репликация 19
24.10. Некоторые молекулы ДНК имеют
кольцевую форму
Методом электронной микроскопии было
показано, что интактные молекулы ДНК
из многих источников замкнуты в кольцо
(рис. 24.18). Открытие того факта, что Е.
coli имеет кольцевую хромосому, не было
неожиданностью. Оно было предсказано
на основе генетических исследований, пока-
завших, что карта генетического сцепления
этой бактерии является кольцевой. Термин
«кольцевая» означает лишь, что цепь ДНК
непрерывна, и отнюдь не относится к ее
геометрической форме. In vivo молекулы
ДНК всегда имеют весьма компактную
Рис. 24.21. Электронная микрофотогра- форму. В связи с этим следует отметить,
фия молекулы ДНК, частично что хромосома Е. coli примерно в 1000 раз
расплетенной под действи- длиннее, чем клетка бактерии.
ем щелочи. Одноцепочечные Не все молекулы ДНК имеют кольце-
участки имеют вид петель, ко- вую форму. Например, ДНК бактериофага
торые окрашены менее интен- Т7 является линейной. Молекулы ДНК не-
сивно, чем двухцепочечные которых вирусов, таких, как бактериофаг λ,
участки. Эти расплетенные претерпевают взаимопревращения линейной
участки ДНК богаты АТ-пара- и кольцевой форм. В вирусной частице при-
ми оснований. Один из них по- сутствует линейная форма, а в клетке-хо-
мечен стрелкой. [Inman R. В., зяине - кольцевая (разд. 30.16).
Schnos M., J. Mol. Biol., 49, 93
(1970).] 24.11. Кольцевые двухспиральные
молекулы ДНК могут находиться
в суперспирализованном
состоянии
ДНК многих видов повышается линейно При превращении линейной двухцепочеч-
от 77 до 100°С с увеличением содержания ной ДНК в замкнутую кольцевую молеку-
GС-пар от 20 до 78%. GC-пары стабильнее лу она приобретает новое свойство. Дже-
АТ-пар, так как в них основания удержи- ром Виноград (Jerome Vinograd) установил,
ваются вместе тремя водородными связя- что ось двойной спирали ДНК может сама
ми, а не двумя. Следовательно, АТ-богатые быть закручена в суперспираль. Эта супер-
области ДНК должны плавиться первыми спираль может быть закручена в правую
(рис. 24.21). Как мы увидим ниже, in vivo или в левую сторону (рис. 24.22). Термины
двойная спираль расплетается под дей- «суперспирализованная», «сверхскручен-
ствием специальных белков. Некоторые из
них вызывают раскручивание ДНК, гидро-
лизуя АТР (разд. 24.21).
Разделенные комплементарные цепи
ДНК спонтанно реассоциируют с образо-
ванием двойной спирали, если температура
становится ниже Тпл. Этот процесс ренату-
рации иногда называют отжигом. Ско-
рость реассоциации зависит от концентра-
ции комплементарных последовательно-
стей (разд. 29.10). Легкость, с которой
плавятся и реассоциируют двойные спира-
ли, имеет критическое значение для выпол-
нения ДНК ее биологических функций.
Рис. 24.22. Схематическое изображение
Часть IV. релаксированной (А) и супер-
20 Информация спирализованной (Б) ДНК.
ная», «суперспиральная», «суперскручен-
ная» и «сверхспиральная» - синонимы.
Кольцевую ДНК, совершенно лишенную
суперспиральных витков, называют релак-
сированной. Для того чтобы превратить ре-
лаксированную ДНК в суперспирализован-
ную, необходимо затратить определенную
энергию. Например, энергия, затрачивае-
мая на образование 15 суперспиральных
витков в одной молекуле ДНК вируса
SV-40 (ее контурная длина 1,7 мкм), соста-
вляет около 100 ккал/моль. Энергия напря-
жения суперспирализованной ДНК (энер-
гия суперспирализации) примерно пропор-
циональна квадрату числа суперспи-
ральных витков.
Суперспирализация, по-видимому, вы-
полняет две биологические функции. Во-
первых, суперспирализованная ДНК имеет
более компактную форму, чем релаксиро-
ванная ДНК такой же длины (рис. 24.23).
Суперспирализация может играть опреде-
ленную роль в упаковке ДНК. Во-вторых,
Суперспирализация может влиять на сте-
пень расплетания двойной спирали и, сле-
довательно, на ее взаимодействия с други-
ми молекулами. Точнее, отрицательная Рис. 24.23. Электронные микрофотогра-
суперспирализация может приводить к рас- фии митохондриальной ДНК:
кручиванию двойной спирали. Интересно от- А - релаксированная кольцевая
метить, что почти все кольцевые молекулы форма; Б - суперспирализован-
ДНК, встречающиеся в природе, отрица- ная кольцевая форма. (Печа-
тельно суперспирализованы. тается с любезного разрешения
Важная характеристика замкнутой коль- д-ра David Clayton.)
цевой ДНК - ее порядок зацепления L (от
англ. linking). Число L указывает, сколько
раз одна цепь пересекает другую цепь, если
их спроецировать на плоскость. Число
L должно быть целым. Кручение Т (от 24.12. Открытие ДНК-полимеразы
англ. twisting) и величина суперспирализа- Перейдем теперь к молекулярному меха-
ции W (от англ. writhe) связаны между со- низму репликации ДНК. Артур Корнберг
бой уравнением (Arthur Kornberg) и его коллеги в 1955 г.
начали поиск фермента, синтезирующего
L = W + Т, ДНК. Вскоре этот поиск увенчался успе-
хом, главным образом потому, что при
т.е. находятся в обратной зависимости. планировании экспериментов были при-
Порядок зацепления - топологическая ха- няты три правильных решения, т.е. был
рактеристика; она может изменяться, лишь сделан правильный выбор между несколь-
когда в одну или в обе цепи кольцевой кими возможностями.
ДНК вносятся разрывы. Действительно, 1. Что представляют собой активиро-
были выделены ферменты, которые ката- ванные предшественники ДНК? Корнберг
литически изменяют величину L. Катали- и его коллеги сделали правильное предпо-
тическую активность таких топоизомераз ложение, что активированные промежу-
легко выявить с помощью гель-электрофо- точные продукты синтеза ДНК - дезоксири-
реза, так как суперспирализованная ДНК бонуклеозид-5'-трифосфаты. В основе это-
более компактна и поэтому имеет боль-
шую подвижность, чем релаксированная 24. ДНК: генетическая роль,
ДНК (рис. 24.24). структура и репликация 21
тивности в осадке, полученном после обра-
ботки инкубационной смеси кислотой. В ос-
нове этого метода лежит тот факт, что
ДНК осаждается кислотами, например
трихлоруксусной кислотой, а нуклеотиды-
предшественники остаются в растворе.
3. Какие клетки следует выбрать для ис-
следования? После того как первона-
чальные эксперименты с экстрактами жи-
вотных клеток дали отрицательные резуль-
таты, выбор пал на бактерии Е. coli,
поскольку деление этих клеток происходит
всего лишь за 20 мин (время генерации), и,
следовательно, их можно выращивать
в больших количествах. Как и предполага-
лось, эта бактерия исключительно богата
ферментами, участвующими в синтезе
ДНК.
Экстракт Е. coli инкубировали с радиоак-
Рис. 24.24. Фотографии гелей, на которых тивным дезокситимидин-5'-трифосфатом.
видна релаксация суперспира- Радиоактивность этого 14
С-меченного
лизованной ДНК вируса SV-40. предшественника составляла 1•106 имп./
Дорожка А - суперспирализо- мин. Радиоактивность осадка, полученного
ванная ДНК с большим чис- добавлением к инкубационной смеси кис-
лом отрицательных витков. лоты, составляла всего 50 имп./мин. Было
При инкубации ДНК с топои- синтезировано лишь несколько пикомолей
зомеразой в течение 5 мин (Б) ДНК, но этим было положено начало.
и 30 мин (В) образуется ряд по- Корнберг писал: «Хотя количество нуклео-
лос с более низкой степенью су- тида, включившегося в состав нуклеиновой
перспирализации. [Keller W., кислоты, было ничтожным, оно было су-
Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2553 щественно выше уровня фона. Мы попро-
(1975).] бовали забить клин в эту узенькую щелку.

го предположения лежали два соображе-


ния. Во-первых, пути биосинтеза пуринов
и пиримидинов приводят к образованию
нуклеозид-5'-фосфатов (а не нуклеозид-3'-
фосфатов). Во-вторых, активированным
промежуточным продуктом синтеза пиро-
фосфатной связи в таких коферментах, как
NAD + , FAD и СоА, является АТР.
2. Что может служить критерием синте-
за Д Н К ? Предполагалось, что абсолютное
количество ДНК, синтезированной в пер-
воначальных экспериментах, должно быть
весьма невелико, главным образом из-за
обилия нуклеаз. Поэтому нужен был ка-
кой-то чувствительный тест. Был разрабо-
тан такой тест с использованием радиоак- Рис. 24.25. Электронная микрофотогра-
тивных нуклеотидов-предшественников. фия молекул ДНК-полиме-
Включение этих предшественников в ДНК разы (сферические структуры),
обнаруживали путем измерения радиоак- связанных с молекулой ДНК
(тонкая нить). (Печатается
Часть IV. с любезного разрешения д-ра
22 Информация Jack Griffith.)
Рис. 24.26. Реакция элонгации цепи, ката- зоксирибонуклеотиды к 3'-гидроксильному
лизируемая ДНК-полимера- концу предсуществующей цепи ДНК (или
зой. РНК). Другими словами, необходима за-
травочная цепь, или затравка, со свобод-
Молотком нам служила очистка фермен- ной 3'-гидроксильной группой.
та - метод, отработанный при изучении 3. Необходима матричная ДНК. Матри-
спиртового брожения». цей может служить как одно- так и двухце-
Этот новый фермент был назван ДНК- почечная ДНК. Двухцепочечная ДНК слу-
полимеразой (рис. 24.25). Теперь его назы- жит эффективной матрицей лишь в том
вают ДНК-полимеразои I, так как с тех случае, если ее сахарофосфатный остов
пор были выделены другие ДНК-полиме- разорван в одном или нескольких местах.
разы. После десяти лет напряженной ра- Реакция элонгации (удлинения) цепи, ка-
боты в лаборатории Корнберга ДНК-по- тализируемая ДНК-полимеразой, происхо-
лимераза I была очищена до гомогенного дит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-кон-
состояния и детально охарактеризована. цом матрицы ближайшего к рибозе атома
Насколько велики были масштабы проде- фосфора очередного дезоксирибонуклеозид-
ланной работы, говорит тот факт, что для трифосфата. В результате образуется фос-
получения 500 мг чистого фермента необ- фодиэфирный мостик и одновременно выс-
ходимо было взять 100 кг клеток E.coli. вобождается пирофосфат (рис. 24.26). По-
ДНК-полимераза I - это единая полипеп- следующий гидролиз пирофосфата обеспе-
тидная цепь с массой 109 кДа. Она катали- чивает дальнейшую полимеризацию. Такое
зирует последовательное присоединение де- смещение общего состояния равновесия
зоксирибонуклеиновых звеньев к цепи ДНК: было бы невозможно, если бы активиро-
ванными промежуточными продуктами
(ДНК)n остатков
+ служили нуклеозиддифосфаты. Именно
+ dNTP (ДНК)n+1 + РРi в этом мы усматриваем убедительную
причину преобладания нуклеозидтрифос-
Для синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе фатов по сравнению с дифосфатами в каче-
I необходимы следующие компоненты: стве активированных предшественников
1. В среде должны присутствовать все в биосинтетических реакциях. Элонгация
четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфа- цепи ДНК происходит в направлении 5'—>
та: dATP, dGTP, dTTP и dCTP. В дальней- —>3' (рис. 24.27). За секунду одна молекула
шем мы будем обозначать эти дезоксири- ДНК-полимеразы I присоединяет пример-
бонуклеозидтрифосфаты общим символом но 10 нуклеотидов. Полимеризация процес-
dNTP. Кроме того, необходимы ионы
Мg2+. 24. ДНК: генетическая роль,
2. ДНК-полимераза I присоединяет де- структура и репликация 23
Рис. 24.27. ДНК-полимеразы катализи- и С), поскольку он образует подходящую
руют рост цепей ДНК в напра- пару оснований с цитозином.
влении 5'—>3'. 3. Нуклеотидный состав новосинтезиро-
ванной ДНК зависит от характера ма-
трицы, а не от относительного количества
сивна, т. е. фермент присоединяет много ну- четырех нуклеотидов-предшественников.
клеотидов, оставаясь связанным с одной Образующаяся ДНК имеет тот же нуклео-
матрицей. тидный состав, что и двухспиральная ма-
тричная ДНК. Из этого следует, что под
24.13. ДНК-полимераза получает действием ДНК-полимеразы реплицируют-
инструкции от матрицы ся обе цепи матричной ДНК.
ДНК-лолимераза катализирует образова- 4. Наиболее убедительным доводом слу-
ние фосфодиэфирной связи только в том жат данные о том, что ДНК фага φХ174,
случае, если основание очередного нуклео- реплицированная in vitro ДНК-полимера-
тида комплементарно соответствующему зой I, полностью инфекционна. Следова-
основанию матричной цепи. Если же осно- тельно, частота, с которой этот фермент
вание очередного нуклеотида не образует делает ошибки, очень низка.
уотсон-криковской пары с соответствую-
щим основанием матричной цепи, вероят- 24.14. ДНК-полимераза I исправляет
ность образования ковалентной связи ошибки в ДНК
очень низка. Следовательно, ДНК-полиме- ДНК-полимераза обладает еще одним ви-
раза - фермент, направляемый матрицей. дом ферментативной активности: в опреде-
Она была открыта первой из ферментов ленных условиях она способна расщеплять
такого типа. цепи ДНК. ДНК-полимераза постепенно
Ряд экспериментов доказывает, что ДНК- гидролизует цепь ДНК с 3'-гидроксильно-
полимераза получает инструкции от ма- го конца. При этом отщепляются монону-
трицы. клеотиды. Таким образом, ДНК-полимера-
1. Первым доводом в пользу этого утвер- за I является также 3'—>5'-экзонуклеазой
ждения послужил тот факт, что значи- (рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должен
тельный синтез ДНК идет только в при- иметь свободный 3'-ОН-конец и не должен
сутствии всех четырех дезоксирибонуклео- находиться в составе двойной спирали.
зидтрифосфатов и матричной Д Н К , Является ли такая экзонуклеазная актив-
2. ДНК-полимераза может включать ность фермента нежелательным побочным
в ДНК некоторые аналоги оснований. На- эффектом, или она каким-то образом уча-
пример, урацил или 5-бромурацил может ствует в биологическом действии ДНК-по-
замещать тимин. Гипоксантин может заме- лимеразы? Эксперименты с использова-
щать гуанин. Способность аналогов заме- нием химически синтезированных полину-
щать основания высоко специфична. Со- клеотидов с некомплементарным остатком
гласно правилу замещения, тот или иной на конце затравки показали, что 3'—>
аналог может включаться лишь при усло- —>5'-экзонуклеазная активность выпол-
вии, что он способен образовать уотсон- няет в процессе полимеризации функцию ре-
криковскую пару с основанием, комплемен- дактирования. Рассмотрим полимер, пока-
тарным замещаемому основанию. Так, ги- занный на рис. 24.28, в котором последова-
поксантин может замещать G (но не А, Т тельность остатков dT образует двойную
спираль с более длинным полимером dA.
Часть IV. На 3'-конце этой poly(dT)-последователь-
24 Информация ности имеется один остаток dC, который
не образует водородных связей, так как он
не комплементарен dA. При добавлении
ДНК-полимеразы и dTTP этот некомпле-
ментарный остаток dC отщепляется рань-
ше, чем начинается присоединение остат-
ков dT. Эксперименты с использованием
множества различных синтетических поли-
меров показали, что ДНК-полимераза
I всегда удаляет некомплементарные
остатки на конце затравки, прежде чем
продолжать полимеризацию. Если на конце
находится комплементарное основание и
в среде присутствуют активированные
предшественники, гидролиза практически
не происходит. Полимеризация предотвра-
щает гидролиз с 3'-конца.
По всей вероятности, репликация ДНК
идет с высокой точностью, так как спарива-
ние оснований проверяется дважды. В тех
случаях, когда пара оснований не вмещает-
ся в двойной спирали, полимеризация обы- Рис. 24.28. 3'—>5'-экзонуклеазная актив-
чно не идет. Однако, если на этом этапе ность ДНК-полимеразы I.
все-таки произойдет ошибка, она может
быть исправлена раньше, чем будет при-
соединен следующий нуклеотид. Таким
образом, ДНК-полимераза I проверяет ре-
зультат каждого проведенного акта поли-
меризации, прежде чем перейти к следую-
щему.
Кроме того, ДНК-полимераза I может
гидролизовать ДНК, начиная с 5'-конца це-
пи. Эта 5'—>3'-нуклеазная активность
(рис. 24.29) существенно отличается от об-
суждавшейся выше 3'—>5'-экзонуклеазной
активности. Во-первых, расщепляемая
связь должна находиться в двухспираль-
ном участке. Во-вторых, может происхо-
дить расщепление как концевой фосфодиэ-
фирной связи, так и связи, расположенной
на расстоянии нескольких нуклеотидов от
5'-конца (который может иметь свободную
или фосфорилированную гидроксильную
группу). В-третьих, 5'—>3'-нуклеазная ак-
тивность увеличивается, если одновремен-
но идет синтез ДНК. В-четвертых, ак- Рис. 24.29. 5'—>3'-нуклеазная активность
тивный участок 5'—>3'-нуклеазной актив- ДНК-полимеразы I.
ности четко отделен от активных участков
полимеризации и 3'—>5'-гидролиза. ДНК-
полимеразу I можно расщепить протеоли-
тическими ферментами на фрагмент с мас- различных фермента в одной полипептид-
сой 36 кДа, содержащий всю 5'—> ной цепи. 5'—>3'-нуклеаза дополняет 3'—>
—>3'-нуклеазную активность, и фрагмент —>5'-экзонуклеазную активность, исправляя
с массой 75 кДа, содержащий всю полиме- ошибки другого рода. Например, 5'—>
разную и всю 3'—>5'-экзонуклеазную ак- —>3'-нуклеаза участвует в вырезании пири-
тивности. Таким образом, ДНК-полимера-
24. ДНК: генетическая роль,
за I содержит по меньшей мере два
структура и репликация 25
Рис. 24.30. ДНК-лигаза катализирует со- фосфатной группы на 5'-конце другой. Об-
единение двух цепей ДНК, вхо- разование фосфодиэфирной связи между
дящих в состав одной двухспи- этими группами - эндергоническая реакция.
ральной молекулы. Следовательно, для реакции соединения це-
пей требуется источник энергии. У Е. coli
и других бактерий эту роль выполняет
N A D + , тогда как в клетках животных и за-
раженных бактериофагом клетках данная
реакция осуществляется за счет энергии
АТР.
Заслуживает внимания и еще один ас-
пект работы ДНК-лигазы: ДНК-лигаза не
может соединить две молекулы одноцепо-
чечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые
ДНК-лигазой, должны быть частью двух-
цепочечной молекулы ДНК. Исследования
модельных систем дают основание думать,
что ДНК-лигаза образует фосфодиэфир-
Рис. 24.31. Ковалентный промежуточный ную связь только в том случае, если вбли-
комплекс фермент—AMP. зи от места разрыва имеется хотя бы не-
сколько пар оснований. В действительно-
сти ДНК-лигаза заделывает одноцепо-
мидиновых димеров, образующихся при чечные разрывы в остове двухспиральной
облучении ДНК ультрафиолетом (разд. ДНК. Этот процесс необходим для нор-
24.24). Более того, 5'—>3'-нуклеазная ак- мального синтеза ДНК, для репарации по-
тивность играет ключевую роль в самой врежденной ДНК и для сращивания
репликации ДНК (разд. 24.19). (сплайсинга) цепей ДНК при генетической
рекомбинации.
24.15. ДНК-лигаза соединяет Рассмотрим механизм этой реакции,
фрагменты ДНК установленный Робертом Леманом (Robert
ДНК-полимераза I может присоединять Lehman). ATP или NAD + вступают в реак-
дезоксирибонуклеотиды к затравочной це- цию с ДНК-лигазой и образуют ковалент-
пи, но она не способна катализировать со- ный комплекс фермент-AMP, в котором
единение двух цепей ДНК или замыкание AMP связан с ε-аминогруппой лизинового
одной цепи ДНК. Обнаружение кольцевой остатка фермента фосфоамидной связью
ДНК указывало, что такой фермент дол- (рис. 24.31). Остаток AMP активирует фос-
жен существовать. В 1967 г. в нескольких фатную группу на 5'-конце ДНК. Послед-
лабораториях одновременно была открыта няя стадия - нуклеофильная атака активи-
ДНК-лигаза - фермент, катализирующий рованного атома фосфора 3'-ОН-группой.
образование фосфодиэфирной связи между В результате образуется фосфодиэфирная
двумя цепями ДНК (рис. 24.30). Фермент связь и освобождается AMP. Движущая
этот активен при наличии свободной сила этой последовательности реакций - ги-
ОН-группы на 3'-конце одной цепи ДНК и дролиз пирофосфата, отщепляющегося при
образовании комплекса фермент—адени-
Часть IV. лат. Таким образом, на образование фосфо-
26 Информация диэфирной связи в остове ДНК расходуют-
Рис. 24.32. Механизм реакции, катализи- теза ДНК нужна какая-то другая полимера-
руемой ДНК-лигазой. за, отличная от ДНК-полимеразы I.
Низкий фон активности полимеразы I
у мутанта polA 1 облегчил поиск новых
ся две богатые энергией фосфатные связи. ДНК-полимераз. Вскоре в нескольких лабо-
если источником энергии служит АТР. раториях были выделены и охарактеризо-
ваны два таких фермента. ДНК-полимеразы
24.16. Открытие ДНК-полимераз II и III II и III подобны полимеразе I в следующих
Мы видели, что ДНК-полимераза I может отношениях:
синтезировать и репарировать ДНК in vitro.
Выполняет ли она эти функции in vivo? Во- 1. Они катализируют направляемый ма-
прос вполне правомерный, так как фермент трицей синтез ДНК из предшественников
не всегда способен осуществлять in vivo ту дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
реакцию, которую он катализирует in vitro. 2. Для проявления их активности необхо-
Условия, существующие в клетке, могут от- дима затравка со свободной 3'-ОН-группой,
личаться от условий, используемых при по- 3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.
становке опытов in vitro, и, кроме того, 4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазной
в клетке могут присутствовать другие фер- активностью. ДНК-полимераза III (но не II)
менты. Действительно, в клетке E.coli является также 5'—>3'-нуклеазой.
имеются по меньшей мере две другие ДНК- Эти полимеразы различаются по характе-
полимеразы, названные полимеразами II ру предпочитаемых ими матриц. Для поли-
и III, которые были обнаружены примерно мераз II и III оптимальными матрицами
через 15 лет после открытия ДНК-полиме- служат двухцепочечные ДНК, имеющие ко-
разы I. Чем же объясняется такое запазды- роткие одноцепочечные пробелы. Полиме-
вание? Дело в том, что активность ДНК-по- раза I, наоборот, предпочитает протя-
лимераз II и III маскировалась высокой женные одноцепочечные участки, сосед-
активностью полимеразы I. ствующие с двухспиральными участками.
Ситуация изменилась в 1969 г., когда Пау- Максимальные скорости катализа in vitro
ла Де Лусия и Джон Кэрнс (Paula DeLucia, для этих ферментов также различаются: по-
John Cairns) выделили мутантную форму лимераза I присоединяет 10 нуклеотидов
E.coli, в экстракте которого обнаруживалось в секунду, а полимераза II - 0,5 и полимераза
от 0,5 до 1% нормальной полимеразной ак- III - 150 нуклеотидов в секунду. В физиоло-
тивности ДНК-полимеразы I по сравнению гически активном состоянии ДНК-полиме-
с обычными клетками. Этот мутант (обо- раза III ассоциирована с некоторыми други-
значенный polA 1) размножался с такой же ми белками. Этот мультисубъединичный
скоростью, как и родительский штамм. комплекс называют голоферментом ДНК-
Кроме того, многие фаги размножались полимеразы III.
в клетках polA 1 так же хорошо, как и в ро- Какова роль этих полимераз in vivo?
дительских клетках. Однако этот мутант го- Вскоре мы расскажем о том, что мультифер-
раздо быстрее погибал под действием уль- ментный комплекс, содержащий ДНК-поли-
трафиолетового облучения. К тому же меразу III, синтезирует большую часть но-
мутант polA 1 был более чувствителен к ле- вообразующейся ДНК, а ДНК-полимераза
тальному действию химического мутагена I удаляет затравку и заполняет пробелы.
метилметансульфоната. Де Лусия и Кэрнс Роль ДНК-полимеразы II пока не устано-
сделали вывод, что репликация ДНК в клет- влена. Проведенные в последнее время био-
ках полученного ими мутанта polA 1 идет
нормально, но репарация ДНК существенно 24. ДНК: генетическая роль,
нарушена. Они предположили, что для син- структура и репликация 27
Рис. 24.33. Положение структурных генов
трех ДНК-полимераз Е. coli.
Ген ДНК-полимеразы I распо-
ложен в локусе polA, ген ДНК-
полимеразы II - в локусе polB
и ген ДНК-полимеразы III - в
локусе dnaE.

химические и генетические исследования по-


казали, что, кроме ДНК-полимераз I и II
и ДНК-лигазы, для репликации ДНК в клет-
ке E.coli необходимо более 10 белков. Пре-
жде чем рассмотреть взаимодействие этих
белков с ДНК, познакомимся в общих чер-
тах с репликацией на уровне целой хромо-
сомы.

24.17. Расплетание родительской ДНК


и синтез новой ДНК происходят
в репликационной вилке
Изображения ДНК во время репликации
были получены с помощью радиоавтогра-
фии и электронной микроскопии. При ра-
диоавтографии изображение образуется
в результате распада подходящего изотопа,
например трития. Испускаемые электроны
взаимодействуют с гранулами серебра фо-
тографической эмульсии. После проявления
пленки возникают черные точки. Метод ра-
диоавтографии имеет довольно низкую раз- Рис. 24.34. Радиоавтограф реплицирую-
решающую способность - порядка несколь- щейся ДНК Е. coli. (Печатается
ких сотен ангстрем. Однако у этого метода с любезного разрешения д-ра
есть определенное преимущество: он позво- John Gairns.)
ляет видеть лишь те молекулы, которые со-
держат метку. Для того чтобы сделать ДНК
видимой при радиоавтографии, в нее вклю- На радиоавтографах и электронных ми-
чают тимин или тимидин, меченный три- крофотографиях видно, что реплицирую-
тием. щаяся ДНК E.coli имеет форму замкнутого
кольца с внутренней петлей (рис. 24.34). Мо-
Часть IV. лекулы такой формы называют тета-струк-
28 Информация турами, так как они напоминают греческую
букву θ (рис. 24.35). Тета-структуры показы-
вают, что молекулы ДНК сохраняют во вре-
мя репликации кольцевую форму. Разреше-
ние этого метода недостаточно велико,
чтобы различить свободные концы. Однако
очевидно, что длинных нитей одноцепочеч-
ной ДНК в молекуле нет. Таким образом,
эти изображения позволяют отвергнуть ме-
ханизм репликации, согласно которому це-
пи родительской ДНК сначала полностью Рис. 24.35. Схематическое изображение
раскручиваются, и только затем исполь- кольцевой хромосомы Е. coli во
зуются в качестве матриц при синтезе новой время репликации. Синими
ДНК. Напротив, синтез новой ДНК сопря- линиями в этой тета-структуре
жен с одновременным раскручиванием роди- показана родительская ДНК,
тельской ДНК. Участок, где происходит красными - новообразованная
одновременное расплетание и синтез, назы- ДНК.
вается репликационной вилкой.

24.18. Репликация ДНК начинается в строго


определенном месте и продолжается
последовательно в обоих направлениях
Начинается ли репликация ДНК E.coli
в произвольном месте хромосомы, или же
в хромосоме имеется определенный участок
инициации? Репликация ДНК - строго регу-
лируемый процесс, поэтому a priori кажет-
ся гораздо более вероятным, что она на-
чинается в определенном месте. Действи-
тельно, как показали работы по определе-
нию относительного числа различных генов
в условиях быстрого синтеза ДНК, реплика-
ция в клетках E.coli начинается в одном
определенном месте хромосомы. Рассмо-
трим два гена - а и b. Предположим, что ген
а расположен вблизи от точки начала репли-
кации, а ген b - вблизи от конца. Тогда ген
а будет реплицироваться намного раньше,
чем ген b. В быстро растущей культуре на
один ген b будет приходиться примерно два
гена а. Если же, наоборот, репликация ДНК
начинается в случайной точке, количество
генов а и b будет одинаковым. Относитель-
ное число генов было определено с по-
мощью метода гибридизации, который рас-
сматривается ниже (разд. 25.5). Результаты Рис. 24.36. Относительные количества
этих экспериментов ясно показали, что от- различных генов в условиях
носительное число генов действительно за- быстрого синтеза ДНК у Е. coli
висит от их положения на карте (рис. 24.36). в зависимости от их положения
Эти данные позволили сделать следующие на генетической карте.
выводы.
1. Репликация начинается в строго опре-
деленном уникальном участке - вблизи гена
ilv, локализованного на 74' на стандартной
генетической карте E.coli.
2. Репликация идет одновременно в обо- 24. ДНК: генетическая роль,
их направлениях с примерно одинаковой структура и репликация 29
скоростью. Другими словами, существуют
две репликационные вилки: одна движется по
часовой стрелке, другая - против часовой
стрелки.
3. Две репликационные вилки встречают-
ся вблизи маркера trp (25' на генетической
карте) - в точке, почти диаметрально проти-
воположной началу репликации.
Еще одно доказательство двунаправлен-
ности репликации ДНК у E.coli было полу- Рис. 24.37. Предполагаемые результаты
чено методом радиоавтографии. Для этого радиоавтографии в случае
вначале репликацию проводили в среде, со- одно- и двунаправленной ре-
державшей тимин, меченный тритием до пликации, если бактерий пере-
умеренной удельной радиоактивности. Че- носят со среды, содержащей ти-
рез несколько минут инкубации бактерии мин с умеренной радиоактив-
перенесли в среду, содержавшую высокоме- ностью, на среду с высокора-
ченный тритием радиоактивный тимин. диоактивным тимином.
Пробы с двумя различными уровнями ра-
диоактивности использовались для того,
чтобы получить на радиоавтографах два ти-
па цепочек зерен серебра: цепочки с низкой
плотностью зерен, соответствующие ДНК,
синтезированной вначале, и цепочки с высо-
кой плотностью, соответствующие ДНК,
синтезированной позже. Если бы реплика-
ция шла в одном направлении, были бы
видны цепочки с высокой плотностью зерен Рис. 24.38. Радиоавтограф ДНК Е. coli во
на одном конце и низкой плотностью на время репликации (условия
другом. Если же репликация идет в двух на- опыта указаны в подписи
правлениях, середина каждого отпечатка к рис. 24.37). Наблюдаемое
ДНК должна была бы иметь низкую плот- распределение зерен серебра
ность зерна, а концы - высокую (рис. 24.37). показывает, что репликация
Радиоавтографы дали наглядный ответ идет в двух направлениях.
(рис. 24.38). Цепочки зерен серебра (отпечат- [Prescott D. M., Kuempel P.L.,
ки ДНК) во всех случаях имели более высо- Proc. Nat. Acad. Sci, 69, 2842
кую плотность зерен на обоих концах, чем (1972).]
посередине, указывая тем самым, что репли-
кация хромосомы E.coli идет в двух напра-
влениях.

24.19. Одна цепь ДНК синтезируется


прерывисто
Вернемся к взаимодействию молекул при
репликации. В области репликационной
вилки обе цепи родительской ДНК служат
матрицами для синтеза новой ДНК. Напом-
ним, что цепи родительской ДНК антипа-
раллельны. Следовательно, общее направле-
ние синтеза ДНК должно быть 5'—>3' для Рис. 24.39. При низком разрешении кажу-
одной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой щееся направление репликации
(рис. 24.39). Однако все известные ДНК-по- ДНК будет 5'—>3' для одной
лимеразы синтезируют ДНК в направлении дочерней цепи и 3'—>5' для
5'—>3', а не 3'—>5'. Как же тогда происходит другой. На самом деле обе цепи
синтезируются в направлении
Часть IV. 5'—>3', как показано на
30 Информация рис. 24.40.
кажущийся (при низкой разрешающей спо-
собности метода) рост одной из дочерних
цепей в направлении 3'—>5'?
Проблема была решена Рейдзи Оказаки
(Reiji Okazaki), который обнаружил, что зна-
чительная часть новосинтезированной
ДНК существует в виде коротких фрагмен-
тов. Такие фрагменты длиной около 1000
нуклеотидов (они называются фрагментами
Оказаки) существуют в течение непродол-
жительного времени в непосредственной
близости от репликационной вилки. По ме-
ре прохождения репликации эти фрагменты
соединяются друг с другом ковалентно под Рис. 24.40. Схематическое изображение
действием ДНК-лигазы и образуют одну из репликационной вилки. Обе це-
дочерних цепей (рис. 24.40). Другая новая пи ДНК синтезируются в на-
цепь синтезируется непрерывно или почти правлении 5'—>3'. Ведущая
непрерывно. Та цепь, которая образуется из цепь синтезируется непрерыв-
фрагментов Оказаки, называется отстаю- но, а отстающая - в виде корот-
щей цепью, а та, что синтезируется без раз- ких фрагментов (фрагменты
рывов или почти без разрывов,- ведущей Оказаки).
цепью. И фрагменты Оказаки, и ведущая
цепь синтезируются в направлении 5'—>3'.
Прерывистая сборка отстающей цепи позво-
ляет путем полимеризации в направлении
5'—>3' на атомном уровне получать общий
рост цепи в направлении 3'—>5'.

24.20. Затравкой синтеза ДНК служит


РНК
Как начинается синтез ДНК? Напомним,
что всем ДНК-полимеразам для иницииро-
вания синтеза ДНК необходима затравка со
свободной 3'-ОН-группой. Что служит за-
травкой при синтезе ведущей цепи и фраг-
ментов Оказаки? Важным толчком к реше-
нию этого вопроса послужило наблюдение,
что для инициации синтеза ДНК необходим
синтез РНК. На основе этого открытия бы-
ло высказано предположение, что РНК, оче-
видно, служит затравкой в синтезе ДНК, так
как уже было известно, что РНК-полиме-
разы способны начинать синтез цепей de
novo. Затем было показано, что новообра- Рис. 24.41. Инициация синтеза ДНК.
зующаяся ДНК ковалентно связана с ко- А - праймаза синтезирует ко-
ротким фрагментом РНК, который и слу- роткую комплементарную
жит затравкой. Итак, РНК-затравка цепь РНК; Б - эта РНК служит
в синтезе ДНК. затравкой для синтеза новой
По всей вероятности, репликация ДНК ДНК; В - РНК, входящая в со-
в клетке E.coli происходит, как показано на став новообразованной цепи,
рис. 24.41. гидролизуется, при этом обра-
1. Особая РНК-полимераза (ее называют зуется брешь, которая впослед-
праймаза) синтезирует короткую цепь РНК ствии заполняется.
(примерно 10 нуклеотидов), комплементар-
ную одной из цепей ДНК-матрицы. В отли- 24. ДНК: генетическая роль,
чие от ДНК-полимеразы праймаза не ну- структура и репликация 31
Рис. 24.42. Электронная микрофотогра- на для синтеза ДНК на одноцепочечной ма-
фия хромосомы Е. coli, прикре- трице, заполняет эти бреши.
пленной к двум фрагментам Последние исследования показали, что
клеточной мембраны. На ри- действию праймазы предшествует образо-
сунке изображена одна интакт- вание предзатравочного промежуточного
ная суперспирализованная мо- комплекса, состоящего как минимум из пяти
лекула ДНК. [Delius H., белков. Один из них - белок dnaB - может
Worcel A., J. Mol. Biol., 82, 108 передвигаться вдоль ДНК, используя энер-
(1974).] гию гидролиза АТР. Белок dnaB может слу-
жить сигналом для активации праймазы.
Специфичность инициации очередного ци-
кла репликации может обеспечиваться бел-
ждается в затравке для синтеза полинуклео- ками, доставляющими белок dnaB точно
тида. в область гена ilv, где находится точка нача-
2. 3'-гидроксильная группа концевого ри- ла репликации хромосомы E.coli. Время на-
бонуклеотида этой цепи РНК служит за- чала репликации ДНК имеет критическое
травкой для синтеза ДНК под действием го- значение, поскольку оно должно быть
лофермента ДНК-полимеразы III. Большая скоординировано с делением клетки. И дей-
часть новообразованной ДНК синтезирует- ствительно, бактериальная хромосома ассо-
ся этим мультисубъединичным комплексом. циирована с впячиванием клеточной мем-
3. РНК-компонент этого РНК-ДНК-ги- браны (рис. 24.42).
брида гидролизуется под действием ДНК-
полимеразы I. 24.21. Энергия гидролиза АТР используется
4. После удаления РНК из новообразо- для расплетания родительской ДНК
ванных цепей между фрагментами ДНК в области репликационной вилки
остаются довольно обширные бреши. ДНК- под действием белка rep
полимераза I, которая хорошо приспособле- В 1953 г. Уотсон и Крик отмечали, что «рас-
крутить спираль - задача труднопреодоли-
Часть IV. мая». Исследования, проведенные в послед-
32 Информация нее время, показали, что в клетке E.coli
вают также белками, дестабилизирующими
спираль (белки ДС), или плавящими белка-
ми.
24.22. ДНК-гираза вводит отрицательные
супервитки в родительскую ДНК, чтобы
облегчить ее расплетание
При расплетании ковалентно замкнутой
кольцевой молекулы ДНК возникают топо-
логические проблемы, так как расплетание
двойной спирали вызывает образование по-
ложительных супервитков в замкнутой мо-
лекуле. В области репликационной вилки
родительская ДНК вращается со скоростью
100 об/с - более чем в 100 раз быстрее, чем
обычная долгоиграющая пластинка. Чтобы
процесс расплетания продолжался, необхо-
димо снять эти положительные супервитки,
образовавшиеся в результате вращения.
Другими словами, необходимо наличие ка-
кого-то молекулярного шарнира. Недавно
Мартин Геллерт (Martin Gellert) установил,
что эту функцию выполняет ДНК-гираза.
Эта топоизомераза удаляет положи-
тельные супервитки, внося одноцепочечные
разрывы и затем заделывая фосфодиэфирные
связи в остове ДНК. АТР не требуется для
такой термодинамически выгодной релакса-
ции третичной структуры ДНК. Более того,
ДНК-гираза может активно вводить отри-
цательные супервитки в ковалентно замкну-
тую кольцевую ДНК за счет энергии гидро-
лиза АТР (рис. 24.43). Эти отрицательные
супервитки способствуют расхождению це-
пей родительской ДНК в области реплика-
Рис. 24.43. Каталитические активности ционной вилки 1 .
ДНК-гиразы.

24.23. Сложность аппарата репликации,


по-видимому, необходима для обеспечения
в области репликационной вилки происхо- очень высокой надежности
дит активное расплетание родительской Существующие представления о молекуляр-
двойной спирали под действием фермента — ном механизме репликации ДНК у E.coli
белка rep. Поскольку энергия для расплета-
ния родительской ДНК высвобождается 1
В этой главе автор называет ДНК-гиразой
при гидролизе АТР, белок гер называют хе- два совершенно различных фермента. Один из
ликазой. На разделение каждой пары осно- них - ДНК-гираза, способная вводить в ДНК
ваний затрачиваются примерно две моле- термодинамически невыгодные отрицательные
супервитки за счет энергии гидролиза АТР; дру-
кулы АТР. Затем каждая из разделенных гой - независимая от АТР ДНК-топоизомераза,
цепей родительской ДНК взаимодействует приводящая кольцевую молекулу ДНК в тер-
с несколькими молекулами белка, связываю- модинамически равновесное (релаксированное)
щегося с одноцепочечной ДНК (ОЦ-связы- состояние. Это два совершенно различных бел-
ка: у них различные ингибиторы, потребности
вающий белок). Роль ОЦ-связывающего в ионных условиях среды, механизм действия.
белка - стабилизировать одноцепочечные В репликации в качестве молекулярного шарни-
участки ДНК, образовавшиеся под дей- ра участвует ДНК-гираза.- Прим. перев.
ствием хеликазы, чтобы расплетенная
область могла функционировать в качестве 24. ДНК: генетическая роль,
матрицы. ОЦ-связывающие белки назы- структура к репликация 33
Рис. 24.44. Схематическое изображение предыдущую пару оснований. Частота оши-
ферментативных процессов бок для них на несколько порядков вели-
в области репликационной вил- чины выше, чем для ДНК-полимераз. Было
ки Е. coli. Фрагменты, отме- найдено остроумное решение этой про-
ченные синим цветом, катали- блемы: начинать синтез ДНК с полинуклео-
зируют инициацию, элонгацию тида, синтезируемого с низкой надеж-
и сшивание (с помощью ДНК- ностью, но отмечать его «временный»
лигазы) цепей ДНК. (Коrn- характер, включив в его состав рибонуклео-
berg A., DNA replication,
W.H. Freeman and Co., 1980.) Таблица 24.2. Белки репликации Е. coli

Белок Функция Масса, Число


представлены на рис. 24.44 и в табл. 24.2.
кДа моле-
Поражает сложность взаимодействий мно- кул в
жества белков, участвующих в этом процес- клетке
се. Генетический анализ показывает, что
в репликации ДНК непосредственно уча- dna В Дает возможность ~250 20
ствует не менее 15 белков. Почему механизм праймазе иницииро-
репликации ДНК столь сложен? В частно- вать синтез РНК
сти, почему синтез ДНК начинается с РНК- Праймаза Синтезирует РНК-за- 60 100
затравки, которая затем удаляется? Если бы травки
ДНК-полимеразы могли начинать синтез rер Расплетает двойную 65 50
цепей de novo, в РНК-затравке не было бы спираль
надобности. Однако такая способность бы- ДНК-связы- Стабилизирует одно- 74 300
ла бы несовместима с чрезвычайно высокой вающий цепочечные участки
точностью ДНК-полимераз. Напомним, что ДНК-гираза Вводит суперспираль- 400
ДНК-полимеразы, прежде чем образовать ные витки
новую фосфодиэфирную связь, проверяют Голофермент Синтезирует ДНК 20
>300
правильность предшествующей пары осно- ДНК-полиме-
ваний. Эта функция редактирования суще- разы III
ственно снижает частоту ошибок. РНК-по-
ДНК-полиме- Удаляет затравку и 109 300
лимеразы, напротив, могут начинать синтез раза I заполняет бреши
цепей de novo, так как они не проверяют
ДНК-лигаза Соединяет концы 74 300
Часть IV. ДНК

34 Информация
тиды. Затем ДНК-полимераза I вырезает
эти короткие последовательности РНК-за-
травок и замещает их последовательностью
ДНК, синтезированной с высокой надеж-
ностью. Создается впечатление, что многие
детали, усложняющие механизм реплика-
ции ДНК, предназначены для обеспечения
чрезвычайно высокой точности. Генетиче-
ский анализ показывает, что частота оши-
9 10
бок составляет одну на 10 -10 считанных
пар оснований.
Рис. 24.45. Модель димера урацила, обра-
24.24. Повреждения ДНК постоянно зованного под действием уль-
репарируются трафиолетового облучения.
Поскольку множество химических и физиче- Тиминовый димер имеет при-
ских агентов вызывает в ДНК повреждения, мерно такую же структуру.
во всех клетках имеются специальные меха-
низмы для исправления этих повреждений.
Основания в ДНК могут изменяться и те- ждения и вносит одноцепочечный разрыв
ряться, фосфодиэфирные связи остова мо- вблизи от димера, обычно с 5'-стороны.
гут разрываться, а две цепи могут попереч- Участок, содержащий димер, выпячивается
но сшиваться друг с другом. Эти поврежде- из двойной спирали, что позволяет ДНК-по-
ния образуются под действием ионизирую- лимеразе I (или другой подобной полимера-
щей радиации, ультрафиолетового облуче- зе) провести репарационный синтез в напра-
ния и различных химических веществ. влении 5'—>3'. Затравкой при этом служит
Многие повреждения в ДНК поддаются ис- 3'-конец разорванной цепи, а матрицей - ин-
правлению, так как генетическая информа- тактная комплементарная цепь. Затем
ция записана в обеих цепях двойной спира- область, где расположен пиримидиновый
ли. Благодаря этому информацию, утрачен- димер, вырезается под действием 5'—>
ную одной из цепей, можно извлечь из —>3'-нуклеазной активности ДНК-полиме-
другой цепи. разы. Наконец, новосинтезированная цепь
Один из наиболее хорошо изученных ме- и остаток той же цепи ДНК соединяются
ханизмов репарации - вырезание пиримиди- ДНК-лигазой. Другой путь репарации-фо-
нового димера (рис. 24.45), который обра- тохимическое расщепление пиримидиново-
зуется при действии на ДНК ультрафиоле- го димера. Почти все клетки содержат фо-
тового света. Соседние пиримидиновые тореактивирующий фермент, который уз-
остатки в одной цепи ДНК могут в этих ус- нает димер и расщепляет его на исходные
ловиях образовать ковалентную сшивку. основания, используя энергию поглощенно-
Такой пиримидиновый димер не уклады- го синего света.
вается в двойную спираль, так что реплика-
ция и экспрессия генов оказываются блоки-
24.25. Рак кожи при золотистой ксеродерме
рованными до тех пор, пока повреждение не обусловлен нарушением нормальной
будет удалено.
репарации ДНК
В осуществлении этого процесса важную
Золотистая ксеродерма (Xeroderma
роль играют четыре ферментативные актив-
pigmentosum) - редкое заболевание кожи
ности (рис. 24.46). Первая из них - УФ-специ-
у людей. Оно наследуется как аутосомный
фичная эндонуклеаза - находит место повре- рецессивный признак. У гомозиготных
больных кожа крайне чувствительна к сол-
нечному и ультрафиолетовому свету. Серь-
езные поражения кожи наблюдаются уже
в детстве, а с возрастом они принимают все
более тяжелый характер. Кожа становится
сухой, и дерма в значительной степени атро-

24. ДНК: генетическая роль,


структура и репликация 35
Ксеродерма -
от греч. слов, означающих «сухая кожа». Этот термин был впервые использован
F. Hebra и М. Kaposi в 1874 г. для описания «пергаментной кожи» и аномаль-
ной пигментации, наблюдавшихся у одного из больных.

