CULTIVO DE LINFOCITOS SIEMBRA RPMI 1640 + A/B + Suero fetal bovino al (5-10%)+ Fitohemaglutinina 10-20 gotas de sangre heparinizada

da Incubar durante 72 horas EXTRACCIN DE CROMOSOMAS Sacar el cultivo y colocar Colcemid Centrifugar y decantar el sobrenadante Agregar Solucin Hipotonoca de KCl al 0.075M Colocar 1 cm de Fijador Carnoy y llevar a la nevera por 20 minutos Centrifugar y colocar Carnoy - llevar a la nevera Repetir los lavados por tres veces Realizar los extendidos por goteo OBJETIVOS Conocer las metodologas citogenticas linfocitos para obtencin de cromosomas. Citogentica. INFORME DE PRCTICA N 5

relacionadas con las tcnicas de cultivo de

Identificar las diferentes tcnicas bandeo cromosmico utilizadas en el laboratorio de

Cul es la funcin de las siguientes sustancias en el cultivo de linfocitos:

1. Suero fetalbovino El papel de suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de lneas y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementacin con hormonas y otros factores de crecimiento que estn involucradas en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de energa celular, control de sntesis de macromolculas y factores que estimulan la formacin del producto deseado. Muchos de los factores suplementados son purificados del mismo suero, lo cual hace que cultivos a gran escala con medio libre de suero no sean rentables. 2. Fitohemaglutinina Dadas las propiedades de aglutinar clulas sanguneas, la PHA se utiliz inicialmente como medio para separarlas de la sangre total. Al demostrarse posteriormente el efecto mitognico, el espectro de aplicaciones se increment y actualmente se usa como factor estimulante de la proliferacin en cultivos de diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos; en los que tambin acta sobre los procesos bioqumicos relacionados con la respuesta inmune. Otras aplicaciones incluyen el estudio in vitro de los mecanismos bioqumicos de la apoptosis y de la proliferacin celular en linfocitos. Todas estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de combinarse especficamente con determinados sacridos. 3. Colquicina/colcemid

El colcemid es un anlogo sinttico de la colchicina, sumamente activo. Colcemid se aade tras el cultivo celular para la inhibicin de mitosis y parada en metafase por degradacin de los microtbulos esenciales para el correcto proceso mittico. Una vez que el cultivo ha alcanzado el crecimiento adecuado, se detiene el ciclo celular en metafase al impedir la formacin del huso mittico con la adicin de colchicina. 4. Solucin hipotonica KCl 0.075 M Esta solucin hipotnica (concentracin de Na menor que la intracelular) ocasiona un arrastre de agua a traves de la membrana celular hacia el citoplasma, entonces la clula se hincha y los cromosomas se dispersan. La precisin en la preparacin y el tiempo de tratamiento hipotnico son fundamentales para la obtencin de metafases ptimas para su estudio: abiertas, fciles de contar y con bajo nmero de cromosomas sobrepuestos. Errores en estos pasos, ocasionan rupturas celulares si la concentracin de sales es extremadamente baja o el tiempo de tratamiento prolongado; o metafases completamente cerradas, inadecuadas para el estudio, si la concentracin de sales es cercana a la isotonia. 5. Carnoy Un fijador modifica una celula mediante la estabilizacin de las protenas de modo que la hace resistente a los cambios posteriores. Carnoy es un fijador tipo coagulante que transforma las protenas en estructuras insolubles mantienendo la morfologa de las estructuras celulares a nivel de microscopa de luz. 6. Glutamina La glutamina (abreviada Gln o Q) es uno de los 20 aminocidos ms comunes empleados en la codificacin del cdigo gentico; es una cadena lateral de una amida del cido glutmico, formada mediante el reemplazo del hidroxilo del cido glutmico con un grupo funcional amina. Su funcin es sintetizar protenas, aumentar el nitrgeno de la sangre, aumentar el ATP (Adenosina Trifosfato) y mejora el sistema inmune. Es necesario suplementar el medio basal con los aminocidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminocidos, pues los requerimientos pueden variar de una clula a otra. Un suplemento comn es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas lneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda aadirla a partir de un stock concentrado (100x) que se mantiene congelado, no ms de 1 semana antes de aadir el medio al cultivo (conservando a 4 C).

Mencione 5 ejemplos de medios de cultivo celular y diga qu tipo de clulas se pueden cultivar para obtener cromosomas y diga cul es su utilidad.

