CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS e PROTENAS

OBJETIVO Com estes testes pretende-se observar reaes caracteristicamente coradas devido presena de certos grupos qumicos nos aminocidos e existncia de ligaes peptdicas nas protenas.

INTRODUO As protenas podem desdobrar-se por hidrlise em aproximadamente 20 aminocidos. Utilizando reagentes que coram aminocidos de modo caracterstico possvel identificar a presena de alguns desses aminocidos. Os aminocidos apresentam todas as reaes qumicas caractersticas de compostos que possuem grupos amina e carboxila (Fig. 1), mas isso deixa de acontecer, no entanto, quando os aminocidos se unem por ligaes peptdicas (Fig. 2).

Figura 1: Frmula geral de um aminocido

10

Figura 2: Ligao peptdica

As protenas so polipeptdios constitudos por cinquenta ou mais resduos de L- -aminocidos, sendo constituintes fundamentais da clula onde desempenham funes diversas. Podem ser caracterizadas a diferentes nveis. Fisicamente podem ser, globulares (se solveis na gua) ou fibrosas (se insolveis na gua). Podem ser classificadas estruturalmente como primrias, secundrias, tercirias ou quaternrias. Quanto ao seu estado de associao podem ser consideradas conjugadas se estiverem associadas a substncias no proticas, ou simples se no estiverem associadas a essas substncias no proticas. O fato de a maioria das protenas ser solvel em gua poder ser atribudo s interaes que se estabelecem entre as molculas de gua e os grupos polares e/ou ionizados das molculas proticas. Qualquer agente que altere a constante dieltrica ou fora inica de uma soluo aquosa influencia a solubilidade das protenas, resultando na precipitao quando as foras de

10

atrao protena-gua so excedidas pelas foras de coeso entre as diferentes molculas proticas. No intuito de caracterizar aminocidos e protenas podem realizar-se vrias reaes coradas. A reao da ninhidrina usada na deteco de aminocidos por ser caracterstica da funo amina primria. A ninhidrina (Fig. 3) um poderoso agente oxidante que reage com -aminocidos, entre pH 4 e 8, originando um composto prpura, que no apresenta sempre a mesma intensidade de colorao.

Figura 3: Complexo formado na reao da ninhidrina. No que se refere reao do Biureto (Fig. 4) este detecta a presena de ligaes peptdicas. Os compostos com duas ou mais ligaes peptdicas tomam uma colorao violeta, devido ao complexo entre cada on de cobre e quatro tomos de nitrognio (dois de cada ligao). A intensidade da cor varia com a concentrao de protenas.

10

Figura 4: Complexo formado na reao do biureto. As protenas na sua forma natural so chamadas de nativas. Qualquer alterao na sua estrutura original designa-se de desnaturao. Esta pode ocorrer com uma extenso varivel, e se resultar numa alterao profunda de configurao haver perda da sua atividade pois a funo de uma protena depende das suas caractersticas conformacionais especficas. PARTE EXPERIMENTAL Reao da ninhidrina Procedimento: Identificar os 5 tubos de ensaio. Adicionar 2,0 mL de gua destilada no tubo 1; 2,0 mL de soluo de glicina 0,1% no tubo 2; 2,0 mL de soluo de casena 2,0 % no tubo 3; 2,0 mL de soluo de fenilalanina 0,1 % no tubo 4; e, 2,0 mL de soluo de glicose 1 % no tubo 5. Acrescentar em cada tubo de 5 a 10 gotas de soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona.

Aquecer em Banho-Maria 60C, se necessrio. Observar as cores formadas e anotar os resultados.

10

Reao do biureto Procedimento: Identificar os tubos Adicionar 1 mL de soluo de glicina a 0,1 % no tubo 1, 1 mL soluo de gelatina a 1,0 % no tubo 2, 1 mL de soluo de casena a 2,0 % no tubo 3, 1 mL de Leite no tubo 4, 1 mL de soluo de ovoalbumina a 2,0 % no tubo 5. Acrescentar em cada tubo 1 mL do reagente de biureto, agitando continuamente. Observar aps alguns minutos. Explicar. Materiais (POR BANCADA)

12 tubos de ensaio Estante para tubos de ensaio Soluo de glicose a 1 % Soluo de fenilalanina 0,1 % Soluo de glicina a 0,1 % Soluo de gelatina a 1,0 % Soluo de casena a 2,0 % Soluo de ovoalbumina a 2,0 % Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona (10 mL) em frasco conta-gotas.

BANCADA GERAL:

Banho Maria a 60oC 200 mL Leite Tubos excedentes

10

REAO XANTOPROTICA
OBJETIVO Caracterizar os aminocidos aromticos. INTRODUO O benzeno reage lentamente com o cido ntrico (HNO3) concentrado para dar o nitrobenzeno. Essa reao pode ser acelerada mediante aquecimento. Assim, aminocidos que apresentem anel benznico em sua cadeia lateral (assim como protenas ou peptdeos que possuam esses aminocidos em sua constituio) podem reagir com o cido ntrico originando um composto amarelo.

Figura 1: Alguns aminocidos aromticos.