фируется. Появляются кератозы, веки по- Дезаминирование цитозина является потен-


крываются рубцами, поражается роговица. циально мутагенным, так как образующий-
Обычно во многих местах возникает рак ко- ся урацил спаривается с аденином, и, следо-
жи. Многие больные погибают, не достиг- вательно, одна из дочерних цепей будет
нув 30 лет, от метастазов этих злокаче- содержать AU-пару оснований вместо ис-
ственных опухолей кожи. ходной GC-пары:
В ДНК человека, как и у E.coli, под дей-
ствием ультрафиолетового света образуют-
ся пиримидиновые димеры. Более того, ме-
ханизмы репарации у человека и у E.coli,
по-видимому, сходны. Изучение фибробла-
стов кожи больных золотистой ксеродер-
мой показало, что одна из форм этой болез-
ни сопровождается биохимическим наруше-
нием. В нормальных фибробластах поло-
вина пиримидиновых димеров, образовав- Эта мутация исправляется под действием
шихся под действием ультрафиолетового репарационной системы, узнающей чуже-
облучения, вырезается менее чем за сутки. родный урацил в молекуле ДНК
В фибробластах же, полученных от больных (рис. 24.47). Прежде всего урацил-
золотистой ксеродермой, за тот же проме- ДНК—гликозидаза гидролизует гликозид-
жуток времени вырезания димеров почти не ную связь остатка урацила с дезоксирибо-
наблюдается. Какой этап репарации нару- зой. На этом этапе остов ДНК остается
шен? Ответ был получен путем определения интактным, но одно основание отсутствует.
молекулярной массы цепей ДНК из фибро- Затем специфическая эндонуклеаза узнает
бластов, облученных ультрафиолетовым этот дефект и расщепляет остов рядом с от-
светом. В нормальных клетках в течение не- сутствующим основанием. ДНК-полимера-
скольких часов после облучения происходит за I вырезает оставшийся дезоксирибозо-
заметное снижение молекулярной массы фосфат и вставляет цитозин, комплемен-
одноцепочечной ДНК. Это снижение моле- тарный гуанину в неповрежденной цепи.
кулярной массы обусловлено первой реак- Наконец, репарированная цепь заделывает-
цией процесса репарации, а именно расще- ся ДНК-лигазой.
плением цепи ДНК рядом с пиримиди- В течение многих лет оставалось загад-
новым димером. После УФ-облучения кле- кой, почему в ДНК присутствует тимин, а не
ток золотистой ксеродермы, наоборот, сни- урацил, ведь оба основания спариваются
жения молекулярной массы не происходит. с аденином. Единственное различие между
Следовательно, это кожное заболевание, ними - метильная группа тимина на месте
возможно, вызвано инактивацией эндону- атома водорода при С-5 в урациле. Почему
клеазы, которая гидролизует остов ДНК ря- это метилированное основание использует-
дом с пиримидиновым димером. Тяжелые ся в ДНК, но не в РНК? Напомним, что на
клинические последствия этого фермента- метилирование дезоксиуридилата с образо-
тивного нарушения свидетельствуют об ис- ванием дезокситимидилата расходуется
ключительной важности процессов репара- много энергии (разд. 22.16). Открытие срав-
ции ДНК. нительно недавно активной системы, репа-
рируюшей дезаминирование цитозина, слу-
24.26. ДНК содержит тимин вместо урацила, жит убедительным ответом на эту загадку.
что делает возможной репарацию Урацил-ДНК—гликозидаза не удаляет
дезаминированного цитозина тимина из ДНК. Таким образом, метильная
Цитозин в ДНК спонтанно дезаминируется группа тимина служит меткой, позволяю-
с измеримой скоростью, образуя урацил. щей отличать его от дезаминированного ци-
тозина. Если бы этой метки не было, ура-
Часть IV. цил, стоящий на правильном месте, было бы
36 Информация невозможно отличить от урацила, образо-
24.27. Рестриктирующие эндонуклеазы
совершили переворот в анализе ДНК
Ферменты рестрикции - эндонуклеазы, спо-
собные узнавать определенные последова-
тельности оснований в двухспиральной
ДНК и расщеплять обе цепи. Эти исключи-
тельно тонкие скальпели - великолепный
подарок природы биохимикам. Существо-
вание ферментов рестрикции позволило
проводить эксперименты, о которых нельзя
было даже и мечтать всего лишь несколько
лет назад. Они представляют собой незаме-
нимые инструменты для исследования

Рис. 24.46. Репарация участка ДНК, со-


держащего тиминовый димер,
в результате последовательно-
го действия специфической эн-
донуклеазы, ДНК-полимеразы
и ДНК-лигазы. Тиминовый ди-
мер показан синим цветом,
а новосинтезированный уча-
сток ДНК - красным. [На-
nawalt P.C, Endeavor, 31, 83
(1972).]

вавшегося в результате дезаминирования.


Дефект остался бы незамеченным, и в одной
из дочерних молекул ДНК неизбежно про-
изошло бы мутационное замещение одной
GC-пары на AU-пapy. Система репарации,
которая выискивает урацилы и оставляет
тимины, подавляет такие мутации. По всей
вероятности, тимин используется в ДНК
вместо урацила для увеличения надежности Рис. 24.47. Остатки уранила в ДНК выре-
генетической информации. В противопо- заются и замещаются цитози-
ложность этому РНК не репарируется, и ном - исходным основанием.
в ней используется урацил, так как он пред-
ставляет собой менее дорогой строи- 24. ДНК: генетическая роль,
тельный блок. структура и репликация 37
Палиндром (перевертыш) -
слово, предложение или стих, которые читаются одинаково слева направо
и справа налево.
Примеры:
Радар
То не ясли ломал, а молился енот.
А роза упала на лапу Азора.
Нажал кабан на баклажан.
Roma tibi subito motibus ibit amor.
Происходит от греческого слова palindromos - бегу назад.
структуры хромосомы, определения после- В каждой цепи эта эндонуклеаза рвет фос-
довательности нуклеотидов в очень фодиэфирную связь между G и С, дисталь-
длинных молекулах ДНК, выделения генов ную по отношению к оси симметрии. К на-
и получения новых молекул ДНК для кло- стоящему времени очищено и охарактеризо-
нирования. Разработку всех этих методов вано более 80 ферментов рестрикции. Их
начали Вернер Арбер, Гамилтон Смит и Дэ- названия состоят из сокращенного до трех
ниел Натанс (Werner Arber, Hamilton Smith, букв названия микроорганизма (например,
Daniel Nathans). Есо от E.coli, Hin от Haemophilus influenzae,
Рестриктирующие эндонуклеазы обнару- Нае от H.aeguptins), обозначения штамма
живаются у самых различных прокариот. и римской цифры. Специфичность неко-
Биологическая роль этих ферментов со- торых ферментов показана на рис. 24.48.
стоит в том, чтобы расщеплять чужеродные Обратите внимание, что производимые в
молекулы ДНК. Собственная клеточная двух цепях разрывы могут быть распо-
ДНК при этом не расщепляется, так как ложены либо со сдвигом относительно
участки, узнаваемые своими ферментами друг друга, либо строго против друг
рестрикции, у нее метилированы. Взаимос- друга.
вязь между ресткрикцией и модификацией Ферменты рестрикции используются для
рассматривается в гл. 30 (разд. 30.9). Важ- расщепления молекул ДНК на опреде-
ное значение имеет тот факт, что многие ленные фрагменты, которые более удобны
ферменты рестрикции узнают специфиче- для анализа и манипулирования, чем ис-
ские последовательности ДНК длиной от ходная молекула. Например, EcoRI расще-
четырех до шести пар оснований и гидроли- пляет кольцевую двухцепочечную ДНК ви-
зуют фосфодиэфирные связи в обеих цепях руса SV-40 длиной 5,1 kb только в одном
в этой области. Удивительная особенность месте, Нра - в четырех местах и Hind - в 11
таких участков расщепления - их симметрия местах. Кусок ДНК, образованный одним
относительно оси вращения второго поряд- ферментом рестрикции, можно специфиче-
ка. Другими словами, узнаваемая последо- ски расщепить на более мелкие фрагменты
вательность пар оснований представляет со- с помощью другого фермента. Используя
бой палиндром. несколько ферментов рестрикции, можно
Расщепляемые участки расположены сим- картировать хромосомы (разд. 31.8). Более
метрично относительно оси второго поряд- того, набор фрагментов, полученных с по-
ка. Например, фермент рестрикции из мощью ферментов рестрикции, может слу-
Streptomyces achromogenes узнает последова- жить своего рода «отпечатком пальца»
тельность для соответствующей молекулы ДНК. Не-
большие различия между сходными моле-
кулами ДНК можно легко выявить с по-
мощью электрофоретического разделения
их рестрикционных фрагментов. Для каж-
дого данного геля электрофоретическая
подвижность фрагмента ДНК обратно
пропорциональна логарифму числа пар ос-
нований (до определенного предела длины
фрагментов). Для разделения фрагментов
Часть IV.
ДНК длиной до 1000 пар оснований ис-
38 Информация
пользуют полиакриламидный гель, а для
24.28. Последовательность нуклеотидов
в ДНК можно быстро определить
с помощью специфического химического
расщепления
Появление надежных методов определения
последовательности нуклеотидов в моле-
кулы ДНК облегчило также изучение
структуры ДНК и ее связи с экспрессией
гена. Метод химического расщепления, раз-
работанный Алланом Максамом и Уолте-
ром Гилбертом (Allan Maxam, Walter
Gilbert), основан на использовании ДНК,
меченной 32 Р по одному из концов одной
из цепей. Для введения 32 Р в 5'-гидро-
ксильный конец обычно используют поли-
нуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщеп-
ляют предпочтительно по одному из четы-
рех нуклеотидов. Условия реакции подби-
рают таким образом, чтобы на каждую
цепь приходился в среднем один разрыв.

Рис. 24.48. Специфичность некоторых эн-


донуклеаз рестрикции. После-
довательности пар оснований,
узнаваемые этими фермента-
ми, имеют ось симметрии вто-
рого порядка. Две цепи ДНК
в этой области симметричны
относительно оси, обозначен-
ной зеленым овалом. (Одна
цепь сдвинута относительно
другой на 180°.) Места расще-
пления показаны красными
стрелками. Сокращенные на-
звания каждого фермента ре-
стрикции приведены справа от
последовательности, которую
он узнает.

разделения более длинных молекул более Рис. 24.49. Электрофоретическое разделе-


пористый агарозный гель. Если ДНК со- ние фрагментов, образующих-
держит радиоактивную метку, полосы ся при расщеплении ДНК
можно выявить методом радиоавтографии. SV-40 тремя различными фер-
В другом случае гель можно покрасить ментами рестрикции. Эти
бромистым этидием, который при связыва- фрагменты флуоресцируют
нии с двухспиральной ДНК флуоресцирует благодаря тому, что гель окра-
ярким оранжевым светом. При использо- шен бромистым этидием. (Пе-
вании этого способа можно легко увидеть чатается с любезного разреше-
полосу, содержащую 50 нг ДНК ния д-ра Jeffrey Sklar.)
(рис. 24.49). Помимо чувствительности,
важное достоинство таких гелей - их высо- 24. ДНК: генетическая роль,
кая разрешающая способность. структура и репликация 39
Частичное расщепление по каждому осно- В результате основание отделяется от со-
ванию дает набор радиоактивных фраг- ответствующего остатка сахара. Затем
32
ментов, начинающихся Р-меткой и кон- смесь нагревают в щелочи, что вызывает
чающихся одним из положений этого расщепление сахарофосфатного остова
основания. Например, если исследуемая ДНК и удаление остатка сахара. В резуль-
ДНК имеет последовательность тате образуются фрагменты, несущие на
конце метку. Эти фрагменты разделяют
в полиакриламидном геле и на радиоавто-
32
5'- P-GCTACGTA-3' графе получают картину полосы различ-
ной интенсивности. Темные полосы со-
ответствуют фрагментам, образовавшимся
при расщеплении по гуанину, так как гуа-
то в результате специфического расщепле-
нин метилируется гораздо быстрее, чем
ния с 5'-стороны каждого из четырех осно-
аденин. В то же время гликозидная связь
ваний получатся следующие радиоак-
в метилированном аденозине менее ста-
тивные фрагменты:
бильна, чем в метилированном гуанозине.
Поэтому при обработке разбавленной кис-
лотой после метилирования происходит
предпочтительное выщепление аденина
(получается дорожка А + G). Сравнение до-
рожки А + G с параллельной дорожкой
G на том же геле показывает, происходит
ли расщепление по А или по G (рис. 24.52).
Расщепление по цитозину и тимину прово-
дят гидразином. Остов затем расщепляют
Затем эти фрагменты разделяют методом
электрофореза в полиакриламидном геле,
который дает возможность разделять мо-
лекулы ДНК, различающиеся по длине
всего лишь на один нуклеотид. Следую-
щий этап - радиоавтография этого геля.
Как показано на рис. 24.50, самая нижняя
полоса расположена на дорожке, соответ-
ствующей расщеплению по С, следую-
щая - на дорожке Т, затем еще одна - на
дорожке А. Следовательно, последователь-
ность первых трех нуклеотидов имеет вид
5'-СТА-3'. Если прочитать все семь полос
снизу вверх, получится последовательность
5'-CTACGTA-3'. Итак, радиоавтограф геля,
полученного после четырех различных реак-
ций химического расщепления, дает набор
полос, по которым можно непосредственно
прочитать нужную последовательность.
Как достигается специфическое расще- Рис. 24.50. Схематическое изображение
пление ДНК? Для этого используют со- геля, на котором показаны ра-
единения, которые способны модифициро- диоактивные фрагменты, обра-
вать основание и затем отщеплять его от зовавшиеся при специфиче-
остатка сахара (рис. 24.51). Пурины моди- ском расщеплении последова-
фицируют диметилсульфатом, метилирую- тельности 5'-32P-GCTACGTA-
щим гуанин по N-7 и аденин по N-3. Рас- 3' по каждому из четырех осно-
щепление гликозидной связи метилирован- ваний (дорожки A, G, С и Т).
ного пурина легко достигается нагрева- Слева указано число нуклеоти-
нием при нейтральном значении рН. дов (n) в каждом фрагменте.
Последовательность основа-
Часть IV. ний читается непосредственно
40 Информация с геля снизу вверх.
24.29. Полная последовательность
оснований ДНК фага φХ174 была
определена с помощью метода
ферментативной репликации
Другой метод определения последователь-
ности оснований в ДНК основан на обра-
зовании меченых фрагментов с помощью
контролируемого прерывания фермента-
тивной репликации in vitro. Этот метод
разработали Фред Сэнгер (Fred Sanger)
и его сотрудники. Для считывания опреде-
ленной последовательности с одноцепочеч-
ной ДНК используют ДНК-полимеразу

Рис. 24.51. Стратегия метода определения


последовательности нуклеоти-
дов в ДНК с помощью химиче-
ского расщепления.

пиперидином, который вытесняет продукты


реакции с гидразином и катализирует
элиминацию фосфатов. В результате рас-
щепления по цитозинам и тиминам полу-
чают серию полос примерно равной интен-
сивности (дорожка С + Т). Эти пирими-
дины различают, проводя гидразинолиз
в присутствии 2 М NaCl, подавляющим
реакцию с тимином (дорожка С). Теперь по-
следовательность ДНК можно прочитать
по радиоавтографу геля, сопоставляя до- Рис. 24.52. На радиоавтографе геля видны
рожки G, A + G, С + Т и С (рис. 24.52). меченые фрагменты, образо-
Самый короткий фрагмент имеет самую вавшиеся при химическом рас-
высокую электрофоретическую подвиж- щеплении. 5'-конец этой ДНК
ность, так что 5'-концу соответствует низ был помечен 32Р. Самый ко-
геля. Если использовать несколько различ- роткий нуклеотид расположен
ных гелей для разделений всех меченых у основания геля. С геля можно
фрагментов, можно легко определить та- прочитать последовательность
ким образом последовательности длиной 5'-CTTTTTTGGGCTTAGC-3'.
более 150 пар оснований.
24. ДНК: генетическая роль,
структура и репликация 41
Заключение
ДНК - молекула наследственности у всех
прокариотических и эукариотических орга-
низмов. У вирусов роль генетического ма-
териала выполняет либо ДНК, либо РНК.
Любая клеточная ДНК представляет собой
две очень длинные спиральные полину-
клеотидные цепи, закрученные вокруг об-
щей оси. Две цепи двойной спирали ориен-
тированы в противоположном направле-
I 1 ) . В качестве затравки для синтеза ис- нии (антипараллельны). Сахарофосфатный
пользуется комплементарный фрагмент, остов каждой цепи лежит снаружи двойной
который можно получить из набора про- спирали, а пуриновые и пиримидиновые
дуктов рестрикции, соответствующей двух- основания - внутри. Две цепи удерживают-
цепочечной ДНК. Кроме четырех радиоак- ся вместе водородными связями между па-
тивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, рами оснований. Аденин (А) всегда спари-
инкубационная смесь содержит 2',3'-диде- вается с тимином (Т), а гуанин (G) - c
зоксианалог одного из них. Включение это- цитозином (С). Таким образом, цепи двой-
го аналога блокирует дальнейший рост це- ной спирали взаимно комплементарны. Ге-
пи, так как он не содержит концевой нетическая информация закодирована в по-
3'-гидроксильной группы, необходимой для следовательности оснований вдоль цепи.
образования следующей фосфодиэфирной Большинство молекул ДНК имеет кольце-
связи. Так образуются фрагменты, несу-
щие на 3'-конце дидезоксианалог (рис. 24.53).
Затем четыре набора фрагментов, образо-
ванных терминированием цепей, разделяют
гель-электрофорезом и прочитывают по-
следовательность оснований синтезирован-
ной ДНК по радиоавтографу геля. Исполь-
зуя менее 1 пмоль очищенной ДНК, мож-
но определить последовательности 200 ну-
клеотидов.
С помощью метода контролируемой ре-
пликации in vitro Сэнгер определил пол-
ную последовательность 5375 оснований
в ДНК фага φХ174. Расшифровка последо-
вательности ДНК целого генома - крупное
достижение молекулярной биологии. Она
позволила сделать ряд важных выводов,
которые мы рассмотрим в гл. 26
(разд. 26.11). Интересно отметить, что Сэн-
гер определил полную последовательность
оснований целого генома через четверть Рис. 24.53. Стратегия метода определения
века после того, как он расшифровал ами- последовательности нуклеоти-
нокислотную последовательность белка2. дов в ДНК путем терминиро-
1
Поэтому данный метод в отечественной ли- вания цепи. Фрагменты обра-
тературе называют методом полимеразного ко- зуются в результате добав-
пирования.- Прим. перев. ления 2',3'-дидезоксианалога
2
Следует отметить, что в промежутке между одного из dNTP в каждую из
этими открытиями Ф. Сэнгер разработал ориги- четырех пробирок, в которых
нальный метод определения последовательно- происходит полимеризация.
сти оснований в РНК, который имел огромные
преимущества перед другими известными в то Например, при добавлении ди-
время методами.- Прим. перев. дезоксианалога dATP обра-
зуются фрагменты, оканчи-
Часть IV. вающиеся на А (показано
42 Информация красным цветом).
вую форму. Ось двойной спирали кольце- лиза АТР. Расплетанию способствует так-
вой ДНК может сама закручиваться же ДНК-гираза, которая играет роль моле-
и образовывать суперспираль. Суперспира- кулярного шарнира и вводит отрица-
лизованная ДНК имеет более компактную тельные супервитки в родительскую ДНК.
форму, чем релаксированная ДНК. Одна цепь ДНК (ведущая) синтезируется
При репликации ДНК две цепи двойной непрерывно, тогда как другая (отстающая)
спирали расплетаются и расходятся по ме- синтезируется в виде фрагментов длиной
ре того, как синтезируются новые цепи. 1 kb. Поскольку образование отстающей
Каждая родительская цепь служит матри- цепи происходит путем сборки из от-
цей для образования новой комплементар- дельных фрагментов, полимеризация в на-
ной цепи. Таким образом, репликация правлении 5'—>3' на атомном уровне при-
ДНК полуконсервативна - каждая дочерняя водит к общему росту этой цепи
молекула получает одну цепь родитель- в направлении 3'—>5'. Синтезу новой ДНК
ской молекулы ДНК. Репликация предшествует синтез РНК, которая исполь-
ДНК - сложный процесс, в осуществлении зуется затем в качестве затравки. Впослед-
которого участвует много белков, в том ствии РНК, входящая в состав новообра-
числе ДНК-полимеразы трех типов зованной РНК-ДНК-цепи, гидролизуется
и ДНК-лигаза. Активированные предше- и замещается ДНК. Затем ДНК-лигаза со-
ственники синтеза ДНК - четыре дезокси- единяет новообразованные фрагменты
рибонуклеозид-5'-трифосфаты. Новая цепь ДНК, которые спарены с одной и той же
синтезируется в направлении 5'—>3'. Этот матричной цепью. В этой реакции уча-
синтез осуществляется путем нуклеофиль- ствует в качестве источника энергии
ной атаки внутреннего атома фосфора оче- NAD + .
редного дезоксинуклеозидтрифосфата Повреждения в ДНК, вызванные ионизи-
3'-гидроксильным концом цепи затравки. рующей радиацией, ультрафиолетовым
Самое важное состоит в том, что ДНК-по- светом и различными химическими соеди-
лимераза катализирует образование фос- нениями, постоянно репарируются. Напри-
фодиэфирной связи только в том случае, мер, пиримидиновые димеры, индуциро-
если основание очередного нуклеотида ванные ультрафиолетовым светом, выре-
комплементарно основанию матричной це- заются специфической эндонуклеазой. Ура-
пи. Другими словами, ДНК-полимеразы — цил, который образуется при спонтанном
ферменты, направляемые матрицами. дезаминировании цитозина в ДНК, уда-
ДНК-полимеразы I, II и III обладают так- ляется гликозидазой, которая дифференци-
же 3'—>5'-экзонуклеазной активностью, ко- рует урацил и тимин.
торая увеличивает надежность репликации Ферменты рестрикции узнают специфиче-
путем удаления некомплементарных остат- ские последовательности, обладающие
ков. ДНК-полимеразам I и III присуща, симметрией второго порядка, и гидроли-
кроме того, 5'—>3'-нуклеазная активность, зуют одну фосфодиэфирную связь в каж-
играющая важную роль в механизмах ре- дой цепи ДНК в этой области. Эти эндону-
пликации и репарации ДНК. клеазы можно использовать для расщепле-
Репликация ДНК в клетках E.coli на- ния молекул ДНК на специфические фраг-
чинается в строго определенном месте (в менты, удобные для дальнейшего изучения.
точке начала репликации) и идет в обоих Разработка методов, позволяющих быстро
направлениях. В области репликационной определять последовательность нуклеоти-
вилки (там, где из двух цепей ДНК полу- дов в ДНК на основе специфического рас-
чаются четыре) обе цепи родительской щепления и электрофоретического разделе-
ДНК используются в качестве матриц для ния продуктов, революционизировала изу-
синтеза новой ДНК. Белок rep расплетает чение структуры ДНК.
родительскую ДНК за счет энергии гидро-

24. ДНК: генетическая роль,


структура и репликация 43
РЕКОМЕНДУЕМАЯ Molecular structure of nucleic acid. Bird R.E., Lourarn J., Martuscelli J.,
ЛИТЕРАТУРА A structure for deoxyribose nucleic acid, Caro L., 1972. Origin and sequence of
Nature, 171, 737-738. chromosome replication in E. coli,
С чего начать Watson J.D., Crick F.H.C., 1953. J, Mol. Biol, 70, 549-566.
Kornberg A., 1979. Aspects of DNA Genetic implications of the structure of Ogawa T., Okazaki Т., 1980. Discontinu-
replication, Cold Spring Harbor Symp., deoxyribonucleic acid, Nature, 171, ous DNA replication, Ann. Rev. Bio-
Quant Biol., 43, 1-9. 964-967. chem., 49, 421-458.
Alberts В., Sternglanz R., 1977. Recent Kornberg A., 1960. Biological synthesis
excitement in the DNA replication of deoxyribonucleic acid, Science, 131, Структура ДНК
problem, Nature, 269, 655-661. 1503-1508. Cantor С.R., Schimmel P.R., 1980.
Fiddes J.G., 1977. The nucleotide Meselson M., Stahl F.W., 1958. The Biophysical Chemistry, Freeman.
sequence of a viral DNA, Sci. Amer., replication of DNA in Escherichia coli, [Имеется перевод: Кантор Ч., Шим-
237(6), 54-67. Proc. Nat. Acad. Sci., 44, 671-682. мел Р. Биофизическая химия. В 3-х
Hamilton H.О., 1979. Nucleotide Taylor J.H. (ed.), 1965. Selected Papers т. - М.: Мир, 1984.] (Гл. 3 и 6 в томе
sequense specificity of restriction endo- on Molecular Genetics, Academic Press. 1 и гл. 22-24 в томе 3 содержат пре-
nucleases, Science, 205, 455-622. (В этой книге содержатся классичес- восходный обзор, посвященный кон-
Nathans D., 1979. Restriction endo- кие статьи, упоминавшиеся в данной формации нуклеиновых кислот.)
nucleases, simian virus 40, and the new главе.)
genetics, Science, 206, 903-909. Суперспиральная ДНК
Bauer W.R., Crick F.H.C., White J.H., Определение последовательности ос- Bauer W.R., 1978. Structure and
1980. Supercoiled DNA, Sci. Amer., нований в ДНК reactions of closed duplex DNA, Ann.
243(1), 118-133. (Ясно и четко Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R., Rev. Biophys. Bioeng., 7, 287-313.
рассмотрена топология суперспи- 1977. DNA sequencing with chain- Crick F.H.C., 1976. Linking numbers
ральных ДНК.) terminating inhibitors, Proc. Nat. Acad. and nucleosomes, Proc. Nat. Acad. Sci.,
Sci., 74, 5463-5467. 73, 2639-2643. (Доступное введение
Книги Maxam A.M., Gilbert W., 1977. A new в проблему порядка зацепления, на-
Kornberg A., 1980. DNA Replication, method for sequencing DNA, Proc. Nat. пряжения и угла закручивания супер-
Freeman. (Выдающаяся монография, Acad. Sci., 74, 560-564. спиральной ДНК.)
читается с большим интересом.) Mizuuchi K., O'Dea M.H., Gellert M.,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1979. Белки, участвующие в репликации 1978. DNA gyrase: subunit structure
Replication and Recombination, Cold ДНК and ATPase activity of the purified
Spring Harbor Symposia of Wickner S.H., 1978. DNA replication enzyme, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,
Quantitative Biology, vol. 43. (Наибо- proteins of Escherichia coli, Ann. Rev. 5960-5963.
лее информативный сборник статей Biochem., 47, 1163-1191. Cozzarelli N.R., 1980. DNA gyrase and
по репликации, репарации и рекомби- Lehman I . R . , 1974. DNA ligase: struc- the supercoiling of DNA, Science, 207,
нации ДНК.) ture, mechanism, and function, Science, 953-960.
Bloomfield V.A., Crothers D.M., 186, 790-797.
Тinосо I., Jr., 1974. Physical Chemistry McHenry C., Kornberg A., 1977. DNA Репарация ДНК
of Nucleic Acids, Harper and Row. polymerase III holoenzyme of Hanawalt P.C., Cooper P.K.,
Davidson J.N., 1977. The Biochemistry Escherichia coli: purification and Ganesan A.K., Smith C.A., 1979. DNA
of the Nucleic Acids, Academic Press. resolution into subunits, J. Biol. Chem., repair in bacteria and mammalian cells,
Ts'o P.O.P., 1974. Basic Principles in 252, 6478-6484. Ann. Rev. Biochem., 48, 783-836.
Nucleic Acid Chemistry, vol. 1 and 2, Rowen L., Kornberg A., 1978. Primase, Lindahl Т., Ljungquist S., Siegert W.,
Academic Press. the dna G protein of Escherichia coli: an Nyberg B., Sperens В., 1977. DNA N-
enzyme which starts DNA chains, J. Biol. glycosidases. Properties of uracil-DNA
Возникновение основополагающих Chem., 253, 758-764. glycosidase from Escherichia coli, J. Biol.
концепций Kornberg A., Scott J.F., Bertsch L.L., Chem., 252, 3286-3294.
Avery О.Т., MacLeod С.M., 1978. ATP utilization by rep protein in Cleaver J.E., 1978. Xeroderma
McCarty M., 1944. Studies on the the catalytic separation of DNA strands pigmentosum. In: Stanbury J.B.,
chemical nature of the substance induci- at a replicating fork, J. Biol. Chem., 253, Wyngaarden J. В., Fredrickson D. S.
ng transformation of pneumococcal 3298-3304. (eds.), The Metabolic Basis of Inherited
types. Induction of transformation by Cozzarelli N.R., 1977. The mecha- Disease (4 th ed.), pp. 1072-1095,
a deoxyribonucleic acid fraction isolated nism of action of inhibitors of McGraw-Hill.
from Pneumococcus Type III, J. Exp. DNA synthesis, Ann. Rev. Biochem., 46,
Med., 79, 137-158. 641-668. Воспоминания и исторические очерки
Hershey A.D., Chase M., 1952. Indepen- Cairns J., Stent G.S., Watson J. D. (eds.),
dent functions of viral protein and 1966. Phage and the Origins of
nucleic acid in growth of bacteriophage,
Место начала репликации ДНК и на- Molecular Biology, Cold Spring Harbor
J. Gen. Physiol., 36, 39-56. правление репликации Laboratory. (Увлекательный сборник
Watson J.D., Crick F.H.C., 1953. Prescott D.M., Kuempel P. L., 1972. воспоминаний некоторых основопо-
Bidirectional replication of the ложников молекулярной биологии.)
Часть IV. chromosome in E. coli, Proc. Nat. Acad. Watson J.D., 1968. The Double Helix,
44 Информация Sci., 69, 2842-2845. Atheneum. (Живой рассказ об откры-
тии структуры ДНК и ее биологичес- Helix, University of Washington Press. of the Genetic Substance, MIT Press.
ких функциях, в котором проступает Portugal F.H., Cohen J.S., 1977. Judson H., 1979. The Eighth Day of
яркая личность автора.) [Имеется A Century of DNA: A History of the Creation, Simon and Schuster.
перевод: Уотсон Д. Двойная спи- Discovery of the Structure and Function
раль. - М.: Мир, 1969.]
Olby R., 1974. The Path to the Double

3. ДНК одного делеционного му-


Вопросы и задачи танта бактериофага λ имеет
1. Напишите комплементарные контурную длину 15 мкм вместо 17 мкм.
последовательности (в стан- Сколько пар оснований недостает у этого
дартной записи в направлении 5'—>3') для мутанта?
следующих последовательностей: 4. Какой результат получили бы
а) GATCAA, Меселсон и Сталь, если бы ре-
б) TCGAAC, пликация ДНК была консервативной? Ука-
в) ACGCGT, жите предполагаемое распределение моле-
г) ТАССАТ. кул ДНК после 1-й и 2-й генераций
2. Одна из цепей двухспиральной в случае консервативной репликации (т.е.
ДНК имеет следующий нуклео- когда родительская двойная спираль не
тидный состав (относительное молярное расходится).
содержание): [А] = 0,30, [G] = 0,24. 5. Зависит ли от видовой принад-
а) Что можно сказать о содержании [Т] лежности способность из-
и [С] в той же цепи? вестных ДНК-лигаз использовать для сое-
б) Что можно сказать о содержании [А], динения ДНК-цепей NAD + или АТР?
[G], [Т] и [С] в комплементарной цепи? Предположим, что обнаружена новая
ДНК-лигаза, нуждающаяся в каком-то
другом источнике энергии. Предположите
приемлемую с энергетической точки зре-
ния замену NAD + или АТР в этой реак-
ции.
6. ДНК-лигаза из Е. coli релакси-
рует суперспирализованную
кольцевую ДНК в присутствии AMP. В от-
сутствие АТР эта активность не проявляет-
ся. Каков механизм этой реакции и почему
он зависит от AMP?
7. На рис. 24.54 приведена схема
радиоавтографа геля с четырь-
мя дорожками фрагментов ДНК, образо-
вавшихся при химическом расщеплении.
32
ДНК содержала Р-метку на 5'-конце.
Какова последовательность этой ДНК?
Рис. 24.54. Схематическое изображение
радиоавтографа геля. Видны Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,
радиоактивные фрагменты, Wilson J. H., Benbow R. M., Hood L. Е.
образующиеся при специфиче- Biochemistry: A Problems Aproach,
ском расщеплении олигону- Benjamin, 1974, chs. 16, 17.
клеотидов.
ГЛАВА 25 шивается реактивом Фёльгена. Касперсон
обнаружил, что почти вся ДНК содержит-
Информационная ся в ядре, тогда как РНК находится боль-
шей частью в цитоплазме. К такому же
РНК и транскрипция выводу пришел Жан Браше (Jean Brachet),
который разделял клетки на ядерную и ци-
В этой главе мы рассмотрим выражение топлазматическую фракции и определял
в фенотипе (экспрессию) генетической ин- в них содержание ДНК и РНК. Более того,
формации, содержащейся в ДНК. Функция он обнаружил, что РНК в цитоплазматиче-
генов - кодирование синтезируемых в клет- ской фракции находится в составе малень-
ке белков. Однако сама ДНК не исполь- ких частиц и ассоциирована с белком. Бы-
зуется в качестве непосредственной ма- ло показано, что эти частицы, состоящие
трицы для синтеза белка. Роль таких из РНК и белка, служат местом синтеза
матриц выполняют молекулы РНК (рибо- белка. Теперь их называют рибосомы.
нуклеиновой кислоты). В норме поток гене-
тической информации в клетке идет в сле- 25.1. Структура РНК
дующем направлении: РНК, подобно ДНК, представляет собой
длинную неразветвленную молекулу, со-
стоящую из нуклеотидов, соединенных
фосфодиэфирными связями 3'—>5'. Число
нуклеотидов в молекуле РНК колеблется
В настоящей главе мы увидим, что неко- от всего лишь 75 до многих тысяч. Кова-
торые молекулы РНК играют роль проме- лентная структура РНК отличается от
жуточных переносчиков информации в син- ДНК в двух отношениях. Как указывает
тезе белка, тогда как другие молекулы само название, сахарный остаток
РНК являются частью аппарата белкового в РНК - рибоза, а не дезоксирибоза. Рибоза
синтеза. Затем мы рассмотрим синтез содержит 2'-гидроксильную группу, кото-
РНК, протекающий в соответствии с по- рой нет в дезоксирибозе. Другое различие
следовательностью ДНК-матрицы. Это - состоит в том, что одним из четырех осно-
процесс транскрипции, за которым следует ваний в РНК является урацил (U) - вместо
трансляция. При трансляции РНК-ма- тимина, содержащегося в ДНК. Как и ти-
трицы направляют синтез белков. Более мин, урацил может образовывать пару ос-
подробно этот вопрос рассматривается нований с аденином. Но в молекуле ураци-
в гл. 27. ла нет метильной группы, имеющейся
Участие РНК в синтезе белка казалось в молекуле тимина.
вероятным уже в 1940 г., за несколько лет
до того, как было показано, что ДНК - ма-
териал наследственности. Торбьёрн Кас-
персон (Torbjorn Caspersson) изучал рас-
пределение РНК и ДНК в отдельных
эукариотических клетках с помощью свето-
вой микроскопии. Он исходил из того фак-
та, что и РНК, и ДНК сильно поглощают
ультрафиолетовый свет с длиной волны
260 нм, но только ДНК интенсивно окра-

Часть IV.
46 Информация
Таблица 25.1. Молекулы РНК у Е. coli

Тип РНК Отно- Коэф- Масса, кДа


ситель- фици- Число
ное со- ент нукле-
держа- седи- отидов
ние, % мента-
ции,
S

Рибосомная 80 23 1,2•103 3700


(рРНК) 16 0,55•1 03 1700
5 3,6•101 120
Транспортная 15 4 2,5•101 75
(тРНК)
Информаци- 5 Гетерогенна
онная (мРНК)

Молекулы РНК имеют одноцепочечное


строение, за исключением РНК некоторых
вирусов. Поэтому нуклеотидный состав
РНК не подчиняется правилу комплемен-
тарности. Действительно, в большинстве
молекул РНК содержание аденина отли-
чается от содержания урацила, а содержа-
ние гуанина отличается от содержания ци-
тозина. Но молекулы РНК все-таки содер- Рис. 25.1. Структура части цепи РНК.
жат участки с двухцепочечной структурой,
которые образуют петли в виде шпилек
(рис. 25.2). В этих участках А спаривается 25.2. Клетки содержат три типа РНК:
с U, a G спаривается с С. Кроме того, рибосомную, транспортную и инфор-
G может образовывать пару оснований мационную
с U, но она менее прочна, чем GС-пара Клетки содержат три типа РНК
(разд. 27.6). Спаривание оснований (табл. 25.1). Информационная РНК (ее на-
в шпильках РНК часто несовершенно. Не- зывают также матричная РНК, отсюда
которые основания, расположенные мРНК) служит матрицей для синтеза бел-
в шпильке друг против друга, не компле- ка. Каждому работающему гену (или груп-
ментарны, и одно или несколько основа- пе генов) соответствует своя молекула
ний в одной из цепей могут выпетливаться мРНК. Следовательно, мРНК - крайне ге-
(выступать) из участка двойной спирали, терогенный класс молекул, у Е. coli сред-
чтобы облегчить спаривание других осно- няя длина молекулы мРНК составляет
ваний. Доля двухспиральных участков примерно 1,2 kb. Транспортная РНК
в различных РНК варьирует в широких (тРНК) переносит аминокислоты в активи-
пределах - в наиболее типичном случае до рованной форме к рибосомам, где они сое-
50% диняются пептидной связью в определен-

Рис. 25.2. РНК может складываться сама


на себя и образовывать двухс- 25. Информационная РНК
пиральные структуры. и транскрипция 47
Единица Сведберга (S) -
коэффициенты седиментации биологических макромолекул выражаются
в единицах Сведберга (сокращенно S); 1S = 10 - 1 3 с. (Сведберг - шведский
ученый, изобретатель ультрацентрифуги.)

ной последовательности, которую задает нии индуктора синтез данных ферментов


РНК-матрица. Для каждой из 20 амино- прекращался также быстро. Эти экспери-
кислот имеется по крайней мере одна раз- ментальные данные были несовместимы
новидность тРНК, Транспортная РНК со- с существованием стабильных матриц для
стоит примерно из 75 нуклеотидов (масса синтеза указанных ферментов. Отсюда Жа-
25 кДа). Это самые маленькие молекулы коб и Моно сделали вывод, что время
РНК. Рибосомная РНК (рРНК) - основной жизни посредника должно быть очень ко-
компонент рибосом, но пока ее роль в син- ротким. Затем они предположили, что он
тезе белка точно не установлена. В клетке должен обладать следующими свойствами.
Е. coli имеется три разновидности рРНК, 1. Посредник должен быть полинуклео-
называемые 23S-, 16S- и 5S-PHK соответ- тидом.
ственно их поведению при седиментации. 2.. Нуклеотидный состав предшественни-
В каждой рибосоме содержится по одной ка должен соответствовать нуклеотидному
молекуле каждой из этих трех разновидно- составу ДНК, которая его кодирует.
стей РНК. Из трех указанных типов РНК 3. Посредник должен быть весьма гете-
(мРНК, тРНК, рРНК) количественно пре- рогенным по размеру, так как гены (или
обладает рРНК. Затем идет тРНК, и мень- группы генов) различаются по длине. Жа-
ше всего в клетке содержится информа- коб и Моно высказали правильное предпо-
ционной РНК, на долю которой приходит- ложение, что три нуклеотида кодируют
ся всего лишь 5% всей РНК. одну аминокислоту, и вычислили, что
масса посредника должна быть не менее
25.3. Формулирование концепции 500 кДа.
информационной РНК 4. Посредник должен быть временно ас-
Концепция мРНК была сформулирована социирован с рибосомами - местом синтеза
Франсуа Жакобом и Жаком Моно белка.
(Francois Jacob, Jacues Monod) в классиче- 5. Посредник должен синтезироваться
ской статье, опубликованной в 1961 г. По- и распадаться очень быстро. Отсюда сле-
скольку в эукариотических клетках белки дует, что аналоги оснований, например
синтезируются в цитоплазме, а не в ядре, 5-фторурацил, должны включаться в по-
было очевидно, что должен существовать средник в течение нескольких минут.
какой-то химический посредник, коди- Для Жакоба и Моно было очевидно, что
руемый генами. Жакоб и Моно назвали известные в то время фракции РНК не
его структурным посредником. Какова удовлетворяют этим критериям. Рибосом-
природа этого промежуточного продукта? ная РНК, которую принято было считать
Важную роль в решении этого вопроса сы- матрицей для синтеза белков, была слиш-
грало проведенное ими исследование регу- ком гомогенна по размеру. Кроме того, ее
ляции синтеза белка у Е. coli (гл. 28). Неко- нуклеотидный состав был сходен у видов,
торые ферменты Е. coli, например фер- сильно различавшихся по нуклеотидному
менты, участвующие в поглощении и ис- составу ДНК. Более того, эта РНК была
пользовании лактозы, индуцибельны. Это стабильной, и 5-фторурацил включался
означает, что количество этих ферментов в нее очень медленно. Транспортная РНК
увеличивается более чем в 1000 раз в при- тоже не подходила на роль посредника по
сутствии индуктора (например, изопропил- тем же причинам. К тому же она слишком
тиогалактозида). Особенно показательна мала. Однако в литературе высказывалось
была кинетика индукции. Добавление ин- предположение о существовании третьего
дуктора уже через несколько минут вызы- типа РНК, который, по-видимому, удовле-
вало максимальный синтез ферментов, ка- творял всем критериям посредника.
тализирующих обмен лактозы. При удале- В клетках Е. coli, зараженных бактериофа-
гом Т2 (рис. 25.3), была обнаружена ранее
Часть IV. неизвестная фракция РНК подходящего
48 Информация размера с очень коротким временем жиз-
ни. Самое интересное, что нуклеотидный Как же происходит при заражении пере-
состав этой фракции РНК был близок ключение синтеза с одних белков на дру-
к составу вирусной ДНК, а не ДНК Е. coli. гие? Одна возможность состояла в том,
что фаговая ДНК программирует образо-
вание новых рибосом. Согласно этому
25.4. Экспериментальные данные предположению, гены определяют синтез
о существовании информационной специализированных рибосом, а каждая
РНК-посредника в синтезе белка рибосома может синтезировать белок
Правомочность гипотезы о короткоживу- только одного вида. Альтернативное пред-
щей РНК-посреднике, играющей роль положение, выдвинутое Жакобом и Моно,
переносчика информации при синтезе бел- состояло в том, что рибосомы - неспециа-
ка, была проверена вскоре после того, как лизированные структуры, которые полу-
гипотеза была сформулирована. Сидней чают генетическую информацию от гена
Бреннер, Франсуа Жакоб и Мэтью Месел- в виде нестабильной информационной
сон (Sydney Brenner, Francois Jacob, РНК (посредника). Эксперименты Бренне-
Matthew Meselson) провели эксперименты ра, Жакоба и Меселсона были спланиро-
на E. coli, зараженной бактериофагом Т2. ваны таким образом, чтобы можно было
Почти все белки, синтезирующиеся после выяснить, происходит ли после заражения
заражения, детерминируются генами фага. синтез новых рибосом или же новообразо-
Синтез этих белков не сопровождается уве- ванная РНК присоединяется к предсуще-
личением общего количества РНК. Однако ствовавшим рибосомам.
вскоре после заражения появляется минор- Бактерии выращивали в среде, содержав-
15 13
ная фракция РНК с коротким временем шей тяжелые изотопы ( N и С), заража-
жизни. Как уже говорилось выше, нуклео- ли фагом и немедленно переносили в сре-
тидный состав минорной фракции РНК ду, содержащую легкие изотопы (14N и
12
сходен с составом фаговой ДНК. Эта си- С). Рибосомы, синтезированные до
стема представлялась оптимальной для и после заражения, можно было разделить
проверки гипотезы посредника, поскольку центрифугированием в градиенте плотно-
в ней происходило быстрое переключение сти, так как их плотности различались
природы синтезируемого белка. Еще одно («тяжелые» и «легкие» соответственно;
преимущество состояло в том, что в зара- рис. 25.4). Новая РНК была помечена ра-
женных клетках не происходило синтеза диоактивными изотопами с помощью 32Р-
рРНК и тРНК. и 14С-урацила, а новый белок был помечен
изотопом 35S. В результате этих экспери-
ментов было установлено следующее.
1. Синтеза рибосом после заражения не
происходит, о чем свидетельствует отсут-
ствие «легких» рибосом.
2. РНК синтезируется после заражения.
Большая часть радиоактивно меченной
РНК обнаруживается в «тяжелом» рибо-
сомном пике. Итак, большая часть ново-
синтезированной РНК ассоциирована
с предсуществующими рибосомами. Допол-
нительные эксперименты показали, что во
время роста фага происходит быстрый
распад и ресинтез этой новой РНК.
3. Радиоактивный изотоп 35S временно
появлялся в «тяжелом» рибосомном пике,
из чего следует, что синтез новых белков
происходит на предсуществующих рибосо-
мах.
Рис. 25.3. Электронная микрофотогра- Эти эксперименты позволили сделать
фия клетки E. coli, зараженной
вирусами Т2. (Печатается с лю-
безного разрешения д-ра Lee 25. Информационная РНК
Simon.) и транскрипция 49
ной ДНК выше температуры плавления
она переходит в одноцепочечную форму.
При медленном охлаждении раствора эти
цепи реассоциируют и образуют двухспи-
ральную структуру, обладающую биологи-
ческой активностью. Мармур и Доти обна-
ружили также, что двухспиральные моле-
кулы образуются только в том случае,
если цепи ДНК происходят из организмов
одного вида или близкородственных ви-
дов. Это наблюдение подсказало Спигел-
ману, что в смеси одноцепочечной ДНК
и РНК должны образовываться гибриды
ДНК-РНК, если их последовательности
Рис. 25.4. Центрифугирование рибосом оснований комплементарны (рис. 25.5).
и РНК контрольных бактерий Схема эксперимента была следующей:
и бактерий, зараженных фагом 1. РНК, синтезированную после зараже-
Т2, в градиенте плотности. Ме- ния Е. coli фагом Т2 (Т2-мРНК), метили
ченная 32Р РНК, синтезирован- изотопом 32Р. В другом эксперименте
ная после заражения, попадает ДНК фага Т2 (Т2-ДНК) пометили изото-
3
в полосу рибосом, образо- пом Н.
ванных до заражения («тя- 2. Смесь Т2-мРНК и Т2-ДНК нагревали
желые» рибосомы). После за- до 100°С. В результате двухспиральная
ражения синтеза рибосом не ДНК расплавлялась и переходила в одно-
происходит. цепочечную форму. Этот раствор, содержа-
щий одноцепочечные РНК и ДНК, медлен-
но охлаждали до комнатной температуры.
3. Охлажденную смесь анализировали
следующий вывод: рибосомы - неспециали- методом центрифугирования в градиенте
зированные структуры, синтезирующие плотности. Образцы центрифугировали не-
в каждый данный момент тот белок, ко- сколько дней в бакет-роторе. Затем пласти-
торый закодирован в информационной РНК,
находящейся в данный момент в рибосо-
мах. Исследования незараженных бакте-
риальных клеток также показали, что ин-
формационная РНК служит звеном, пере-
носящим информацию от гена к белку.
Вскоре представление об информационной
РНК стало одним из основополагающих
в молекулярной биологии.