Medio de cultivo RPMI 1640 El medio Roswell Park Memorial Institute, comnmente conocida como RPMI, es una forma de instrumento utilizado en el cultivo de clulas y cultivo de tejidos. Tradicionalmente se ha utilizado para el crecimiento de clulas humanas linfoide. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y est formulado para su uso en una atmsfera de dixido de carbono 5%. Hay una variedad de medios similares en la serie de RPMI, como RPMI 1640. RPMI-1640 es un medio de cultivo que fue desarrollado por Moore et al. en el Roswell Park Memorial Institute, de ah el acrnimo RPMI. La formulacin se basa en el medio RPMI-1630 que

utiliza un sistema amortiguador de bicarbonato y variaciones en las cantidades de aminocidos y vitaminas. Es un medio que ha sido usado para el cultivo de leucocitos humanos normales y neoplsicas, y ha demostrado una amplia aplicabilidad para apoyar el crecimiento de muchos tipos de clulas en cultivo, incluyendo frescos linfocitos humanos.
Que son los intercambios de cromatides hermanas y cul es su importancia clnica Que es la fragilidad cromosmica y cul es la importancia clnica Que es el X frgil Es el sndrome del X frgil, tambin conocido como sndrome de Martin-Bell. Sndrome gentico causante de la deficiencia mental hereditaria ms frecuente; pudiendo ser ste desde moderado a severo y que afecta principalmente a varones, quienes manifiestan un fenotipo caracterstico. Su nombre se debe a la presencia de una "rotura" en el extremo distal del cromosoma X (Xq27.3) en el cariotipo de los individuos afectados. En 1991, se identific el defecto molecular causante del sndrome, sustituyendo al estudio citogentico como mtodo de confirmacin diagnstica. Que son las bandas de alta resolucin y como se obtienen

Este tipo de bandas se obtienen con tcnicas de bandeo G o R en etapas ms precoces de la mitosis( profase o prometafase), cuando los cromosomas todava estn en un estado relativamente descondensado. Las bandas de alta resolucin son especialmente tiles cuando se sospecha que existe una pequea anomala estructural en un cromosoma. El bandeo tpico suele oscilar entre 400 500 bases por cariotipo, mediante el uso de las tcnicas anteriores. En ocasiones puede ser necesario llegar a obtener ms bandas, una mayor resolucin. Mediante las tcnicas que se listarn ahora, se puede llegar a conseguir una resolucin de 800 1000 bandas. Se puede hacer con Giensa, siempre y cuando los cromosomas estn menos condensados. Se suelen emplear cromosomas profsicos o en fases tempranas de la metafase. Se debern sincronizar todas las divisiones, mediante un antagonista del cido flico que bloquee la divisin. Se provoca entonces la divisin, a la vez que se da un tratamiento corto con colcemil, que es un inhibidor de la divisin.Existe una terminologa internacionalmente establecida para nombrar las bandas. Lanumeracin va de proximal a distal, en cada brazo. Dentro de cada banda se pueden detectar en ocasiones otras bandas, de manera que una banda puede ser identificada como: 5p 12.10.Existen algunas anomalas que se pueden detectar mediante el bandeo, como puede ser el sndrome del X frgil, que es la causa principal del retraso mental en varones humanos. Para detectarlo se hace un cultivo en medio con timidina y la tincin con Giensa. En las bandas G se usan colorantes que se unen a regiones ricas en AT, que contengan entre un55 60%. Se usan colorantes como Giensa o Quinacrina. Las bandas R se detectan mediante colorantes que se unen a GC, en regiones que contengan entre 50 60%. Las diferencias en los porcentajes de bases no sern suficientes para explicar las diferencias. Existen autores que han propuesto un modelo que postula que las diferencias se debern posiblemente a diferencias estructurales. Se cree que algunas protenas podran unirse a regiones especficas del DNA. Defina euploidia y aneuploida y d 3 ejemplos. Euploidia: Significa que las clulas poseen juegos completos de cromosomas; lo normal en la especie
humana es que haya 2 juegos completos (2 x 23 = 46), pero a veces hay 3 e incluso 4 juegos (triploida, tetraploida) incompatibles con la vida. Es el estado celular en el cual la clula tiene uno o ms juegos completos de cromosomas (dotaciones monoploides (x)) de su especie; dependiendo de especies, se excluyen los cromosomas sexuales.

Ejemplos: 1. 28,XY, +5,+6,-21,-12,+18 2. 98,XXY,+5,+8+12-18+20 3. 79,+6+8+10-15 Aneuploida: Hace referencia a cambios en el nmero de cromosomas, que pueden dar lugar a enfermedades
genticas. Un aneuploide es un individuo cuyo nmero de cromosomas difiere del tipo salvaje en parte de su dotacin cromosmica, debido a un cromosoma extra o ausente, que siempre se asocia con una deficiencia en

el desarrollo fsico, mental o ambos. Es lo opuesto: en el juego de cromosomas aparece uno o ms cromosomas concretos como copias extra, o bien falta alguna copia. La trisoma significa que hay 3 copias de un cromosoma concreto en las clulas que, por lo que se refiere a los dems cromosomas, es diploide.

Ejemplos:

1. 49,XY,+2,+3,+15,-16,+18,-19 2. 46,Y, +4,-11,+21 3. 48,XYY,+2-15 Explique tres mecanismos por los cuales se pueden producir trisomas y monosomas en un individuo. Realice una representacin grfica de las siguientes alteraciones estructurales
Isocromosomas: Es un cromosoma anormal en el que se ha perdido un brazo y el otro se ha duplicado
de manera especular, dando lugar a una monosoma parcial debido al brazo perdido, y a una trisoma parcial, debido al brazo duplicado.

Dicentricos:

Duplicaciones:

Inserciones:

Anillos

BIBLIOGRAFA
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