Observao: a colorao amarela existe em meio cido. Se deixarmos o meio mais alcalino, ser observada uma colorao vermelho-alaranjada.

10

Figura 2: Desenvolvimento da reao xantoprotica.

PARTE EXPERIMENTAL - Numerar os tubos de ensaio e preparar a seguinte bateria: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 2 2 2 2 2 2 2 mL mL mL mL mL mL mL da da da da da de de soluo de ovoalbumina 2% soluo de fenilalanina 1% soluo de tirosina 1% soluo de triptofano 1% soluo de glicina 1% gua destilada amostra

- A cada tubo de ensaio adicionar 10 gotas de cido ntrico (HNO3) concentrado. - Ferver, com cuidado, por dois minutos em banho-maria 100 oC; - Aps esfriar, adicione, gota a gota, 2 mL da soluo de NaOH 12M; - Misture, observe e anote os resultados. O desenvolvimento de colorao amarela em meio cido e vermelhoalaranjada em meio alcalino indica que os aminocidos da amostra apresentam o anel benznico em sua estrutura. Material a) Reagentes e solues cido ntrico (HNO3) concentrado soluo de NaOH 12 N soluo de ovoalbumina 2% soluo de fenilalanina 1% soluo de tirosina 1% soluo de triptofano 1% b) Vidraria e instrumental - 06 tubos de ensaio - pipetadores de 1 mL - conta-gotas

- soluo de glicina 1% - gua destilada - soluo de amostra desconhecida

10

Reaes de Precipitao de Protenas

OBJETIVO Caracterizar a estrutura tridimensional das protenas. INTRODUO As protenas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que est relacionada com suas propriedades fsicas e biolgicas. A modificao na estrutura tridimensional nativa de uma protena, com a conseqente alterao de suas propriedades conhecida como desnaturao. A desnaturao envolve alteraes nas estruturas quaternria, terciria e secundria de protenas, mas no da primria.

Figura 1: Estrutura tridimensional de uma enzima, a hexoquinase.

A desnaturao, usualmente decresce a solubilidade das protenas. A diminuio da solubilidade pode ser explicada pela exposio de radicais

10

hidrofbicos e outros que prejudiquem a interao protena-gua e favoream a interao protena-protena. A desnaturao o evento primrio e importante. A floculao e a coagulao, que muitas vezes so confundidos com desnaturao de protenas, so simplesmente manifestaes visveis das alteraes estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vrios agentes desnaturantes de protenas, tais como: calor, cidos, lcalis, solventes orgnicos, solues concentradas de uria e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alteraes que se observam em decorrncia da desnaturao protica, pode-se citar: diminuio da solubilidade, perda de atividade biolgica (por exemplo, da ao enzimtica, da ao hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptdica, alteraes na viscosidade e coeficiente de sedimentao, etc. As precipitaes, alm de serem utilizadas para caraterizar a presena de protenas em soluo, tambm so teis para proceder a desprotenizao de lquidos biolgicos para anlise de componentes no proticos. 01) Precipitao por Ao do Calor A estrutura terciria de uma protena mantida por interaes

hidrofbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio aquoso, procurando se agruparem no interior do glbulo protico, pelas atraes inicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas ou ainda pelas Foras de Van der Waals. Ao fornecer energia a um meio aquoso contendo protenas, atraes entre os radicais so desfeitas e a protena "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais apolares que estavam contidos no seu interior. Isto que leva desnaturao. 02) Precipitao por reao com os reagentes para alcalides

10

Determinados agentes, como os reagentes para alcalides podem ser usados na precipitao de protenas, o que til na desproteinizao de materiais biolgicos, como o sangue: nions de cidos complexos (tricloroactico, tnico, fosfotngstico) formam sais insolveis onde a protena funciona como ction. 03) Precipitao por Reao com Sais de Metais Pesados A adio de sais de metais pesados, tais como mercrio, chumbo, cobre e zinco, levam formao de sais denominados "quelatos" entre os aminocidos cidos e estes metais. A protena precipita porque estes sais so insolveis em gua e tambm porque, com a quebra das ligaes inicas, os aminocidos hidrofbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. 04) Precipitao por Ao de Solventes Orgnicos A adio de solventes orgnicos, como o etanol, ter etlico e acetona, s solues aquosas de protenas pode levar precipitao das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dieltrica inferior da gua. Solventes orgnicos em baixas temperaturas (0 C ou menos) so teis para a separao de misturas proticas, porque as protenas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturao. Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgnicos podem levar desnaturao por romperem pontes de hidrognio e interaes apolares, importantes na manuteno da conformao protica. A gua tem uma alta constante dieltrica, assim a fora de atrao entre molculas proticas contendo radicais com cargas opostas baixa, predominando a interao protena-gua em vez da interao protena-protena. A adio de solventes, pode inverter esta situao, levando agregao e precipitao das molculas proticas.

10

05) Solubilizao (Salting In) A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas, uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como na valncia de ctions e nions que formam o sal. Em concentrao reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas protenas, um fenmeno denominado salting-in, provavelmente devido interao da protena com os sais causando diminuio da interao protenaprotena e, portanto, aumentando a solubilidade.