25.5. Опыты по гибридизации показали,


что информационная РНК комплементарна
кодирующей ее ДНК-матрице
В 1961 г. Сол Спигелман (Sol Spigelman)
разработал новый метод, названный гибри-
дизацией. Он должен был дать ответ на
следующий вопрос: комплементарна ли
последовательность оснований РНК, син-
тезированной после заражения фагом Т2,
последовательности оснований ДНК фага
Т2? Из работы Джулиуса Мармура и Пола
Доти (Julius Marmur, Paul Doty) было из-
вестно, что при нагревании двухспираль- Рис. 25.5. Если РНК и ДНК имеют ком-
плементарные последователь-
Часть IV. ности, может образоваться ги-
50 Информация брид РНК—ДНК.
ковые пробирки с образцами протыкали
снизу и собирали фракции по каплям для
дальнейшего анализа.
В результате были обнаружены три по-
лосы (рис. 25.6). Полоса с наибольшей
плотностью соответствовала одноцепочеч-
ной РНК. Вторая полоса соответствовала
двухспиральной ДНК. Третья располага-
лась вблизи от полосы ДНК и состояла из
двухцепочечных гибридных молекул
ДНК—РНК. Итак, Т2-мРНК образовыва-
ла гибрид с Т2-ДНК. В отличие от этого
Т2-РНК не гибридизовалась с ДНК мно-
гих бактерий и неродственных вирусов, да-
же если их нуклеотидный состав был подо-
Рис. 25.6. РНК, образовавшаяся после
бен Т2-ДНК. Последующие эксперименты заражения E. coli фагом Т2,
показали, что фракция мРНК из незара- комплементарна вирусной
женных клеток гибридизуется с ДНК
ДНК. В этих экспериментах по
именно того организма, из которого она
гибридизации РНК метили
была выделена, но не с ДНК нерод- 32
Р, а ДНК фага Т2 - 3Н. Рас-
ственных организмов. Эти убедительные пределение радиоактивности
эксперименты продемонстрировали, что
в градиенте плотности хлори-
последовательность оснований мРНК ком-
стого цезия показывает, что
плементарна последовательности ДНК-ма- большая часть РНК, синтези-
трицы. К тому же был разработан рованной после заражения, по-
мощный метод, с помощью которого мож-
падает в одну полосу с ДНК
но было исследовать поток генетической фага Т2. (Spiegelman S., Hybrid
информации в клетках и выяснять, сходны
nucleic acids, Sci. Amer., 1964.)
ли две молекулы нуклеиновой кислоты.

25.6. Рибосомные РНК и транспортные


РНК также синтезируются на
ДНК-матрице
Метод гибридизации был использован за-
тем, чтобы выяснить, синтезируются ли
рРНК и тРНК также на ДНК-матрицах.
Образование гибридов РНК—ДНК выяв-
ляли с помощью фильтров, а не центрифу-
гированием в градиенте плотности, так как
этот метод проще, чувствительнее и тре-
бует меньше времени. Одноцепочечные
РНК проходят через нитроцеллюлозный
фильтр, а двухспиральные ДНК и гибриды
РНК—ДНК задерживаются на фильтре.
РНК Е. coli пометили изотопом 32 Р и сме-
шали с немеченой ДНК Е. coli. Эту смесь
нагревали, медленно охлаждали и затем
отфильтровывали через нитроцеллюлозу.
Радиоактивность, задержанную на филь- Рис. 25.7. Электронная микрофотогра-
тре, просчитывали. Результаты экспери- фия РНК-полимеразы E. coli.
ментов не вызывали сомнений: гибриды (Печатается с любезного разре-
РНК—ДНК образовывались со всеми шения д-ра Robley Williams
рРНК (5S, 16S и 23S) и тРНК. Отсюда сле- и д-ра Michael Chemberlin.)
довало, что в геноме Е. coli имеются после-
довательности, комплементарные этим мо- 25. Информационная РНК
лекулам РНК. и транскрипция 51
Рис. 25.8. Механизм реакции элонгации Синтез РНК во многих отношениях
цепи, катализируемой РНК-по- подобен синтезу ДНК (рис. 25.8). Во-
лимеразой. первых, как будет вскоре показано более
подробно, синтез идет в направлении 5'—>
25.7. Все клеточные РНК синтезирует —>3'. Во-вторых, по-видимому, механизм
РНК-полимеразa элонгации сходен. Происходит нуклео-
Концепция мРНК стимулировала поиски фильная атака внутреннего фосфата оче-
фермента, который синтезирует РНК в со- редного нуклеозидтрифосфата 3'-ОН-груп-
ответствии с последовательностью ДНК- пой на конце растущей цепи. В-третьих,
матрицы. Стратегия эксперимента была движущая сила синтеза - гидролиз пиро-
такой же, как и при поиске ДНК-полиме- фосфата.
разы I. В 1960г. Джерард Хёрвиц и Сэ- Однако по некоторым важным особен-
мюэл Вейсс (Jerard Hurwitz, Samuel Weiss) ностям синтез РНК отличается от синтеза
независимо открыли такой фермент. Они ДНК. Во-первых, РНК-полимеразе не нуж-
назвали его РНК-полимеразой. Ферменту на затравка. Во-вторых, ДНК-матрица при
из клеток Е. соli (рис. 25.7) нужны были синтезе РНК полностью сохраняется, тог-
для синтеза РНК следующие компоненты. да как при синтезе ДНК она сохраняется
1. Матрица. Предпочтительная матри- лишь наполовину. В-третьих, РНК-полиме-
ца - двухцепочечная ДНК. Одноцепочечная раза, насколько известно, не обладает ни-
ДНК также может служить матрицей. Ни какими нуклеазными активностями.
РНК (как одноцепочечная, так и двухцепо- Все три типа клеточной РНК Е.
чечная), ни гибриды РНК—ДНК не могут coli - мРНК, тРНК и рРНК - синтезируют-
служить эффективными матрицами. ся одной РНК-полимеразой в соответствии
2. Активированные предшественники. Не- с инструкциями, заданными ДНК-матри-
обходимы все четыре рибонуклеозидтри- цей. В клетках млекопитающих имеет ме-
фосфата - ATР, GTP, UTP и СТР. сто разделение труда между несколькими
3. Двухвалентные ионы металлов. Фер- видами РНК-полимераз. Кроме того, необ-
мент активен в присутствии Mg 2+ или ходимо отметить, что некоторые вирусы
Mn 2 + . In vivo эту потребность фермента кодируют РНК-синтезирующие ферменты,
2+
удовлетворяет Mg . совершенно отличные от ферментов клет-
РНК-полимераза катализирует инициа- ки-хозяина. Таковы, например, РНК-поли-
цию и элонгацию цепей РНК. Фермент ка- мераза, кодируемая ДНК-содержащим фа-
тализирует следующую реакцию: гом Т7, и РНК-репликаза, кодируемая
(РНК)n остатков + Рибонуклеозидтрифос- РНК-содержащим фагом Qβ. Репликаза
фат (РНК)n + 1 остаток + PP i . фага Qβ является РНК-зависимой РНК-
полимеразой, так как она синтезирует
Часть IV. РНК не по ДНК-матрице, а по РНК
52 Информация (гл. 30). Клеточные же ферменты, синтези-
5'-GCGGCGACGCGCAGUUAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-3' мРНК
3'-CGCCGCTGCGCGTCAATTAGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA-5'
ДНК
5'-GCGGCGACGCGCAGTTAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTT-3'

Рис. 25.9. Последовательность основа- комплементарна матричной ДНК. Наибо-


ний мРНК комплементарна лее убедительный довод в пользу надежно-
последовательности матрич- сти копирования ДНК при транскрипции
ной ДНК. Показана часть по- получен при изучении последовательности
следовательности триптофано- оснований; оказалось, что последователь-
вого оперона. ность мРНК в точности комплементарна
последовательности матричной ДНК
(рис. 25.9).
рующие РНК, наоборот, представляют со-
бой ДНК-зависимые РНК-полимеразы. 25.9. Обычно в данном участке генома
транскрибируется только одна цепь ДНК
25.8. РНК-полимераза получает инструкции Транскрибируются ли обе цепи двухспи-
от ДНК-матрицы ральной матричной ДНК, или только од-
Подобно ДНК-полимеразам, описанным на? А priori кажется маловероятным, что
в предыдущей главе, РНК-полимераза ис- в одном и том же участке ДНК обе цепи
пользует информацию, содержащуюся кодируют функциональные белки. Один из
в ДНК-матрице. Первым доводом в поль- первых ответов на этот вопрос был полу-
зу этого утверждения послужили данные чен при использовании метода гибридиза-
о том, что нуклеотидный состав новосин- ции в опытах с Е. coli, зараженной фагом
тезированной РНК комплементарен соста- φХ174. Частицы фага φХ174 содержат
ву матричной цепи ДНК. Если в качестве одноцепочечную ДНК, которую называют
матрицы использовать синтетический по-
лидезоксирибонуклеотид poly(dT), содержа-
щий только остатки тимидиловой кислоты,
то в синтезируемую полирибонуклеотид-
ную цепь включается только один рибону-
клеозидтрифосфат - АТР. Продукт реак-
ции - полирибоаденилат [сокращенное обо-
значение poly(rA)]. Если в качестве ма-
трицы для РНК-полимеразы используется
сополимер с чередующимися основаниями
poly(dA-dT), то включаются UTP и АТР,
а в качестве продукта реакции образуется
poly(rA-rU). Нуклеотидный состав РНК,
синтезированной с использованием в каче-
стве матрицы одноцепочечной ДНК фага
φХ174, также свидетельствует о наличии
комплементарности между РНК-продук-
том и ДНК-матрицей (табл. 25.2). Экспери-
менты по гибридизации показывают, что
РНК, синтезированная РНК-полимеразой,

Таблица 25.2. Нуклеотидный состав РНК, синтезиро-


ванной на вирусной ДНК в качестве матрицы Рис. 25.10. Как показывает этот гибриди-
ДНК-матрица (плюс-цепь фага РНК-продукт
зационный эксперимент, толь-
φХ174) ко одна цепь РФ-ДНК фага
φХ174 используется в качестве
А 0.25 0,25 U матрицы при транскрипции.
Т 0,33 0,32 А
G 0,24 0,23 С
С 0,18 0,20 G 25. Информационная РНК
и транскрипция 53
Рис. 25.11. Электронная микрофотогра- φХ174 служит in vivo матрицей для тран-
фия, на которой виден процесс скрипции.
транскрипции. [Miller О. L., Точно так же только одна цепь таких ви-
Hamkalo В. A., Visualization of русов, как Т7, SP8 и α, транскрибируется in
RNA synthesis on chromosomes, vivo. В случае таких вирусов, как фаги Т4
Int. Rev. Cytol., 33, 1 (1972).] или λ, ситуация сложнее. В одних участках
генома матрицей служит одна цепь, в дру-
гих - другая. Такая же транскрипция с пере-
плюс-цепью. После того как плюс-цепь меной матрицы в различных группах генов
проникает в бактерию, синтезируется ком- происходит и в клетках Е. coli.
плементарная минус-цепь, и в результате
образуется кольцевая двухцепочечная мо- 25.10. РНК-полимераза Е. coli состоит из
лекула ДНК, называемая репликативной субъединиц
формой (РФ). Эта РФ-ДНК направляет РНК-полимераза Е. coli - очень большой
синтез мРНК, которая в свою очередь де- и сложный фермент. Масса целого фермен-
терминирует фаговые белки. Вскоре после та равна примерно 500 кДа. РНК-полиме-
заряжения E. coli фагом φХ174 в среду до- раза состоит из отдельных субъединиц
бавляли 32Р-фосфат; так получили ра- (табл. 25.3); это можно доказать, вызвав
диоактивную фаговую РНК. Ее выделили. диссоциацию фермента в концентрирован-
Кроме того, РФ-ДНК разделили на соста- ном растворе мочевины. Субъединичный
вляющие плюс- и минус-цепи, что нетруд- состав целого фермента, называемого го-
но сделать, поскольку они различаются по лоферментом,- α2ββ'σ. Как это видно из
нуклеотидному составу и, следовательно,
по плавучей плотности. Затем осуществили
Таблица 25.3. Субъединицы РНК-полимеразы E.coli
гибридизацию, с тем чтобы выяснить, ком-
плементарна ли новосинтезированная
мРНК плюс-цепи, или минус-цепи, или же Обозначение Число Масса, кДа .
обеим цепям. Был получен однозначный субъединицы субъединиц
результат: только минус-цепь РФ-ДНК
образовывала гибрид с меченой мРНК. α 2 40
Итак, только одна цепь РФ-ДНК фага β 1 155
β' 1 165
Часть IV. σ 1 95
54 Информация
рибонуклеазой, и определить в этих фраг-
ментах последовательность нуклеотидов.
Другой подход сводится к тому, чтобы ис-
следовать ряд мутантов с повышенной или
пониженной интенсивностью транскрипции
определенных генов. В результате таких
исследований было установлено, что про-
моторные участки состоят примерно из со-
рока пар оснований, что соответствует
фрагменту ДНК длиной примерно 140 А.
Как показал анализ различных промото-
ров Е. coli и фагов, функцию сигнала узна-
вания в основном выполняет последова-
тельность семи пар оснований, середина
которой находится на расстоянии пример-
но 10 нуклеотидов перед точкой, с которой
начинается кодирование мРНК (рис. 25.13).
Второй участок узнавания расположен на
Рис. 25.12. Электронная микрофотогра- расстоянии около 35 нуклеотидов перед
точкой начала мРНК; он также участвует
фия РНК-полимеразы-голо-
в первоначальном связывании РНК-поли-
фермента, связанного со мно-
меразы.
гими промоторными участка-
ми фрагмента ДНК фага Т7.
25.12. σ-Субъединица обеспечивает
[Williams R.C., Ргос. Nat. Acad.
узнавание промоторных участков РНК-
Sci., 74, 2313 (1977).]
полимеразой
Кор-фермент (α2ββ') РНК-полимеразы не
может начинать транскрипцию в промо-
последующего текста, после того как ини- торных участках. Для специфической ини-
циация синтеза РНК произошла, σ-субъе- циации необходим голофермент α2ββ'σ
диница отделяется от фермента. РНК-по-
Роль сигма-субъединицы была открыта
лимераза без σ-субъединицы называется
следующим образом. Если РНК-полимера-
минимальным ферментом или кор-фермен-
зу очищали хроматографией на колонке
том (α2ββ'). Каталитический участок РНК-
с фосфоцеллюлозой, то она была практи-
полимеразы находится в кор-ферменте.
Установлено, что β'-субъединица участвует
в связывании с ДНК-матрицей, а β-субъе-
диница - в связывании субстратов - рибону-
клеозидтрифосфатов. σ-Субъединица голо-
фермента участвует в выборе участка
инициации транскрипции.
Синтез РНК РНК-полимеразой Е. coli
происходит в три этапа, называемых
1) инициация, 2) элонгация и 3) термина-
ция. С этими процессами мы познакомим-
ся несколько ниже. Рис. 25.13. Промоторные последователь-
ности лактозного (А), галактоз-
25.11. Транскрипция инициируется на промо- ного (Б) и триптофанового (В)
торных участках матричной ДНК оперонов E.coli, фагов λ (Г)
Транскрипция начинается в определенных и φХ174 (Д) и вируса SV-40 (Е).
участках матричной ДНК, называемых Предполагаемая область го-
промоторами. Как РНК-полимераза нахо- мологии, так называемая по-
дит эти участки? Один из подходов к ре- следовательность Прибнова
шению этой проблемы состоит в том, (Pribnow), показана зеленым.
чтобы выделить те фрагменты, которые
голофермент РНК-полимеразы защищает 25. Информационная РНК
от расщепления панкреатической дезокси- и транскрипция 55
обе цепи фаговых ДНК-матриц, тогда как
голофермент транскрибирует асимметрич-
но одну цепь, как он это делает in vivo.
Сигма-субъединица обеспечивает специ-
4
фическую инициацию, снижая в 10 раз
сродство РНК-полимеразы к ДНК, не
содержащей промоторов. Кроме того, сиг-
ма-субъединица активирует узнавание про-
моторных последовательностей РНК-поли-
меразой. Наконец, сигма-субъединица уча-
Рис. 25.14. Разделение РНК-полимеразы ствует в раскрывании двойной спирали
на σ-субъединицу и кор-фер- ДНК, так чтобы одна из цепей могла слу-
мент (минимальный фермент; жить матрицей. При связывании голофер-
α2ββ') на колонке с фосфоцел- мента РНК-полимеразы расплетается при-
люлозой. мерно один виток спирали ДНК. Так
происходит подготовка фермента к обра-
зованию первой фосфодиэфирной связи но-
чески лишена активности при использова-
вой цепи РНК.
нии в качестве матрицы ДНК фага Т4, но После того как начинается синтез новой
сохраняла активность в опытах с ДНК из
цепи РНК, сигма-субъединица отделяется
тимуса теленка. Наряду с этим та же РНК-
от голофермента. Кор-фермент продол-
полимераза, очищенная центрифугирова- жает транскрибировать матрицу ДНК. Та-
нием в градиенте концентрации глицерола,
ким образом, функция голофермента —
была, напротив, весьма активна на обеих
поиск промотора и инициация, а функция
матрицах. Из этого наблюдения можно
кор-фермента - элонгация. Отделившаяся
было сделать вывод, что в препарате РНК-
сигма-субъединица присоединяется к дру-
полимеразы, очищенной на фосфоцеллю-
гой молекуле кор-полимеразы, чтобы уча-
лозе, не хватает какого-то фактора. Так оно
ствовать в инициации нового цикла тран-
и было (рис. 25.14). Активность фермента,
скрипции.
очищенного на фосфоцеллюлозе, значи- Инициация новых цепей РНК регули-
тельно увеличивается при добавлении дру- руется многими способами. Некоторые
гой фракции, элюирующейся с колонки. промоторные последовательности обеспе-
Этот стимулирующий фактор сам по себе чивают высокую эффективность инициа-
не обладает каталитической активностью. ции, другие менее эффективны. Кроме то-
Он был назван сигма (σ)-фактором. После- го, эффективность инициации регулируется
дующие эксперименты показали, что фер-
белками, которые связываются с самим
мент, очищенный на фосфоцеллюлозе,
промоторным участком или рядом с ним.
лишен σ-субъединицы, тогда как фермент,
Репрессоры блокируют транскрипцию,
очищенный в глицероле, содержит ее. Та-
препятствуя связыванию РНК-полимеразы,
ким образом, препарат, проявлявший мак-
а факторы положительной регуляции спо-
симальную активность при использовании собствуют инициации, облегчая связывание
в качестве матрицы ДНК фага Т4, предста- РНК-полимеразы. Эти важные регуля-
влял собой голофермент α2ββ'σ а кор-фер-
торные механизмы мы рассмотрим под-
мент α2ββ' был не в состоянии транскриби- робнее в гл. 28.
ровать эту ДНК. Добавление σ-субъеди-
ницы к кор-ферменту приводило к рекон-
струкции вполне активного голофермента. 25.13. Цепи РНК начинаются с pppG или
Кор-фермент обладал способностью тран- рррА
скрибировать ДНК тимуса теленка, так Большинство новосинтезированных цепей
как эта матрица содержит много одноце- РНК содержат своего рода ярлычок, ко-
почечных разрывов. РНК, синтезированная торый показывает, с чего начался их син-
кор-полимеразой in vitro, не соответствует тез. Новые цепи РНК имеют строго опре-
транскриптам, образующимся in vivo. деленную структуру 5'-конца: молекула
В частности, кор-фермент транскрибирует начинается либо с рррА, либо с pppG. В от-
личие от синтеза ДНК затравка в этом
Часть IV. случае не нужна. Цепи РНК могут обра-
56 Информация зовываться de novo.
в инкубационную смесь. Таким образом,
32
Р включается в молекулу РНК в начале
синтеза, а не в конце. Следовательно, рост
цепи РНК идет в направлении 5 ' — > 3 ' , как
при синтезе ДНК.
Кор РНК-полимеразы движется вдоль
цепи матричной ДНК в направлении 3'—>
—>5', так как матричная цепь антипарал-
Этот ярлычок на 5'-конце был открыт
лельна новосинтезированной цепи ДНК.
двумя способами. Было обнаружено, что
Одна и та же молекула РНК-полимеразы
цепи РНК включают 32Р, если инкуба-
синтезирует весь транскрипт - иными сло-
ционная смесь содержит меченный по
вами, транскрипция процессивна. По мере
γ-атому 32Р-АТР. Очевидно, что включен-
того как расплетается очередной участок
ная метка должна быть локализована на
ДНК, транскрибированный участок восста-
конце, так как только α-атом фосфора ну-
навливает свою двухспиральную конфор-
клеозидтрифосфата может участвовать
в образовании внутренних фосфодиэ- мацию. Максимальная скорость элонгации
составляет примерно 50 нуклеотидов
фирных мостиков РНК. Кроме того, при
щелочном гидролизе новосинтезированной в секунду.
Необходимо подчеркнуть, что РНК-по-
РНК образуются продукты трех типов: ну-
клеозиды, нуклеозид-2'-монофосфаты (или лимераза не обладает нуклеазной актив-
нуклеозид-3'-монофосфаты) и нуклеозид-
тетрафосфаты (рис. 25.15). Если в ка-
честве субстрата использовали γ-32Р-АТР,
образовывался аденозин-3'-фосфат-5'-три-
фосфат. γ-Атом фосфора этого нуклео-
зидтетрафосфата содержал метку. Анало-
гичный результат был получен с γ-32P-GTP.
Однако, если взять γ-меченный СТР или
UTP, радиоактивность не включается.
Следовательно, новообразованная цепь
РНК имеет трифосфатную группу на
5'-конце и свободную ОН-группу на 3'-конце.

25.14. Цепи РНК синтезируются


в направлении 5'—>3'
В каком направлении синтезируется РНК?
В направлении 5'—>3' или 3'—>5'? Два
противоположных механизма роста цепи
проиллюстрированы на рис. 25.16. При ро-
сте в направлении 5'—>3' трифосфатный
конец образуется в начале роста цепи,
а при росте 3'—>5' трифосфатный конец
появляется с последним включенным
остатком. Кинетика включения радиоак-
тивности в РНК, синтезированную из
γ-32P-GTP (или АТР), указывает, какая из
этих возможностей имеет место. Если в ка-
честве субстрата использовать γ-32P-GTP,
то отношение включения 32 Р к общему
включению нуклеотидов в продукт дости-
гает максимума очень быстро после сме- Рис. 25.15. Продукты щелочного гидроли-
шивания компонентов, а затем постепенно за цепи РНК, меченной с по-
снижается во времени. При этом общая ра- мощью γ-32Р-АТР.
диоактивность уже помеченной РНК не
снижается при последующем добавлении 25. Информационная РНК
большого избытка нерадиоактивного GTP и транскрипция 57
Рис. 25.16. Предполагаемое положение той области (рис. 25.17). Следовательно,
32
Р-метки в случае роста в на- РНК-транскрипт этой области самоком-
правлении 5'—>3' и 3'—>5'. На- плементарен, а это значит, что он способен
блюдаемое в действительности к спариванию оснований, приводящему
положение метки показывает, к образованию структуры шпильки
что РНК синтезируется в на- (рис. 25.18). Кроме того, новообразованные
правлении 5'—>3'. цепи РНК кончаются несколькими остат-
ками U, которые кодируются серией осно-
ваний А в АТ-богатой области ДНК-ма-
трицы. Одна или несколько подобных
ностью. В отличие от ДНК-полимеразы структурных особенностей заставляют
РНК-полимераза не проверяет правильно- РНК-полимеразу задержаться, сделать
сти новообразованной полинуклеотидной паузу, когда она сталкивается с таким сиг-
цепи. В связи с этим надежность тран- налом. В некоторых участках терминации
скрипции значительно ниже, чем надеж- новообразованные цепи РНК высвобо-
ность репликации. Частота ошибок при ждаются без участия дополнительных бел-
синтезе РНК составляет примерно одну ков. В других местах для терминации цепи
ошибку на 10 4 —10 5 нуклеотидов, что в 105 необходимо участие белка ρ (ро).
раз выше, чем при синтезе ДНК. Гораздо
более низкую надежность синтеза РНК
клетка обходит тем, что с одного гена син- 25.16. Белок ρ участвует в терминировании
тезируется много копий РНК-транскрип- транскрипции
тов. Тот факт, что терминирование транскрип-
ции в некоторых участках происходит
25.15. Матричная ДНК содержит стоп-сиг- с участием белка ρ, подтверждается сле-
налы для транскрипции дующими данными: молекулы РНК, син-
Терминирование транскрипции регулирует- тезированные in vitro в присутствии белка
ся так же тонко, как и инициирование. ρ, короче молекул, полученных в его отсут-
В матричной ДНК имеются стоп-сигналы, ствие. Например, РНК, синтезированная на
которые были расшифрованы путем срав- ДНК фага fd в присутствии белка ρ, имеет
нения различных последовательностей ос- коэффициент седиментации 10S, тогда как
нований в этих участках. Все они имеют РНК, синтезированная в отсутствие бел-
одну общую особенность: вслед за GC-бо- ка ρ,- 23S. Дополнительные сведения о дей-
гатой областью перед участком термина- ствии белка ρ были получены при добавле-
ции располагается АТ-богатая последова- нии этого фактора терминации в инкуба-
тельность. Отличительная особенность ционную смесь через различные промежут-
терминирующих последовательностей — ки времени после начала синтеза РНК.
симметрия второго порядка этой GC-бога- Если белок ρ добавляли через несколько
секунд, через 2 и 10 мин после инициации,
Часть IV. получали РНК с коэффициентами седимен-
58 Информация тации 13, 17 и 23S соответственно. Этот ре-
терминации, не требующий белка ρ (дает
23S-PHK). Следовательно, специфическая
терминация может происходить и в отсут-
ствие белка ρ. Однако белок ρ выявляет
дополнительные сигналы терминации, ко-
торые сама по себе РНК-полимераза узна-
вать не может.
Каким образом белок ρ вызывает терми-
нацию синтеза РНК по достижении опре-
деленных сигналов терминации? Одна из
возможностей состоит в том, что этот бе-
лок-тетрамер с массой 200 кДа - садится
на РНК и движется по направлению к мо-
лекуле РНК-полимеразы, останавливая ее
на участке терминации. Согласно этой мо-
дели, белок ρ вытесняет РНК-полимеразу
с 3'-конца РНК, что приводит к высвобож-
дению РНК-транскрипта. Интересно отме-
тить, что при терминировании транскрип-
ции белок ρ гидролизует АТР.
Как можно было предвидеть, термини-
рование транскрипции некоторых генов
контролируется. В ходе дальнейшего изло-
жения мы увидим, что бактериофаг λ син-
тезирует белки-антитерминаторы, обеспе-
чивающие возможность транскрипции
и экспрессии некоторых генов (разд. 28.11),
У Е. coli действует система регуляции с ис-
пользованием специализированных терми-
нирующих сигналов, называемых атте-
нюаторами, для обеспечения пищевых по-
требностей клетки (разд. 28.9).

Рис. 25.17. Последовательность ДНК,


соответствующая 3'-концу
trp-мРНК E.coli. Последова-
тельности оснований, пока-
занные желтым цветом, обла-
Рис. 25.18. Последовательность основа-
дают симметрией второго по-
рядка относительно оси, обо- ний 3'-конца мРНК, транскри-
значенной зеленым цветом. бированной с триптофанового
оперона E.coli. Возможно обра-
зование стабильной структуры
зультат свидетельствует о том, что матри- шпильки.
ца содержит но крайней мере три участка
терминации, чувствительных к белку ρ (они 25. Информационная РНК
дают 10S-, 13S- и 17S-PHK), и один участок и транскрипция 59
Рис. 25.19. Влияние фактора ρ на размер Второй тип процессинга - присоединение
транскрибируемых РНК. нуклеотидов к концам некоторых РНК.
Например, последовательность ССА при-
соединяется к 3'-концам молекул тРНК.
25.17. Многие молекулы РНК которые еще не обладают этой конце-
после транскрипции расщепляются вой последовательностью. У эукариот к
и химически модифицируются 3'-концу большинства молекул мРНК
Образование функционально активных мо- присоединяется длинная последователь-
лекул РНК (процессинг) продолжается пос- ность poly(A), а метилированный нуклео-
ле завершения транскрипции. У прокариот тид G (так называемый «колпачок», или
молекулы транспортных и рибосомных «кеп») - к 5'-концу (разд. 29.22).
РНК образуются путем расщепления и хи-
Модификации оснований и рибозных
мической модификации определенных ново- остатков представляют собой третий тип
синтезированных цепей РНК. Например, процессинга. У эукариот одна 2'-гидрок-
у E.coli три вида молекул рибосомных
сильная группа примерно на сто рибозных
РНК и одна молекула транспортной РНК остатков в рРНК ферментативно метили-
вырезаются из первичного РНК-тран- руется за счет S-аденозилметионина.
скрипта, который, кроме того, содержит У бактерий в рРНК метилируются не
спейсерные (разграничивающие) участки остатки рибозы, а основания. Особенно ин-
(рис. 25.20). Другие транскрипты содержат тересны необычные основания, которые
по несколько различных видов тРНК или встречаются во всех молекулах тРНК
несколько копий одной и той же тРНК. (разд. 27.3). Они образуются путем фер-
Нуклеазы, которые расщепляют и укорачи-
вают эти предшественники рРНК и тPHK,
действуют с высокой точностью. Напри-
мер, рибонуклеаза Р образует правильные
5'-концы всех молекул тРНК в клетке Е.
coli. Рибонуклеаза III вырезает предше-
ственники 5S-, 16S- и 23S-pPHK из первич-
ного транскрипта, расщепляя опреде-
ленные связи в двухспиральных шпи-
лечных областях. Молекулы мРНК у про-
кариот, наоборот, практически не претер-
певают модификации. Более того, многие
из них транслируются еще до того, как за-
канчивается их транскрипция. В то же вре-
мя некоторые вирусные мРНК (например, ментативной модификации обычных рибо-
мРНК фага Т7) расщепляются рибонуклеа- нуклеотидов, входящих в состав предше-
зой III раньше, чем начинается трансляция. ственника тРНК. Например, псевдоуриди-
лат и риботимидилат образуются путем
Часть IV. модификации уридиловых остатков после
60 Информация транскрипции.
транскрипцию совершенно различным пу-
тем. Рифамицин, образуемый бактериями
Streptomyces, и его полусинтетическое про-
изводное рифампицин специфически инги-
бируют инициацию синтеза РНК. Эти ан-
тибиотики не предотвращают связывания
РНК-полимеразы с ДНК-матрицей. Ри-
фампицин препятствует образованию пер-
вой фосфодиэфирной связи в цепи РНК.
При этом антибиотик практически не
влияет на элонгацию цепи. Столь высокая
избирательность ингибирующего действия
делает рифампицин ценным инструментом
в молекулярно-биологических исследова-
ниях. Например, его можно использовать
для подавления инициации новых цепей
РНК, не затрагивая транскрипции тех це-
пей, синтез которых уже начался. Ми-
шенью для рифампицина, видимо, служит
У эукариот все транскрипты подвер- β-субъединица РНК-полимеразы. Были вы-
гаются интенсивному процессингу. делены мутанты Е. coli, устойчивые к ри-
Расщепление и модификация предшествен- фампицину (так называемые rif-r-му-
танты). В некоторых из них электрофоре-
ников рРНК и тРНК напоминают соответ-
ствующие процессы у прокариот. Удиви- тическая подвижность β-субъединицы из-
тельное отличие состоит в том, что мРНК менена.
Механизм действия актиномицина D (со-
эукариот образуется путем расщепления
большого транскрипта и последующего сра-
щивания (сплайсинга) получающихся при
этом фрагментов. Это явление мы рассмо-
трим в одной из следующих глав
(разд. 29.21). У эукариот транскрипция
и трансляция происходят в различных ком-
партментах клетки. По всей вероятности,
процессинг РНК играет ключевую роль
в регуляции транспорта мРНК, рРНК
и тРНК из ядра в цитозолъ.

25.18. Антибиотики - ингибиторы транскрип-


ции: рифамицин и актиномицин
Антибиотики - очень интересные молекулы,
так как многие из них представляют собой держащего полипептиды антибиотика, про-
весьма специфические ингибиторы биоло- дуцируемого микроорганизмом Streptomy-
гических процессов. Актиномицин и рифа- ces) совершенно отличен от механизма дей-
мицин - два антибиотика, ингибирующих ствия рифампицина. Актиномицин D проч-
но связывается с двухспиральной ДНК и
за счет этого подавляет ее активность
в качестве матрицы для синтеза РНК.
Он состоит из двух идентичных цикли-
ческих пептидов, соединенных феноксазо-
новой системой колец (рис. 25.22). Состав
Рис. 25.20. При расщеплении этого пер- этих циклических пептидов необычен: они
вичного транскрипта обра- содержат саркозин, метилвалин и D-валин.
зуются молекулы 5S, 16S и 23S Кроме того, в их молекуле имеется эфир-
рРНК и одна молекула тРНК.
Спейсерные участки закра- 25. Информационная РНК
шены желтым цветом. и транскрипция 61
ра образования новых РНК как в прока-
риотических, так и в эукариотических клет-
ках.
Недавно структура кристаллического
комплекса одной молекулы актиномицина
с двумя молекулами дезоксигуанозина бы-
ла изучена на уровне атомного разрешения
(рис. 25.23). В этом комплексе феноксазо-
новое кольцо актиномицина зажато между
двумя гуаниновыми кольцами. Один из
циклических пептидов расположен над фе-
ноксазоновым кольцом, другой - под ним.
Каждый из этих пептидов образует
сильные водородные связи с 2-аминогруп-
пой гуанинового остатка. Между антибио-
тиком и нуклеозидами осуществляется
много энергетически выгодных вандер-
ваальсовых взаимодействий. Важная осо-
бенность этого комплекса состоит в том,
что он почти симметричен. Ось симметрии
второго порядка проходит вдоль линии,
Рис. 25.21. Пространственная модель соединяющей средние атомы О и N фенок-
структуры актиномицина D. сазонового кольца. Конформация всего
Феноксазоновое кольцо обо- комплекса показывает, что актиномицин
значено красным цветом, ци- узнает в ДНК последовательность основа-
клические пептиды - желтым. ний GpC. Обратите внимание, что если
(По рисунку, любезно пред- в одной цепи ДНК имеется последователь-
оставленному д-ром Henry ность 5'GpC3', то в комплементарной цепи
Sobell.) последовательность будет 3'CpG5'. По-ви-
димому, актиномицин интеркалирует
ная связь между гидроксильной группой в ДНК между двумя GC-парами основа-
треонина и карбоксильной группой метил- ний и взаимодействует с остатками G в ос-
валина. новном таким же образом, как и в ком-
Актиномицин D прочно связывается плексе с динуклеотидом. Согласно этой
с двухспиральной ДНК, но не с одноцепо- модели, циклические пептидные остатки
чечными ДНК или РНК, двухспиральной локализованы в малой бороздке спирали
РНК или РНК-ДНК-гибридами. Кроме ДНК. Главная особенность этой модели
того, связывание актиномицина с ДНК за- состоит в том, что симметрия молекулы
метно усиливается с увеличением содержа- актиномицина соответствует симметрии
ния остатков гуанина. Спектроскопические определенной последовательности в ДНК1.
и гидродинамические исследования ком-
плексов актиномицина D с ДНК свиде- 25.19. Разработаны совершенные методы
тельствуют о том, что феноксазоновое определения последовательности
кольцо актиномицина проникает в ДНК нуклеотидов в РНК
между двумя соседними парами основа- Высокая разрешающая способность мето-
ний. Такой способ связывания называется да гель-электрофореза дает возможность
интеркаляцией (рис. 25.23). При низких быстро определять последовательности ну-
концентрациях актиномицин D ингибирует клеотидов как в молекулах РНК, так и
транскрипцию, не оказывая сколько-нибудь
существенного влияния на репликацию 1
Изложенная точка зрения на структуру ком-
ДНК. На синтез белка непосредственно ак- плекса актиномицина D с ДНК не является об-
тиномицин также не влияет. Благодаря щепризнанной. Существует и другая гипотеза,
этому актиномицин D широко использо- согласно которой актиномицин не интеркали-
вался в качестве специфического ингибито- рует в ДНК, а связывается в малой бороздке,
причем структура комплекса актиномицина D
с динуклеотидом GpC не отражает структуры
Часть IV, его комплексов с протяженными молекулами
62 Информация ДНК. - Прим. перев.
Рис. 25.22. Структура актиномицина D. тарной ДНК. Но как получить комплемен-
в молекулах ДНК. Для этого 3'- или 5'-ко- тарные фрагменты ДНК? Один из мето-
нец цепи РНК метят радиоактивной груп- дов состоит в следующем. С помощью
пой. Затем меченую цепь частично расще- рестрикционных эндонуклеаз фрагменти-
пляют по одному из четырех оснований, руют большие молекулы ДНК. Затем ме-
тодом гибридизации идентифицируют ре-
чтобы получить набор фрагментов. Специ-
фическое (или избирательное) расщепление стрикционные фрагменты, содержащие по-
можно провести с помощью ферментов, следовательность, комплементарную ис-
специфичных к определенному основанию следуемой РНК. В другом случае компле-
ментарную ДНК синтезируют фермента-
эндонуклеаз (табл. 25.4). Например, рибо-
нуклеаза Т1 гидролизует РНК с 3'-стороны тивно по РНК-матрице с помощью обрат-
ной транскриптазы из опухолеродных ви-
остатков G. Кроме того, РНК можно спе-
русов (разд. 30.19). Именно так была рас-
цифически расщепить с помощью химиче- шифрована полная последовательность 576
ской модификации одного из четырех осно- нуклеотидов мРНК, колирующей β-цепь
ваний. Затем остов расщепляют в месте,
гемоглобина человека.
где расположено модифицированное осно-
вание. После этого четыре набора фраг-
ментов разделяют гель-электрофорезом Заключение
и последовательность оснований РНК чи- Поток генетической информации в нор-
тают непосредственно с радиоавтографа мальных клетках происходит в направле-
(рис. 25.24), как и в случае ДНК нии: ДНК —> РНК —> белок. Синтез РНК
(разд. 24.28). Эти подходы позволяют лег- по ДНК-матрице называется транскрип-
ко определять в молекулах РНК последо- цией, а синтез белка по РНК-матрице -
вательность 100-200 нуклеотидов. трансляцией. Существует три типа моле-
Другая стратегия сводится к тому,
чтобы определять последовательность ну- 25. Информационная РНК
клеотидов не в самой РНК, а в комплемен- и транскрипция 63
Таблица 25.4. Ферменты, используемые при определении последовательности нуклеотндов в РНК 1)

Фермент Тип активности Субстрат Продукты

Рибонухлеаза T1 Эндо- и экзонуклеаза


Панкреатическая рибонукле- Эндо- и экзонуклеаза
аза
Рибонуклеаза U2 Эндо- и экзонуклеаэа

Рибонуклеаза I Эндо- и экзонуклеаза


(из P. polycephalum) N = A, G, U, но не С
Щелочная фосфатаза (из Е. соli) Фосфатаза

Фосфодиэстepaзa из селезен- Экзонуклеаза


ки крупного рогатого скота

Фосфодиэстераза змеиного Экзонуклеаза


яда
Полинуклеотидкиназа Киназа

1)
В эту таблицу необходимо внести еще один фермент - РНК-лигазу. С его помощью осуществляется
включение метки в 3'-концы РНК: —XpY + pCp —> XpYpCp (pCp содержит 32Р-метку).- Прим. перев.

Рис. 25.23. Предполагаемая структура ся с малой бороздкой спирали


комплекса актиномицина D ДНК. Между актиномицином
с ДНК. Феноксазоновое коль- D и соседними гуанинами воз-
цо актиномицина (показано никает несколько водородных
красным цветом) интеркали- связей. Ось симметрии субъе-
рует между двумя GС-парами диниц актиномицина D совпа-
ДНК (показаны синим цветом). дает с осью симметрии сахаро-
Циклические пептиды актино- фосфатного остова и последо-
мицина D (желтые) связывают- вательности оснований ДНК.
(По рисунку, любезно пред-
Часть IV. оставленному д-ром Henry
64 Информация Sobell.)
чаются среди мРНК; они могут содержать
более 5000 нуклеотидов. Последователь-
ность нуклеотидов в длинных цепях РНК
можно определить, расщепляя их и разде-
ляя фрагменты гель-электрофорезом.
Все клеточные РНК синтезирует РНК-
полимераза в соответствии с последова-
тельностью ДНК-матрицы. Активиро-
ванными промежуточными продуктами
служат рибонуклеозидтрифосфаты. Синтез
РНК, как и синтез ДНК, происходит в на-
правлении 5'—>3'. РНК-полимераза отли-
чается от ДНК-полимеразы тем, что не
нуждается в затравке и не обладает нук-
леазными активностями. Еще одно отли-
чие состоит в том, что ДНК-матрица при
синтезе РНК полностью сохраняется, тог-
да как при синтезе ДНК она сохраняется
наполовину. РНК-полимераза Е. coli имеет
субъединичную структуру α2ββ'σ и массу,
достигающую 500 кДа. Кор-фермент имеет
состав α2ββ'. Сигма-субъединица увеличи-
вает скорость и специфичность транскрип-
ции, так как она обеспечивает узнавание
РНК-полимеразой сигналов начала тран-
скрипции в матричной ДНК. Связывание
РНК-полимеразы с такими промоторными
участками вызывает локальное расплета-
ние матрицы, что создает условия для
образования первой фосфодиэфирной свя-
зи. Цепи РНК начинаются с pppG или
рррА. После инициации синтеза новой це-
пи сигма-субъединица отделяется от голо-
Рис. 25.24. Радиоавтограф фрагмента фермента. Терминация транскрипции так
5S-PHK дрожжей. 3'-конец по- же тонко регулируется, как и инициация.
мечен радиоактивной меткой. Матричная ДНК содержит стоп-сигналы
Четыре дорожки соответ- транскрипции. Некоторые из этих сигналов
ствуют расщеплению по остат- узнает белок ρ. Некоторые специфические
кам G, А, С и U. На геле можно ингибиторы могут блокировать транскрип-
прочитать последовательность цию. Например, антибиотик рифампицин
5'-CGAAACUCAGGUGCUG- ингибирует инициацию синтеза РНК, а ак-
CAAUC-3'. [Peattie D. А., Ргос. тиномицин D блокирует элонгацию РНК.
Nat. Acad. Sci., 76, 1762 (1979).] Многие молекулы РНК подвергаются по-
сле транскрипции расщеплению и химиче-
ской модификации (например, метили-
руются). У прокариот молекулы тРНК
и рРНК подвергаются интенсивному про-
кул РНК: информационная РНК (мРНК), цессингу, а молекулы мРНК почти не пре-
транспортная РНК (тРНК) и рибосомная
терпевают модификаций. У эукариот все
РНК (рРНК). Все эти РНК одноцепо-
транскрипты сильно модифицируются.
чечные. Транспортная РНК и рибосомная
РНК содержат протяженные двухспи-
ральные участки, которые образуются при
складывании цепи в шпильки. Самыми ма-
ленькими молекулами РНК являются
тРНК; они содержат около 75 нуклеоти- 25. Информационная РНК
дов. Самые длинные молекулы РНК встре- и транскрипция 65
РЕКОМЕНДУЕМАЯ Инициирование транскрипции Wu A.M., Platt T., 1978. Transcription
ЛИТЕРАТУРА Hayashi M., Hayashi M.N., termination: nucleotide sequence at 3'
С чего начать Spiegelman S., 1963. Restriction of in end of tryptophan operon in
Miller О. 1973. The visualization of vivo genetic transcription to one of the Escherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci.,
genes in action, Sci. Amer, 228(3), complementary strands of DNA, Proc. 75, 5442-5446.
34-42. Nat. Acad Sci., 50, 664-672.
Spiegelman S., 1964. Hydrid nucleic Taylor K., Hradecna Z., Szybalski W., Антибиотики - ингибиторы синтеза
acids, Sci. Amer., 210(5), 48-56. 1967. Asymmetric distribution of the РНК
Chamberlin M.J., 1976. RNA transcribing regions on the com- Goldberg J.H., Friedman P.A., 1971.
polymerase: an overview. In: Losick R. plementary strands of coliphage Antibiotics and nucleic acids, Ann.
and Chamberlin M. (eds.), RNA λ DNA, Proc. Nat. Acad. Sci., Rev. Biochem., 40, 775-810.
Polymerase, pp. 17-67, Cold Spring 57, 1618-1625. Sobell H.M., 1974. How actinomycin
Harbor Laboratory. Burgess R.R., Travers A.A., Dunn J.J., binds to DNA. Sci. Amer., 231(2),
Открытие информационной РНК Bautz E.K.F., 1969. Factor stimulating 82-91.
Jacob F., Monod J., 1961. Genetic transcription by RNA polymerase,
regulatory mechanisms in the synthesis Nature, 221, 43-46. (Открытие сигма- Процессинг РНК
of proteins, J.Mol.Biol., 3, 318-356. фактора.) Perry R.P., 1976. Processing of RNA,
Brenner S., Jacob F., Meselson M., Gilbert W., 1976. Starting and stopping Ann. Rev. Biochem., 45, 605-630.
1961. An unstable intermediate sequences for the RNA polymerase. In: Steitz J.A., Young R.A., 1978.
carrying information from genes to Losick R. and Chamberlin M. (eds.), Complementary sequences 1700
ribosomes for protein synthesis, RNA Polymerase, pp. 193-205, Cold nucleotides apart from a ribonuclease
Nature, 190, 576-581. Spring Harbor Laboratory. III cleavage site in Escherichia coli
Hall B.D., Spiegelman S., 1961. Reznikoff W.S., Abelson J . N . , 1978. ribosomal precursor RNA, Proc. Nat.
Sequence complementarity of T2-DNA The lac promoter. In: Miller J. H. and Acad. Sci., 75, 3593-3597.
and T2-specific RNA, Proc. Nat. Acad. Reznikoff W. S. (eds.), The Operon, Altman S., 1978. Biosynthesis of tRNA.
Sci., 47, 137-146. pp. 221-243, Cold Spring Harbor In: Atlman S. (ed.), Transfer RNA,
РНК-полимераза Laboratory. (Сопоставляются 29 про- pp. 48-77, MIT Press.
Losick R., Chamberlin M. (eds.), 1976. моторных последовательностей.)
RNA Polymerase, Cold Spring Harbor Определение последовательности ос-
Laboratory. (Книга содержит ряд Терминирование транскрипции нований в РНК
превосходных статей.) Adhya S., Gottesman M., 1978. Control Peattie D.A., 1979. Direct chemical
Chamberlin M.J., 1974. The selectivity of transcription termination, Ann. Rev. method for sequencing RNA, Proc.
of transcription, Ann. Rev. Biochem., Biochem., 47, 967-996. Nat. Acad. Sci., 76, 1760-1764.
43, 721-776. Das A., Merril C., Adhya S., 1978. Simoncsits A., Brownlee G.G.,
Travers A., 1976. RNA polymerase Interaction of RNA polymerase and Brown R.S., Rubin J.R., Guilley H.,
specificity and the control of growth, rho in transcription termination: 1977. New rapid gel sequencing meth-
Nature, 263, 641-646. coupled ATPase, Proc. Nat. Acad. Sci., od for RNA, Nature, 269, 833-836.
75, 4828-4832.

Вопросы и задачи 4. Каким образом кордицепин


(3'-дезоксиаденозин) блокирует
1. Сравните ДНК-полимеразу I синтез РНК?
и РНК-полимеразу Е. coli по 5. Какие продукты должны полу-
каждому из следующих свойств. читься при частичном гидроли-
а) Субъединичная структура. зе олигорибонуклеотида
б) Активированные предшественники. 5'-pGCAGUACUGUC-3'
в) Направление элонгации цепи. следующими ферментами:
г) Нуклеазные активности. а) панкреатической рибонуклеазой,
д) Сохранение матрицы. б) рибонуклеазой Т1,
е) Потребность в затравке. в) рибонуклеазой U2,
ж) Энергетика реакции элонгации. г) рибонуклеазой I из Physarum!
2. Напишите последовательность 6. Исчерпывающий гидролиз оли-
молекулы мРНК, синтезиро- горибонуклеотида панкреатиче-
ванной на матричной цепи ДНК со сле- ской рибонуклеазой дает следующие про-
дующей последовательностью: дукты: Ср 2Up, AGCp и GAAUp. Гидролиз
того же олигонуклеотида рибонуклеазой
5'-ATCGTACCGTTA-3'. T1 дает AAUp, UAGp и CCUGp. Какова
его последовательность?
3. РНК легко гидролизируется Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,
щелочью, а ДНК нет. Почему? Wilson J.H., Benbow R.M., Hood L.E.
Biochemistry: A Problem Approach, ens. 16,
17 Benjamin, 1974, chs. 16,17.
ГЛАВА 26 Все подобные попытки закончились не-
удачей. Физико-химические соображения
Генетический код и также не дают никаких оснований счи-
тать это предположение правдопо-
зависимость между добным.»
генами и белками Крик отметил, что РНК не имеет вы-
пуклых гидрофобных поверхностей, позво-
В главе 25 была описана роль информа- ляющих отличить валин от лейцина и изо-
ционной РНК в качестве посредника ме- лейцина, и не содержит соответствующим
жду геном и его полипептидным продук- образом расположенных заряженных
том. В настоящей главе мы рассмотрим групп, чтобы различать положительно
дальнейший поток информации от гена и отрицательно заряженные боковые цепи
к белку. В центре внимания находится ге- аминокислот. Затем Крик предлагает прин-
нетический код, связывающий последова- ципиально иной механизм для узнавания
тельность оснований ДНК (или соответ- мРНК:
ствующего транскрипта) с последователь- «РНК - это прежде всего последователь-
ностью аминокислот в белке. Код универ- ность участков, способных образовывать
сален для всех организмов. Он восхищает водородные связи. Поэтому независимо
своей простотой. Три основания, соста- от того, что именно связывается с мат-
вляющие кодон, детерминируют одну ами- рицей специфичным образом, связыва-
нокислоту. Кодоны считываются последо- ние, очевидно, происходит путем образо-
вательно молекулами транспортных РНК вания водородных связей. Следователь-
(тРНК), играющих при синтезе белка роль но, естественно предположить, что ами-
адаптеров. Полная расшифровка генети- нокислоты переносятся к матрице адап-
ческого кода в 60-х годах - одно из вы- торными молекулами и что именно
дающихся достижений современной био- адаптор соответствует РНК. В простей-
логии. шем случае потребуется 20 адаптеров,
по одному на каждую аминокислоту».
26.1. Транспортная РНК - адапторная Эта новаторская гипотеза вскоре стала
молекула в синтезе белка доказанным фактом. Роль адаптера в бел-
Мы уже видели, что мРНК служит матри- ковом синтезе играет тРНК. Структура
цей для синтеза белка. Каким образом она этих замечательных адапторных молекул
осуществляет соединение аминокислот и реакции, в которых они участвуют, рас-
в правильном порядке? В 1958 г. Фрэнсис сматриваются подробно в следующей гла-
Крик (Francis Crick) писал: ве. Здесь же достаточно отметить, что
«Одно из первых предположений, до- в тРНК имеются место прикрепления ами-
вольно наивных, состояло в том, что нокислот и участок узнавания матрицы
РНК будет принимать конфигурацию, (рис. 26.1 и 26.2). Молекула тРНК перено-
способную образовать двадцать раз- сит определенную аминокислоту в активи-
личных «полостей», по одной для боко- рованной форме к месту синтеза белка.
вой цепи каждой из двадцати аминокис- Карбоксильная группа аминокислоты свя-
лот. Если бы это было так, можно было зана эфирной связью с 3'-гидроксильной
бы попробовать проиграть эту задачу
в обратном направлении, т.е. найти не-
обходимую конфигурацию РНК, пы- 26. Генетический код.
таясь воссоздать форму этих полостей. Зависимость гены-белки 67
или 2'-гидроксильной) группой рибозного
остатка, расположенного на 3'-конце цепи
тРНК. Во время синтеза белка связанная
аминокислота может перемешаться с 2'- на
3'-гидроксильную группу и обратно. При-
соединение аминокислоты к тРНК с обра-
зованием аминоацил-тРНК катализируется
особым ферментом, называемым аминоа-
цил-тРНК—синтетазой (или активирую-
щим ферментом). Эта реакция этерифика-
ции идет за счет энергии АТР. Для каждой
из 20 аминокислот имеется по крайней ме-
ре одна специфическая синтетаза. Участок
узнавания матрицы в тРНК представляет
собой последовательность из трех основа- Рис. 26.1. Присоединение аминокислоты
ний, называемую антикодоном (рис. 26.2). (показана красным цветом)
Антикодон тРНК узнает кодон, т. е. ком- к молекуле тРНК. Аминокис-
плементарную последовательность из трех лота связана эфирной связью
оснований в мРНК. с 3'-гидроксильной группой
концевого аденозина РНК.
Молекула тРНК, несущая ко-
26.2. Аминокислоты кодируются группами
валентно привязанную амино-
из трех оснований, начиная со строго
кислоту, называется аминоа-
определенной точки
цил-тРНК или «нагруженная»
Генетический код связывает последова-
тРНК, а тРНК без аминокис-
тельность оснований в ДНК (или в со-
лоты - «ненагруженная».
ответствующих транскриптах) и последова-
тельность аминокислот в белках. К 1961 г.
благодаря экспериментам Фрэнсиса Крика,
Сиднея Бреннера (Francis Crick, Sydney
Brenner) и других исследователей были
установлены следующие свойства генетиче-
ского кода.
1. Чему равно кодирующее отношение?
Поскольку в ДНК имеется четыре вида ос-
нований, то при кодировании одной ами-
нокислоты одним основанием могло бы
кодироваться всего лишь четыре амино-
кислоты. При кодировании одной амино-
кислоты двумя основаниями кодировалось
бы 16 аминокислот (4•4=16), а при коди-
ровании тремя основаниями - 64 аминокис-
лоты (4•4•4 = 64). Белки состоят из двад-
цати аминокислот основного набора. Из
этого несложного подсчета было очевидно,
что для кодирования одной аминокислоты,
видимо, необходимы три или более осно-
ваний. Генетические эксперименты показа-
ли, что на самом деле одну аминокислоту
кодирует группа из трех оснований. Эта
группа оснований называется кодоном.
2. Является ли код перекрывающимся?
В случае непрерывающегося триплетного Рис. 26.2. Схематическое изображение
кода каждая группа из трех оснований ко- аминоацил-тРНК. Показаны
участок прикрепления амино-
Часть IV. кислоты и антикодон (участок
68 Информация узнавания матрицы).
дирует только одну аминокислоту, тогда Первые две аминокислоты в этой полипеп-
как в случае полностью перекрывающегося тидной цепи будут нормальными, но
триплетного кода АБВ кодирует первую остальная последовательность оснований
аминокислоту, БВГ-вторую, ВГД-третью будет прочитана неправильно, так как в ре-
и т.д. зультате делеции Ж произошел сдвиг рамки
Эту дилемму удалось решить путем считывания. Теперь предположим, что
определения последовательности амино- между Е и Ж добавилось основание Ш:
кислот в мутантах. Предположим, что ос-
нование В мутировало в В'. Если код не
перекрывается, изменится только одна
аминокислота. При полностью перекры-
вающемся коде мутация В в В' приведет
к изменению аминокислот 1, 2 и 3. Изуче-
ние последовательности аминокислот бел-
ка оболочки мутантов вируса табачной мо- Эта вставочная мутация также нарушает
заики показало, что у этих мутантов рамку считывания, начиная с кодона ами-
измененной обычно оказывалась только нокислоты 3. В действительности генетиче-
одна аминокислота. Напомним также, что ские исследования вставочных и деле-
как уже говорилось при обсуждении ано- ционных мутантов позволили выяснить
мальных гемоглобинов в гл. 5, и в этом многие свойства генетического кода,
случае у большинства мутантов происхо- 4. Как уже было сказано выше, суще-
дило изменение только одной аминокис- ствует 64 возможных триплета оснований
лоты. Отсюда был сделан вывод, что гене- и 20 аминокислот. Соответствует ли ка-
тический код не перекрывается: ждой из 20 аминокислот только один три-
плет, или некоторые аминокислоты коди-
руются более чем одним триплетом? Гене-
тические исследования показали, что боль-
шинство из 64 триплетов кодируют амино-
кислоты. В последующих биохимических
3. Как происходит правильное считыва- исследованиях было установлено, что 61
ние группы из трех оснований? A priori од- триплет из 64 кодирует определенные ами-
на из возможностей состоит в том, что нокислоты. Таким образом, для большин-
одно из четырех оснований (оно обозначе- ства аминокислот имеется более одного
но Q) служит «запятой» между группами кодового слова. Другими словами, генетиче-
по три основания: ский код вырожден.
. . . QAБBQГДEQЖЗИQКЛMQ. . .
26.3. Расшифровка генетического кода:
синтетические РНК могут служить
Оказалось, что это не так. Последователь- информационными РНК
ность оснований читается последователь- Каково соотношение между 64 видами ко-
но, начиная со строго определенной точки: довых слов и 20 аминокислотами? В прин-
ципе на этот вопрос можно получить пря-
мой ответ, если сравнить последователь-
ность аминокислот в каком-либо белке
с соответствующей последовательностью
оснований его гена или мРНК. Однако
в 1961 г. этот подход был совершенно не-
Запятых в коде нет. Предположим, что
доступен, так как о последовательностях
в результате мутации произошла делеция
оснований в генах и молекулах мРНК ни-
основания Ж:
чего не было известно. Тогда казалось, что
проблема генетического кода не может
быть решена в близком будущем, но вне-
запно ситуация изменилась. Маршалл Ни-

26. Генетический код.


Зависимость гены-белки 69
ренберг (Marshall Nirenberg) обнаружил, Ниренберга была бесклеточная система
что добавление полиуридилата [ p o l y ( U ) ] синтеза белка, зависящая от добавления
в бесклеточную систему синтеза белка при- мРНК.
водит к синтезу полифенилаланина. Оче- Другим важнейшим компонентом в этом
видно, poly(U) выполнил функцию инфор- эксперименте был синтетический полири-
мационной РНК. Первое кодовое слово бонуклеотид poly(U). Poly(U) синтезирова-
было расшифровано: UUU кодирует фени- ли с помощью полинуклеотид-фосфори-
лаланин Этот замечательный эксперимент лазы - фермента, открытого в 1955 г. Ма-
указал путь к полной расшифровке генети- рианной Грюнберг-Манаго и Северо Очоа
ческого кода. (Marianne Grunberg-Manago, Severo Ochoa).
Обсудим более подробно этот эпо- Этот фермент катализирует синтез полири-
хальный эксперимент. В качестве двух ос- бонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфа-
новных компонентов были использованы тов:
бесклеточная система, активно синтезиро-
(РНК) n + Рибонуклеозиддифосфат
вавшая белок, и синтетический полирибо-
(РНК) n + 1 + Pi.
нуклеотид, сыгравший роль информацион-
ной РНК. Бесклеточная система синтеза Полинуклеотид-фосфорилаза и РНК-поли-
белка была получена из Е. coli следующим мераза катализируют совершенно раз-
образом. Бактериальные клетки осторожно личные реакции. В приведенной реакции
разрушали, перемалывая с тонко измель- активированными предшественниками слу-
ченным порошком окиси алюминия, чтобы жат рибонуклеозиддифосфаты, а не три-
получить клеточный сок. Затем обрывки фосфаты. Продукт реакции - ортофосфат,
клеточной стенки и клеточной мембраны а не пирофосфат. Следовательно, равнове-
удаляли центрифугированием. В результа- сие в реакции не может быть сдвинуто
те получали экстракт, содержащий ДНК, вправо в результате гидролиза пирофосфа-
мРНК, тРНК, рибосомы, ферменты и дру- та. В самом деле, in vivo равновесие сдви-
гие клеточные компоненты. При добавле- нуто в сторону распада РНК, а не ее син-
нии ATP, GTP и аминокислот в этой бес- теза. Принципиальное отличие состоит
клеточной системе синтезировался белок. в том, что полинуклеотид-фосфорилаза не
По крайней мере одна из добавленных использует матрицы. Состав РНК, синте-
аминокислот была радиоактивной, что да- зированной этим ферментом, определяется
вало возможность обнаружить ее включе- соотношением рибонуклеотидов в инкуба-
ние в белок. Эту смесь инкубировали при ционной смеси, а последовательность близ-
37°С примерно в течение 1 ч. Затем доба- ка к случайной. Благодаря этому полину-
вляли трихлоруксусную кислоту, чтобы клеотид-фосфорилаза оказалась ценней-
остановить реакцию и осадить белки. При шим инструментом в экспериментах по
этом свободные аминокислоты оставались расшифровке генетического кода. Напри-
в надосадочной фракции. Осадок промыва- мер, poly(U) синтезировали, инкубируя
ли и просчитывали его радиоактивность, в присутствии фермента раствор высокой
определяя таким образом сколько меченой
аминокислоты включилось в новосинтези-
рованный белок. Важная особенность этой
системы состоит в том, что синтез белка
можно остановить добавлением дезоксири-
бонуклеазы, разрушающей матрицы для
синтеза новых мРНК. Поскольку та
мРНК, которая уже имелась в смеси ко
времени добавления дезоксирибонуклеазы,
лабильна, синтез белка можно прекратить
в течение нескольких минут. Затем Нирен-
берг обнаружил, что синтез белка возобно-
вляется при добавлении неочищенной Рис. 26.3. Синтез белка в бесклеточной
фракции мРНК. Таким образом, в руках системе останавливается через
несколько минут после доба-
вления дезоксирибонуклеазы
Часть IV. и возобновляется при добавле-
70 Информация нии мРНК.
концентрации UDP. Сополимеры двух ри- Таблица 26.1. Ожидаемая встречаемость триплетов
бонуклеотидов, например U и А, со слу- в случайном сополимере U (0,76) и G (0,24)
чайной последовательностью готовили,
также инкубируя UDP и АТР с этим Триплет Вероятность Относи-
ферментом. тельная
Различные синтетические рибонуклео- встречае-
тиды вводили в бесклеточную систему син- мость, %
теза белка и измеряли включение меченно-
го 14С L-фенилаланина. Результаты оказа-
лись поразительными: UUU 0,76•0,76•0,76=0,439 100
UUG 0,75•0,24•0,24 = 0,139 31,6
UGU 0,76•0,24•0,76 = 0,139 31,6
GUU 0,24•0,76•0,76 = 0,139 31,6
Добавленный 14
С, имп./мин UGG 0,76•0,24•0,24 = 0,0438 10,0
полинуклеотид GUG 0,24•0,76•0,24 = 0,0438 10,0
GGU 0,24•0,24•0,76 = 0,0438 10,0
GGG 0,24•0,24•0,24 = 0,0138 3,1
Контроль 44
Poly(A) 50 различных триплетов: UUU, UUG, UGU,
Poly(С) 38
Poly(U) GUU, UGG, GUG, GGU и GGG. Относи-
39800
тельную частоту этих триплетов можно
легко вычислить, исходя из молярного со-
Тот же эксперимент был проделан отношения U и G в сополимере. Оно со-
с различными 14С-аминокислотами в ка- ставляло 0,76:0,24 (табл. 26.1). Относи-
ждой инкубационной смеси. Оказалось, что тельное включение различных аминокис-
poly(А) вызывает синтез полилизина, лот в присутствии этой матрицы приведе-
a poly(С) - синтез полипролина. Так было но в табл. 26.2. В наибольшей степени
расшифровано три кодовых слова: включался, как и можно было предпола-
гать, фенилаланин, так как триплет UUU
встречался чаще всего. Затем шли валин,
лейцин и цистеин. Уровень их включения
Кодовое слово Аминокислота составлял чуть больше трети от включения
фенилаланина, что соответствует вычис-
ленной частоте встречаемости триплетов,
UUU Фенилаланин содержащих два U и одно G. Включение
ААА Лизин других аминокислот было очень низким.
ССС Пролин Отсюда был сделан вывод, что валин, лей-
цин и цистеин кодируются кодонами, содер-

Кодовое слово GGG невозможно было Таблица 26.2. Включение аминокислот в присутствии
расшифровать таким же образом, потому случайного сополимера U (0,76) и G (0,24)
что poly (G) не работает в качестве ма-
трицы. Возможно, это объясняется тем,
что он образует трехцепочечную спираль- Аминокислота Относитель- Состав соот-
ную структуру. Полирибонуклеотиды, ное включе- ветствующего
образующие протяженные участки с упоря- ние, % кодона
доченной структурой, не эффективны в ка-
честве матриц для синтеза белка.
Фенилаланин 100 UUU
Валин 37 2U, 1G
26.4. Состав кодонов многих аминокислот Лейцин 36 2U, 1G
был определен с помощью сополимеров Цистеин 35 2U, 1G
в качестве матриц Триптофан 14 1U, 2G
Для дальнейшего изучения генетического Глицин 12 1U, 2G
кода были использованы в качестве ма-
триц полирибонуклеотиды, состоящие из
оснований двух типов. Например, слу- 26. Генетический код.
чайный сополимер U и G содержит восемь Зависимость гены-белки 71
жащими 2U и 1G, а триптофан и глицин С помощью методов органической хи-
кодируются кодонами, которые содержат мии и биохимии были синтезированы все
1U и 2G. 64 тринулеотида. Для каждого тринуклео-
Эксперименты того же типа проводили тида было проверено связывание молекул
и с другими случайными сополимерами, тРНК, соответствующих всем 20 амино-
а именно с UA, UC, АС и AG, а также кислотам. Например, было показано, что
с UGC, AGC, UAC и UAG. Таким образом pUpUpG стимулирует связывание только
в лабораториях Ниренберга и Очоа был лейциновой тРНК, pUpGpU - только ци-
определен состав кодонов, соответствую- стеиновой тРНК, a pGpUpU - связывание
щих каждой из 20 аминокислот. только валиновой тРНК. Отсюда был сде-
лан вывод, что кодоны UUG, UGU
и GUU соответствуют лейцину, цистеину
26.5. Тринуклеотиды способствуют
и валину соответственно. С несколькими
связыванию определенных молекул тРНК
кодонами не было получено избирательно-
с рибосомами
го связывания какой-либо тРНК, тогда как
При использовании смешанных сополиме-
с несколькими другими связывалось более
ров в качестве матриц удалось установить
одной тРНК. Для большинства кодонов
состав кодонов, соответствующих опреде-
были получены вполне четкие результаты.
ленным аминокислотам, но не их последо-
В общем этот простой и элегантный под-
вательность (кроме UUU, ААА и ССС).
ход позволил расшифровать около 50 ко-
Как уже говорилось, валин кодируется
донов.
триплетом из 2U и 1G. Какой же это три-
плет: UUG, UGU или GUU? Ответ на
этот вопрос был получен с помощью двух 26.6. Еще один инструмент расшифровки
совершенно различных экспериментальных кода - сополимеры с определенной
подходов: во-первых, с использованием последовательностью
синтетических полирибонуклеотидов с упо- Примерно в то же время Гобинду Коране
рядоченной последовательностью и, во- (Gobind Khorana) удалось синтезировать
вторых, с помощью зависимого от кодона полирибонуклеотиды с определенной по-
специфического связывания молекул тРНК вторяющейся последовательностью. Соче-
с рибосомами. тая методы органической химии и фермен-
В 1964 г. Ниренберг установил, что три- тативные методы, он синтезировал ряд
нуклеотиды способствуют связыванию сополимеров с повторяющейся последова-
определенных молекул тРНК с рибосомами тельностью из двух, трех и четырех осно-
в отсутствие синтеза белка. Например, до- ваний. Рассмотрим, к примеру, стратегию
бавление pUpUpU вызывает связывание синтеза poly(GUA). Этот упорядоченный
фенилаланиновой тРНК, а рАрАрА значи- сополимер имеет последовательность
тельно увеличивает связывание лизиновой
GUAGUAGUAGUAGUAGUAGUAGUA...
тРНК, как и рСрСрС - связывание проли-
новой тРНК. Динуклеотиды не стимули-
руют связывания тРНК с рибосомами. Эти Прежде всего Корана синтезировал с по-
работы показали, что тринуклеотид (как мощью методов органической химии два
и триплет в мРНК) специфически связы- комплементарных дезоксирибонуклеотида
вается с определенной молекулой тРНК, по девять нуклеотидов длиной: d(TAC)3 и
для которой он является кодовым словом. d(GTA) 3 . Затем эти два олигонуклеотида
Был разработан простой и быстрый тест были использованы в качестве матрицы
на связывание: связанные с рибосомами для синтеза длинных цепей ДНК из четы-
молекулы тРНК задерживаются на нитро- рех дезоксинуклеозидтрифосфатов под дей-
целлюлозном фильтре, а несвязанные мо- ствием ДНК-полимеразы I. Ни один оли-
лекулы тРНК проходят через фильтр. Для гонуклеотид в отдельности не был эффек-
того чтобы определить, какие именно мо- тивной матрицей. Если же присутствовали
лекулы тРНК садятся на фильтр, исполь- оба олигонуклеотида, то d(TAC)3 служил
зовали молекулы тРНК, несущие опреде- матрицей для синтеза poly(dGTA), a
ленную аминокислоту, меченную 14С. d(GTA) 3 - для синтеза poly(dTAC). Эти
длинные комплементарные ДНК обра-
зовывали двухспиральные молекулы. Сле-
72 дующим шагом было получение длинных
содержит кодоны двух видов - АБА и БАБ.
Поэтому полипептидный продукт должен
представлять собой чередующуюся после-
довательность из двух аминокислот (сокра-
щенно обозначенных ак1 и ак 2 ):

Стоит ли на N-конце полипептидного про-


дукта aк1 или ак2, зависит от того, на-
чинается ли рамка считывания с А или с Б.
Если в качестве матрицы использовали
poly(UG), то синтезировался полипептид
из чередующихся валина (Val) и цистеина
(Суs):
UGU|GUG|UGU|GUG|UGU|GUG
Рис. 26.4. Цепь этой двухспиральной ма-
тричной ДНК, которая должна Этот результат однозначно доказывал три-
транскрибироваться, опреде- плетность кода и показывал, что один из
ляется набором рибонуклео- триплетов - UGU или GUG - кодирует ци-
зидтрифосфатов в инкубацион- стеин, а другой - валин. В сочетании
ной смеси. с данными по связыванию тРНК было
очевидно, что UGU кодирует цистеин,
a GUG - валин. В присутствии некоторых
полирибонуклеотидных цепей с последова- чередующихся сополимеров из двух осно-
тельностью, соответствующей poly (dTAC) ваний происходил синтез следующих поли-
и poly(dGTA). Для этого дуплекс пептидов:
poly(dTAC): poly(dGTA) использовали
в качестве матрицы для РНК-полимеразы.
Цепь ДНК для транскрипции можно вы- Матрица Продукт Смысл кодонов
брать, добавляя три подходящих рибону-
клеозидтрифосфата. Если в инкубацион-
ную смесь добавить GTP, UTP и АТР, го Poly(UC) Poly(Ser-Leu)
на матричной цепи poly(dTAC) синтези-
руется полирибонуклеотидный продукт
Poly(AG) Poly(Arg-Gln)
poly(GUA). Другая цепь не транскриби-
руется, так как не хватает одного из необ-
ходимых субстратов - СТР. Если же доба- Poly(AC) Poly(Thr-His)
вить СТР, UTP и АТР, то на другой
матричной цепи синтезируется poly(UAC).
Итак, органический синтез и вслед за ним
матричный синтез с помощью ДНК-поли- Рассмотрим теперь матрицу, состоящую
меразы и РНК-полимеразы позволили син- из повторяющейся последовательности
тезировать два длинных полирибонуклеоти- трех оснований, поли(АБВ). Если рамка
да со строго определенной повторяющейся считывания начинается с А, образующийся
последовательностью оснований (рис. 26.4). полипептид должен содержать аминокис-
Эти регулярные сополимеры были ис- лоту только одного вида, кодируемую три-
пользованы в качестве матриц в бесклеточ- плетом АБВ:
ной системе синтеза белка. Рассмотрим не-
которые результаты такого эксперимента.
Сополимер, состоящий из чередующейся
последовательности двух оснований - А
и Б:
АБА | БАБ | АБА | БАБ | АБА |. . .
26. Генетический код.
Зависимость гены-белки 73
Если рамка считывания начинается с Б, липептидов. Причина этого явления станет
синтезирующийся полипептид должен со- ясна чуть ниже.
держать другую аминокислоту, кодируе- Корана синтезировал также ряд сополи-
мую триплетом БВА: меров, состоящих из повторяющегося те-
трануклеотида, например poly(UAUC). На
этой матрице шел синтез полипептида
с повторяющейся последовательностью
Tyr-Leu-Ser-Ile независимо от рамки
считывания:

Если же рамка считывания начинается с В, UAU|CUA|UCU|AUC|UAU|CUA|UCU|AUC


должен образовываться полипептид треть- Туr—Leu—Ser—Ilе—Туr—Leu—Ser—Ilе
его типа, содержащий аминокислоту, коди-
руемую триплетом ВАБ: Отсюда можно было сделать вывод
о смысле четырех кодонов.
Совершенно иной результат был полу-
чен при использовании в качестве матрицы
poly(GUAA). Единственными продуктами
были ди- и трипептиды. Почему не было
более длинных цепей? Объясняется это
тем, что один из триплетов, встречающих-
ся в этом сополимере, а именно UAA, ко-
Таким образом, предполагаемые про- дирует не аминокислоту, а терминацию
дукты - три различных гомополипептида. синтеза белка:
Действительно, именно такой результат
получался в случае большинства матриц, GUA | AGU | AAG | UAA | GUA|A. . .
состоящий из повторяющейся последова- Val—Ser —Lys— Стоп
тельности трех нуклеотидов. Например, на
poly(UUC) синтезировались полифенилала- На матрице poly(AUAG) также получались
нин, полисерин и полилейцин. Этот резуль- только ди- и трипептиды, так как UAG-
тат в сочетании с результатами других экс- второй сигнал терминации цепи:
периментов показывал, что UUC кодирует AUA|GAU|AGA|UAG|AUA|G. . .
фенилаланин, UCU-серин и CUU-лейцин.
Полипептиды, которые синтезировались на Ile — Asp—Arg—Стоп
других матрицах этого типа, приведены
в табл. 26.3. Обратите внимание, что Посмотрим теперь снова на табл. 26.3. На
в присутствии poly(GUA) и poly(GAU) матрице poly(GUA) синтезировались два,
происходил синтез двух, а не трех гомопо- а не три гомополипептида по той причине,
что третья рамка считывания соответ-
Таблица 26.3. Гомополнпептнды, синтезирующиеся на ствует последовательности
матрицах, которые состоят нз повторяющихся последова-
тельностей тринуклеотидов G | UAG | UAG | U A G - - -
Стоп — Стоп — Стоп
Матрица Синтезирующиеся полипептиды
т. е. представляет собой повторяющуюся
последовательность сигнала терминации.
Poly(UUC) Phe; Ser; Leu Как же обстоит дело с poly(GAU)? На
Poly(AAG) Lys; Glu; Arg этой матрице синтезировались только два
Poly(UUG) Cys; Leu; Val гомополипептида, потому что третья рам-
PoIy(CCA) Gln; Thr; Asn
ка считывания соответствует еще одному
Poly(GUA) Val; Ser
Poly(UAC) Tyr; Thr; Leu
сигналу терминации - UGA:
Poly(AUС) Ile; Ser; His
Poly(GAU) Met; Asp GA | UGA | UGA | UGA | U. . .
Стоп — Стоп — Стоп
Часть IV.
74 Информация
Таблица 26.4. Генетический код1)

Первое Третье
положение Второе положение положение
(5'-конец) (3'-конец)

U С A G
Phe Ser Туr Cys U
Phe Ser Туr Cys С
U Leu Ser Стоп Стоп А
Leu Ser Стоп Trp G
Leu Pro His Arg U
Leu Pro His Arg С
С Leu Pro Gln Arg А
Leu Pro Gln Arg G
lle Thr Asn Ser U
Me Thr Asn Ser С
А Me Thr Lys Arg А
Met Thr Lys Arg G
Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly С
G Val Ala Glu Gly А
Val Ala Glu Gly G
1)
Зная положение оснований в кодоне, можно найти соответствующую
аминокислоту. Например, кодон 5'-AUG-3' в мРНК детерминирует
метионин, тогда как CAU детерминирует гистидин. Кодоны UAA, UAG
и UGA - сигналы терминации (стоп-кодоны). AUG является частью сиг-
нала инициации помимо того, что он кодирует внутренние остатки ме-
тионина.

В действительности оказалось, что только 26.7. Основные свойства генетического кода


три кодона не кодируют никакой аминокис- Были расшифрованы все 64 кодона
лоты: UAG, UAA и UGA. (табл. 26.4). 61 триплет соответствует опре-
Синтез полинуклеотидов с определенной деленным аминокислотам, а три кодируют
последовательностью в лаборатории Ко- терминацию. Поскольку существует 20 ами-
раны был выдающимся достижением. Ис- нокислот и 61 триплет для их кодирования,
пользование этих полимеров в качестве ма- очевидно, что код в высокой степени выро-
триц для синтеза белка в сочетании жден. Иными словами, многие аминокис-
с работами Ниренберга по связыванию лоты детерминируются более чем одним
тРНК с рибосомами в присутствии трину- триплетом. Только триптофан и метионин
клеотидов привели к полной расшифровке кодируются всего одним триплетом.
генетического кода к 1966 г. Еще за шесть Остальные 18 аминокислот кодируются
лет до этого такое событие казалось несбы- двумя и более триплетами. Так, в частности,
точной мечтой. Благодаря разработке со- лейцин, аргинин и серин кодируются
вершенных методов синтеза в лаборатории шестью кодонами каждый. В нормальных
Кораны стало возможным и еще одно до- физиологических условиях код однозначен:
стижение: полный синтез молекулы ДНК, каждый кодон обозначает только одну
соответствующей последовательности мо- аминокислоту.
лекулы транспортной РНК.
26. Генетический код.
Зависимость гены-белки 75
Кодоны, соответствующие одной амино- 26.8. Сигналы инициации и терминации
кислоте, называют синонимами. Например. синтеза белка
CAU и САС - синонимы для гистидина. Как мы уже упоминали, UAA, UAG и UGA
Обратите внимание, что синонимы не раз- (стоп-кодоны) обозначают терминацию це-
бросаны случайным образом по таблице ге- пи. Эти кодоны считываются не молекулами
нетического кода (табл. 26.4). Аминокисло- тРНК, а особыми белками - факторами
та, кодируемая двумя или более синонима- терминации. Сигнал начала (инициации)
ми, занимает одну клетку в таблице (за синтеза белка более сложен. Полипеп-
исключением тех случаев, когда для данной тидные цепи у бактерий начинаются с моди-
аминокислоты существует более четырех фицированной аминокислоты формилме-
синонимов). Аминокислоты, располо- тионина (fMet).
женные в одной клетке, кодируются кодона-
ми, у которых два первых основания одина-
ковые, а третье различается, например
GUU, GUC, GUA и GUG. Большинство си-
нонимов различается только последним ос-
нованием триплета. Рассмотрение кода по-
казывает, что XYC и X Y U всегда кодируют
одну и ту же аминокислоту, a X Y G и X Y A
чаще (но не всегда) кодируют одну и ту же
аминокислоту. Структурные основы такой
эквивалентности кодонов станут понятны
после обсуждения природы антикодонов
в молекулах тРНК (разд. 27.6).
Каков биологический смысл сильной вы- Существует особая тРНК, которая пере-
рожденности генетического кода? Один из носит fMet. Эта fMet-тРНК узнает кодон
возможных ответов состоит в том, что выро- AUG (или реже GUG). Однако AUG являет-
жденность сводит к минимуму пагубное ся также кодоном для метионина, располо-
действие мутаций. Если бы код не был вы- женного внутри полипептида, а GUG-ко-
рожден, 20 кодонов кодировали бы амино- дон внутреннего валина. Это значит, что
кислоты, а 44 вызывали бы терминацию сигнал для первой аминокислоты полипеп-
цепи. тидной цепи должен быть сложнее, чем для
Таким образом, вероятность превраще- всех последующих аминокислот. AUG (или
ния кодона в сигнал терминации была бы GUG) представляет собой часть сигнала
гораздо выше в случае невырожденного ко- инициации. Существует другой сигнал, пред-
да, чем в существующем коде. Важно учесть, шествующий AUG (или GUG), который
что мутации, приводящие к образованию определяет, будет ли кодон считан как сиг-
сигнала терминации цепи, обычно приводят нал инициации цепи или как кодон для вну-
к синтезу неактивных белков, тогда как за- треннего остатка метионина (или валина).
мещение одной аминокислоты другой обыч- Механизмы инициации и терминации синте-
но относительно безвредно. Кроме того, вы- за белка мы рассмотрим в следующей главе
рожденность кода может иметь определен- (разд. 27.13).
ное значение постольку, поскольку она
26.9. Генетический код универсален
позволяет нуклеотидному составу ДНК ме-
няться в широких пределах, не влияя на ами- Как мы уже сказали, генетический код был
нокислотную последовательность белков, ко- расшифрован в результате исследований по-
дируемых этой ДНК, ([G] + ведения тринуклеотидов и синтетических
матричных РНК в бесклеточных системах,
+ [С])-содержание бактериальных ДНК ко-
леблется от 30% до более 70%. Молекулы полученных из бактерий. Возникают два во-
ДНК с сильно различающимся содержа- проса. Одинаков ли генетический код in vivo
нием [G] + [С] могут кодировать одни и те и in vitro? Одинаков ли генетический код
же белки благодаря систематическому ис- у всех организмов? Убедительный ответ на
пользованию различных синонимов. эти вопросы был получен при анализе мута-
ций у вирусов, бактерий и высших организ-
мов. Известно множество аминокислотных
Часть IV. замен, возникающих в результате мутаций
76 Информация в генах гемоглобина человека, белка обо-
лочки вируса табачной мозаики (ВТМ) ций на генетической карте был таким же,
и α-цепи триптофан-синтазы E.coli. Почти как порядок соответствующих замен в по-
все эти аминокислотные замены объясняют- следовательности аминокислот полипептид-
ся заменами всего лишь одного основания ного продукта (рис. 26.5). Другими словами,
(табл. 26.5). Это - надежная проверка пра- ген, кодирующий α-цепь, и его полипеп-
вильности всего генетического кода и его тидный продукт коллинеарны.
универсальности.
Почему код не изменился за миллионы 26.11. Некоторые последовательности
лет эволюции? Обсудим действие мутации, вирусных ДНК кодируют более одного белка
изменяющей считывание мРНК. Такая му- Открытие того факта, что ДНК фага φХ174
тация изменит последовательность амино- кодирует больше белков, чем позволяет
кислот в большинстве, если не во всех бел- имеющееся в ней количество нуклеотидов,
ках, синтезируемых в клетках мутантного было совершенно загадочным. Как этот ви-
организма. Многие их этих изменений, бе- рус может кодировать более 2000 аминокис-
зусловно, окажутся губительными, и, следо- лотных остатков, если он содержит всего
вательно, должно существовать сильное да- лишь 5375 нуклеотидов? Ответ был получен
вление отбора против таких мутаций. из полной последовательности оснований
(разд. 24.29), когда обнаружилось, что
в ДНК фага φХ174 некоторые гены перекры-
26.10. Последовательность оснований гена ваются. Определенные участки соответству-
и последовательность аминокислот ющих транскриптов транслируются в раз-
соответствующего полипептида коллинеарны
личных рамках считывания, что приводит к
Обратимся теперь к взаимоотношениям ме- образованию белков с различными последо-
жду генами и белками. Как показала работа вательностями аминокислот (рис. 26.6).
Сеймура Бензера (Seymour Benzer) по гене- Например, одни и те же 300 нуклеотидов
тическому картированию высокого разре- кодируют белок гена Е и большую часть
шения, гены - неразветвленные структуры. белка гена D. Еще более поразительный
Этот важный результат согласовывался
Таблица 26.5. Мутации в гемоглобине человека, трипто-
с установленным фактом, что ДНК предста-
фан-синтазе E.coli и белке оболочки вируса табачной мо-
вляет собой линейную последовательность заики (ВТМ)
пар оснований. Полипептидные цепи также
имеют неразветвленную структуру. Поэто-
му в начале 60-х годов возник следующий Белок Замена Предполагае-
вопрос: существует ли линейное соответ- аминокислоты мое изменение
ствие между геном и его полипептидным кодона
продуктом?
Подход Чарлза Янофски (Charles 1)
Гемоглобин Glu—>Val
Yanofsky) к этой проблеме состоял в исполь-
GAA—>GUA
зовании мутантов E.coli, у которых обра- Гемоглобин Glu—>Lys1)
зуется измененная молекула фермента. Бы- GAA —>AAA
ло выделено много мутантов по α-цепи Гемоглобин Glu —>Gly GAA —>GGA
триптофан-синтазы и определена локализа- Триптофан-синтаза Gly —>Arg GGA —>AGA
ция мутаций на генетической карте α-цепи Триптофан-синтаза Gly—>Glu GGA —>GAA
с помощью рекомбинационных эксперимен- Триптофан-синтаза Glu —>Ala GAA —>GCA
тов с трансдуцирующим фагом. Некоторые Белок оболочки Leu —>Phe CUU—>UUU
из этих мутаций были локализованы близко ВТМ
Белок оболочки Glu —>Gly GAA —>GGA
друг к другу на генетической карте, тогда
ВТМ
как другие были сильно удалены в пределах Белок оболочки Pro —>Ser CCC —>UCC
одного гена. Следующей важной задачей ВТМ
было определить положение аминокислот-
ной замены для каждого из этих десяти му- 1)
Замена Glu—>Val и Glu—>Lys происходит в положе-
тантов. Прежде всего была определена по- нии 6 в β-цепи гемоглобинов S и С человека соответ-
следовательность 168 аминокислот α-цепи ственно.
дикого типа. Затем с помощью метода «от-
печатков пальцев» были установлены место
и природа аминокислотной замены в ка- 26. Генетический код.
ждом случае. Порядок расположения мута- Зависимость гены-белки 77
Рис. 26.5. Коллинеарность гена и амино- 26.12. Гены эукариот представляют собой
кислотной последовательно- мозаику из транслируемых и нетрансли-
сти α-цепи триптофан-синтазы. руемых последовательностей ДНК
Положение мутаций в ДНК У бактерий полипептидные цепи кодируют-
(желтая линия) было определе- ся непрерывной последовательностью три-
но методами генетического плетных кодонов. В течение многих лет счи-
картирования. Аминокис- талось, что гены высших организмов также
лотные замены в последова- непрерывны. Эта точка зрения была неожи-
тельности аминокислот (синяя данно опровергнута в 1977 г., когда в не-
линия) расположены в том же скольких лабораториях было открыто, что
порядке, что и соответствую- некоторые гены имеют прерывистое строе-
щие мутации. (Yanofsky С., ние. Например, ген β-цепи гемоглобина пре-
Gene Structure and Protein рывается в области, кодирующей аминокис-
Structure, Sci. Amer., 1967.) лотную последовательность, длинной неко-
дирующей вставочной последовательностью
из 550 пар оснований и короткой последова-
пример представляет родственный бакте- тельностью из 120 пар оснований. Таким
риофаг G4, в ДНК которого некоторые ко- образом, ген β-глобина разделен на три ко-
роткие участки кодируют три различных дирующие последовательности:

белка. Эти вирусы используют перекрываю-


щиеся гены, чтобы ввести больше информа- Эта удивительная структура была открыта
ции в маленькие молекулы ДНК. Однако за с помощью электронно-микроскопических
эту генетическую экономию приходится исследований гибридов между β-глобино-
платить: на последовательности аминокис- вой мРНК и фаргментом ДНК мыши, со-
лот, кодируемые перекрывающимися гена- держащим ген β-глобина (рис. 26.7). Двухце-
ми, накладываются строгие ограничения. почечная ДНК частично денатурируется,
Поэтому перекрывающиеся гены, по-види- что позволяет мРНК гибридизоваться
мому, широко используются лишь в тех слу- с комплементарной цепью ДНК. Затем
чаях, когда количество ДНК строго лимити- одноцепочечный участок ДНК образует
ровано, как в случае вирусов с белковой петлю и на электронных микрофотографиях
оболочкой строго определенных размеров. выглядит как тонкая линия в отличие от
двухцепочечной ДНК или ДНК-РНК-ги-
Часть IV. бридных участков, которые выглядят значи-
78 Информация тельно толще. Если бы ген β-глобина был
зацию таких вставочных последовательно-
стей.
На каком этапе экспрессии гена удаляют-
ся вставочные последовательности? Ново-
синтезированные РНК, выделенные из ядра,
значительно длиннее молекул мРНК, ко-
торые из них получаются. В частности, пер-
вичный транскрипт гена β-глобина содер-
жит две нетранслируемые области. Эти
вставочные последовательности в первич-
ном 15S-транскрипте вырезаются, а коди-
рующие последовательности одновременно
соединяются под действием фермента
сплайсинга. Этот фермент обладает высо-
кой точностью. Так, образуется зрелая
9S-мРНК (рис. 26.9). Кодирующие последо-
вательности прерывистых («разорванных»)
генов называются экзонами, а вставочные
последовательности - интронами (от англ.
слов expressed regions - экспрессирующиеся
участки и intervening sequence - прерываю-
щая последовательность).
Еще один прерывистый эукариотический
ген - ген овальбумина куриного яйца, ко-
торый состоит из восьми экзонов, разде-
ленных семью длинными интронами
(рис. 26.10). Еще более удивителен ген ко-
нальбумина: он содержит не менее 17 экзо-
нов. Общее свойство экспрессии этих ге-
нов - то, что их экзоны располагаются
в мРНК и в ДНК в одной и той же последо-
вательности. Таким образом, прерывистые
гены, подобно непрерывным генам, колли-
Рис. 26.6. Перекрывающиеся гены
неарны своим полипептидным продуктам.
в ДНК фага φХ174. Рядом с
Все картированные до настоящего време-
последовательностью основа- ни гены птиц и млекопитающих, кроме генов
ний показаны две последова- гистонов (разд. 29.13), содержат интроны.
тельности аминокислот, детер- Почему практически все гены высших эука-
минируемые различными рам- риот содержат вставочные последователь-
ками считывания. ности? Один из возможных ответов состоит
в том, что прерывистые гены отражают про-
непрерывен, была бы видна одна петля. Од- цесс эволюции. Экзоны могут соответство-
нако на электронных микрофотографиях та- вать крупным структурным или функцио-
ких гибридов (рис. 26.8) отчетливо видны нальным элементам (доменам), которые
три петли. Это показывает, что ген преры- соединились и образовали белки с новыми
вается по крайней мере одним участком свойствами. Другая возможность состоит
ДНК, которого нет в соответствующей в том, что вырезание вставочных последова-
мРНК. Дополнительные данные о вста- тельностей регулирует поток мРНК из ядра
вочных последовательностях были полу-
в цитозоль. В соответствии с этой гипотезой
чены при картировании рестрикционных сплайсинг (сращивание) первичного тран-
фрагментов гена β-глобина и продукта скрипта играет ключевую роль: он опреде-
обратной транскрипции мРНК. Большие ляет, какие белки синтезирует клетка. От-
различия между этими картами показали, крытие прерывистых генов у высших орга-
что геномная ДНК содержит нетрансли- низмов ввело нас в увлекательную область
руемые последовательности между коди-
рующими последовательностями. Рестрик- 26. Генетический код.
ционные карты позволили уточнить локали- Зависимость гены-белки 79
Рис. 26.7. Выявление вставочных после- за один цикл репликации. Для E.coli
довательностей с помощью и Drosophila melanogaster эти величины со-
электронной микроскопии. ставляют 4•10 - 1 0 и 7•10-1 соответствен-
Молекула мРНК (красная ли- но.
ния) гибридизуется с геномной Существует два типа одиночных замен
ДНК, содержащей соответ- пары оснований. Транзиция - замещение
ствующий ген. А - если ген не- одного пурина другим пурином или одного
прерывен, видна одна петля пиримидина другим пиримидином. Транс-
одноцепочечной ДНК (показа- версией, наоборот, называется замещение
но синим цветом); Б - если ген
содержит вставочную последо-
вательность, видны две петли
одноцепочечной ДНК (показа-
но синим цветом) и одна петля
двухцепочечной ДНК (синий
и желтый цвет).

познания, которая, по-видимому, имеет


большое значение для понимания роста
и дифференцировки клеток.

26.13. Мутации возникают в результате


изменений последовательности оснований
ДНК Рис. 26.8. Электронная микрофотогра-
Существуют мутации нескольких типов: фия гибрида β-глобиновой
1) замена одной пары оснований (или не- мРНК и фрагмента геномной
скольких пар) другой парой; 2) делеция ДНК, содержащего ген β-гло-
одной или более пар оснований; 3) вставка бина. Толстые петли двухспи-
(включение, инсерция) одной или более пар ральной ДНК - вставочные по-
оснований (рис. 26.11). Наиболее распро- следовательности в ДНК, ко-
страненный тип мутаций - замена одной торых нет в мРНК (как на
пары оснований другой парой. Частота спон- рис. 26.7, Б). Верхняя стрелка
танных мутаций у бактериофага Т4 была указывает на большую вста-
оценена в 1,7•10 -8 на одну пару оснований вочную последовательность,
нижняя стрелка - на малень-
Часть IV. кую. (Печатается с любезного
80 Информация разрешения д-ра Philip Leder.)
завывать необычные пары оснований, от-
личные от А-Т и G-C. Например, тауто-
мерная иминоформа аденина может спари-
ваться с цитозином (рис. 26.12). В следую-
щем цикле репликации этот аденин, воз-
можно, снова перейдет в свое обычное
таутомерное состояние и будет спариваться
с тимином, тогда как цитозин будет спари-
ваться с гуанином. В результате одна из до-
черних молекул ДНК будет содержать пару
G-C вместо пары А-Т (рис. 26.13).
Кроме того, мутации могут вызывать де-
фектные ДНК-полимеразы. Существует му-
тант E.coli, у которого частота мутаций
в 1000 раз выше, чем в норме, возможно, из-
за измененной полимеразы. Отличительная
особенность мутаций этих клеток состоит
в том, что почти все они являются трансвер-
сиями А-Т—>G-C.

Рис. 26.9. Транскрипция гена β-глобина 26.14. Некоторые химические мутагены


и удаление вставочных после- весьма специфичны
довательностей из первичного В ДНК можно включить аналоги основа-
РНК-транскрипта. Образова- ний, например 5-бромурацил и 2-аминопу-
ние «колпачка» и присоедине- рин. Они вызывают транзиции, нарушая
ние poly(A) обсуждаются правила спаривания оснований в процессе
в разд. 29.22. их собственного включения в состав ДНК
или в следующем цикле репликации
(рис. 26.14). Аналог тимина 5-бромурацил
пурина пиримидином или пиримидина пу- в норме спаривается с аденином. Однако
рином: доля енольного таутомера в 5-бромурациле
выше, чем в тимине, возможно, из-за высо-
кой электроотрицательности атома брома
по сравнению с метильной группой при С-5.
Енольная форма 5-бромурацила спаривает-
ся с гуанином, и это вызывает транзиции
А-Т—>G-C. 2-аминопурин в норме спари-
вается с тимином. В отличие от аденина
Механизм спонтанного возникновения обычный таутомер 2-аминопурина может
транзиций был предложен Уотсоном и Кри- образовать одну водородную связь с цито-
ком в их классической работе о двойной зином. Поэтому 2-аминопурин способен вы-
спирали ДНК. Они отметили, что неко- зывать транзиции А-Т—>G-C.
торые атомы водорода каждого из четырех В основе действия других мутагенов ле-
оснований могут менять свое положение. жат химические модификации оснований
Такие таутомерные формы, которые возни- ДНК. Например, азотистая кислота реаги-
кают с низкой вероятностью, могут обра- рует с основаниями, имеющими аминогруп-

Рис. 26.10. Структура гена овальбумина


куриного яйца. Интроны (неко-
дирующие участки) показаны
желтым цветом, а экзоны - си- 26. Генетический код.
ним. Зависимость гены-белки 81
На примере типогралских ошибок пу. При этом происходит окислительное де-
Замена заминирование аденина до гипоксантина,
На примере типожграфских ошибок цитозина до урацила, гуанина до ксантина.
Вставка Образующийся при этом гипоксантин спа-
ривается с цитозином, а не с тимином, ура-
На примере тпографских ошибок цил спаривается с аденином, а не с гуани-
Делеция ном. Ксантин, как и гуанин, спаривается
с цитозином. Поэтому азотистая кислота
На примере типограф-савдкмьыэм вызывает транзиции А-Т—>G-C. Гидро-
Нонсенс ксиламин (NН2ОН) - высокоспецифичный
мутаген. Он реагирует почти исключитель-
Рис. 26.11. На примере типографских но с цитозином и дает производное, которое
ошибок можно проиллюстри- спаривается с аденином, а не с гуанином.
ровать различные типы мута- Гидроксиламин вызывает транзицию толь-
ций. ко в одном направлении: G-С—>А-Т.
Другой тип мутаций вызывают плоские
ароматические молекулы, например акри-
дины. Эти соединения интеркалируют
в ДНК, т.е. проскальзывают между сосед-
ними парами оснований в двойной спирали
ДНК (разд. 25.18). Интеркаляторы, видимо,
стабилизируют спаривание оснований со
сдвигом в повторяющихся последователь-
ностях, таких, например, как CGCGCGCG.
В результате они вызывают включения или
делеции одной или более пар оснований. Дей-
ствие таких мутаций заключается в измене-
нии рамки считывания, если только общее
число делетированных или включившихся
Рис. 26.12. Редкая таутомерная форма оснований не кратно трем. Именно анализ
аденина спаривается с цитози- таких мутантов позволил доказать триплет-
ном вместо тимина. Этот тау- ность генетического кода.
томер образуется при сдвиге 26.15. Многие мутагенные канцерогены
протона 6-аминогруппы к ато- можно выявить по их мутагенному действию
му N-1. на бактерии
Многие опухоли у человека возникают в ре-
зультате воздействия токсичных химиче-
ских веществ. Поскольку эти химические
канцерогены обычно мутагенны, можно ду-
мать, что повреждение ДНК лежит в основе
и канцерогенеза, и мутагенеза. Эти соедине-
ния важно идентифицировать и оценить их
потенциальную биологическую активность,
чтобы свести к минимуму то воздействие,
которое они оказывают на человека. Брюс
Эймс (Bruce Ames) разработал простой
и чувствительный тест для выявления хими-
ческих мутагенов. На чашку Петри поме-
Рис. 26.13. Спаривание редкой таутомер- щают тонкий слой агара, содержащий
ной формы аденина (А*) с цито- около 109 клеток специально сконструиро-
зином (С) привоцит к появле- ванного тест-штамма Salmonella. Эти бакте-
нию пары G—С в следующем рии не способны расти в отсутствие гисти-
поколении. дина, поскольку они несут мутацию в одном
из генов биосинтеза этой аминокислоты.
Часть IV. Добавление мутагена в центр чашки инду-
82 Информация цирует появление множества новых мута-
нов - добавление гомогената печени млеко-
питающих. Напомним, что некоторые по-
тенциальные канцерогены превращаются
в активную форму под действием фермента-
тивных систем печени или других тканей
млекопитающих (разд. 20.21). В бактериях
эти ферменты отсутствуют, в связи с чем на
чашку наносят несколько миллиграммов го-
могената печени, чтобы активировать по-
добные мутагены. Например, соединение

Рис. 26.14. Аналог тимина 5-бромурацил


иногда спаривается с гуанином
вместо аденина. Присутствие
атома брома при С-5 увеличи-
вает долю редкого таутомера,
образующегося при сдвиге
протона от N-3 к атому кисло-
рода при С-4.

ций. Небольшая часть этих мутаций приво-


дит к реверсии исходной мутации (возврат
к дикому типу), так что клетки приобретают
способность синтезировать гистидин. Эти
ревертанты размножаются в отсутствие эк-
зогенного гистидина и появляются в виде
отдельных колоний на чашке после инкуба-
ции чашки в течение двух дней при 37°С
(рис. 26.15). Например, 0,5 мкг 2-аминоан-
трацена дают 11.000 колоний ревертантов
по сравнению всего лишь с 30 спонтанными
ревертантами в отсутствие этого мутагена. Рис. 26.15. Тест на мутагены с использова-
Можно легко поставить опыт с различными нием сальмонеллы. А. На чаш-
9
концентрациями исследуемого соединения, ку Петри посеяно примерно 10
чтобы получить кривую доза-ответ. Обыч- бактерий, неспособных синте-
но эта зависимость имеет линейный харак- зировать гистидин. Б. На чаш-
тер; отсюда следует, что пороговой концен- ку помещен кружок фильтро-
трации в процессах мутагенеза нет. вальной бумаги, пропитанный
Некоторые тест-линии чувствительны мутагеном. В результате воз-
к заменам пар оснований, тогда как другие никает множество ревертан-
можно использовать для выявления делеций тов, способных синтезировать
или вставок пар оснований (сдвигов рамки). гистидин. Эти ревертанты
Чувствительность этих штаммов, скон- видны в виде ореола колоний
струированных специально для оценки му- вокруг белого кружочка. Не-
тагенов, увеличена генетически: они лишены большое число колоний на
системы эксцизионной репарации. Кроме чашке А - спонтанные ревер-
того, у них нет липополисахаридной обо- танты. [Ames B.N., McCann J.,
лочки, которая обычно окружает клетки Yamasaki E., Mutation Res., 31,
Salmonella. Отсутствие этого барьера облег- 347 (1975).]
чает проникновение в клетку потен-
циальных мутагенов. Еще одна важная осо- 26. Генетический код.
бенность этой системы выявления мутаге- Зависимость гены-белки 83
с реакционноспособной боковой цепью Генетический код един у всех живых орга-
(дающее ему возможность образовать кова- низмов. Он был расшифрован в результате
лентную связь с ДНК) и с ароматической экспериментов трех типов. Во-первых, син-
группой (которое позволяет ему интеркали- тетические полирибонуклеотиды (полу-
ровать) обладает значительно большей му- ченные с помощью полинуклеотид-фосфо-
тагенностью, чем такое же соединение, со- рилазы) были использованы в качестве
стоящее из одной ароматической группы. мРНК в бесклеточных системах синтеза
В настоящее время тест с использованием белка, после того как было открыто, что
Salmonella широко используется для оценки poly(U) кодирует фенилаланин. Во-вторых,
опасности мутагенного и канцерогенного тринуклеотид (подобный кодону в мРНК)
действия множества разнообразных хими- специфически связывается с определенной
ческих соединений. Эта быстрая и недорогая тРНК, для которой он является кодовым
бактериологическая проба на мутагенность словом. Были синтезированы все 64 трину-
дополняет эпидемиологические обследова- клеотида и проверена их способность сти-
ния и пробы на животных, которые всегда мулировать связывание определенных
оказываются более трудоемкими, мед- тРНК с рибосомами. В-третьих, в качестве
ленными и дорогими. Тест на мутагенность мРНК были использованы синтетические
с использованием Salmonella - ответвление полирибонуклеотиды с известной последо-
исследований взаимосвязи гена и белка вательностью. Например, на матрице
у бактерий. Это - удивительный пример то- poly(UAUC) синтезировался poly(Tyr-
го, как фундаментальные исследования Leu-Ser-Ile).
в области молекулярной биологии могут не- Многие гены высших эукариот имеют
посредственно внести важный вклад в здра- «разорванное» строение. Кодирующие по-
воохранение. следовательности (экзоны) в таких генах
разделены вставочными последовательно-
стями (интронами), которые удаляются
в ходе превращения первичного транскрип-
Заключение
та в мРНК. Например, ген β-глобина млеко-
Последовательность оснований гена колли-
питающих содержит два интрона. Преры-
неарна аминокислотной последовательно-
вистые гены, как и непрерывные гены,
сти полипептидного продукта. Генетиче-
коллинеарны своим полипептидным про-
ский код - это взаимосвязь между последо- дуктам.
вательностью оснований в ДНК (или со-
Мутации обусловлены изменениями в по-
ответствующего РНК-транскрипта) и по- следовательности оснований ДНК. Ос-
следовательностью аминокислот в белках. новные типы мутаций - замены, делеции
Аминокислоты кодируются группами по
и включения. Самый распространенный тип
три основания (они называются кодонами),
мутаций - замена одной пары оснований на
начиная с фиксированной точки. 61 кодон из
другую. Замена одного пурина другим или
64 кодирует определенную аминокислоту,
одного пиримидина другим пиримидином
а остальные три кодона (UAA, UAG и UGA)
называется транзицией. Трансверсия - заме-
служат сигналами терминации. Таким обра-
щение пурина пиримидином и наоборот.
зом, для большинства аминокислот имеется
Мутации могут возникать вследствие спон-
более одного кодового слова. Другими сло-
танной таутомеризации оснований или под
вами, код вырожден. Кодоны, определяю- действием аналогов оснований (например,
щие одну и ту же аминокислоту, называют-
5-бромурацила) или других химических му-
ся синонимами. В большинстве случаев
тагенов (например, азотистой кислоты). По-
синонимы различаются только последним тенциальную канцерогенную активность
основанием триплета. Некоторые последо-
многих веществ можно выявить по их мута-
вательности вирусных ДНК кодируют бо-
генному действию на бактерии.
лее одного белка, так как их транскрипты
транслируются в различных рамках считы-
вания.

Часть IV.
84 Информация
РЕКОМЕНДУЕМАЯ Medicine (1963-1970), pp. 341-369, rabbit β-globin gene contains a large
ЛИТЕРАТУРА American Elsevier (1973). insert in the coding sequence, Cell, 12,
Nirenberg M., 1968. The genetic code. 1097-1108.
С чего начать In: Nobel Lectures: Physiology or Breathnack R., Mandel J.L., Cham-
Yanofsky С., 1967. Gene structure and Medicine (1963-1970), pp. 372-395, bon P., 1977. Ovalbumin gene is split in
protein structure, Sci. Amer, 216(5), American Elsevier (1973). chicken DNA, Nature, 270, 314-319.
80-94. (Статья содержит данные, сви- Garen A., 1968. Sense and nonsense in Cochet M., Gannon F., Hen R.,
детельствующие о коллинеарности the genetic code, Science, 160, 149-159. Maroteaux L., Perrin F., Chambon P.,
гена и пептида.) Woese C.K., 1967. The Genetic Code, 1979. Organisation and sequence
Nirenberg M.W., 1963. The genetic Harper and Row. studies of the 17-piece chicken
code II. Sci. Amer., 208(3), 80-94. (Опи- Cold Spring Harbor Laboratory, 1966. conalbumin gene, Nature, 282, 567-574.
сано использование синтетических The Genetic Code (Cold Spring Harbor Tilghman S.M., Tiemeier D.C., Seid-
полирибонуклеотидов для расши- Symposia on Quantitative Biology, man J.G., Peterlin B.M., Sullivan M.,
фровки кода.) vol. 31). (Сборник выдающихся ста- Maijel J.V., Leder P., 1978. Intervening
Crick F.Н.С., 1966. The genetic code тей, в которых установлены ос- sequence of DNA identified in the struc-
III, Sci. Amer., 215(4), 55-62. (В статье новные свойства кода.) tural portion of a mouse β-globin gene,
рассматриваются представления Proc. Nat. Acad. Sci., 75, 725-729.
о генетическом коде в тот момент, Перекрывающиеся гены
когда он был почти полностью рас- Barrell B.C., Air G.M., Hutchin- Мутагенез
шифрован.) son С.A., III, 1976. Overlapping genes Hayes W., 1968. The Genetics of
Kourilsky P., Chambon Р., 1978. The in bacteriophage φX174, Nature, 264, Bacteria and Their Viruses (2nd ed.),
ovalbumin gene: an amazing gene in 34-40. Wiley. (В гл. 13 четко и кратко опи-
eight pieces, Trends Biochem. Sci., 3, сана природа мутаций.)
244-247. Коллинеарность гена и белка Drake J. W., Baltz R.H., 1976. The
Yanofsky С., Carlton В.С., Guest J . R . , biochemistry of mutagenesis, Ann. Rev.
Гипотеза адаптера (роль тРНК) Helinski D.R., Henning U., 1964. On the Biochem., 45, 11-38.
Crick F.H.C., 1958. On protein colinearity of gene structure and protein Drake J.W., 1970. The Molecular Basis
synthesis, Symp. Soc. Exp. Biol, 12, structure, Proc. Nat. Acad. Sci., 51, of Mutation, Holden-Day.
138-163. (Блистательное предвидение 266-272.
механизма белкового синтеза. Изло- Sarabhai X.S., Stretton O.W., Bren- Выявление канцерогенов
жена гипотеза адаптера.) ner S., Bolle A., 1964. Colinearity of Ames B.N., 1979. Identifying envi-
gene with polypeptide chain, Nature, ronmental chemicals causing mutations
Генетический код 201, 13-17. and cancer, Science, 204, 587-593.
Crick F.Н.С., Barnett L., Brenner S., Devoret R., 1979. Bacterial tests for
Watts-Tobin R.J., 1961. General nature Разорванные гены н вставочные по- potential carcinogens. Sci. Amer,
of the genetic code for proteins, Nature, следовательности 241(2), 40-49.
192, 1227-1232. Crick F., 1979. Split genes and RNA McCann J., Spingarn N.E., Kobori J.,
Khorana H.G., 1968. Nucleic acid splicing in evolution of eukaryotic cells, Ames B.N., 1975. Detection of
synthesis in the study of the genetic Science, 202, 1257-1260. carcinogens as mutagens: bacterial
code. In: Nobel Lectures: Physiology or Jeffreys A.J., Flavell R.A., 1977. The tester strains with R factor plasmids,
Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 979-983.

Вопросы и задачи ной РНК тем же мутагеном привела к по-


явлению в том же положении фенилала-
1. Какую последовательность нина:
аминокислот кодирует следую-
щая последовательность оснований моле-
кулы мРНК? Считайте, что рамка считыва-
ния начинается с 5'-конца: 5'-UUGCCU- а) Каковы предполагаемые кодоны для
AGUGAUUGGAUG-3'. этих четырех аминокислот?
2. Какова последовательность по- б) Что применялось в качестве мутагена:
липептида, который образуется 5-бромурацил, азотистая кислота или акри-
при добавлении poly(UUAC) в бесклеточ- диновый краситель?
ную систему синтеза белка? 4. Специалист по химии белка ска-
3. Одноцепочечную РНК вируса зал молекулярному генетику,
табачной мозаики обработали что он нашел новый мутантный гемогло-
химическим мутагеном. Были получены му- бин, в котором аспартат замещает лизин.
танты, у которых в определенном положе-
нии вместо пролина располагается серин 26. Генетический код.
или лейцин. Повторная обработка мутант- Зависимость гены-белки 85
Молекулярный генетик удивился и отпра- а) Могла ли эта мутация возникнуть путем
вил своего приятеля еще повозиться замены одной пары оснований в ДНК фага
в лаборатории. Т4? Если нет, то как мог возникнуть такой
а) Почему молекулярный генетик выразил мутант?
сомнения в возможности такой аминокис- б) Какова последовательность оснований
лотной замены? мРНК, кодирующей пять аминокислот
б) Какая аминокислотная замена показа- в белке дикого типа, отличающихся от той
лась бы молекулярному генетику более же последовательности у мутанта?
приемлемой? 6. РНК-транскрипт одного участ-
5. Ниже приведены последова- ка ДНК фага G4 содержит по-
тельности аминокислот в фраг- следовательность 5'-AAAUGAGGA-3'. Этот
менте лизоцима бактериофага Т4 дикого ти- фрагмент кодирует три различных белка.
па и мутанта: Каковы их последовательности?

Дополнительные вопросы см.: Wood W.В.,


Wilson J. H., Benbow R. M., Hood L. Е,
Biochemistry: A Problems Approach,
Benjamin, 1974, ch. 19.
Инициация приводит к связыванию инициа-
ГЛАВА 27 торной тРНК с сигналом начала транскрип-
Синтез белка ции в мНРК. Инициаторная тРНК занимает
Р-участок рибосомы (от англ. peptidyl - пеп-
тидильный) - один из двух участков связы-
Из предыдущей главы нам известно, что по- вания тРНК. Элонгация начинается со
следовательность аминокислот в белках связывания аминоацил-тРНК с другим
определяется последовательностью кодо- участком связывания тРНК на рибосоме,
нов в мРНК, считываемых молекулами называемым А-участком (от англ.
тРНК. Обратимся теперь к механизму син- aminoacyl - аминоацильный). Затем обра-
теза белка. Этот процесс называется транс- зуется пептидная связь между аминогруп-
ляцией (от англ. translation - перевод), так пой второй аминоацил-тРНК и карбоксиль-
как информация, записанная на четырехбук- ной группой fMet, связанного с инициатор-
венном языке нуклеиновых кислот, перево- ной тРНК. Теперь образовавшаяся в резуль-
дится на язык белков, состоящий из 20 букв. тате дипептидил-тРНК перемещается из
Как и следовало ожидать, трансляция - про- А-участка в Р-участок, в то время как осво-
цесс более сложный, чем репликация или бодившаяся молекула тРНК покидает рибо-
транскрипция ДНК, которые происходят сому. Связывание аминоацил-тРНК, пере-
с использованием одного и того же языка мещение пептидил-тРНК из А-участка
спаривания оснований. Трансляция осу- в Р-участок и одновременное перемещение
ществляется в результате согласованного рибосомы к следующему кодону мРНК тре-
взаимодействия более чем сотни видов ма- буют гидролиза GТР. Затем новая амино-
кромолекул. Помимо рибосом, необходимы ацил-тРНК связывается со свободным А-
молекулы тРНК, активирующих фермен- участком и начинается новый цикл реакции
тов, растворимых факторов и мРНК. элонгации, подобный уже описанному.
Прежде чем перейти к подробному описа- Терминация происходит тогда, когда стоп-
нию синтеза белка, рассмотрим процесс кодон (сигнал терминации) в молекуле
в общих чертах. Белок синтезируется в на- тРНК считывается фактором освобождения
правлении от аминоконца к карбоксильно- белка. Это приводит к отделению завершен-
му концу путем последовательного присое- ной полипептидной цепи от рибосомы. В на-
динения аминокислот к карбоксильному стоящей главе мы будем говорить главным
концу растущей пептидной цепи. Амино- образом о синтезе белка в клетках E.coli, где
ацил-тРНК, в которых карбоксильная груп- этот процесс лучше всего изучен. Некоторые
па аминокислоты присоединена к 3'-концу различия между синтезом белка у прока-
тРНК, играют в этом процессе роль активи- риот и эукариот будут рассмотрены
рованных предшественников. Присоедине- в разд. 29.25.
ние аминокислоты к соответствующей
тРНК катализирует аминоацил- 27.1. Аминокислоты активируются
тРНК—синтетаза. Эта реакция активации, и присоединяются к транспортным РНК
будучи аналогична активации жирных кис- под действием специфических синтетаз
лот, также запускается энергией гидролиза Образование пептидной связи между ами-
АТР. Для каждой аминокислоты имеется по ногруппой одной аминокислоты и СООН-
крайней мере один вид тРНК и специфиче- группой другой аминокислоты термодина-
ский активирующий фермент. Синтез белка
осуществляется в три стадии, называемые
инициацией, элонгацией и терминацией. 27. Синтез белка 87
мически невыгодно. Этот термодинамиче-
ский барьер преодолевается путем актива-
ции СООН-группы аминокислот-предше-
ственников. Активированными промежу-
точными продуктами синтеза белка слу-
жат эфиры аминокислот, в которых карбок-
сильная группа аминокислоты связана с 2'-
или 3'-гидроксильной группой рибозного
остатка на 3'-конце тРНК. Аминоацильная
группа может быстро перемещаться из
2'-положения в 3'-положение и обратно.
Этот активированный промежуточный про-
дукт называется аминоацил-тРНК
(рис. 27.1).
Присоединение аминокислоты к тРНК Рис. 27.1. В аминоацил-тРНК аминокис-
имеет значение не только потому, что при лота связана эфирной связью
этом активируется ее карбоксильная группа с 2'- или 3'-гидроксильной груп-
и она может образовать пептидную связь, пой концевого аденозина.
но и потому, что аминокислоты сами по се-
бе не способны узнавать кодоны в мРНК. цильная группа на 2'- или 3'-гидроксильную
Аминокислоты переносятся к рибосомам группу рибозного остатка на 3'-конце тРНК,
специфическими тРНК, которые и узнают зависит от того, о какой аминокислоте и ка-
кодоны в мРНК. Таким образом, эти тРНК кой аминоацил-тРНК—синтетазе идет
выполняют роль адапторных молекул. речь. Активированная аминокислота может
В 1957 г. Пол Замечник и Малон Хогланд очень быстро перемещаться из 2'- в 3'-поло-
(Paul Zamecnik, Mahlon Hoagland) установи- жение и обратно.
ли, что активация аминокислот и их после- Аминоацил-АМР + тРНК
дующее присоединение к тРНК катализи- Аминоацил-тРНК + AMP.
руются специфическими аминоацил-
тРНК—синтетазами, которые также на- Суммарная реакция этапов активации
зывают активирующими ферментами. и переноса описывается следующим уравне-
В реакциях, катализируемых некоторыми нием:
синтетазами, первая стадия состоит в обра- Аминокислота + АТР + тРНК
зовании аминоациладенилата из аминокис- Аминоацил-тРНК + AMP + РР i .
лоты и АТР. Это активированное соедине-
ние представляет собой смешанный анги- ΔG' для этой реакции близко к нулю, так
дрид, в котором карбоксильная группа как свободная энергия гидролиза эфирной
аминокислоты присоединена к фосфатной связи аминоацил-тРНК соответствует сво-
группе AMP. Другие синтетазы катализи- бодной энергии гидролиза концевой фосфо-
руют реакцию АТР, аминокислоты и тРНК
без промежуточного образования доступно-
го для обнаружения аминоациладенилата.

Следующий этап - перенос аминоациль-


рильной группы АТР. Что же в таком случае
ной группы аминоацил-АМР на молекулу
запускает синтез аминоацил-тРНК? Как
тРНК с образованием аминоацил-тРНК-
и можно было ожидать, реакция запускается
активированного промежуточного продук-
гидролизом пирофосфата. Суммарная реак-
та в синтезе белка. Переносится ли аминоа- ция этих превращений высокоэкзергонична:
Часть IV. Аминокислота + АТР + тРНК + Н 2 О
88 Информация Аминоацил-тРНК + AMP + 2Р i .
Таким образом, на синтез аминоацил-
тРНК затрачиваются две богатые энергией
фосфатные связи. Одна из них расходуется
на образование эфирной связи аминоацил-
тРНК, другая сдвигает равновесие реакции
в сторону образования продукта.
Стадии активации и переноса определен-
ной аминокислоты катализируются одной
и той же аминоацил-тРНК—синтетазой.
В действительности аминоацил-АМР не дис-
социирует из комплекса с синтетазой. Он
прочно связывается с активным центром
фермента нековалентными взаимодействия-
ми. В норме аминоацил-АМР, образующий-
ся в качестве промежуточного продукта син-
теза аминоацил-тРНК, существует в течение
непродолжительного времени, но он вполне
стабилен и может быть легко выделен, если
в реакционной смеси нет тРНК.
Мы уже встречались с ациладенилатным
промежуточным продуктом при активации
Рис. 27.2. Пространственные модели
жирных кислот (разд. 17.6). Интересно от-
валина и изолейцина. Синте-
метить, что Пол Берг (Paul Berg) первым от-
тазы, активные в отношении
крыл этот промежуточный продукт в реак-
этих аминокислот, высоко спе-
ции активации жирных кислот, и он же
цифичны.
позже выяснил, что этот продукт образуется
также при активации аминокислот. Основ-
ное различие между этими реакциями со-
27.2. Надежность синтеза белка
стоит в том, что в первом случае роль акцеп-
определяется высокой специфичностью
тора ацильных групп играет СоА, а во
аминоацил-тРНК-синтетаз
втором - тРНК. Энергетика этих биосинте-
Правильная трансляция генетических ма-
тических реакций очень сходна: обе они ста-
триц обеспечивается высокой специфич-
новятся необратимыми благодаря гидроли-
ностью аминоацил-тРНК—синтетаз. Эти
зу неорганического пирофосфата.
ферменты весьма избирательны в отноше-
Для каждой аминокислоты имеется по
нии активируемых аминокислот и соответ-
крайней мере одна аминоацил-тРНК—син-
ствующей тРНК-акцептора. Как будет ука-
тетаза. Эти ферменты различаются по раз-
зано несколько ниже, молекулы тРНК,
меру, субъединичной структуре и аминокис-
акцептирующие различные аминокислоты,
лотному составу (табл. 27.1).
имеют различные последовательности ос-
Таблица 27.1. Свойства некоторых аминоацнл- нований, благодаря чему синтетазы легко
тРНК-сннтетаз узнают их. Гораздо более сложная задача
для этих ферментов - различать сходные
аминокислоты. Например, единственное
Источник Специфич- Масса, Субъеди- различие между изолейцином и валином со-
ность к ами- кДа ничная стоит в том, что изолейцин содержит лиш-
нокислоте структура
нюю метиленовую группу (рис. 27.2). До-
полнительная энергия связывания, которую
вносит эта лишняя группа —СН2—, благо-
E.coli Гистидин 85 α2
E.coli Изолейцин 114 Одна цепь
приятствует тому, что активация изолей-
E.coli Лизин 104 цина происходит примерно в 200 раз чаще,
α2
E.coli Глицин 227 α2β2
чем активация валина. Концентрация ва-
Дрожжи Лизин 138 α2 лина in vivo примерно в 5 раз выше концен-
Дрожжи Фенилалакин 270 α2β2 трации изолейцина, так что валин должен
Поджелудоч- Триптофан 108 α2
ная железа бы-
ка
27. Синтез белка 89
был бы неправильно включаться вместо
изолейцина в одном случае из 40. Однако
наблюдаемая частота ошибок in vivo соста-
вляет всего одну на 3000. Это указывает, что
должна существовать еще какая-то стадия
коррекции ошибок для увеличения надежно-
сти. Действительно, синтетаза исправляет
собственные ошибки. Валин, активиро-
ванный по ошибке, не переносится на тРНК,
специфичную к изолейцину. Вместо этого
тРНК способствует гидролизу валин-АМР
и таким образом предупреждает его непра-
вильное включение в белки. Кроме того, эта
гидролитическая реакция освобождает син-
тетазу для активации и переноса изолей-
цина правильной аминокислоты. Каким
образом синтетаза избегает гидролиза
изолейцин-АМР - правильного промежу- Рис. 27.3. Исправление ошибок с по-
точного продукта? Скорее всего, гидроли- мощью гидролиза ошибочного
тический участок достаточно велик, чтобы продукта.
там поместился валин-АМР, но слишком
мал для связывания изолейцин-АМР.
Многие другие аминоацил-тРНК—син-
тетазы также содержат, помимо участков
синтеза, гидролитические участки. Возмож-
но, эти участки действуют как двойные
фильтры, обеспечивающие высокую надеж-
ность. Участок синтеза отбрасывает амино-
кислоты, превышающие по размеру нужную
аминокислоту, а гидролитический участок
разрушает те активированные промежу-
точные продукты, которые меньше по раз-
меру, чем требуется. Очевидно, высокая на-
дежность синтеза белка в первую очередь
зависит от механизма коррекции с помощью
гидролитической активности, которой обла-
дают многие аминоацил-тРНК—синте-
тазы.
27.3. Молекулы транспортных РНК имеют
общий план строения
В 1965 г, Роберт Холли (Robert Holley) после
семи лет упорных поисков впервые опреде-
лил последовательность оснований одной
из транспортных РНК. При исследовании
дрожжевой аланиновой тРНК была получе-
на первая полная последовательность ну- Рис. 27.4. Последовательность основа-
клеиновой кислоты. Эта работа стала источ- ний дрожжевой аланиновой
ником новых идей, касающихся биологиче- тРНК. Модифицированные ну-
ской активности молекулы тРНК. В процес- клеозиды (отмечены зеленым)
се расшифровки последовательности Холли сокращенно обозначаются сле-
разработал общие методы для определения дующим образом: инозин - I,
последовательности нуклеотидов в нуклеи- метилинозин - mI, дигидро-
новых кислотах. Последовательность дрож- уридин - UH 2 , риботимидин -
Т, псевдоуридин - ψ, метилгу-
Часть IV. анозин - mG и диметилгуано-
90 Информация зин - m2G.
жевой аланиновой тРНК показана на тилированные производные A, U, С и G, ко-
рис. 27.4. Молекула представляет собой од- торые образуются путем ферментативной
ну цепь из 76 рибонуклеотидов. 5'-конец модификации тРНК-предшественника
фосфорилирован (pG), а 3'-конец имеет сво- (разд. 25.17). Роль этих необычных основа-
бодную 3'-гидроксильную группу. Харак- ний неизвестна. Вполне возможно, что мети-
терная особенность этой молекулы - высо- лирование препятствует спариванию неко-
кое содержание оснований, отличных от А, торых оснований и делает их таким образом
U, G и С. В ней содержится девять необы- доступными для других взаимодействий.
чных нуклеотидов: инозин, псевдоуридин, Кроме того, метилирование изменяет ги-
дигидроуридин, риботимидин и метилиро- дрофобность некоторых участков тРНК,
ванные производные гуанозина и инозина. что может иметь важное значение для их
Участок прикрепления аминокислоты пред- взаимодействия с синтетазами и рибо-
ставляет собой 3'-гидроксильную группу сомными белками.
остатка аденозина на 3'-конце молекулы. 3. 5'-конец тРНК фосфорилирован. На
Последовательность IGC в середине моле- 5'-конце обычно расположен остаток pG.
кулы - антикодон. Он комплементарен 4. На 3'-конце всех тРНК находится по-
GCC - одному из кодонов аланина. следовательность ССА. Активированная
аминогруппа прикрепляется к 3'-гидрок-
сильной группе концевого аденозина.
5. Примерно половина нуклеотидов
тРНК спарена и образует участки двойной
спирали (рис. 27.5). Не спарены пять групп
оснований: 3'-концевая область ССА (акцеп-
Вскоре были определены последователь- торная ветвь); ТψC-петля, которая получи-
ности нескольких других молекул тРНК. ла свое название по последовательности ри-
К настоящему времени уже известны после- ботимидин - псевдоурацил - цитозин;
довательности более 70 тРНК. Самое уди- добавочная петля, число остатков которой
вительное, что все эти последовательности различно в разных тРНК; дигидроуридило-
можно изобразить в форме клеверного ли- вая петля, которая содержит несколько
ста, в котором около половины нуклеоти- остатков дигидроуридина; антикодоновая
дов образует пары оснований. Следователь- петля.
но, молекулы тРНК обладают многими 6. Антикодоновая петля состоит из семи
общими структурными особенностями. оснований, расположенных в следующей
В этом факте нет ничего неожиданного, так последовательности:

как все молекулы тРНК должны взаимодей- 27.4. Транспортная РНК имеет L-образную
ствовать примерно одинаковым образом форму
с рибосомами и мРНК. Говоря конкретно, К настоящему времени трехмерная структу-
все молекулы тРНК должны укладываться ра молекулы тРНК установлена на атом-
в А- и Р-участки рибосомы и должны взаи- ном уровне благодаря рентгеновским кри-
модействовать с ферментом, катализирую- сталлографическим исследованиям, осу-
щим образование пептидной связи. ществленным в лабораториях Александра
Все молекулы транспортных РНК обла- Рича и Арона Клуга (Alexander Rich, Aaron
дают следующими общими свойствами. Klug). В результате проведенного ими неза-
1. Все они представляют собой одну цепь висимого рентгенографического изучения
длиной от 73 до 93 рибонуклеотидов (масса фенилаланиновой тРНК получено множе-
около 25 кДа). ство новых данных о структуре молекулы
2. Они содержат много необычных осно- тРНК.
ваний, как правило, от 7 до 15 на молекулу.
Многие из этих необычных оснований пред-
ставляют собой метилированные или диме- 27. Синтез белка 91
Рис. 27.5. Общая схема строения моле- действует с некоторыми основаниями и да-
кул тРНК. же с другим участком самого остова. Во
многих подобных взаимодействиях 2'-ОН-
группа остатков рибозы выступает в каче-
1. Молекула имеет L-образную форму стве донора или акцептора при образовании
(рис. 27.6 и 27.7). водородных связей. Кроме того, значитель-
2. В молекуле имеется два участка двой- ная часть оснований упакована в стопки
ной спирали. Каждая из этих спиралей содер- (межплоскостные взаимодействия). Эти ги-
жит примерно десять пар оснований, что со- дрофобные взаимодействия между соседни-
ответствует одному витку спирали. Спи- ми ароматическими кольцами играют ос-
ральные участки расположены перпендику- новную роль в молекулярной архитектуре.
лярно друг другу, что и придает молекуле 4. ССА-конец - участок прикрепления
L-образную форму. Схема спаривания осно- аминокислоты - расположен на одном из
ваний, постулированная в модели клеверно- концов L. Другой конец L представляет со-
го листа, построенной по результатам опре- бой антикодоновую петлю. Таким образом,
деления последовательности, оказалась пра- аминокислота, связанная в аминоацил-
вильной. тРНК, удалена от антикодона (на расстоя-
3. Большинство оснований вне спи- ние примерно 80 А). Дигидроуридиловая
ральных участков образует необычные во- петля и ТψC-петля образуют угол буквы L.
дородные связи. Эти третичные взаимодей- 5. ССА-конец и прилегающая к нему спи-
ствия возникают между основаниями, ко- ральная область не очень сильно взаимо-
торые обычно не комплементарны друг действуют с остальной молекулой. Эта
другу (например, G—G, А—А и А—С). Бо- часть молекулы может изменять конформа-
лее того, рибозофосфатный остов взаимо- цию при активации аминокислоты и при
синтезе белка на рибосоме.
Часть IV. Определение трехмерной структуры
92 Информация тРНК - важный шаг в изучении процесса
трансляции на молекулярном уровне. Еще
совсем недавно решение этого вопроса каза-
лось делом далекого будущего. Теперь идеи
и усилия исследователей в данной области
обращаются к еще более сложным задачам,
таким, как изучение трехмерной структуры
комплексов аминоацил-тРНК—синтетазы
с тРНК и даже тРНК, связанной с мРНК
и рибосомными белками.

27.5. В узнавании кодона участвует


антикодон, а не активированная присоединенный остаток цистеина превра-
тили в аланин, обработав Cys-тРНК C y s ни-
аминокислота
Мы уже упоминали, что антикодон келем Ренея. В результате атом серы отде-
лился от активированного остатка цисте-
тРНК - участок, узнающий кодон мРНК,
ина; связь цистеина с тРНК при этом не
и что узнавание происходит путем спарива-
затрагивалась.
ния оснований. Играет ли какую-нибудь
роль в этом процессе аминокислота, присое- Так была получена гибридная аминоацил-
тРНК, в которой аланин ковалентно при-
диненная к тРНК? Ответ на этот вопрос
соединен к тРНК, специфичной к цистеину.
был получен следующим путем. Вначале ци-
стеин присоединили к соответствующей
тРНК (она обозначается тРНК С у s ). Затем

Рис. 27.7. Схематическое изображение


трехмерной структуры дрож-
Рис. 27.6. Фотография скелетной модели жевой фенилаланиновой
дрожжевой фенилаланиновой тРНК. (По рисунку, любезно
тРНК, основанная на карте предоставленному д-ром Sung-
электронной плотности с раз- Hou Kim.)
решением 3 А. (Печатается
с любезного разрешения д-ра
Sung-Hou Kim.) 27. Синтез белка 93
Какой кодон узнаёт эта гибридная Так, X и X' должны быть либо А и U (или
тРНК - аланина или цистеина? Ответ был U и А), либо G и С (или С и G). Из этой мо-
получен при использовании этой гибридной дели следует, что каждый антикодон может
тРНК в бесклеточной системе синтеза бел- узнавать только один кодон. Однако факты,
ка. Матрицей служил случайный сополимер, которыми мы располагаем, противоречат
построенный из U и G в соотношении 5 : 1 ; этому. Некоторые выделенные в чистом виде
в норме он вызывает включение цистеина молекулы тРНК могут узнавать более
(UGU), но не аланина (GCX). Но когда в ин- одного кодона. Например, дрожжевая алани-
кубационную смесь добавили Ala-тРНК Cys , новая тРНК, изученная Холли, связывается
произошло включение аланина в полипеп- с тремя кодонами: GCU, GCC и GCA.
тид. Другими словами, аланин включался Только первые два основания этих кодонов
так, как если бы к тРНК, специфичной к ци- одинаковы, третье различается. Может
стеину, был присоединен цистеин. Был сде- быть, узнавание третьего основания кодона
лан вывод, что узнавание кодона не зависит иногда менее избирательно, чем узнавание
от аминокислоты, прикрепленной к двух других? Общая картина вырожденно-
тРНК. сти генетического кода показывает, что дело
Такой же результат был получен в тех может обстоять именно так. XYU и XYC
случаях, когда роль матрицы выполняла всегда кодируют одну и ту же аминокисло-
гемоглобиновая мРНК. В качестве гиб- ту, a X Y A и XYG обычно имеют одинаковый
ридной аминоацил-тРНК использовали смысл. Исходя из этих данных, Крик пред-
14
С-аланил-тРНКCys. Единственный ра- положил, что на спаривание третьего осно-
диоактивный триптический пептид (т. е. пеп- вания должны накладываться менее строгие
тид, содержащий 14С-аланин) соответство- стерические ограничения, чем на спаривание
вал пептиду, который в норме содержит двух других. Были построены модели раз-
цистеин, а не аланин. С другой стороны, ни личных вариантов спаривания оснований,
в одном пептиде, который в норме содержит чтобы определить, какие из них сходны со
аланин, а не цистеин, не было обнаружено стандартными А — U - и G—С-парами в от-
метки. Этот эксперимент, равно как и пре- ношении расстояния и угла между глико-
дыдущий, убедительно доказал, что амино- зидными связями. В это исследование был
кислота в аминоацил-тРНК не играет ника- включен инозин, так как он встречается в не-
кой роли в выборе кодона. которых антикодонах. Если предположить,
что в спаривании третьего основания кодо-
27.6. Молекула транспортной РНК на допустима некоторая стерическая свобо-
может узнавать более одного кодона да («качание», или неоднозначное соответ-
благодаря «качаниям» ствие), то комбинации, приведенные
По каким правилам происходит узнавание в табл. 27.2, кажутся вполне возможными.
кодона антикодоном в тРНК? Проще всего В настоящее время правомочность гипо-
предположить, что каждое из оснований ко- тезы «качаний» доказана. Антикодоны
дона образует уотсон-криковскую пару ос- тРНК с известной последовательностью
нований с комплементарным основанием связываются с теми кодонами, которые
антикодона. Тогда кодон и антикодон дол- предсказывает эта теория. Например, анти-
жны полностью соответствовать друг другу кодоном дрожжевой аланиновой тРНК
с учетом антипараллельности (на схеме
штрих обозначает комплементарное осно-
вание): Таблица 27.2. Допустимые типы спаривания третьего ос-
нования кодона в соответствии с гипотезой «качаний»

Первое основание Третье основание


антикодона кодона

C G
А U
U А или G
G U или С
Часть IV. I U, С или А
94 Информация
является IGC. Эта тРНК узнает кодоны основание в антикодоне. Эти спонтанные
GCU, GCC и GCA: события противоположны по своей сути хи-
мической модификации in vitro аминокис-
лоты, прикрепленной к тРНК. Любопытна
история открытия таких мутантных тРНК.
В течение многих лет генетики знали, что
повреждающее действие некоторых мута-
ций может быть подавлено другой мута-

Итак, I спаривается с U, С и А, как и пред-


сказывает теория.
Фенилаланиновая тРНК, имеющая анти-
кодон GAA, узнает кодоны UUU и UUC, но
не UUA и UUG:

Таким образом, G спаривается с U или с С


в третьем положении кодона, как и пред-
сказывает гипотеза качаний.
Можно сделать два обобщения, касаю-
щихся кодон-антикодонового взаимодей-
ствия.
1. Первые два основания кодона спари-
ваются обычным образом. Узнавание про-
исходит точно. Следовательно, кодоны, ко-
торые различаются по одному из первых
двух оснований, должны узнаваться раз-
личными тРНК. Например, и UUA, и CUA
кодируют лейцин, но считываются раз-
личными тРНК.
2. Первое основание антикодона опреде-
ляет, считывает ли данная молекула тРНК
один, два или три типа кодонов: С и А уз-
нают по одному кодону, U и G - по два ко-
дона, I - три кодона. Итак, одна из причин
вырожденности генетического кода заклю-
чается в неточности, или неоднозначности,
спаривания («качании») третьего основания
кодона. Именно в этом мы усматриваем ос-
новную причину распространенности не-
обычного нуклеозида инозина в антикодо-
нах. Инозин увеличивает число кодонов,
которые способна считывать данная мо-
лекула тРНК (рис. 27.8). Рис. 27.8. Благодаря «качаниям» инозин
может давать пары оснований
27.7. Мутантные молекулы транспортных с цитозином, аденином и ура-
РНК могут подавлять другие мутации цилом.
Новый этап в изучении процесса узнавания
кодона начался в связи с исследованиями
мутантных тРНК, в которых изменено одно 27. Синтез белка 95
Рис. 27.9. Супрессия мутации, приво- различных генах. Один из этих супрессоров
дящей к терминации цепи, вто- считывает UAG как кодон тирозина,
рой мутацией в молекуле
тРНК.

цией. Предположим, какой-то фермент стал


неактивным из-за превращения кодона
GCU (аланин) в кодон GAU (аспартат). Му-
тации какого рода могли бы восстановить
активность этого фермента? что может привести к синтезу активного
1. Обратная мутация того же основания белка вместо неполной полипептидной цепи
А—>С даст исходное кодовое слово. (рис. 27.9). Почему же эта мутантная РНК
2. Другая мутация A—>U даст валин вставляет тирозин в ответ на кодон UAG?
(GUU), который, возможно, полностью или В норме тирозиновая тРНК узнает кодоны
частично восстановит активность фермента. UAC и UAU. Эта мутантная тРНК идентич-
3. Мутация в другом месте того же гена на нормальной тирозиновой тРНК, за ис-
может обратить действие первой мутации. ключением одной замены основания в анти-
Такой измененный белок будет отличаться кодоне: GUA—>CUA. Мутация G—>С пер-
от белка дикого типа двумя аминокислота- вого основания антикодона меняет специ-
ми. фичность узнавания. Как предсказывает
4. Мутация в другом гене может преодо- теория «качаний», измененный антикодон
леть повреждающее действие первой мута- может узнавать только UAG.
ции. Это явление называется межгенной Супрессорная тРНК этого типа будет за-
супрессией. креплена отбором скорее всего в том случае,
В течение долгого времени механизм дей- если мутировавшая тРНК не была необхо-
ствия межгенных супрессоров оставался за- димой. Иными словами, должна существо-
гадкой. Теперь мы знаем из генетических вать другая разновидность тРНК, которая
и биохимических исследований, что боль- узнает те же кодоны, что и мутировавшая
шинство таких супрессоров действует, из- тРНК. Действительно, у E.coli имеются две
меняя считывание мРНК. Рассмотрим различные тРНК, которые в норме узнают
к примеру мутацию, которая приводит к по- кодоны UAC и UAU. Изменяется та тРНК,
явлению терминирующего кодона UAG которая присутствует в небольшом количе-
(т. е. стоп-кодона, или сигнала терминации). стве. Функция этой минорной разновидно-
Результатом мутации будет образование сти тирозиновой тРНК в норме неясна.
неполных полипептидных цепей. Такие му- В связи с существованием такой супрессор-
тации называются нонсенс-мутациями (от ной мутации возникает еще один вопрос. Ес-
англ. nonsense - бессмысленный), так как не- ли мутантный кодон в UAG считывается
полные полипептиды обычно неактивны. как тирозин, а не как сигнал терминации,
Действие нонсенс-мутации UAG может что происходит при нормальной термина-
быть подавлено мутациями в нескольких ции цепей? Как ни странно, большинство
полипептидных цепей в клетках супрессор-
Часть IV. ного мутанта терминируется нормально,
96 Информация возможно, по той причине, что сигнал тер-
супрессия не обладает стопроцентной эф-
фективностью.
Были обнаружены и другие виды му-
тантных тРНК. Миссенс-супрессоры изме-
няют считывание мРНК, так что в ответ на
некоторые кодоны вставляется измененная
аминокислота (например, глицин вместо ар-
гинина). Особенно интересны супрессоры
сдвига рамки. Одна из таких тРНК содержит
лишнее основание в антикодоновой петле.
Благодаря этому она считывает в качестве
кодона четыре основания вместо трех. На-
пример, UUUC считывается как кодон фе-
нилаланина вместо UUU. Такая измененная
тРНК может супрессировать вставку лиш-
него основания.

27.8. Рибосомы - органеллы,


в которых происходит синтез белка,-
состоят из большой и малой субчастиц
Перейдем теперь к механизму синтеза бел-
ка. Этот сложный процесс происходит в ри-
босомах, которые можно рассматривать как
органеллы синтеза белка, подобно тому как
митохондрии считают органеллами окисли-
тельного фосфорилирования. Рибосома -
весьма специализированная и сложная
структура. Ее диаметр - примерно 200 А.
Лучше всего изучены рибосомы E.coli. Мас-
са этой рибосомы составляет 2500 кДа,
а коэффициент седиментации 70S. Ее можно
диссоциировать на большую (50S) и малую
(30S) субчастицы. Далее эти субчастицы
можно диссоциировать на составляющие их
белки и РНК. 30S-субчастица содержит 21
белок и одну молекулу 16S-PHK. 50S-субча-
стица содержит примерно 34 белка и 2 моле-
кулы РНК (23S и 5S). Рибосома E.coli при-
мерно на две трети состоит из РНК и на
одну треть - из белка.
Рибосомы цитоплазмы эукариотических
клеток несколько крупнее бактериальных
рибосом. Интактная эукариотическая рибо-
сома имеет коэффициент седиментации 80S.
Подобно бактериальной рибосоме, она дис-
Рис. 27.10. Электронные микрофотогра- социирует на большую (60S) и малую (40S)
фии 70S-рибосом (А), 50S-суб- субчастицы. Малая субчастица содержит
частиц (Б) и 30S-субчастиц (В). одну молекулу 18S-PHK, а большая субча-
(Печатается с любезного разре- стица - три молекулы РНК (28S, 7S1) и 5S).
шения д-ра James Lake.) Рибосомы митохондрий и хлоропластов от-
личаются от цитоплазматических рибосом
минации представляет собой нечто боль- 1
Эту рРНК по сложившейся традиции чаще
шее, чем просто кодон UAG. Действитель- обозначают 5,8S-PHK.- Прим. перев.
но, известно, что некоторые кодирующие
последовательности заканчиваются двумя
различными стоп-кодонами. Кроме того, 27. Синтез белка 97
1. 16S-PHK необходима для ее сборки
и функционирования. Эта потребность весь-
ма специфична, так как 16S-PHK из дрож-
жей не может заменить 16S-PHK из E.coli.
Роль молекул рибосомной РНК остается
областью пристального интереса со сто-
роны исследователей.
2. В опытах по реконструкции каждый
раз из системы исключали один из белков,
чтобы выяснить, может ли интактная
30S-субчастица образоваться из остальных
20 белков и 16S-PHK. Оказалось, что по
крайней мере шесть белков необходимо для
сборки 30S-частицы.
3. Для сборки функционально активной
Рис. 27.11. Рибосомы можно диссоцииро- 30S-частицы необходимо большинство вхо-
вать примерно на 55 белков дящих в нее белков. Итак, 30S-субчастица
и три молекулы РНК. представляет собой кооперативную целост-
ную в функциональном отношении структу-
ру.
эукариот. Они больше похожи на 70S-ча- 27.10 Белки синтезируются в направлении
стицы, а не на 80S. Между синтезом белка от аминоконца к карбоксильному концу
в митохондриях, хлоропластах и бактериях Одним из первых вопросов, касающихся ме-
имеется много общего. ханизма синтеза белка, был вопрос о том,
синтезируются ли белки в направлении от
27.9. Рибосомы можно реконструировать из аминоконца к карбоксильному концу или
составляющих их молекул белков и РНК
наоборот. Четкий ответ на этот вопрос дали
Рибосомную 30S-субчастицу можно рекон- опыты Говарда Динциса (Howard Dintzis)
струировать из смеси 16S-PHK и 21 белка, с импульсной меткой. Ретикулоциты, актив-
входящего в ее состав. Сборку этих компо-
нентов с образованием функционально ак-
тивной 30S-субчастицы впервые осуществил
Масаясу Номура (Masayasu Nomura)
в 1968 г. Через несколько лет была рекон-
струирована 50S-субчастица. Эти экспери-
менты имели важное значение в двух отно-
шениях. Во-первых, они продемонстрирова-
ли, что вся информация, необходимая для
сборки этой органеллы, содержится в струк-
туре ее компонентов. Для сборки не нужны
никакие внерибосомные факторы. Таким
образом, образование рибосом in vitro пред-
ставляет собой процесс самосборки. Во-
вторых, реконструкцию можно использо-
вать для того, чтобы выяснить, необходим
ли тот или иной компонент для сборки ри-
босомы или собственно для ее функциони-
рования. Например, таким образом был вы-
явлен компонент рибосомы, отвечающий за
ее чувствительность к антибиотику стрепто- Рис. 27.12. Разделение белков рибосом-
мицину (разд. 27.20). Из работ по рекон- ной 50S-субчастицы с по-
струкции 30S-субчастицы были сделаны сле- мощью двумерного электро-
дующие выводы. фореза в полиакриламидном
геле. (Печатается с любезного
Часть IV. разрешения д-ра Charles
98 Информации Cantor.)
27.11. Информационная РНК транслируется
в направлении 5'—>3'
Направление считывания мРНК определя-
ли с помощью синтетического полинуклео-
тида

использованного в качестве матрицы в бес-


клеточной системе синтеза белка. ААА ко-
дирует лизин, а ААС-аспарагин. Полипеп-
тидный продукт имел структуру

Поскольку аспарагин был расположен на


карбоксильном конце, кодон ААС был счи-
тан последним. Следовательно, трансляция
идет в направлении 5'—>3'. Напомним, что
мРНК также синтезируется в направлении
5'—>3' (разд. 25.14). Это означает, что мРНК
может транслироваться уже в то время, ког-
Рис. 27.13. Электрофоретическое разделе- да она еще синтезируется. Действительно,
ние в полиакриламидном геле
белков нативной рибосомной
30S-субчастицы (слева) и рекон-
струированной 30S-субча-
стицы (справа). В реконструи-
рованной субчастице присут-
ствуют все те же белки, что и
в нативной. (Печатается с лю-
безного разрешения д-ра
Masayasu Nomura.)

но синтезирующие гемоглобин, инкубиро-


вали в присутствии 3 Н-лейцина в течение
коротких промежутков времени, недоста-
точных для синтеза полных цепей. Синтези-
рованный в этих условиях гемоглобин раз-
деляли на α- и β-цепи и обрабатывали
трипсином. Затем определяли удельную ра- 3
диоактивность полученных пептидов, т.е. Рис. 27.14. Распределение Н-лейцина
отношение их радиоактивности к общему в α-цепи гемоглобина, синтези-
содержанию лейцина. В пептидах, располо- рованного после инкубации ре-
женных в нативном белке вблизи карбок- тикулоцитов в течение корот-
сильного конца, было больше радиоактив- кого времени в присутствии
ности, чем в пептидах вблизи аминоконца. метки. Более высокая радиоак-
Наблюдалось постепенное возрастание ра- тивность С-конца по сравне-
диоактивности от аминоконца к карбоксиль- нию с N-концом указывает, что
ному концу (рис. 27.14). Сильнее всего был С-конец синтезируется послед-
помечен карбоксильный конец, так как он ним.
синтезировался последним. Следовательно,
направление роста цепей — от аминоконца
к карбоксильному концу. 27. Синтез белка 99
у E.coli 5'-конец мРНК взаимодействует
с рибосомами вскоре после того, как он син-
тезируется (рис. 27.15). Таким образом,
трансляция тесно сопряжена с транскрип-
цией.

27.12. Одну молекулу мРНК одновременно


транслирует несколько рибосом
Одну молекулу мРНК могут одновременно
транслировать несколько рибосом. Это су-
щественно увеличивает эффективность ис-
пользования мРНК. Группа рибосом, свя-
занных с одной молекулой мРНК, назы-
вается полирибосомой или полисомой. Рибо-
сомы, входящие в состав этой структуры,
работают независимо, и каждая из них син-
тезирует полную полипептидную цепь. При
максимальной плотности рибосом на
мРНК одна рибосома приходится на 80 ну-
клеотидов. Полирибосомы, синтезирующие
гемоглобин (цепь гемоглобина содержит
145 аминокислот, а мРНК - соответственно
500 нуклеотидов), обычно состоят из пяти
рибосом. Рибосомы, расположенные ближе Рис. 27.15. Транскрипция участка ДНК
всего к 5'-концу мРНК, несут самые корот- E.coli и трансляция новообра-
кие полипептидные цепи, а те, что ближе зующейся мРНК. Транскриби-
к 3'-концу,- почти полные цепи. После осво- руется лишь часть хромосомы.
бождения полипептидного продукта рибо- [Miller О. L, Hamkalo В. А.,
сомы диссоциируют на 30S- и 50S-субча- Thomas С. A., Jr., Visualization
стицы. of Bacterial Genes in Action,
Science, 169, 392 (1970).]
27.13. Синтез белка в бактериях
инициируется формилметиониновой тРНК
Как начинается синтез белка? A priori про-
стейшая возможность состоит в том, что Ключом к изучению механизма инициа-
транслируется вся мРНК, и никакие особые ции цепи стало открытие того факта, что
сигналы начала синтеза не нужны. Однако примерно половина N-концевых аминокис-
эксперименты показали, что трансляция не лот белков E.coli - метионин, хотя в других
начинается непосредственно на 5'-конце положениях полипептидной цепи эта амино-
мРНК. На самом деле первый трансли- кислота встречается редко. Кроме того, N-
руемый кодон почти всегда расположен на конец новообразованных белков обычно
расстоянии не менее чем 25 нуклеотидов от модифицирован, из чего следует, что в ини-
5'-конца. К тому же многие молекулы циации, очевидно, участвует какое-то про-
мРНК у прокариот полицистронны, т.е. ко- изводное метионина. Действительно, синтез
дируют две или более полипептидные цепи. белка у бактерий начинается с формилме-
Например, одна молекула мРНК длиной тионина (fMet). Существует особая тРНК,
около 7000 нуклеотидов кодирует пять фер- которая переносит формилметионин к ри-
ментов пути биосинтеза триптофана у E.coli. босоме для инициации синтеза белка. Эта
Каждый из этих пяти ферментов имеет инициаторная тРНК (сокращенно обозна-
собственные сигналы начала и конца транс- чается mPHKf) отличается от той тРНК, ко-
ляции в мРНК. На деле все изученные моле- торая вводит метионин во внутренние поло-
кулы бактериальных мРНК содержат сиг- жения (сокращенно тРНК m ). Буква f указы-
налы начала и конца каждой кодируемой вает, что метионин, присоединенный
ими полипептидной цепи. к инициаторной тРНК, может быть форми-
лирован, тогда как метионин, присоеди-
Часть IV. ненный к тРНК m ,- нет.
100 Информация Метионин присоединяет к этим двум раз-
Рис. 27.16. Схематическое изображение
организации полирибосомы
(полисомы). Рибосомы дви-
жутся вдоль мРНК в направле-
нии 5'—>3'. Рибосомы рабо-
тают независимо друг от друга.

новидностям тРНК одна и та же аминоа-


цил-тРНК—синтетаза. Затем специальный
фермент формилирует аминогруппу ме-
тионина, присоединенного к тPHK f . Донор
активированной формильной группы в этой 27.14. Сигналом инициации служит кодон
реакции N 10 -формилтетрагидрофолят. AUG (или GUG), которому предшествует
несколько оснований, способных спариваться
с 16S-PHK
Какие структурные особенности мРНК по-
зволяют системе синтеза белка различать
кодоны AUG? Первым шагом на пути к ре-
шению этого вопроса было выделение ини-
циаторных участков ряда мРНК. Для этого
комплексы мРНК с рибосомами, образо-
вавшиеся в условиях, допускающих инициа-
цию, но не элонгацию, расщепляли панкреа-
тической рибонуклеазой. Во всех случаях от
расщепления была защищена последова-
тельность длиной около 30 нуклеотидов.
Как и предполагалось, каждый из этих ини-
циирующих участков содержал кодон AUG
или GUG (рис. 27.18).
Кроме того, каждый участок инициации
содержит богатую пуринами последова-
тельность, центр которой находится на рас-
стоянии примерно 10 нуклеотидов в 5'-сто-
рону от инициирующего кодона. Роль этого
богатого пуринами участка стала ясна, ког-
да была расшифрована последовательность
16S-PHK. 3'-конец этой рибосомной РНК
содержит последовательность из несколь-
ких оснований, комплементарную богатому
пурином участку в областях инициации

Рис. 27.17. Образование формилметио-


нил-тРНК f . 27. Синтез белка 101
Рис. 27.18. Последовательности участков комплекса без мРНК, a IF-1 и IF-2 способ-
инициации синтеза белка неко- ствуют связыванию инициаторной тРНК
торых бактериальных и ви- с комплексом мРНК и 30S-субчастицы.
русных РНК. Затем 50S-cyбчастица присоединяется
к инициаторному 30S-комплексу, образуя
инициаторный 70S-комплекс. На этом этапе
мРНК. Из продуктов ферментативного рас-
происходит гидролиз связанного GTP. 70S-
щепления инициирующего комплекса уда-
инициаторный комплекс (рис. 27.20) готов
лось выделить комплекс 3'-концевого фраг-
к стадии элонгации белкового синтеза. Мо-
мента 16S-мРНК и области инициации лекула fMet-тPHK f занимает Р-участок (пеп-
мРНК (рис. 27.19). Последовательности бо-
тидильный участок) рибосомы. Второй уча-
лее чем 70 изученных участков инициации
сток на рибосоме для связывания молекулы
показывают, что число пар оснований, ко-
тРНК-А-участок (аминоацильный) - еще
торые мРНК образует с 16S-PHK, колеблет-
пуст. Существование раздельных участков
ся от 3 до 9. Интересно, что изменение силы
Р и А было показано при изучении пуроми-
этого взаимодействия дает возможность ре-
цина - антибиотика, о котором говорится
гулировать эффективность инициации.
ниже (разд. 27.21). Сейчас важно отметить,
Итак, место начала синтеза белка опреде- что fMet-тPHK f располагается таким обра-
ляется взаимодействиями двух типов: спа-
зом, что антикодон спаривается с иниции-
риванием оснований мРНК с 3'-концом
рующим кодоном AUG (или GUG) в мРНК.
16S-pPHK и с формилметиониновой инициа-
Таким образом, рамка считывания устана-
торной тРНК.
вливается специфическим взаимодействием
рибосомы и fMet-тPHK f с мРНК. Напом-
27.15. В результате образования
инициирующего 70S-комплекса формил-
ним, что в этом взаимодействии участвует
метиониновая тРНК связывается
богатый пурином участок, расположенный
со стороны 5'-конца от инициирующего ко-
с Р-участком
Синтез белка начинается с ассоциации дона. Он спаривается с 3'-концом 16S-PHK,
мРНК, рибосомной 30S-субчастицы и фор- входящей в состав 30S-субчастицы. Выясне-
милметиониновой тРНК. Они образуют ние этого сложного способа, которым до-
30S-комплекс инициации (рис. 27.20). Для стигается правильная ориентация инициа-
торной тРНК, породило любопытную про-
образования этого комплекса необходимы
GTP и три белковых фактора, называющих- блему. Каким же образом в опытах по
ся IF-1, IF-2 и IF-3. Один из этих факторов расшифровке генетического кода
(разд. 26.3) могли транслироваться poly(U)
инициации - IF-3 - участвует в связывании
мРНК с 30S-субчастицей. Кроме того, IF-3 и другие синтетические полипептиды без
препятствует ассоциации 50S- и 30S-субча- сигналов начала трансляции? Ответ заклю-
стиц с образованием непродуктивного 70S- чается в том, что, к счастью, в этих экспери-
ментах происходила неспецифическая
трансляция благодаря тому, что концентра-
Часть IV. ция Mg 2 + в реакционной смеси была выше,
102 Информация чем это имеет место in vivo.
Рис. 27.19. Спаривание богатого пурином 27.17. После образования пептидной связи
участка (показано синим цве- происходит транслокация
том) в области инициации Теперь у нас имеется комплекс, в котором
мРНК и 3'-концевого участка аминоацил-тРНК занимает А-участок,
16S-pPHK (красный цвет). Ко-
дон AUG (зеленый цвет) опре-
деляет начало полипептидной
цепи. Показанная на рисунке
мРНК кодирует А-белок фага
R17.

27.16. Фактор элонгации Тu доставляет


аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы
Цикл элонгации белкового синтеза вклю-
чает три этапа: 1) связывание аминоацил-
тРНК (узнавание кодона); 2) образование
пептидной связи; 3) транслокация. Цикл
начинается с введения аминоацил-тРНК
в пустой А-участок рибосомы. Выбор опре-
деленной разновидности тРНК зависит от
того, какой кодон мРНК находится
в А-участке. Комплементарная аминоацил-
тРНК доставляется в А-участок белком,
который называется фактором элонгации
EF-Tu. Когда аминоацил-тРНК занимает
правильное положение на рибосоме, проис-
ходит гидролиз GTP, связанного с EF-Tu.
GDP остается прочно связанным с EF-Tu
до тех пор, пока он не вытесняется другим
фактором элонгации, а именно EF-Ts.
Образовавшийся комплекс Тu с Ts распа-
дается при связывании GTP с Тu; новый
комплекс Tu-GTP готов для следующего
раунда элонгации. Эта ассоциация и диссо-
циация белков (рис. 27.21) ускоряется
и приобретает характер повторяющегося
цикла за счет энергии гидролиза GTP.
Важно отметить, что EF-Tu не взаимо-
действует с fMet-mPHK f . Поэтому ини- Рис. 27.20. Стадия инициации синтеза бел-
циаторная тРНК не попадает в А-участок. ка: образование 30S-комплекса
В то же время Меt-тРНКm связывается инициации и затем 70S-ком-
с EF-Tu, подобно всем другим аминоацил- плекса инициации.
тРНК. Этим и объясняется тот факт, что
внутренние кодоны AUG не считываются
инициаторной тРНК. 27. Синтез белка 103
Рис. 27.21. Цикл реакций с участием фак- действовать каталитически. Транслока-
тора элонгации Тu. ция - еще один пример направленного дви-
жения, энергию для которого обеспечивает
а fMet-тРНК занимает Р-участок. Все гото- гидролиз нуклеозидтрифосфата. После
во к образованию пептидной связи транслокации А-участок освобождается
(рис. 27.22). Эту реакцию катализирует пеп- и подготавливается к связыванию аминоа-
тидилтрансфераза - фермент, представляю- цил-тРНК, чтобы начать новый цикл элон-
щий собой составную часть 50S-субча- гации (рис. 27.23).
стицы. Активированный формилметиони-
новый остаток fMet-TPHK f (расположенной 27.18. Синтез белка терминируется
в Р-участке) переносится на аминогруппу факторами освобождения
аминоацил-тРНК (в А-участок), образуя Если А-участок рибосомы занят кодонами
дипетидил-тРНК. UAA, UGA или UAG, то связывания ами-
После образования пептидной связи не- ноацил-тРНК обычно не происходит. Нор-
нагруженная тРНК занимает Р-участок, мальные клетки не содержат тРНК с анти-
а дипептидил-тРНК занимает А-участок. кодонами, комплементарными сигналам
Следующий этап цикла элонгации - транс- термииации. Их узнают белковые факторы
локация. Происходят три перемещения: не- освобождения. Один из этих факторов ос-
нагруженная тРНК покидает Р-участок, вобождения - RF-1 - узнает кодоны UAA
пептидил-тРНК переходит из А-участка или UAG. Второй фактор освобождения —
в Р-участок и мРНК продвигается на три RF-2 - узнает UAA или UGA. Таким обра-
нуклеотида. В результате следующий ко- зом, белки способны узнавать тринуклео-
дон занимает нужное положение для тидные последовательности с высокой спе-
считывания очередной мРНК. Для транс- цифичностью.
локации необходим третий фактор элонга- Связывание одного из факторов освобо-
ции - EF-G (называемый также транслока- ждения с терминирующим кодоном
зой). Во время транслокации происходит в А-участке каким-то образом активирует
гидролиз GTP, связанного с EF-G. Гидро- пептидилтрансферазу, и она гидролизует
лиз GTP обусловливает отделение EF-G связь между полипептидом и тРНК в Р-
от рибосомы. Следовательно, GTP может участке. Фактор освобождения изменяет
специфичность пептидилтрансферазы та-
Часть IV. ким образом, что акцептором активиро-
104 Информация ванного пептидильного остатка становится
лазой. Под действием аминопептидазы мо-
жет произойти отщепление одного или
нескольких N-концевых остатков. И у про-
кариот, и у эукариот концевой метионин
иногда отщепляется в то время, когда син-
тез остальной полипептидной цепи еще
продолжается.
2. При окислении двух цистеиновых
остатков могут образоваться дисульфидные
связи.
3. Боковые цепи некоторых аминокислот
могут быть специфически модифициро-
ваны. Например, некоторые остатки про-
лина и лизина в коллагене гидроксили-
руются. Гликопротеины образуются путем
присоединения сахаров к боковым цепям
аспарагина, серина и треонина. Некоторые
белки фосфорилируются. К ферментам ко-
валентно присоединяются простетические
группы, например липоевая кислота.
4. Полипептидные цепи могут подвер-
гаться специфическому расщеплению, на-
пример при превращении проколлагена
в коллаген и проинсулина в инсулин.
Трансляция мРНК вируса полиомы дает
очень длинную полипептидную цепь, кото-
рая гидролизуется с образованием не-
скольких белков.
27.20. Стрептомицин ингибирует инициацию
и вызывает неправильное считывание
информационной РНК
Мы уже видели, что антибиотики - чрезвы-
чайно важный инструмент в биохимиче-
ских исследованиях, так как действие мно-
гих антибиотиков весьма специфично. На-
пример, рифампицин - мощный ингибитор
инициации синтеза РНК (разд. 25.18). Из-
вестно много антибиотиков, ингибирую-
щих синтез белка (табл. 27.3). В случае
Рис. 27.22. Образование пептидной связи. некоторых из них установлен и меха-
низм действия. Стрептомицин - сильно ос-
новной трисахарид - препятствует связыва-
Н 2 О, а не аминогруппа. Затем полипептид- нию формилметионил-тРНК с рибосомами
ная цепь покидает рибосому. 70S-рибосома и нарушает таким образом правильную
диссоциирует на 30S- и 50S-субчастицы инициацию белкового синтеза. Кроме того,
и приготавливается к синтезу новой белко- стрептомицин вызывает неправильное
вой молекулы. считывание мРНК. Если в качестве матри-
цы используется poly(U), то наряду с вклю-
27.19. Многие белки модифицируются чением фенилаланина (UUU) происходит
после трансляции включение изолейцина (AUU). Место дей-
Многие полипептиды, образующиеся при ствия стрептомицина в рибосоме было
трансляции мРНК,- еще не окончательные определено в результате опытов по рекон-
продукты. Они могут быть впоследствии струкции компонентов рибосом из чув-
модифицированы различными способами.
1. Формильная группа на N-конце бакте-
риальных белков гидролизуется деформи- 27. Синтез белка 105
Рис. 27.23. Стадия элонгации синтеза бел-
ка: связывание аминоацил-
тРНК, образование пептидной
связи и транслокация.

ствительных и устойчивых к стрептомици-


ну бактерий. Такие штаммы бактерий
различаются мутацией в единственном
гене. Чем же различаются эти рибосомы?
Поскольку рибосомы можно диссоцииро-
вать и реконструировать in vitro, предста-
влялась возможность выяснить, где распо-
ложен детерминант чувствительности
к стрептомицину - в 50S- или 30S-субчасти-
це. Гибридные рибосомы из 50S-субчастиц
устойчивых бактерий и 30S-субчастиц чув-
ствительных бактерий оказались чувстви-
тельными к стрептомицину, а рибосомы, по-
лученные из субчастиц в обратной комбина-
ции, устойчивы к нему. Этот эксперимент
показал, что детерминант чувствительно-
сти к стрептомицину локализован в 30S-суб-

Часть IV.
106 Информация
Таблица 27.3. Антибиотики - ингибиторы синтеза белка

Антибиотик Действие

Стрептомицин Ингибирует инициацию и вызы-


вает неправильное считывание
мРНК (у прокариот)
Тетрациклин Связывается с 30S-субчастицей
и ингибирует связывание аминоа-
цил-тРНК (у прокариот)
Хлорамфеникол Ингибирует пептидилтрансфе-
разную активность 50S-субча-
стицы рибосом (у прокариот)
Циклогексимид Ингибирует пептидилтрансфе-
разную активность 60S-субча-
стины рибосом (у эукариот)
Эритромицин Связывается с 50S-субчастицей
и ингибирует транслокацию (у Рис. 27.24. Структура пуромицина напо-
прокариот) минает аминоацилированный
Пуромицин Вызывает преждевременную
конец аминоацил-тРНК.
терминацию цепи, действуя в ка-
честве аналога аминоацил-тРНК
(у прокариот и эукариот)
с рибосомы. Пуромицин был использован
для изучения функционального состояния
рибосом. Концепция существования А-
частице. Следующий эксперимент проде- и Р-участков возникла в результате опытов
монстрировал, что чувствительность с использованием пуромицина для выясне-
к стрептомицину определяется каким-то ния локализации пептидил-тРНК. Когда
белком 30S-субчастицы, а не молекулой пептидил-тРНК находится в А-участке (до
16S-PHK. Наконец, после ряда сложных транслокации), она не может вступать в ре-
экспериментов оказалось, что чувствитель- акцию с пуромицином.
ность к стрептомицину детерминируется
только одним белком, входящим в состав 27.22. Некоторые короткие пептиды
30S-субчастицы S12. синтезируются без участия рибосом
Теперь мы перейдем к другому механизму
27.21. Пуромицин вызывает преждевремен- образования пептидной связи в биологиче-
ную терминацию цепи, так как имитирует ских системах. Рассмотрим в качестве при-
амииоацилированную транспортную РНК мера биосинтез грамицидина S - цикличе-
Антибиотик пуромицин ингибирует синтез ского пептидного антибиотика, состоящего
белка, поскольку он освобождает ново- из двух идентичных пентапептидов, соеди-
образованные полипептидные цепи еше до ненных «голова к хвосту» (рис. 27.25). Этот
того, как завершается их синтез. Пуроми- антибиотик продуцируют некоторые
цин-аналог концевого участка аминоацил- штаммы спорообразующей бактерии
тРНК аминоациладенозина (рис. 27.24). Он Bacillus brevis.
связывается с А-участком рибосомы и пре- Биосинтез грамицидина S происходит
пятствует связыванию аминоацил-тРНК. в отсутствие рибосом или мРНК. Для него
Кроме того, пуромицин содержит α-амино- необходим гораздо более простой синтети-
группу. Эта аминогруппа, подобно амино- ческий аппарат, состоящий всего лишь из
группе аминоацил-тРНК, образует пептид- двух ферментов - EI и ЕII. Фермент ЕII
ную связь с карбоксильной группой расту- (масса 100 кДа) активирует фенилаланин,
щей пептидной цепи в результате реакции, остальные четыре аминокислоты пентапеп-
катализируемой пептидилтрансферазой. тидного фрагмента активируются EI (масса
Образующийся продукт представляет со- 180 кДа). Кроме того, оба фермента уча-
бой пептид с ковалентно присоединенным
остатком пуромицина на карбоксильном
конце. Затем пептидилпуромицин сходит 27. Синтез белка 107
переносится на иминогруппу L-пролиново-
го остатка, присоединенного к EI, с обра-
зованием дипептида. В последующих ре-
акциях участвует только E I . Активирован-
ная карбонильная группа остатка пролина
в составе дипептида реагирует с амино-
группой валинового остатка, прикреплен-
ного к тому же ферменту, и дает трипеп-
тид. Этот процесс повторяется с участием
орнитина и затем лейцина, образуя в ре-
зультате пентапептид, связанный с фермен-
том. С возникновением каждой новой пеп-
тидной связи растущий пептид переносится
на новую сульфгидрильную группу. Нако-

Рис. 27.25. Последовательность амино-


кислот в грамицидине S, цикли-
ческом пептиде, состоящем из
двух одинаковых пентапеп-
тидных групп.

ствуют в образовании пептидной связи.


В этой системе аминокислоты активи-
руются путем образования тиоэфиров, свя-
занных с ферментами. Вместо 3'-концевой
гидроксильной группы тРНК активиро-
ванные аминокислоты присоединяются
к сульфгидрильной группе EI и EII:

Если инкубировать L-пролин, L-валин,


L-орнитин и L-лейцин с EI в присутствии
АТР, они образуют тиоэфирные связи
с определенными сульфгидрильными груп-
пами ЕI. Точно так же D-фенилаланин
в присутствии АТР образует тиоэфирную
связь с ЕII. нец, активированные пентапептиды, при-
Синтез пептида в этой системе иниции- соединенные к двум различным молекулам
руется взаимодействием EI и ЕII. Остаток EI, реагируют друг с другом с образова-
D-фенилаланина, присоединенный к ЕII, нием циклического грамицидина S.

Часть IV.
108 Информация
Следует отметить две особенности этого на специфическая тРНК. Все транспортные
биосинтетического пути. РНК, обладающие различной специфич-
1. Аминокислотная последовательность ностью, характеризуются общим планом
грамицидина S определяется простран- строения. Это - одиночные цепи РНК дли-
ственной организацией и специфичностью ной примерно 80 нуклеотидов, содержащие
ферментов EI и ЕII. На каждую пептидную некоторые модифицированные (например.
связь приходится по меньшей мере одна метилированные) производные обычных
субъединица белка. Выходит, что этот спо- оснований. Последовательности оснований
соб синтеза уступает по экономичности всех известных тРНК могут быть напи-
рибосомному механизму. Поэтому пеп- саны в виде клеверного листа, в котором
тиды, содержащие более чем примерно 15 примерно половина нуклеотидов спарена.
остатков, не синтезируются с помощью Кристаллографические исследования с по-
этого механизма. мощью рентгеновских лучей показали, что
2. Синтез грамицидина S напоминает молекула тРНК имеет L-образную форму.
синтез жирных кислот в том отношении, На одном конце L-образной структуры на-
что активированными промежуточными ходится 3'-концевая ССА-последователь-
продуктами в обоих процессах служат ность, являющаяся местом присоединения
тиоэфиры. Кроме того, EI содержит кова- аминокислоты, на другом конце, на рас-
лентно связанный остаток фосфопантете- стоянии около 80А,- антикодон. Информа-
ина. Возможно, этот тиол переносит расту- ционная РНК узнает антикодон тРНК,
щую пептидную цепь с одного участка ЕI а не присоединенную к тРНК аминокисло-
на следующий. Фриц Липман (Fritz ту. Кодон мРНК образует пары оснований
Lipmann) предположил, что синтез полипеп- с антикодоном тРНК. Некоторые тРНК
тидных антибиотиков, возможно, предста- узнают более одного кодона благодаря то-
вляет собой как бы атавизм, напоминаю- му, что спаривание третьего основания ко-
щий о примитивном механизме синтеза дона менее избирательно, чем спаривание
белка, который использовался на заре эво- двух других (гипотеза «качаний», неодноз-
люции. Синтез рибосомных белков мог начного соответствия; wobble-hypothesis).
возникнуть в результате эволюции синтеза Синтез белка происходит на рибосомах,
жирных кислот. образованных из больших и малых субъе-
диниц. В каждом из них примерно две тре-
Заключение ти массы приходится на долю РНК и одна
Синтез белка (трансляция) зависит от треть-на белок. 70S-рибосома E.coli (мас-
координированного взаимодействия более са 2500 кДа) состоит из 30S- и 50S-субча-
чем 100 макромолекул, к которым, помимо стиц.
рибосом, относятся мРНК, тРНК, активи- Синтез белка происходит в три этапа,
рующие ферменты и белковые факторы. называемых соответственно инициацией,
Синтез белка начинается с активации ами- элонгацией и терминацией. Информацион-
нокислот аминоацил-тРНК-синтетазами ная РНК, формилметионил-тРНКf и 30S-
(активирующими ферментами) за счет субчастица рибосомы соединяются, образуя
энергии АТР. Синтетазы соединяют кар- 30S-комплекс инициации. Сигналом начала
боксильную группу аминокислоты с 2'- или трансляции служит кодон AUG (или
3'-гидроксильной группой остатка аденози- GUG), которому предшествует богатая пу-
на на 3'-конце тРНК. Для каждой амино- рином последовательность, способная спа-
кислоты имеется по меньшей мере один
активирующий фермент. Кроме того, для
каждой аминокислоты имеется хотя бы од- 27. Синтез белка 109
риваться с 16S-pPHK. Затем 50S-субчасти- и UAG, что приводит к гидролизу связи
ца рибосомы присоединяется к этому ком- между полипептидом и тРНК. При обра-
плексу, что приводит к образованию 70S- зовании 70S-комплекса инициации, при
комплекса инициации, готового к следую- связывании аминоацил-тРНК с рибосомой
щему этапу. Цикл элонгации включает и на стадии транслокации происходит ги-
связывание аминоацил-тРНК (узнавание дролиз GTP. Различные стадии синтеза
кодона), образование пептидной связи белка избирательно ингибируются токси-
и транслокацию. Рост цепи происходит нами и антибиотиками. Пептидные анти-
в направлении от N-конца к С-концу. биотики и другие короткие полипептиды
Терминацию синтеза белка осуществляют синтезируются без рибосом, причем меха-
факторы освобождения, которые узнают низм их образования напоминает синтез
терминирующие кодоны UAA, UGA жирных кислот.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ Транспортная РНК to nonsense triplets and ribosome bindi-


Schimmel P., Soil D., Abelson J. (eds.) ng sites, Proc. Nat. Acad. Sci., 71,
ЛИТЕРАТУРА
1979. Transfer RNA. Cold Spring 1342-1346.
С чего начать Harbor Laboratory. (В части I рассмо- Steitz J.A., Jakes K., 1975. How
трены структура, свойства и узнава- ribosomes select initiator regions in
Miller О.L., Jr., 1973. The visualization ние, а в части II - биосинтез и генетика mRN A: base pair formation between the
of genes in action, Sci. Amer., 228(3), тРНК. Авторитетный и содержа- 3'-terminus of 16S rRNA and the mRNA
34-42. тельный труд.) during initiation of protein synthesis in
Rich A., Kim S.H., 1978. The three- Kim S.-H., 1978. Three-dimensional Escherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci., 72,
dimensional structure of transfer RNA, structure of transfer RNA and its 4734-4738.
Sci. Amer., 238(1), 52-62. functional implications, Advan. Enzy- Gupta S.L, Waterson J., Sopori M.,
Clark B.F.C., Marcher K.A., 1968. mol, 46, 279-315. Weissman S.M., Lengyel P., 1971., Mo-
How proteins start, Sci. Amer., 218(1), Jack A., Ladner J.E., Klug A., 1976. vement of the ribosome along the
36-42. Crystallographic refinement of yeast messenger ribonucleic acid during
phenylalanine transfer RNA ot 2,5 A protein synthesis, Biochemistry, 10,
Книги, посвященные синтезу белка resolution, J. Mol. Biol., 108, 619-649. 4410-4421.
Weissbach H., Pestka S. (eds.), 1977. Sussman J.L., Kim S.-H., 1976. Three- Kaziro Y., 1978. The role of GTP in
Molecular Mechanisms of Protein dimensional structure of a transfer RNA polypeptide chain elongation, Biochim.
Biosynthesis, Academic Press. (Содер- in two crystal forms, Science, 192, Biophys. Acta, 505, 95-127.
жит статьи о синтетазах, структуре 853-858.
и функции рибосом, инициации, элон- Надежность трансляции
гации, транслокации, терминации Амноацил-тРНК синтетазы Fersht A., Dingwall C., 1979. Evidence
и антибиотиках-ингибиторах белко- Schimmel P.R., Soil D., 1979. Amino for the double-sieve editing mechanism
вого синтеза.) acyl-tRNA synthetases: general features in protein biosynthesis, Biochemistry,
and recognition of transfer RNAs, Ann. 18, 2627-2631.
Cold Spring Harbor Laboratory, 1969. Rev. Biochem., 48, 601-648.
Антибиотики и токсины
Mechanisms of Protein Biosynthesis
Pestka S., 1971. Inhibitors of ribosome
(Cold Spring Harbor Symposium on Инициация, элонгация и терминация
function, Ann. Rev. Microbiol., 25,
Quantitative Biology, vol. 34). Dintzis H.М., 1961. Assembly of
487-562.
the peptide chains of hemoglo-
Jimenez A., 1976. Inhibitors of trans-
Рибосомы bin, Proc. Nat. Acad. Sci., 47, 247-
lation, Trends Biochem. Sci., 1, 28-29.
Nomura M., Tissieres A., Lengyel P. 261. (Важные эксперименты по
(eds.) 1975. Ribosomes, Cold Spring импульсной метке, показавшие, что Tai P.-C., Wallace B.J., Davis B.D.,
Harbor Laboratory. (Содержит вели- белки синтезируются в направлении 1978. Streptomycin causes misreading of
natural messenger by interacting with
колепные статьи о структуре, функ- от аминоконца к карбоксильному
ribosomes after initiation, Proc. Nat.
ции и сборке рибосом.) концу.)
Brimacombe К., Staffer G., Witt- Steitz J.A., 1979. Genetic signals and Acad. Sci., 75, 275-279.
тапп H.G., 1978. Ribosome structure, nucleotide sequences in messenger RNA. Нерибосомный синтез пептидов
Ann. Rev. Biochem., 47, 217-249. In: Goldberger R.F. (ed.), Biological Lipmann F., 1971. Attempts to map
Wittman H.G., 1977. Structure and Regulation and Development, vol. I, a process evolution of peptide
function of Escherichia coli ribosomes, pp. 349-399, Plenum. biosynthesis, Science, 17 , 875-884.
Fed. Proc., 36, 2025-2080. Shine J., Dalgarno L., 1974. The Perlman D., Bondanszky M., 1971. Bio-
Nomura M., 1973. Assembly of bacterial 3'-terminal sequence of Escherichia coli synthesis of peptide antibiotics, Ann.
ribosomes, Science, 179, 864-873. 16S ribosomal R N A : complementarity Rev. Biochem., 40, 449-464.
Lipmann F., 1973. Nonribosomal poly-
Часть IV. peptide synthesis on polyenzyme
110 Информация templates, Ace. Chem. Res., 6, 361-367.
Вопросы и задачи активирующая группа отщепляется от при-
соединяющегося к растущей цепи мономе-
1. Образование Ile-тРНК происхо- ра. Укажите, по какому из механизмов, 1-му
дит через связанный с фермен- или 2-му, протекают следующие реакции
том промежуточный продукт Ilе-АМР. Бу- биосинтеза.
дет ли, по вашему мнению, образовываться а) Синтез гликогена.
32 32
Р-меченный АТР из РР i , если инкубиро- б) Синтез жирных кислот.
вать каждый из следующих наборов компо- в) С5 —> С10 —> С 15 при синтезе
нентов в присутствии специфического акти- холестерола.
вирующего фермента? г) Синтез ДНК.
32
а) АТР и PPi. д) Синтез РНК.
б) тРНК, АТР и РР i .
32
е) Синтез белка.
в) Изолейцин, АТР и 3 2 Р Р i . 5. Мутации, в результате которых
2. Из бактерий, выращенных на возникают терминирующие ко-
«тяжелой» (содержащей 13С и доны, называются нонсенс-мутациями. Эти
15
N) и на «легкой» ( 1 2 С и l4 N) среде, получи- мутации могут быть супрессированы изме-
ли рибосомы. Эти 70S-рибосомы добавили ненными тРНК. Например, мутантная РНК
в систему с активным синтезом белка in считывает кодон UGA как триптофановый
vitro. Через несколько часов из смеси ото- кодон. Какое наиболее вероятное замеще-
брали пробу и проанализировали ее центри- ние основания произошло в этой мутантной
фугированием в градиенте плотности. тРНК?
Сколько полос 70S-рибосом вы ожидаете 6. Придумайте реактив для кова-
увидеть в градиенте плотности? лентного мечения по сродству
3. Сколько богатых энергией фос- участков связывания тРНК в рибосоме. Как
фатных связей затрачивается на бы вы синтезировали такой реактив?
синтез белка из 200 остатков, если исходить 7. мРНК-транскрипт одного гена
из готовых аминокислот? фага Т7 содержит следующую
4. Существует два основных меха- последовательность оснований:
низма элонгации биологических
молекул (рис. 27.26). 1-й механизм основан

Предскажите, к какому результату приведет


мутация отмеченного стрелкой G при его
замене на А.
8. Что общего между коррекцией
ошибок при синтезе белка
и ДНК?
Рис. 27.26. Два механизма элонгации. Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,
на отщеплении активирующей группы (по- Wilson J.H., Benbow R.M., Hood L. E.,
меченной на рисунке крестиком) от расту- Biochemistry: A Problems Approach,
щей цепи. При синтезе по 2-му механизму Benjamin, 1974, ch. 18.
ГЛАВА 28 Главный фермент в метаболизме этого са-
хара - β-галактозидаза, гидролизующая
Регуляция выражения лактозу на галактозу и глюкозу (рис. 28.1).
При выращивании на лактозе клетка Е. coli
гена в фенотипе содержит несколько тысяч молекул β-галак-
Мы уже видели, что активность многих бел- тозидазы. Если же выращивать Е. coli на
ков регулируется с помощью различных ме- других источниках углерода, например на
ханизмов, например протеолитической ак- глюкозе или глицероле, то число молекул
тивации, аллостерических взаимодействий β-галактозидазы на клетку не достигает де-
и ковалентной модификации. В этой главе сяти. Лактоза индуцирует значительное уве-
рассматривается регуляция скорости синте- личение количества β-галактозидазы в клет-
за белка, которая также играет принци- ке Е. coli, причем она вызывает синтез новых
пиально важную роль в обшей картине ме- молекул фермента, а не активирует профер-
таболизма клетки. У бактерий активность мент (рис. 28.2). Следовательно, β-галакто-
гена регулируется в основном на уровне зидаза - индуцибельный фермент. Одновре-
транскрипции, а не трансляции. Мы сосредо- менно и согласованно с β-галактозидазой
точим внимание на лактозном и триптофа- синтезируются еще два белка - галактозид-

новом оперонах Е. coli и на регуляторных пермеаза и тиогалактозид-трансацетилаза.


аспектах цикла развития бактериофага λ, Пермеаза необходима для переноса лак-
так как молекулярные механизмы регуля- тозы через бактериальную клеточную мем-
ции в этих системах хорошо изучены. Более брану, трансацетилаза же не имеет суще-
того, именно интенсивное исследование ственного значения для метаболизма лак-
этих систем позволило сформулировать не- тозы. Физиологическая роль трансацети-
которые общие принципы регуляции выра- лазы пока не установлена, in vitro она ката-
жения гена в фенотипе (экспрессии гена) лизирует перенос ацетильной группы аце-
у прокариот и вирусов. Экспрессия гена у эу- тил-СоА на гидроксильную группу при С-6
кариот регулируется иначе, как это станет тиогалактозида.
очевидно из следующей главы. Физиологическим индуктором β-галакто-
зидазы является аллолактоза, которая обра-
28.1. β-Галактозидаза - зуется из лактозы в результате реакции
индуцибельный фермент трансгликозилирования. Синтез аллолак-
Е. coli может использовать лактозу в каче- тозы катализируется теми несколькими мо-
стве единственного источника углерода. лекулами β-галактозидазы, которые имеют-
ся в клетке еще до индукции. Изучение
Часть IV. природы индукторов показало, что неко-
112 Информация торые β-галактозиды служат индукторами,
от какого-то общего элемента, отличного
от генов, кодирующих их последовательно-
сти. Ген этого общего регуляторного эле-
мента был обозначен i. Индуцибельные бак-
терии дикого типа имеют генотип
+ + + +
i z y a , а конститутивные мутанты по
-- + + +
лактозным генам - генотип i z y a .
Каким образом осуществляется влияние
гена i на скорость синтеза белков, коди-
руемых генами z, у и а? Проще всего было
предположить, что ген i кодирует синтез не-
коего компонента цитоплазмы, названного
репрессором, которого либо совсем нет в
i---клетках, либо он там неактивен. Эта идея
была проверена в ряде изящных генетиче-
ских экспериментов с частично диплоидны-
ми бактериями, имевшими два набора генов
лактозной области. Один набор содержался
в бактериальной хромосоме, а второй - в по-
Рис. 28.1. β-Галактозидаза гидролизует ловом факторе F', введенном в клетку при
лактозу. конъюгации. Например, был получен ди-
плоид i + z - - / F i - - z + . У этого диплоида гены
i + z - - находятся в хромосоме, а гены i - - z + - в
не являясь при этом субстратами β-галакто- эписоме. Является ли этот диплоид индуци-
зидазы, тогда как другие соединения ведут бельным или конститутивным в отношении
себя как субстраты, не будучи при этом ин- β-галактозидазы? Другими словами, может
дукторами. Например, изопропилтиогалак- ли ген i+ бактериальной хромосомы подав-
тозид (ИПТГ) неметаболизируемый индук- лять экспрессию гена z+, расположенного
тор (его также называют холостым индук- в эписоме? Эксперимент дал совершенно
тором).

28.2. Открытие регуляторного гена


Ключом к изучению механизма индукции
β-галактозидазы стало открытие того фак-
та, что под действием всех исследованных
индукторов количество пермеазы и транса-
цетилазы возрастало прямо пропорцио-
нально количеству β-галактозидазы. Даль-
нейший прогресс был достигнут при изуче-
нии мутантов. Оно показало, что β-галакто-
зидаза, пермеаза и трансацетилаза коди-
руются тремя генами - z, у и а соответствен-
но - которые расположены друг за другом.
Были получены мутанты, утратившие спо-
собность к синтезу одного из этих белков.
Например, генотип z - - y + a + обозначает, что
у данного мутанта нет β-галактозидазы, но Рис. 28.2. Увеличение количества β-га-
имеются в нормальном количестве пермеа- лактозидазы идет параллельно
за и трансацетилаза. Наибольший интерес увеличению числа клеток в рас-
представляет класс мутантов, у которого тущей культуре E.coli. Наклон
мутацией затронуты все три белка. Такие этого графика указывает, что
конститутивные мутанты синтезируют без β-галактозидаза составляет
всякого индуктора большие количества 6,6% всего синтезируемого бел-
β-галактозидазы, пермеазы и трансацети- ка.
лазы. Франсуа Жакоб и Жак Моно (Francois
Jacob, Jacques Monod) пришли к выводу, что 28. Регуляция выражения
скорость синтеза этих трех белков зависит гена в фенотипе 113
Рис. 28.3. Карта лактозного оперона
и его регуляторного гена.
В карте масштаб не соблюден:
участки р и о в действительно-
сти гораздо меньше, чем коди-
рующие участки генов.

Рис. 28.4. Схема лактозного оперона 28.3. Оперон - единица координированной


в репрессированном (А) и инду- генетической экспрессии
цированном (Б) состояниях. На основе только что описанных экспери-
ментов Жакоб и Моно постулировали мо-
дель оперона, объясняющую регуляцию бел-
кового синтеза. Генетические элементы этой
четкий результат: диплоид индуцибелен, а не модели - регуляторный ген, операторный
конститутивен. Такой же результат был по- ген и набор структурных генов (рис. 28.3).
-- + + --
лучен и в отношении диплоида i z / F i z . Регуляторный ген продуцирует репрессор,
Следовательно, ген i кодирует способный который может взаимодействовать с опера-
к диффузии репрессор. торным геном. В дальнейшем выяснилось,
что репрессор представляет собой белок.
Часть IV. Операторный ген расположен рядом по со-
114 Информация седству со структурными генами, которые
он контролирует. Связывание репрессора способность связываться с ИПТГ. Уолтер
с операторным геном препятствует тран- Гилберт и Бенно Мюллер-Хилл (Walter
скрипции структурных генов. Операторный Gilbert, Benno Muller-Hill) установили, что
ген в совокупности со структурными гена- lас-репрессор - белок, который связывается
ми, рядом с которыми он расположен, назы- с ДНК, содержащей lас-оперон, но не связы-
вается опероном. В случае лактозного оперо- вается ни с одной другой ДНК. Как и пред-
на ген i - регуляторный ген, ген о - ген-опе- полагалось, ИПТГ подавляет связывание
ратор, а гены z, у и а - структурные гены. lас-репрессора с lас-операторной ДНК.
Кроме того, существует еще промоторный Клетка Е. coli дикого типа содержит всего
участок (обозначаемый символом р) для около десяти молекул lас-репрессора. При
связывания РНК-полимеразы. Этот участок очистке репрессора возникли трудности,
инициирования транскрипции расположен связанные с тем, что он составляет всего
перед операторным геном. Индуктор, на- 0,001% общего содержания белка. Однако
пример изопропилтиогалактозид (ИПТГ), существуют isq-мутанты, имеющие, по-види-
связывается с репрессором и тем самым на- мому, более эффективный промотор гена i.
рушает его взаимодействие с операторным У этих мутантов образуется гораздо боль-
геном. Теперь гены z, у и а могут транскри- ше lас-репрессора. Количество lас-репрессо-
бироваться. При этом образуется одна ра увеличивается еще сильнее, если исполь-
длинная молекула РНК, кодирующая все зовать трансдуцирующие фаги, несущие
три белка (рис. 28.4). Молекулу мРНК, ко- область lас. Зараженные таким фагом клет-
дирующую более одного белка, называют ки Е. coli содержат около 20 000 молекул ре-
полицистронным (или полигенным) тран- прессора (примерно 2% всего белка). Это
скриптом. прекрасный исходный материал для выделе-
ния lас-репрессора.
28.4. lас-Репрессор - тетрамерный белок Репрессор - тетрамер из идентичных
При выделении репрессора лактозного опе- субъединиц с массой 37 кДа, каждая из ко-
рона (lас-репрессор) была использована его торых имеет один участок связывания с ин-
дуктором. Константа диссоциации ИПТГ
составляет примерно 10 - 6 М. Репрессор
очень прочно и быстро связывается с опера-
тором. Константа диссоциации комплекса
репрессор-оператор составляет примерно
10 - 1 3 М. Такое высокое сродство обуслов-
лено тем, что в клетке Е. coli дикого типа со-
держится всего несколько молекул реп-
рессора. Константа скорости ассоциации
9 -1 -1
поразительно высока - 7•10 м •с . Из
этого следует, что репрессор находит опера-
торный участок, диффундируя вдоль моле-
кулы ДНК (одномерный поиск), а не ищет
его, находясь в водной среде (трехмерный
1
поиск) .

28.5. Последовательность оснований в


lас-операторе симметрична
Наличие чистого lас-репрессора сделало
возможным выделение lас-оператора
1
Недавно проведенные исследования показали,
что ситуация намного сложнее: поиск оператора
репрессором включает оба указанных механиз-
Рис. 28.5. Электронная микрофотогра- ма и в очень большой степени зависит от ион-
фия lас-репрессора, связанного ного состава среды.- Прим. перев.
с ДНК, содержащей lас-опера-
тор. (Печатается с любезного 28. Регуляция выражения
разрешения д-ра Jack Griffith.) гена в фенотипе 115
налам терминирования транскрипции
(разд. 28.8) и к связыванию пептидного
антибиотика актиномицина D с ДНК
1
(разд. 25.18) .

28.6. Циклический AMP стимулирует


транскрипцию многих индуцибельных
катаболических оперонов
Давно уже известно, что в клетках Е. coli,
растущих на глюкозе, активность катаболи-
ческих ферментов, таких, как β-галактозида-
за, галактокиназа, арабинозо-изомераза
и триптофаназа, находится на очень низком
уровне. Очевидно, было бы совершенно из-
лишним синтезировать эти ферменты в ус-
ловиях изобилия глюкозы 2 . Молекулярный
механизм такого ингибирующего действия
глюкозы, получивший название катаболит-
Рис. 28.6. lас-Репрессор защищает lас- ная репрессия, был расшифрован. Ключом
оператор от расщепления пан- к выяснению этого вопроса явились данные
креатической дезоксирибону- о том, что глюкоза понижает концентрацию
клеазой. циклического AMP в клетках Е. coli. Затем
обнаружилось, что экзогенный циклический
AMP снимает состояние репрессии, обусло-
и определение его последовательности ос- вленное присутствием глюкозы. Последую-
нований. Гилберт и его сотрудники, воздей- щие биохимические и генетические исследо-
ствовав ультразвуком на ДНК фага, содер- вания показали, что циклический AMP
жащего lас-область, получили фрагменты стимулирует инициирование транскрипции
длиной примерно 1000 пар оснований. многих индуцибельных оперонов.
К смеси фрагментов добавили lас-рспрессор Циклический AMP, синтезированный
и затем профильтровали раствор через ни- в отсутствие глюкозы, связывается с БАК
троцеллюлозную мембрану. Фрагменты (белковый активатор катаболизма) - бел-
ДНК, не связанные с lас-репрессором, про- ком, представляющим собой димер из
шли через фильтр, а комплексы ДНК-ре- субъединиц массой 22 кДа. Комплекс БАК
прессор прочно связались с ним. Связанную с циклическим AMP стимулирует тран-
ДНК сняли с фильтра с помощью ИПТГ. скрипцию, связываясь вблизи от многих
Эти элюированные фрагменты ДНК обра- промоторных участков; БАК без AMP та-
ботали панкреатической дезоксирибону- кой способностью не обладает. Опытами по
клеазой в присутствии репрессора. Идея расщеплению дезоксирибонуклеазой было
этого этапа эксперимента состояла в том, установлено, что в случае lас-оперона БАК
что операторный участок, связанный в ком- связывается рядом с участком связывания
плексе с репрессором, должен быть защи- РНК-полимеразы. Точнее, БАК защищает
щен от расщепления дезоксирибонуклеазой от расщепления нуклеотиды от —87 до
(рис. 28.6). Затем установили последова- —49, а РНК-полимераза - нуклеотиды от
тельность оснований этих операторных
фрагментов, определив последовательность 1
При детальном изучении механизма воздей-
транскрибированной с этих фрагментов ствия laс-репрессора с оператором оказалось,
РНК. Последовательность оснований этого что вазимодействию не свойственна такая сим-
участка оказалась очень интересной: 28 пар метрия, так что пока остается не совсем ясным,
почему последовательности laс-оператора (и
оснований расположены симметрично отно- многих других операторов) обладают элемента-
сительно оси второго порядка (рис. 28.7). ми симметрии,- П р и м . перев.
Симметрия репрессора, по-видимому, со- 2
Далеко не очевидно, почему клетки E.coli, как
ответствует симметрии оператора. Этот и многие другие клетки, предпочитают именно
принцип узнавания приложим также к сиг- глюкозу всем остальным источникам углерода
и энергии и используют ее до тех пор, пока ее
содержание не будет исчерпано даже в присут-
Часть IV. ствии значительного избытка других сахаров.—
116 Информация Прим. перев.
Рис. 28.7. Нуклеотидная последователь- с промотором (araI) и оператором (araО)
ность lac-оператора. Симме- образуют арабинозный оперон (рис. 28.9).
тричные участки закрашены Этот оперон регулируется геном (araС), рас-
одинаковым цветом. положенным рядом с операторным участ-

—48 до +5 (рис. 28.8). При этой системе


нумерации первый транскрибируемый ну-
клеотид обозначается +1. Последователь-
ность оснований ДНК, узнаваемая БАК,
обладает симметрией второго порядка, с ко-
торой мы постоянно сталкиваемся при рас-
смотрении взаимодействий белков с ДНК.
Каким образом БАК стимулирует инициа-
цию синтеза лактозной мРНК в 50 раз? По- ком. Подобно лактозному оперону, араби-
следовательное расположение неперекры- нозный оперон может быть активирован
вающихся участков связывания БАК комплексом БАК с циклическим AMP. Ара-
и РНК-полимеразы дает основание думать,
что связывание БАК с ДНК порождает
новые участки взаимодействия РНК-поли-
меразы с ДНК. Лактозный репрессор, на-
против, связывается с нуклеотидами от —3
до +21, которые в значительной степени
перекрываются с участком РНК-полиме-
разы (нуклеотиды от —48 до +5). Таким
образом, репрессор препятствует инициа-
ции, блокируя связывание РНК-полимеразы.
По всей вероятности, комплекс циклический
AMP-БАК действует таким же образом
и на другие индуцибельные опероны. Итак,
индуцибелъные опероны контролируются
с помощью комплементарных механизмов,
которые используют в качестве сигнальных
молекул циклический AMP и специфические
индукторы.

28.7. Различные формы одного и того же бел-


ка активируют и ингибируют
транскрипцию арабинозного оперона
Бактерии могут использовать арабинозу
в качестве источника энергии, превра-
щая ее в ксилулозо-5-фосфат - промежуточ- Рис. 28.8. На схеме показаны БАК
ный продукт пентозофосфатного пути и РНК-полимераза, сидящие
(разд. 15.4). Превращение арабинозы в кси- на ДНК-матрице. Положение
лулозо-5-фосфат происходит в результате этих белков было определено
последовательного действия арабинозо- с помощью расщепления ну-
изомеразы, рибулокиназы и рибулозо-5- клеазой.
фосфат-эпимеразы - ферментов, кодируе-
мых генами araА, araВ и araD соответ- 28. Регуляция выражения
ственно. Эти структурные гены вместе гена в фенотипе 117
вместе с комплексом БАК-сАМР связы-
вается с промоторным участком, что дает
возможность РНК-полимеразе начать тран-
скрипцию. Таким образом, один и тот же
регуляторный белок служит положи-
тельным и отрицательным регулятором.
Рис. 28.9. Карта арабинозного оперона 28.8. Транскрипция триптофанового оперона
и его регуляторного гена. регулируется и аттенюатором, и оператором
Еще один регуляторный элемент был от-
крыт Чарльзом Янофски (Charles Yanofsky)
бинозный оперон был первым, в отношении и его коллегами при изучении триптофано-
которого было установлено наличие и поло- вого оперона E. coli. Транскрибируемая
жительной, и отрицательной регуляций. с этого оперона мРНК длиной 7kb кодирует
Продукт гена аrаС - белок, который суще- пять ферментов, превращающих хоризмат
ствует в двух функционально различных со- в триптофан (разд. 21.9). Эти пять белков
стояниях Р1 и Р 2 . В отсутствие арабинозы синтезируются при трансляции полици-
этот белок действует как репрессор (Р1). стронной trp-мРНК последовательно, коор-
Форма P1 связывается с оператором, что динированно и в эквимолярных количе-
препятствует транскрипции оперона. Араби- ствах. Трансляция начинается раньше, чем
ноза снимает Р1 с оператора и смещает кон- заканчивается транскрипция. trp-мРНК син-
формационное равновесие в сторону Р2 (ак- тезируется примерно за 4 мин и затем бы-
тивирующей формы). Затем форма Р2 стро разрушается. Короткое время жизни

Рис. 28.10. Схема trp-оперона. Показаны trp-мРНК, составляющее всего около 3 мин,
контрольные участки - промо- позволяет бактериям быстро реагировать
тор (р), оператор (о) и аттенюа- на изменяющуюся потребность в триптофа-
тор (а), а также гены, кодирую- не. Е. coli может менять скорость образова-
щие лидерную последователь- ния ферментов биосинтеза триптофана бо-
ность (L), и ферменты пути лее чем в 700 раз.
биосинтеза триптофана (E, D, Как осуществляется эта регуляция?
С, В и А). Первый уровень регуляции достигается пу-
тем взаимодействия специфического репрес-
сора с trp-операторным участком ДНК. trp-
репрессор - белок с массой 58 кДа, коди-
руемый геном trpR, удаленным от trp-оперо-
на на довольно большое расстояние. Ком-
плекс этого репрессора и триптофана прочно
связывается с оператором, тогда как сам по
себе репрессор с ним не связывается. Други-
Рис. 28.11. Последовательность основа- ми словами, триптофан является корепрессо-
ний trp-оператора. Ось симме- ром. Мишень, на которую действует ком-
трии второго порядка обозна- плекс триптофана с репрессором,- участок
чена зеленым. Пара оснований, ДНК, обладающий симметрией второго по-
отмеченная +1,- начало тран- рядка (рис. 28.11); и в этом случае симме-
скрибируемой части оперона. трия играет важную роль во взаимодей-
ствии белка с ДНК. Этот операторный
Часть IV. участок перекрывается с промоторным
118 Информация участком инициирования транскрипции. Та-
Рис. 28.12. Последовательность основа- ром и геном первого фермента пути
ний аттенюаторного участка биосинтеза триптофана. Этот участок
trp. Связанные симметрией терминации, регулируемый физиологиче-
второго порядка пары основа- скими условиями, подобен участкам тер-
ний GC-богатой области пока- минации в конце других оперонов
заны синим цветом; такие же (разд. 25.15); он содержит GC-богатую по-
пары AT-богатой области по- следовательность и следом за ней АТ-бо-
казаны желтым цветом. гатый участок. Каждый из этих участков ат-
тенюатора обладает симметрией второго
порядка (рис. 28.12). Кроме того, термини-
ким образом, связывание trp-penpeccopa рованный лидерный транскрипт заканчи-
с оператором препятствует связыванию вается несколькими U подряд.
РНК-полимеразы с trp-промотором, и гены Аттенюаторный участок дополняет опе-
trp не транскрибируются. ратор в регуляции транскрипции trp-генов.
В течение некоторого времени считалось, При изобилии триптофана инициация тран-
что ингибирование конечным продуктом ка- скрипции блокируется в результате связыва-
талитической активности первого фермен- ния комплекса триптофан-репрессор с опе-
тативного комплекса в пути биосинтеза ратором. По мере снижения концентрации
триптофана (разд. 21.11) и система ингиби- триптофана в клетке репрессия снижается
рования транскрипции с участием репрессо- и начинается транскрипция. Однако неко-
ра и оператора - основные регуляторные си- торые молекулы РНК-полимеразы поки-
стемы биосинтеза триптофана. Эта точка дают матрицу, дойдя до аттенюатора, тогда
зрения была неожиданно опровергнута, ког- как другие продолжают синтезировать пол-
да было обнаружено, что у некоторых му- ную trp-матрицу. По мере исчерпания трип-
тантов с делециями между оператором и ге- тофана увеличивается доля молекул РНК-
ном первого фермента (trpE) в опероне полимеразы, проходящих через аттенюа-
происходит повышенное образование торный участок.
trp-мРНК. К тому же анализ 5'-концевой по-
следовательности trp-мРНК показал, что 28.9. Аттенюация опосредуется трансляцией
там имеется лидерная последовательность лидерной мРНК
длиной 162 нуклеотида, расположенная Каким образом аттенюаторный участок trp-
перед инициирующим кодоном trpE. Затем оперона улавливает концентрацию трипто-
оказалось, что делеции, повышающие со- фана в клетке? В решении этого вопроса
держание trp-мРНК, картируются в этой ли- особенно важную роль сыграли данные
дерной области, примерно в 30-60 нуклеоти- о том, что часть лидерной мРНК трансли-
дах от начала гена trpE. Следующее руется. Весьма существенно, что в 14-член-
поразительное наблюдение состояло в том, ном лидерном полипептиде (рис. 28.13)
что при высокой концентрации триптофана имеются остатки триптофана в положениях
образовывался транскрипт, содержащий 10 и 11. Когда триптофан находится в избы-
всего 130 нуклеотидов лидерной последова- тке, синтезируется полный лидерный пеп-
тельности ; при нехватке же триптофана син- тид. Но если триптофана не хватает, рибо-
тезировалась trp-мРНК длиной 7000 ну- сома задерживается на двух располо-
клеотидов, включающая полную лидерную женных тандемом кодонах UGG, поскольку
последовательность. Отсюда Янофски сде- в этом случае оказывается недостаточным
лал вывод, что транскрипция trp-оперона содержание триптофанил-тРНК. Застряв-
должна регулироваться участком контро-
лируемой терминации, называемым атте- 28. Регуляция выражения
нюатором. Он локализован между операто- гена в фенотипе 119
Рис. 28.13. Последовательность амино- чены, чтобы улавливать концентрации фе-
кислот в лидерном пептиде trp нилаланина и гистидина. Если соответ-
и последовательность основа- ствующих аминоацилированных тРНК не
ний в соответствующей лидер- хватает, трансляция лидера останавливает-
ной мРНК. ся. Как уже обсуждалось выше на примере
trp-оперона, считается, что застрявшая ри-
босома таким образом изменяет конформа-
шая рибосома каким-то образом меняет цию мРНК, что у нее происходит спарива-
структуру мРНК, так что РНК-полимераза ние оснований. Это дает возможность
транскрибирует оперон за пределами атте- РНК-полимеразе проскакивать аттенюа-
нюаторного участка. Ключевой аспект это- торный участок 1 . Присутствие семи после-
го регуляторного механизма состоит в том, довательно расположенных кодонов ги-
что трансляция и транскрипция тесно сопря- стидина в лидерной мРНК гистидинового
жены между собой. Рибосомы, транслирую- оперона существенно увеличивает чувстви-
щие лидерную trp-мРНК, следуют непос- тельность этого детектора. Действительно,
редственно за молекулой РНК-полимеразы, падение концентрации гистидил-тРНК на
транскрибирующей ДНК-матрицу. Иссле- 15% вызывает троекратное увеличение чис-
дования, проведенные в последние годы, по- ла молекул мРНК, транскрибируемых с это-
казали, что застрявшая рибосома изменяет го оперона.
вторичную структуру мРНК: конформация,
при которой основания спариваются, благо- 28.11. Репрессоры и активаторы
приятствуя тем самым терминированию детерминируют развитие умеренных фагов
транскрипции, изменяется таким образом, Обратимся теперь к роли репрессоров и ак-
что РНК-полимераза проскакивает атте- тиваторов транскрипции в регуляции жиз-
нюатор (рис. 28.14). Мы начинаем пони- ненного цикла бактериофага лямбда (λ). Зре-
мать, что молекулы нуклеиновых кислот, лая вирусная частица состоит из линейной
как и белковые молекулы, могут принимать двухспиральной молекулы ДНК (48 kb), упа-
различные конформации и что изменения кованной в белковую оболочку. Существует
конформации регулируются и имеют дале- два пути развития вируса: он может разру-
ко идущие физиологические последствия. шить клетку-хозяина или он может стать ее
компонентом (отсюда и название - уме-
28.10. Аттенюаторный участок ренный). При литическом пути развития
гистидинового оперона содержит семь происходит полное выражение (экспрессия)
гистидиновых кодонов подряд фаговых генов, что приводит к лизису бакте-
В настоящее время известны еще два оперо- рии и образованию примерно 100 вирусных
на биосинтеза аминокислот у E. coli, содер- частиц потомства. В другом случае развитие
жащих аттенюаторные участки. Фенилала- фага λ может пойти по пути лизогенизации
ниновый оперон и гистидиновый оперон, клетки, когда его ДНК становится кова-
подобно триптофановому оперону, содер- лентно связанной с ДНК клетки-хозяина
жат регулируемые участки терминации в строго определенном месте (сайт-специфи-
перед первым геном, кодирующим фермент. ческая интеграция). Этот процесс рекомби-
И в этих случаях лидерная область перед нации, в котором участвует кольцевая моле-
участком терминации транслируется. Уди- кула ДНК фага λ, мы обсудим ниже
вительна последовательность аминокислот (разд. 30.16). Когда ДНК фага интегрирует
в лидерном пептиде фенилаланинового опе- с ДНК клетки-хозяина, большинство фа-
рона: 7 из 15 остатков - фенилаланины говых функций выключается. Фаговая ДНК
(рис. 28.15). Еще поразительнее лидерный в таком состоянии называется профагом,
пептид гистидинового оперона: он содер- а клетка-хозяин, содержащая профаг - лизо-
жит семь остатков гистидина подряд. Оче- генной бактерией. Профаг реплицируется
1
видно, что эти лидерные мРНК предназна- Автор противоречит собственному утвержде-
нию, что застрявшая рибосома разворачивает
Часть IV. мРНК (см. предыдущий разд.); рибосома дей-
ствительно способствует именно разворачива-
120 Информация нию мРНК.- Прим. перев.
Рис. 28.14. Схематическое изображение ские функции молчат, но не теряются
аттенюации trp-оперона E.coli. (рис. 28.17). Многие агенты, нарушающие
Когда триптофан имеется в нормальную репликацию ДНК в клетке-хо-
избытке (А), лидерный учас- зяине, индуцируют профаг, и он переходит
ток (обозначен цифрой 1) на путь литического развития.
trp-мРНК полностью трансли- Вначале рассмотрим выражение генов фа-
руется. Участок 2 взаимодей- га λ при литическом пути. Цель разви-
ствует с рибосомой, что позво- тия - образование многочисленного потом-
ляет основаниям участков 5 и ства - достигается путем последовательной
4 спариваться. Эта спаренная транскрипции вирусных генов. Вначале обра-
область каким-то образом сиг- зуются белки, необходимые для репликации
нализирует РНК-полимеразе и рекомбинации ДНК, затем белки головки
о том, что следует закончить и отростка вирусной частицы и белки, необ-
транскрипцию. Если же трип- ходимые для лизиса клетки-хозяина.
тофана не хватает (Б), участки Чрезвычайно важное значение имеет стро-
3 и 4 не взаимодействуют, так гая очередность этих событий; преждевре-
как рибосома застревает на менное разрушение клетки-хозяина для ви-
trp-кодонах участка 1. Участок руса, конечно, невыгодно. Выражение генов
2 взаимодействует с участком при литическом развитии происходит в три
3 вместо того, чтобы входить стадии: предраннюю, раннюю и позднюю
в рибосому, и в результате (рис. 28.18). На предранней стадии начинает-
участки 3 и 4 не могут спари- ся синтез РНК с двух промоторов - PL и PR.
ваться. Вследствие этого тран- Один из образующихся при этом тран-
скрипция продолжается. скриптов служит матрицей для синтеза бел-
[Oxender D. L., Zurawski G., ка N, которому принадлежит важнейшая
Yanofsky C., Proc. Nat. Acad. регуляторная роль. В отсутствие белка
Sci., 76, 5524 (1979).] N предранние транскрипты заканчиваются
на одном из двух участков терминации. Бе-
лок N препятствует терминированию тран-
скрипции в этих участках и обеспечивает та-
в лизогенной бактерии как часть клеточной
хромосомы обычно на протяжении многих 28. Регуляция выражения
поколений. В лизогенном состоянии литиче- гена в фенотипе 121
Рис. 28.15. Последовательность амино- ствует транскрипции ранних генов в левую
кислот в лидерном пептиде сторону. В частности, не синтезируется бе-
и последовательность основа- лок N, и поэтому литический путь оказы-
ний соответствующего участка вается закрытым. Связываясь с OR, λ-ре-
мРНК фенилаланинового (А) прессор препятствует выражению генов cro
и гистидинового (Б) оперонов. и Q в правую сторону. Таким образом, ког-
да λ-репрессор связан с OL и OR, весь геном
фага молчит, кроме гена сI, кодирующего
ким образом дальнейшее выражение генов λ-репрессор. Как будет указано чуть ниже,
фага λ. Белок N включает раннюю стадию. λ-репрессор сам контролирует работу гена
В это время синтезируются белки, необхо- сI, регулируя таким путем собственную кон-
димые для репликации ДНК фага центрацию. Инактивация λ-репрессора
и рекомбинации. Кроме того, на ранней ста- обеспечивает возможность транскрипции
дии транскрибируется ген Q. Белок Q - еще генов, участвующих в литическом процессе.
один важный регуляторный элемент выра- Профаг исключается из хромосомы клетки-
жения генов фага λ. Он необходим для пере- хозяина, и литические функции экспресси-
хода в позднюю стадию. На поздней стадии руются.
транскрибируются гены, необходимые для
образования головки и отростка фага и для 28.12. Два оператора фага лямбда содержат
лизиса клетки-хозяина. Белок Q, подобно ряд участков связывания репрессора
белку N, подавляет терминацию транскрип- λ-Репрессор был выделен и подробно изу-
ции. Короче говоря, последовательная регу- чен Марком Пташне (Mark Ptashne). Моно-
ляция литического развития осуществляет-
ся двумя белками - положительными регуля-
торами, кодируемыми генами N и Q. Их
действие заключается в том, что они позво-
ляют РНК-полимеразе продолжать тран-
скрипцию, проскочив несколько участков
терминации.
В лизогенном цикле различают три ста-
дии: установление лизогенного состояния,
его поддержание и выход из лизогенного со-
стояния. Для установления состояния про-
фага необходимо, чтобы вирусная ДНК ин-
тегрировалась с ДНК клетки-хозяина
и литические функции вируса были инакти-
вированы. Эти процессы протекают очень
сложно, и до конца они не изучены. Поддер-
жание состояния профага, наоборот, срав-
нительно несложный процесс. А. Дейл Кей-
зер (A. Dale Kaiser) показал, что из всех
генов профага экспрессируется только ген
сI. Этот ген кодирует λ-репрессор, который
связывается с двумя операторными участка-
ми OL и OR (рис. 28.19). Связывание λ-ре-
прессора с OL непосредственно препят- Рис. 28.16. Электронная микрофотогра-
фия фагов λ. (Печатается с лю-
Часть IV. безного разрешения д-ра
122 Информация A. Dale Kaiser.)
Рис. 28.17. Генетическая карта фага λ. По- операторные участки обладают частичной
казаны лишь некоторые гены. симметрией второго порядка.
После проникновения в бакте- Самые сильные места связывания репрес-
риальную клетку линейная сора в операторах OL и OR расположены
двухцепочечная ДНК перехо- ближе всего к началу первого структурного
дит в кольцевую форму. гена оперона. Промоторный участок гена
N расположен в пределах OL а промотор
гена cro - внутри OR. Как и в лактозном, и
мере массой 26 кДа находится в равновесии в арабинозном оперонах, связывание ре-
с олигомерами. С ДНК связываются имен- прессора с этими операторами препятствует
но олигомеры. Два операторных связыванию РНК-полимеразы с соответ-
участка - ОL и ОR - узнаются одним и тем же ствующим промотором, и, следовательно,
репрессором. Ген сI, кодирующий этот ре- транскрипция не начинается. Связывание
прессор, расположен между ОL и OR λ-репрессора с двумя участками в OL и OR
(рис. 28.19). Каждый их этих операторов со- более эффективно блокирует промотор, чем
держит три участка связывания λ-репрессо- связывание только с одним участком.
ра. Расщепление с помощью нуклеаз пока-
зало, что участки связывания представляют 28.13. λ-Репрессор регулирует
собой последовательность из 17 пар основа- собственный синтез
ний и отделены друг от друга АТ-богатыми Число молекул λ-репрессора в лизогенных
участками длиной от 3 до 7 пар оснований. клетках Е. coli строго регулируется. Сниже-
Последовательности оснований всех этих ние количества репрессора (даже кратковре-
участков связывания λ-репрессора сходны, менное) переводит клетку на литический
но не идентичны. Узнаваемая последова- путь. С другой стороны, избыток репрессо-
тельность - 5'-TATCACCGC-3' или что-ни- ра затруднит выход фага, если условия его
будь в этом роде. Как и lас-оператор, эти существования в бактерии станут неблаго-

Рис. 28.18. Три стадии транскрипции при приятными. Как регулируется концентрация
литическом цикле развития фа- λ-репрессора? Проведенные сравнительно
га λ. Белок N образуется на недавно исследования показали, что это ре-
предранней стадии и активи- прессор регулирует собственный синтез.
рует раннюю стадию. Тогда Для этого λ-репрессор связывается с OR3
в свою очередь синтезируется операторным участком, локализованным
белок Q, который активирует
позднюю стадию. [Echols H., 28. Регуляция выражения
The Bacteria, 8, 502 (1979).] гена в фенотипе 123
Рис. 28.19. Схематическое изображение при низкой концентрации λ-репрессора и по-
операторных участков OL и OR давляется при высокой концентрации того
и прилегающих генов. Самое же белка. Другими словами, выражение ге-
высокое сродство к λ-репрессо- на сI - саморегулирующаяся система.
ру имеют ОL1 и ОR1. сI - ген-ре- Описанная регуляция по принципу обрат-
прессор. Левый транскрипт на- ной связи стремится поддерживать концен-
чинается с гена N, правый - с трацию репрессора на таком уровне, чтобы
гена crо. остальной геном фага не экспрессировался.
Как же тогда фаг может выйти из состояния
лизогении? Литический цикл запускается
ближе всего к гену cI, и выключает тран- при снижении числа молекул λ-репрессора;
скрипцию этого гена (рис. 28.20). Связывание содержание λ-репрессора должно умень-
репрессора с О R 1 , напротив, усиливает тран- шаться до такого уровня, которого доста-
скрипцию гена cI. Напомним, что сродство точно только для транскрипции гена crо.
λ-репрессора к ОR1 выше, чем к OR3. Таким Новообразованный белок cro связывается с
образом, транскрипция гена cI усиливается ОR3 и подавляет транскрипцию гена cI.

Рис. 28.20. Саморегуляция концентрации Самое главное, что OR3 имеет более высо-
λ-репрессора. А - когда репрес- кое сродство к белку cro, чем OR1. Таким
сора мало, он связывается с образом, небольшое количество белка cro
O R 1 и стимулирует транскрип- подавляет синтез λ-репрессора, не выключая
цию гена сI. Б - по мере увели- синтеза самого белка cro. Вследствие этого
чения концентрации λ-репрес- λ-репрессор уже не может руководить хо-
сора он связывается с ОR3 дом событий. С этого момента необратимо
и ингибирует дальнейшую запускается цепь реакций, ведущих к лизису.
транскрипцию гена cI. Таким образом, тонкое взаимодействие все-
го нескольких белков и операторных участ-
Часть IV. ков определяет путь развития фага. Было
124 Информация бы интересно выяснить, имеют ли неко-
торые регуляторные системы, такие, как Кроме того, некоторые опероны биосин-
множественные операторные участки с раз- теза аминокислот, в том числе trp-оперон,
личным сродством к белкам, более общее находятся под контролем аттенюаторов.
значение в регуляции развития прокариоти- Если конечный продукт биосинтеза - амино-
ческих клеток. кислота - имеется в изобилии, транскрипция
в аттенюаторном участке прекращается.
Для аттенюации необходима трансляция
Заключение лидерной мРНК. Регуляция широкого спек-
Клетки регулируют количество синтези- тра генов осуществляется циклическим
руемых белков различными способами. У E. AMP, который связывается с особым бел-
coli выражение генов регулируется в первую ком (БАК). Этот комплекс взаимодействует
очередь на уровне транскрипции, а не транс- с промоторными участками нескольких ин-
ляции. Многие гены организованы в опе- дуцибельных оперонов и стимулирует ини-
роны - координированные единицы генети- циирование транскрипции. Концентрация
ческой экспрессии. Оперон состоит из циклического AMP повышается только при
регуляторных участков (оператора и промо- недостатке глюкозы. Таким образом, глю-
тора) и нескольких структурных генов. Вне коза косвенно подавляет синтез различных
оперона имеется регуляторный ген, коди- ферментов катаболизма.
рующий белок, который взаимодействует Бактериофаг λ может размножаться
с операторным участком. Последователь- и разрушать клетки-хозяева (литический
ность оснований лактозного оператора сим- путь); в другом случае его ДНК может инте-
метрична. Вообще симметрия играет основ- грировать с хромосомой клетки-хозяина
ную роль в узнавании определенных участ- (лизогенный путь). При литическом разви-
ков в ДНК белками. lac-Оперон индуци- тии происходит последовательная тран-
руется β-галактозидами, например аллолак- скрипция трех групп генов. На предранней
тозой и изопропилтиогалактозидом. Связы- стадии образуется белок N, активирующий
вание индуктора с lac-репрессором приво- транскрипцию ранних генов. При этом
дит к его вытеснению с оператора. Теперь в свою очередь синтезируется белок Q - ак-
РНК-полимераза может пройти через опе- тиватор поздней стадии транскрипции. Ли-
ратор и транскрибировать lас-оперон. Трип- зогенное состояние поддерживается λ-ре-
тофановый оперон репрессируется трипто- прессором, который кодируется геном cI.
фаном, который связывается со специфиче- Репрессор связывается с операторами OR и
ским репрессором и дает ему таким OL и препятствует транскрипции предран-
образом возможность связаться с операто- них генов. Присутствие многочисленных
ром. В результате транскрипция генов, ко- участков связывания в этих операторах по-
дирующих ферменты биосинтеза триптофа- зволяет λ-репрессорам регулировать соб-
на, выключается. ственный синтез.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ Лактозный оперон Reznikoff W., 1975. Genetic regulation:


ЛИТЕРАТУРА Miller J.H., Reznikoff W.S., 1978. The the lac control region, Science, 187,
Operon, Cold Spring Harbor 27-35.
С чего начать Laboratory. (Превосходный сборник
Jacob F., Monod J., 1961. Genetic статей, касающихся регуляторных Арабинозный оперон
regulatory mechanisms in the synthesis механизмов Е. coli и фага λ. Детально Wilcox G., Meuris P., Bass P., Englesbe-
of proteins, J. Moi. Biol., 3, 318-356. (B рассмотрены лактозный, триптофа- rg E., 1974. Regulation of the arabinose
этой блистательной статье была новый, арабинозный, гистидиновый operon in vitro, J. Biol. Chem., 249,
предложена модель оперона и сфор- и галактозный опероны.) 2946-2952.
мулировано представление об ин- Gilbert W., Muller-Hill В., 1966. Hirsh J., Schleif R., 1976. Electron
формационной РНК.) Isolation of the lac represser, Proc. Nat. microscopy of gene regulation: the
Ptashne M., Gilbert W., 1970. Genetic Acad. Sci., 56, 1891-1898. L-arabinose operon, Proc. Nat. Acad.
repressers, Sci. Amer, 222(6), 36-44. Dickson R., Abelson J., Barnes W., Sci., 73, 1518-1522.
Maniatis Т., Ptashne M., 1976. A DNA
operator-repress or system, Sci. Amer., 28. Регуляция выражения
234(1), 64-76. гена в фенотипе 125
Триптофановый и Proc. Nat. Acad. Sci., 75, 4281-4285. function of a represser in bacteriophage
гистидиновый опероны Stephens J. C., Artz S. W., Ames B. N., lambda, Science, 194, 156-161.
Platt Т., 1978. Regulation of gene 1975. Guanosine 5'-diphosphate 3'-di- Johnson A., Meyer B.J., Ptashne M.,
expression in the tryptophan operon of phosphate (ppGpp): positive effector for 1978. Mechanism of action of the crо
Esherichia coli. In: Miller J. H. and histidine operon transcription and protein of bacteriophage λ, Proc. Nat
Reznikoff W. S.(eds.), The Operon, general signal for amino acid deficiency, Acad. Sci., 75, 1783-1787.
pp. 213-302, Cold Spring Harbor Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 4389-4393. Ptashne M., Jeffrey A., Johnson A.D.,
Laboratory. (Четко изложены пред- Maurer R., Meyer B.J., Pabo C.O.,
ставления о trp-опероне.) Циклический AMP и катаболитная Roberts T.M., Sauer R.T, 1980. How
Oxender D.L., Zurawski G., репрессия the λ represser and crо work, Cell, 19,
Yanofsky C., 1979. Attenuation in the Pastan L, Adhya S., 1976. Cyclic 1-11.
Escherichia coli tryptophan operon: the adenosine 3',5'-monophosphate in Hershey A.D. (ed.), 1971. The
role of RNA secondary structure Escherichia coli, Bacteriol. Rev., 40, Bacteriophage Lambda, Cold Spring
involving the Trp codon region, Proc. 527-551. Harbor Laboratory. [Имеется пере-
Nat. Acad. Sci., 76, 5524-5528. Zubay G., Schwartz D., Beckwaith J., вод: Фаг лямбда.- М.: Мир, 1975.]
Bertrand K., Korn L., Lee F,r Platt Т., 1970. Mechanism of activation of (Содержит множество сведений о фа-
Squires C.L., Squires C., Yanofsky C., catabolite-sensitive genes: a positive ге λ.)
1975. New features of the regulation of control system, Proc. Nat. Acad. Sci., 66, Reichardt L., Kaiser A.D., 1971.
the tryptophan operon, Science, 189, 104-110. Control of λ represser synthesis, Proc.
22-26. (Рассказ об истории открытия Nat. Acad. Sci., 68, 2185-2189.
аттенюации транскрипции.) Регуляция транскрипции фага λ
Barnes W.M., 1978. DNA sequence Ptashne M., Backman К., Нитауип
from the histidine operon control М.Z., Jeffrey A., Maurer R., Meyer В.,
region: seven histidine codons in a row, Sauer R. Т., 1976. Autoregulation and

Вопросы и задачи других источников углерода. Концентра-


ция циклического AMP в клетках мутанта
1. К какому результату приведут нормальна. Какая мутация могла бы при-
следующие мутации? вести к такому результату?
а) Делеция регуляторного гена lас-оперона. 5. Клетка Е. coli, несущая профаг
б) Делеция регуляторного гена trp-оперона. λ, иммунна к литическому ин-
в) Делеция регуляторного гена аrа-оперо- фицированию этим фагом. Почему?
на. 6. Транскрипция сI может быть
г) Делеция гена сI фага λ. инициирована с промотора
д) Делеция гена N фага λ. pRE, предназначенного для установления
2. Суперрепрессированные му- лизогении, или pRM, предназначенного для
S
танты по lас-оперону (i ) ведут ее поддержания. Транскрипты с pRM на-
себя как неиндуцибельные мутанты. Ген iS чинаются с 5'-концевого кодона AUG λ-pe-
+
доминирует над геном i в частичных ди- прессора, а в транскрипте pRE этому кодо-
плоидах. Каким может быть молеку- ну инициации предшествует последова-
лярный механизм этой мутации? тельность, комплементарная 3'-концевой
3. Имеется мутант Е. coli, синте- последовательности 16S-pPHK. Для ини-
зирующий большие количества циации на участке pRE необходимы белки,
β-галактозидазы независимо от того, при- кодируемые фагом, которые не экспресси-
сутствует ли в среде индуктор. Частичные руются в лизогенном состоянии.
диплоиды, образованные из этого мутанта а) Какой транскрипт будет транслировать-
и F i + o + z - - , также синтезируют много β-га- ся с большей эффективностью?
лактозидазы независимо от присутствия б) Каково возможное физиологическое зна-
индуктора. Какая мутация могла бы при- чение этого различия?
вести к такому результату?
4. Из культуры дикого типа выде- Дополнительные вопросы см.: Hood L.E.,
лен мутант, неспособный расти Wilson J. H, Wood W. В., Molecular Biology
на галактозе, лактозе, арабинозе и ряде of Eucaryotic Cells, Benjamin, 1975, ch. 1.
ГЛАВА 29 что у эукариот выражение (экспрессия) ге-
нов осуществляется значительно более
Эукариотические сложным путем, чем у прокариот. Иссле-
дования в этой области быстро развивают-
хромосомы и выражение ся, поскольку мы научились выделять
генов у эукариот и клонировать гены эукариот, определять
в них последовательность нуклеотидов
Эукариотическая клетка содержит гораздо
и осуществлять их выражение в хорошо
больше генетической информации, чем
изученных системах. По всему чувствуется,
прокариотическая. Например, в клетке че-
что мы находимся на пороге раскрытия
ловека в 1000 раз больше ДНК, чем
одной из важнейших проблем биологии —
в клетке Е. coli, и примерно в 100000 раз
механизма клеточной дифференцировки.
больше, чем в одном вирионе фага λ. Это
изобилие ДНК наделяет эукариот больши-
ми потенциальными возможностями, ко-
торых нет у прокариот. Другое отличие со-
стоит в том, что ДНК высших организмов
ассоциирована с основными белками - ги-
стонами, а хромосомы низших организмов
таких белков не содержат. Предназначение
этих основных белков - упаковывать ДНК,
с тем чтобы при контурной длине, равной
многим сантиметрам, она могла бы поме-
ститься в объеме диаметром несколько ми-
крометров. Характерная морфология эука-
риотических хромосом, которую легко на-
блюдать в световом микроскопе, показы-
вает, что они организованы значительно
сложнее, чем геномы прокариотических
клеток. К тому же форма эукариотических
хромосом резко меняется в ходе клеточно-
го цикла. Еще одна важная особенность,
которая собственно и отличает эукариот
от прокариот, состоит в том, что эукарио-
тические хромосомы окружены ядерной
мембраной. Этой мембраны у прокариот
нет, равно как нет и других внутренних
мембран. Благодаря наличию мембраны
транскрипция и трансляция у эукариот
разделены во времени и в пространстве, Рис. 29.1. Фазово-контрастная микрофо-
тогда как у прокариот они тесно сопря- тография хромосомы типа
жены. В ядрах высших организмов пер- ламповой щетки из ооцита.
вичные транскрипты подвергаются значи- (Печатается с любезного разре-
тельной модификации, расщепляются и их шения д-ра Joseph Gall.)
фрагменты соединяются. Лишь небольшая
часть синтезированных в ядре РНК выхо- 29. Хромосомы и выражение
дят в цитозоль в виде мРНК. Очевидно, генов у эукариот 127
Рис. 29.2. Радиоавтограф молекулы gaster - 43•106 кДа. Превосходное совпаде-
ДНК Drosophila melanogaster. ние результатов наблюдалось также в слу-
Контурная длина этой ДНК чае мутанта с транслокацией, затрагиваю-
равна 1,2 см. [Kavenoff R., щей самую большую хромосому. В этой
Klotz L. С., Zimm В. Н., Cold хромосоме содержится дополнительный ку-
Spring Harbor Symp. Quant. сок ДНК, благодаря которому содержа-
Biol., 38, 4 (1974).] ние ДНК в ней достигает 59•106 кДа. Из-
меренное количество ДНК в этой моле-
куле составило 58•106 кДа. Радиоавтогра-
фы ДНК D. melanogaster (рис. 29.2) под-
29.1. Эукариотическая хромосома содержит тверждают существование очень длинных
одну молекулу двухспиральной ДНК молекул ДНК. Эти исследования показа-
Можно ли утверждать, что хромосома со- ли, что хромосома дрозофилы содержит
держит одну длинную молекулу ДНК? одну непрерывную молекулу ДНК. Кроме
В течение многих лет на этот вопрос было того, эта молекула ДНК линейная и не-
трудно ответить, так как очень длинные разветвленная.
молекулы ДНК невероятно чувствительны
к разрыву под действием сил сдвига. Бру-
но Зимм (Bruno Zimm) решил эту пробле- 29.2. Эукариотическая ДНК прочно связана
му с помощью метода вязкостной эласто- с основными белками - гистонами
метрии, позволяющего измерять длину ДНК эукариотических хромосом находит-
самых крупных молекул ДНК в смеси. Мо- ся не в свободном виде, а прочно связана
лекулы ДНК растягивают в потоке жидко- с группой небольших основных белков, на-
сти, и затем им дают свернуться в нор- зываемых гистонами. На долю гистонов
мальное состояние. Время, за которое приходится около половины массы эука-
свертывается половина молекул, зависит риотических хромосом; вторую половину
от их молекулярной массы. Клетки пло- составляет ДНК. Этот нуклеопротеиновый
довых мушек лизировали в камере для из- материал хромосомы называется хромати-
мерений, чтобы избежать разрывов ДНК ном. Если обработать хроматин солью или
при переносе образцов. Нуклеазы инакти- разбавленной кислотой, гистоны и ДНК
вировали, инкубируя образцы в присут- можно диссоциировать. Образовавшуюся
ствии детергента при 65°С. Кроме того, смесь можно затем разделить с помощью
для гидролиза связанных с ДНК белков ионообменной хроматографии. Гистоны
добавляли проназу. подразделяются на пять типов, обозна-
Масса самых крупных молекул ДНК чаемых соответственно H1, H2A, Н2В, Н3
в полученной смеси составляла 41•106 кДа. и Н4. Они имеют массу от 11 до 21 кДа
Эта величина хорошо согласуется с из- (табл. 29.1). Удивительная особенность ги-
вестным содержанием ДНК в самой стонов - высокое содержание положительно
большой хромосоме Drosophila melano- заряженных боковых цепей: примерно
каждый четвертый остаток - лизин или ар-
Часть IV. гинин.
128 Информация Благодаря посттрансляционным моди-
фикациям определенных боковых цепей
каждый гистон существует в нескольких
формах. Например, лизин-16 гистона Н4
может быть ацетилирован. Кроме того, ги-
стоны могут быть метилированы, ADP-ри-
бозилированы и фосфорилированы. Изме-
нения заряда, способности к образованию
водородных связей и формы молекул ги-
стонов в результате таких ковалентных
модификаций могут играть важную роль
в регуляции доступности ДНК для репли-
кации и транскрипции.
Рис. 29.3. Последовательность амино-
29.3. Последовательности аминокислот кислот в гистонах Н4 из тимуса
в гистонах Н3 и Н4 почти одинаковы теленка. Несколько остатков
у всех животных и растений модифицированы. α-Амино-
Эмиль Смит и Робер Де-Ланж (Emil группа ацетилирована, равно
Smith, Robert DeLange) показали, что по- как и ε-аминогруппа Lys-16. ε-
следовательности аминокислот в гистоне Аминогруппа Lys-20 метили-
Н4 из проростков гороха и из тимуса те- рована или диметилирована.
ленка различаются только по двум поло- Гистон Н4 из проростков горо-
жениям из 102. Замены эти очень незначи- ха имеет такую же последова-
тельны: валин - вместо изолейцина и ли- тельность аминокислот, за ис-
зин - вместо аргинина. Таким образом, по- ключением положений 60
следовательность аминокислот гистона Н4 (изолейцин) и 77 (аргинин).
сохранилась почти без изменений на протя-
жении 1,2•10 9 лет, прошедших со времени
разделения всего живого на царства расте-
ний и животных. Гистон Н3 также мало сле того, как дивергируют две эволю-
изменился на протяжении этого колоссаль- ционные линии. Эта величина для гистонов
ного периода эволюции. Последовательно- Н3 и Н4 составляет 3•108 и 6•108 лет со-
сти аминокислот в гистоне Н3 из пророст- ответственно и значительно выше, чем для
ков гороха и из тимуса теленка различают- других исследованных до настоящего
ся по четырем положениям. Интересно времени белков, Например, для цитохрома
сравнить скорость изменения последова- с единичный эволюционный период соста-
тельности этих гистонов в ходе эволюции вляет 2•107 лет, для гемоглобина - 6•106
6
со скоростью изменения других белков. лет, для фибринопептидов - 1•10 лет. За-
Обычно для этого используется величина мечательная консервативность структуры
единичного эволюционного периода. Она гистонов Н3 и Н4 свидетельствует о том,
равна времени, за которое последователь- что они выполняют какую-то чрезвычайно
ность аминокислот изменяется на 1% по- важную функцию, возникшую на заре эво-
люции эукариот и сохранившуюся с тех
пор почти без изменений.
Таблица 29.1. Гистоны

29.4. Нуклеосомы - повторяющиеся


Тип Отноше- Число Мас- Локализа- субъединицы хроматина
ние аминокис- са, кДа ция Как происходит взаимодействие гистонов
[Lys]/ лотных с ДНК и образование нити хроматина?
[Arg] остатков Основываясь на данных, полученных раз-
личными методами, Роджер Корнберг
(Roger Kornberg) высказал в 1974 г. пред-
Н1 20,0 215 21,0 Линкер положение, что хроматин состоит из по-
Н2А 1,25 129 14.5 Сердцеви-
вторяющихся субъединиц, каждая из ко-
на
Н2В 2.5 125 13,8 торых включает 200 пар оснований ДНК
Н3 0,72 135 15,3
Н4 0,79 102 11,3 29. Хромосомы и выражение
генов у эукариот 129
Целый ряд экспериментальных данных
свидетельствует в пользу этой модели
структуры хроматина.
1. Электронная микроскопия. На элек-
тронных микрофотографиях хроматина
видны группы расположенных друг за дру-
гом бусин диаметром 100 А, соединенных
тонкой нитью (рис. 29.4). Степень растяже-
ния хроматиновой нити зависит от способа
подготовки образцов для микроскопии.
Некоторые методы дают электронные ми-
крофотографии с более компактным рас-
положением 100-ангстремных бусин. Сле-
довательно, электронная микроскопия пря-
мо подтверждает, что хроматин - цепочка
почти сферических частиц, между которы-
ми расположены гибкие участки.
2. Дифракция рентгеновских лучей
и нейтронов. При рентгеновской дифракции
на нитях хроматина также виден повтор
длиной 100 А. Нейтронная дифракция по-
казывает, что ДНК расположена снаружи
нуклеосомы.
3. Нуклеазный гидролиз. Свободную
ДНК в растворе можно расщепить по лю-
бой из ее фосфодиэфирных связей с по-
мощью панкреатической дезоксирибону-
клеазы I (ДНКазы I) или микрококковой
нуклеазы. ДНК в хроматине, за исключе-
нием нескольких участков, наоборот, защи-
щена от гидролитического действия ну-
клеазы. Характер расщепления хроматина
поражает своей простотой: на электрофо-
реграмме видна лесенка четко выраженных
полос (рис. 29.5). В этих фрагментах содер-
Рис. 29.4. Электронная микрофотогра- жатся фрагменты ДНК, кратные основно-
фия хроматина. Частицы, похо- му повтору длиной примерно 200 пар ос-
жие на бусины, имеют диаметр нований. Электронные микрофотографии
около 100 А. (Печатается с лю- показывают, что число сферических частиц
безного разрешения д-ра Ada во фрагменте хроматина равно числу
Olins и д-ра Donald Olins.) 200-парных повторов (рис. 29.6). Например,
фрагмент, содержащий ДНК длиной 600
и по 2 молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 пар оснований, состоит из трех 100-анг-
и Н4. Теперь эти повторяющиеся единицы стремных частиц. Следовательно, бусина,
называют нуклеосомами. Большая часть видимая на электронной микрофотогра-
ДНК намотана на гистоновую сердцевину фии, соответствует нуклеосоме, получае-
(гистоновый кор). Остальная ДНК, так на- мой при нуклеазном гидролизе.
зываемый линкер, или межнуклеосомная 4. Реконструкция. Если добавить ги-
ДНК, соединяет соседние нуклеосомы стоны к ДНК аденовируса или обезьяньего
и обеспечивает гибкость хроматиновой ни- вируса SV-40, можно получить in vitro xpo-
ти. Таким образом, хроматиновая нить матиноподобную нить. Количество ДНК,
представляет собой гибкую цепочку нуклео- связанной с нуклеосомой в таких системах
сом, напоминающую бусины на нитке. реконструкции, составляет около 200 пар ос-
нований. Кроме того, для образования ну-
Часть IV. клеосомы необходимо эквимолярное коли-
130 Информация чество гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Если
какого-либо гистона в смеси для рекон-
струкции оказывается недостаточно, обра-
зования характерных бусин не происхо-
дит. Однако гистон H1 для реконструкции
не нужен; этот факт перекликается с тем, что
гистон H1 присутствует не во всех нуклеосо-
мах эукариотических клеток. Исследования
дифракции рентгеновских лучей также по-
казывают, что для получения картины, ха-
рактерной для хроматина, необходимо до-
бавить гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4.

29.5. Минимальная нуклеосома


(«ядро» нуклеосомы) состоит из ДНК
длиной 140 пар оснований, намотанной
на октамер гистонов
Содержание ДНК в нуклеосомах различных
организмов и типов клеток колеблется от
160 до 240 пар оснований (табл. 29.2). Что
лежит в основе этих различий? И в этом слу-
чае использование нуклеаз оказалось весьма

Рис. 29.5. Гель-электрофорез фрагмен- Рис. 29.6. Электронные микрофотогра-


тов ДНК хроматина, полу- фии мономеров (А), димеров
ченных с помощью ограничен- (Б), тримеров (В) и тетрамеров
ного гидролиза микрококко- (Г) нуклеосом, полученных, как
вой нуклеазой. На дорожку описано в подписи к рис. 29.5.
А была нанесена нефракциони- [Finch J. Т., Noll M, Kornberg
рованная смесь. При центрифу- R.D., Ргос. Nat. Acad. Sci., 72,
гировании в градиенте концен- 3321 (1975).]
трации сахарозы были полу-
чены фракции мономеров (Б),
димеров (В), тримеров (Г) и те-
трамеров (Д). [Finch J. Т.,
Noll M., Kornberg R. D., Ргос. 29. Хромосомы и выражение
Nat. Acad. Sci., 72, 3321 (1975).] генов у эукариот 131
информативным. Нуклеосомы можно
в свою очередь гидролизовать микрококко-
вой нуклеазой; при этом получаются ча-
стицы минимальной нуклеосомы (нуклео-
сомного «ядра»), содержащие 140 пар
оснований, независимо от исходного содер-
жания ДНК в расчете на одну нуклеосому.
Эта минимальная нуклеосома, по всей ве-
роятности, практически одинакова у всех эу-
кариот. Она состоит из фрагмента ДНК
длиной 140 пар оснований, связанного с окта-
мером гистонов (по два гистона Н2А, Н2В,
Н3 и Н4).
Минимальные нуклеосомы были полу-
чены в кристаллическом виде и в настоящее
время исследуются с помощью электронной
микроскопии (рис. 29.7) и дифракции рент-
геновских лучей. Кристаллизация этих ча- Рис. 29.7. Электронная микрофотогра-
стиц показывает, что нуклеосомы хрома- фия кристалла минимальных
тина весьма гомогенны. Арон Клуг и Джон нуклеосом. Центры соседних
Финч (Aaron Klug, John Finch) установили, нуклеосом в этом гексагональ-
что минимальная нуклеосома (нуклеосом- ном слое находятся на расстоя-
ное «ядро») представляет собой уплощен- нии 100 А друг от друга.
ную частицу размером 110 х 100 x 55 А [Finch J. Т. et al, Nature, 269, 31
и состоит из двух слоев. Фрагмент ДНК (1977).]

Таблица 29.2. Содержание ДНК в нуклеосомах


Рис. 29.8. Схематическое изображение
нуклеосомы. Двойная спираль
ДНК (красная полоса) намота- Тип клеток Число пар основа-
на на октамер гистонов (по две ний
молекулы Н2А, Н2В, Н3 и Н4;
изображены голубым). Гистон
H1 (желтый цвет) связывается Дрожжи 165
с наружной стороной этой ми- Клетки HeLa 183
нимальной нуклеосомы и Костный мозг крысы 196
192
Печень крысы
с линкерной ДНК. (Kornberg
Почки крысы 196
A., DNA Replication. Freeman Яйцевод курицы
and. Co., 1980.) Эритроциты курицы 207
Гаструла морского ежа 218
Часть IV. Сперма морского ежа 241
132 Информация
длиной 140 пар оснований намотан снаружи
на сердцевину и образует 1 3 / 4 оборота лево-
закрученной суперспирали с шагом пример-
но 28 А (рис. 29.8).
Как уже упоминалось, гистон H1 не всег-
да присутствует в нуклеосоме. Последова-
тельность аминокислот в гистоне H1 наибо-
лее вариабельна из всех пяти гистонов.
К тому же гистон H1 отличается от других
гистонов пo стехиометрии: на нуклеосому
приходится одна молекула гистона H1. Кро-
ме того, гистон H1 легко отделяется от ну-
клеосом, что указывает на его перифериче-
скую локализацию, т.е. он не является
частью гистоновой сердцевины. Нуклео-
сомы теряют гистон H1, когда ДНК в их со-
ставе укорачивается со 160 до 140 пар осно-
ваний. Таким образом, гистон H1 почти
наверняка расположен вне нуклеосомы, бли-
же к линкерной ДНК. Гистон H1 может слу-
жить мостиком между различными нуклео-
сомами и способствовать таким образом
повышению компактности хроматина.
Рис. 29.9. Предполагаемая соленоидная
модель хроматина. На один
29.6. Нуклеосома - первый уровень оборот спирали приходится
конденсации ДНК шесть нуклеосом (показаны си-
Накручивание ДНК на нуклеосомную серд- ним цветом). Двойная спираль
цевину обеспечивает конденсацию ДНК, так ДНК (красная) намотана на ка-
как уменьшает ее линейные размеры. Уча- ждую нуклеосому. [Finch J.T.,
сток ДНК длиной 200 пар оснований имеет Klug A., Proc. Nat. Acad. Sci., 73,
в растворе длину 680 А. В нуклеосоме это 1900 (1976).]
количество ДНК укладывается в частицу
диаметром 100 А. Таким образом, плот-
ность упаковки (степень конденсации) ну- с плотностью упаковки около 40 (рис. 29.9).
клеосомы составляет примерно 7. Сравнима Складывание таких соленоидов в петли мо-
ли эта величина со степенью конденсации жет дать дополнительную конденсацию. По
ДНК в хромосоме? Метафазные хромо- всей вероятности, в стабилизации струк-
сомы человека, которые находятся в сильно туры хромосомы высших порядков уча-
конденсированном состоянии, содержат ствуют различные негистоновые белки. На-
5,3•109 пар оснований, что соответствует пример, в лишенных гистонов метафазных
контурной длине ДНК 180 см. Эта ДНК хромосомах выявляется центральный бел-
упакована в 46 цилиндрических структур, ковый остов, окруженный множеством
общая длина которых составляет 200 мкм. очень длинных петель ДНК (рис. 29.10). По-
Таким образом, плотность упаковки ДНК видимому, эти петли ДНК закреплены на
в метафазных хромосомах равна приблизи- остове. Такая организация может иметь
4
тельно 10 . В интерфазных ядрах, где хрома- важное значение для передвижения хромо-
тин находится в более дисперсном состоя- сом в митозе и мейозе.
нии, плотность упаковки для ДНК соста-
вляет примерно 102-103. Очевидно, нуклео- 29.7. Репликация эукариотической ДНК
сома представляет собой лишь первый начинается во многих местах и идет
уровень конденсации ДНК. в двух направлениях
Каков следующий уровень организации Подобно другим молекулам ДНК, эукарио-
ДНК? Одна из возможностей состоит тическая ДНК реплицируется полуконсерва-
в том, что сами нуклеосомы укладываются
в спираль. Например, предложена соленоид- 29. Хромосомы и выражение
ная модель хроматина диаметром 360 А генов у эукариот 133
Рис. 29.10. Электронная микрофотогра- ма дрозофилы содержит ДНК длиной
фия ДНК, с которой удалены 2,1 см, или 62000 kb. Репликационная вилка
гистоны. ДНК прикрепляется ДНК дрозофилы движется со скоростью 2,6
к центральному белковому kb/мин (сравните со скоростью движения
остову. Гистоны удалили из вилки у Е. coli 16 kb/мин). Если бы в самой
метафазных хромосом клеток большой хромосоме дрозофилы существо-
HeLa, обработав их полианио- вала только одна точка начала репликации,
нами. (Печатается с любезного то ее удвоение заняло бы более 16 сут. На
разрешения д-ра Ulrich самом деле время репликации составляет
Laemmli.) менее 3 мин. Это достигается коопера-
тивным действием более чем 6000 реплика-
ционных вилок на одну молекулу ДНК. Мо-
тивно. Кроме того, реплицированная ДНК лекула ДНК из ядра дрозофилы, находяще-
полуконсервативно распределяется между гося на стадии дробления, представляет
сестринскими хроматидами метафазных собой набор следующих один за другим
хромосом (рис. 29.11). Методом электрон- участков репликации, или «глаз»
ной микроскопии было показано, что репли- (рис. 29.12). Активирование каждой точки
кация эукариотической ДНК начинается во инициации порождает две расходящиеся ре-
многих точках и идет в двух направлениях. пликационные вилки. Расширяющиеся
Использование многих точек инициации не- в обоих направлениях «глаза» сливаются
обходимо для быстрой репликации, так как и образуют две дочерние молекулы ДНК
эукариотические ДНК имеют огромную (рис. 29.13). «Глаз» внутри другого «глаза»
длину. Например, самая длинная хромосо- никогда не наблюдался. Из этого следует
что начало репликации не может снова реак-
Часть IV. тивироваться, пока не закончится реплика-
134 Информация
Рис. 29.11. Флуоресцентная микрофото-
графия метафазных хромосом
мужчины. ДНК в клетках
дважды реплицировалась
в среде, содержащей аналог ти-
мидина 5-бромдезоксиуридин
(BrdU). Хромосомы сначала
окрасили хинакрином (А),
отмыли и снова окрасили бис-
бензимидазольным красите-
лем Хехст 33258 (Б). BrdU ту-
шит флуоресценцию второго
красителя, поэтому сестрин-
ские хроматиды, содержащие
ДНК, в которой только одна
полинуклеотидная цепь заме-
щена BrdU, флуоресцирует яр-
че, чем ДНК с BrdU в обеих це-
пях. (Печатается с любезного
разрешения д-ра Sammuel
Latt.)

ция всей молекулы ДНК.


В эукариотических клетках имеются
ДНК-полимеразы трех типов (табл. 29.3).
α-Полимераза играет основную роль в ре-
пликации хромосомы, а β-фермент уча-
ствует в репарации ДНК. Когда покоящиеся
клетки начинают быстро делиться, количе- Рис. 29.12. Электронная микрофотогра-
ство α-полимеразы возрастает более чем фия реплицирующейся хромо-
в 10 раз. γ-Полимераза отвечает за реплика- сомной ДНК из дробящегося
цию митохондриальной ДНК. Как и прока- ядра эмбриона дрозофилы.
риотические ДНК-полимеразы, эти фер- «Глаза» - только что реплици-
менты используют в качестве активиро- рованные участки. (Печатается
ванных предшественников дезокси- с любезного разрешения д-ра
рибонуклеозидтрифосфаты и осуществляют David Hogness.)
элонгацию затравки по матрице в направле-
нии 5'—>3'. Но в отличие от прокариот эука- 29. Хромосомы и выражение
риотические ДНК-полимеразы не обладают генов у эукариот 135
Рис. 29.13. Схематическое изображение 29.8. Новые гистоны образуют
репликации эукариотической новые нуклеосомы на отстающей
хромосомы. Родительская дочерней цепи ДНК
ДНК показана синим цве- В репликационных вилках синтез ДНК идет
том, новообразованная ДНК- в направлении 5'—>3' по одной дочерней це-
красным. пи и в направлении 3'—>5' по другой. Как
и при репликации прокариотической ДНК
(разд. 24.19), это происходит следующим
нуклеазной активностью. Скорее всего образом: одна цепь, ведущая, синтезируется
функцию исправления ошибок выполняют непрерывно, а другая, отстающая,- преры-
нуклеазы, ассоциированные с этими поли- висто. Как распределяются старые и новые
меразами в мультиферментных комплексах. гистоны? Чтобы решить этот вопрос, синтез
ДНК проводили в присутствии ингибитора
белкового синтеза циклогексимида. В этих
условиях синтез ДНК прекращается в тече-
ние примерно 15 мин. При действии
ДНКазы I половина новообразованной
ДНК полностью распадается, а другая по-
ловина расщепляется на фрагменты длиной
200 пар оснований. Этот эксперимент, а так-
же данные, полученные с помощью метки
тяжелыми изотопами, показали, что роди-
тельские гистоны ассоциированы только
с одной из двухспиральных дочерних ДНК,
тогда как другая остается голой из-за отсут-

Рис. 29.14. Фазы клеточного цикла эука- Таблица 29.3. Эукариотические ДНК-полимеразы
риотической клетки: митоз
(М); фаза покоя 1, перед синте- Тип Локализация Основная Масса,
зом ДНК (G l ); период синтеза функция кДа
ДНК (S); фаза покоя 2, после Ядро Репликация 140
α
синтеза ДНК (G2). Продолжи- ядерной ДНК
тельность фаз зависит от типа Репарация 40
клеток и условий культивиро- β » ядерной ДНК
вания. Митоз - обычно самая
Митохондрии Репликация 150
короткая фаза. γ митохондриаль-
ной ДНК
Часть IV.
136 Информация
ваются на отстающей цепи по той причине,
что до соединения фрагментов Оказаки она
содержит одноцепочечные участки.

29.9. Митохондрии и хлоропласты содержат


собственную ДНК
Не вся наследственная информация эука-
риотических клеток содержится в ядерной
хромосомной ДНК. В результате генетиче-
ских исследований дрожжей был открыт ми-
тохондриальный геном, отличный от ядер-
ного генома. В 1949 г. Борис Эфрусси (Boris
Ephrussi) обнаружил, что некоторые му-
танты пекарских дрожжей не способны
к окислительному фосфорилированию. Эти
дефектные по дыханию мутанты медленно
растут за счет брожения. Они называются
Рис. 29.15. Асимметричная репликацион- petites (что по-французски означает «ма-
ная вилка, возникшая в резуль- ленькие»), так как образуют очень малень-
тате синтеза ДНК в присут- кие колонии. Генетический анализ привел
ствии циклогексимида, блоки- к неожиданному открытию, что мутации
рующего образование новых petites сегрегируют независимо от ядра; это
гистонов. Одна из дочерних навело на мысль о том, что митохондрии
молекул ДНК покрыта бусина- обладают собственным геномом. И дей-
ми, другая остается голой. Это ствительно, через несколько лет в митохон-
показывает, что родительские дриях была обнаружена ДНК. Более того,
гистоны связаны только митохондриальная ДНК из штамма petite
с одной из дочерних молекул. отличалась по плавучей плотности от мито-
[Riley D., Weintraub H., Proc. хондриальной ДНК дрожжей дикого типа;
Nat. Acad. Sci., 76, 331 (1979).] из этого следовало, что у мутанта изменена
значительная часть митохондриального ге-
нома. Вслед за этим было показано, что хло-
ропласты фотосинтезирующих эукариот то-
ствия новых гистонов. Эта интерпретация же содержат ДНК и что она реплицируется,
находит прямое подтверждение на элек- транскрибируется и транслируется.
тронных микрофотографиях, где видно, что Митохондриальная ДНК животных кле-
в области репликационной вилки одна из ток - кольцевая двухцепочечная молекула
дочерних нитей покрыта бусинами, а дру- с контурной длиной около 5 мкм, что со-
гая - нет (рис. 29.15). Иными словами, роди- ответствует 15 kb. Дрожжевая митохон-
тельские гистоны распределяются во время дриальная ДНК обычно примерно в 5 раз
репликации консервативно1. Такое поведе- длиннее, а хлоропластная - в 10 раз длиннее.
ние гистонов показывает, что гистоны не от- Молекулы ДНК в митохондриях и хлоро-
деляются от ДНК во время репликации. пластах не связаны с гистонами. Они отно-
Старые гистоны остаются на двухцепочеч- сительно невелики, сравнимы по величине
ной ДНК, содержащей ведущую цепь, тогда с вирусными геномами. Лучше всего изучен
как новые гистоны садятся на ДНК, содер- митохондриальный геном дрожжей, коди-
жащую отстающую цепь. Причина этого рующий примерно десять белков, две моле-
различия между дочерними молекулами кулы рибосомной РНК и около 26 видов
ДНК заключается, очевидно, в том, что ги- транспортной РНК. Молекулы, кодируемые
стоны гораздо прочнее связываются с двух- митохондриальной ДНК и синтезируемые
цепочечной ДНК, чем с одноцепочечной. внутри этой органеллы, составляют всего
Старые гистоны, по-видимому, не удержи- около 5% митохондриального белка. Таким
1 образом, большая часть белков митохон-
Недавно этот вывод подвергался серьезной
критике в связи с тем, что по некоторым дрии кодируется ядерным геномом. Однако
данным циклогексимид нарушает нормальное
распределение гистонов во время репликации.— 29. Хромосомы и выражение
Прим. перев. генов у эукариот 137
генетический вклад митохондриальной браны митохондрий кодируются митохон-
ДНК необходим. Например, три из семи дриальным геномом. Существование от-
субъединиц цитохромоксидазы и три из де- дельных геномов влечет за собой ряд
сяти субъединиц АТРазы внутренней мем- вопросов. Каким образом репликация мито-
хондриальной ДНК координируется
с удвоением хромосом и делением клетки?
Как белки, синтезированные в цитозоле,
проникают в митохондрии и взаимодей-
ствуют с продуктами митохондриальных
генов? Но самое загадочное состоит в сле-
дующем: зачем митохондриям нужны со-
бственные геномы, если 95% их белков коди-
руются ядерным геномом? Ответов на эти
интригующие вопросы пока нет.

29.10. Эукариотическая ДНК содержит


много повторяющихся последовательностей
оснований
Рой Бриттен (Roy Britten) и его сотрудники
исследовали кинетику реассоциации ДНК,
денатурированной нагреванием, и обнару-
жили, что эукариотическая ДНК в отличие
от прокариотической ДНК содержит
много повторяющихся последовательно-
стей оснований. В этих экспериментах
ДНК дробили на короткие фрагменты
и затем денатурировали нагреванием рас-
твора выше температуры плавления ДНК
(Тпл). Затем полученный раствор одноцепо-
чечной ДНК охлаждали до температуры
примерно на 25°С ниже Тпл, оптимальной
для реассоциации комплементарных цепей
Рис. 29.16. Электронно-микроскопиче- с образованием двухспиральной ДНК. Ки-
ское изображение молекулы нетику реассоциации можно регистриро-
вать самыми различными способами.
митохондриальной ДНК, со-
Один из методов состоит в измерении по-
держащей два генома, соеди-
ненных «голова к хвосту» глощения раствора при 260 нм (разд. 24.9).
При этой длине волны коэффициент погло-
с образованием кольца. Репли-
щения двухцепочечной ДНК примерно на
кация этой молекулы ДНК
40% ниже, чем соответствующая величина
только что началась. Стрелка-
для одноцепочечной ДНК; это явление на-
ми показаны две петли, распо-
зывается гипохромизмом. В основе другого
ложенные на противопо-
ложных сторонах кольца. Эти экспериментального подхода лежит тот
факт, что двухцепочечная ДНК связывает-
петли с вытесненной цепью
ся колонками с гидроксиапатитом (фосфа-
(D-петли, от англ. displa-
том кальция), а одноцепочечная проскаки-
cement - вытеснение) содержат
вает. В этом методе привлекает то, что он
новосинтезированную ДНК.
позволяет фракционировать большие коли-
Более тонкая линия в каждой
чества ДНК на основе скорости ее реассо-
петле - вытесненный одноцепо-
циации после тепловой денатурации.
чечный участок родительской
Наблюдаемая кинетика реассоциации
ДНК. (Печатается с любезного
ДНК Е. coli или фага Т4 соответствует
разрешения д-ра David
ожидаемой кинетике бимолекулярной реак-
Clayton.)
ции
Часть IV.
138 Информация
Рис. 29.17. Кривые зависимости f от C0t мощью этой кривой. C 0 t 0 , 5 - значение C0t,
(«кривые C0t») отображают ки- при котором происходит реассоциация по-
нетику реассоциации несколь- ловины ДНК (f= 0,5). Для ДНК Е. coli зна-
ких денатурированных нагре- чение C 0 t 0 , 5 составляет примерно 9 М•с,
ванием ДНК. По оси ординат для фага Т4 C 0 t 0 , 5 = 0,3 М•с. Эти числа
отложена доля одноцепо- показывают, что ДНК Е. coli реассоции-
чечных молекул, по оси рует примерно в 30 раз медленнее, чем
абсцисс - C0t. Быстрая реассо- ДНК фага Т4. Объясняется это тем, что
циация сателлитной ДНК мы- ДНК Е. coli длиннее и число разных видов
ши показывает, что она содер- фрагментов, которые содержатся в препа-
жит огромное количество рате ДНК, разрушенной силами сдвига,
повторяющихся последова- больше, чем в препарате ДНК Т4. Итак,
тельностей. [Britten R. J., Koh- концентрация комплементарных фрагмен-
ne D. E., Science, 161, 530 тов в растворе фрагментированной ДНК
(1968).] Е. coli ниже, чем в растворе ДНК фага Т4
(содержащем такое же количество нуклео-
тидов), и, следовательно, скорость реассо-
где S и S' - комплементарные одноцепо- циации ниже. Исследование ряда прока-
чечные молекулы, D - реассоциировавшая риотических ДНК показало, что величина
двойная спираль и k - константа скорости C 0 t 0,5 прямо пропорциональна размеру ге-
ассоциации. В такой реакции доля одноце- нома.
почечных молекул f снижается со временем Когда с помощью этого метода стали
в соответствии с уравнением исследовать ДНК мыши, получили неожи-
данный результат. Геномы млекопитаю-
щих примерно на три порядка величины
больше, чем геном Е. coli, и предполага-
лось, что будет получена величина C 0 t 0 , 5
где С0 - исходная концентрация ДНК (вы- порядка
4
10 М•с. Раствор ДНК
раженная в молях нуклеотидов в 1 л), -4
с концентрацией 10 М и с такой величи-
а t - время в секундах. Для определенной ной C0t0,5 должен реассоциировать напо-
ДНК и заданных экспериментальных усло- ловину за 108 с (примерно 3 года). К уди-
вий (т. е. ионной силы, температуры, разме- влению исследователей, они обнаружили,
ра фрагментов ДНК) f зависит только от что 10% ДНК мыши реассоциирует напо-
C0t - произведения концентрации ДНК на ловину за несколько секунд. Эта фракция
время. Кинетику реассоциации удобно гра- ДНК мыши реассоциирует быстрее, чем
фически изображать, откладывая зависи- даже самые маленькие вирусные ДНК, и,
мость f от десятичного логарифма C0t. Та- следовательно, содержит много повторяю-
кая кривая C0t имеет сигмоидную форму щихся последовательностей. Анализ кри-
(рис. 29.17). Характеристикой того или
иного препарата ДНК служит величина 29. Хромосомы и выражение
C 0 t 0 , 5 , которую легко определить с по- генов у эукариот 139
вой зависимости f от C0t показал, что эта
фракция мышиной ДНК содержит порядка
миллиона копий повторяющейся последова-
тельности длиной около 300 пар оснований.
Примерно 20% мышиной ДНК ренатури-
рует с промежуточной скоростью. Этот
факт, согласно интерпретации авторов,
указывал, что данная фракция содержит
3 4
10 —10 копий определенных последова-
тельностей. Остальные 70% мышиной
ДНК ренатурировали очень медленно. Ве-
личина C 0 t 0,5 для этой фракции показыва-
ла, что она состоит из уникальных или по-
чти уникальных последовательностей осно-
ваний.
Все изученные до настоящего времени Рис. 29.18. На этой кривой седиментации
эукариотические геномы, кроме, возможно, видны три отчетливых пика са-
дрожжей, содержат повторяющиеся по- теллитной ДНК (ρ = 1,692,
следовательности ДНК, тогда как прока- 1,688 и 1,671). Показан резуль-
риоты ее не содержат. Например, челове- тат равновесного центрифуги-
ческая ДНК на 30% состоит из последова- рования ДНК D. virilis в ней-
тельностей, повторяющихся по меньшей тральном градиенте CsCl.
мере 20 раз. Относительное содержание [Gall J. G., Cohen E. H., Ather-
высокоповторяющейся, умеренно повто- ton D. D., Cold Spring Harbor
ряющейся и уникальной ДНК различно Symp. Quant. Biol., 38, 417
у разных видов. (1974).]
29.11. Высокоповторяющаяся ДНК и обрабатывали щелочью для денатурации
(сателлитная ДНК) локализована ДНК. Затем этот препарат инкубировали
в центромерах с меченной тритием РНК, транскрибиро-
Многие высокоповторяющиеся ДНК мож- ванной in vitro очищенной сателлитной
но выделить методом центрифугирования ДНК в качестве матрицы. Гибриды ра-
в градиенте плотности, так как их плавучая диоактивной РНК с участками хромосомы,
плотность отличается от плотности основ- содержащими сателлитную ДНК, вы-
ной ДНК. Например, ДНК Drosophila virilis являли с помощью радиоавтографии
дает главный пик и три сателлитных пика (рис. 29.19). Был получен очень четкий ре-
с меньшей плотностью (рис. 29.18). Эти са- зультат: сателлитная ДНК мыши встре-
теллитные пики содержат исключительно чается только в области центромер. Лока-
повторяющуюся ДНК. Каждая из них лизация этих последовательностей и отсут-
представляет собой повторяющуюся по- ствие в клетке комплементарных им РНК
следовательность гептануклеотидов: объясняются, по-видимому, тем, что са-

Роль высокоповторяющейся ДНК не- теллитные последовательности участвуют


известна. Но хромосомная локализация в перемещениях хромосом во время мито-
этой фракции была определена с помощью за и мейоза.
метода гибридизации in situ, разработанно-
го Джозефом Голлом и Мэри Лу Пардью 29.12. Гены, кодирующие рибосомные РНК,
(Joseph Gall, Mary Lou Pardue). Клетки им- расположены один за другим тандемно
мобилизовали под тонким слоем агара и повторяются несколько сот раз
Гены, кодирующие молекулы рибосомных
Часть IV. РНК, отличаются двумя особенностями.
140 Информация Во-первых, они повторяются тандемно
са Бернстила, Доналда Брауна, Оскара
Миллера (Max Birnstiel, Donald Brown,
Oscar Miller) и их сотрудников. Гены, коди-
рующие четыре рибосомные PHK - 18S-,
5,8S-, 28S- и 5S-рРНК,- были выделены
в чистом виде из ДНК африканских шпор-
цевых лягушек Xenopus laevis и Xenopus
mulleri. Выбор пал на шпорцевых лягушек
по той причине, что их о