06) Precipitao (Salting Out) As protenas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturao por ao de solventes orgnicos, como foi explicado anteriormente, variao do pH e por alteraes da fora inica do meio. A variao do pH pode ser usada para precipitar protenas no seu ponto isoeltrico, pH no qual a repulso eletrosttica entre as molculas mnima. Este efeito denominado de salting- out. As protenas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas caractersticas estruturais nativas por uma variao de pH acima ou abaixo do ponto isoeltrico.

PARTE EXPERIMENTAL Reaes de precipitao de protenas com desnaturao 01) Reao de precipitao por aquecimento Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir: TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 %

10

TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 1 ponta de esptula de ovoalbumina em p. Aquecer os tubos de ensaio, um a um, diretamente na chama e observar os resultados. 02) Reao de precipitao com reagentes para alcalides Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir: TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5% Adicionar a cada um dos tubos, 1 mL de cido . Agitar brevemente e deixar os tubos em repouso. Observar.

03) Reao de precipitao com sais de metais pesados Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir: TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 % TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5% Adicionar 1ml de acetato de chumbo a 5% a cada tubo de ensaio. Observar. 04) Reao de precipitao por ao de solventes orgnicos Preparar os 3 tubos de ensaio a seguir: TUBO 1 - 2 mL de soluo de ovoalbumina 10 %

10

TUBO 2 - 2 mL de glicose 5% TUBO 3 - 2 mL de soluo de casena 0,5% Adicionar 2 mL de lcool etlico a cada tubo de ensaio. Observar. Se necessrio refazer os tubos e adicionar 2 mL de xilol a cada tubo. Observar. 05) Efeito da fora inica sobre a solubilidade da ovoglobulina - Salting in Colocar 5 mL de soluo de ovoalbumina 10% juntamente com 2 mL de gua destilada em um bquer pequeno. Agitar esta soluo com um basto de vidro at o aparecimento de um precipitado . Em seguida adicionar soluo de cloreto de sdio 2% cerca de 2 mL at redissoluo do precipitado. 06) Salting out Com o auxlio de uma pipeta adicionar 2mL da soluo anterior (salting in) em um tubo de ensaio. Posteriormente, acrescentar 2 mL de soluo saturada de sulfato de amnio (NH4)2SO4 at a percepo de um precipitado de protenas. Ento juntar 4 a 6 mL de gua destilada e observar os resultados.

MATERIAL a) Reagentes: Soluo de ovoalbumina 10% em gua. Soluo de casena 0,5 % em gua. Soluo de glicose 5% em gua. Ovoalbumina em p. cido tricloroactico 10%. Acetato de chumbo 5%. lcool etlico.

10

Xilol. Cloreto de sdio 2%. Soluo saturada de (NH4)2SO4 (Sulfato de amnio).

b) Equipamentos e vidrarias (por bancada) - Estante para tubos de ensaio com 12 tubos de 15 cm - Tubos de ensaio para reposio - Basto de vidro - Pipetador automtico de 1 mL - Ponteiras azuis - Bicos de Bunsen conectados ao gs - Caixa de fsforos - Bquer de 50 a 100 mL de capacidade

10

CURVA DE TITULAO DE AMINOCIDOS - GLICINA

OBJETIVO Identificao do aminocido glicina, atravs dos valores de pKas obtidos numa curva de titulao. INTRODUO A titulao de um aminocido (Fig. 1) consiste na adio gradual de uma base a uma soluo cida at atingir um pH bsico ou na adio gradual de um cido a uma soluo bsica at atingir um pH cido.

Figura 1: Titulao de aminocido.

A glicina (Fig.2) o mais simples dos aminocidos, apresentado R=H. O aminocido glicina possui dois grupos ionizveis com capacidade tamponante:

10

 -COOH/ -COO- em pH cido e -NH3+/ -NH2 em pH alcalino e duas zonas de tamponamento entre os pHs 1,3 e 3,3 (dependente do grupo carboxila) e entre os pHs 8,6 e 10,6 (dependente do grupamento amino). No pH 2,3, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo carboxila protonado ( -COOH) e 50% apresentam o grupo carboxila desprotonado ( -COO-).

Figura 2: Estrutura da glicina no ionizada.

Nestas condies, o pK igual ao pH (pK1 da glicina igual a 2,3). Da mesma forma, no pH 9,6, 50% das estruturas moleculares da glicina apresentam o grupo amino protonado ( -NH3+) e 50% apresentam o grupo amino desprotonado ( -NH2). Nestas condies, o pK tambm igual ao pH (pK2 da glicina igual a 9,6). No pH 5,9, eqidistante das duas zonas de tamponamento, h um grande predomnio da forma isoeltrica, caracterizando o ponto isoeltrico (pI) da glicina.

PARTE EXPERIMENTAL

1.

Colocar 50 mL da soluo do aminocido glicina (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH 12,0. Traar as curvas de titulao, colocando nas ordenadas os valores de pH medidos e nas abscissas os volumes correspondentes. Indicar as zonas de tamponamento, pK1 e pK2.

2. Demonstrar as estruturas inicas predominantes da glicina nos pHs 1,9; 5,5 e 10 (utilize os valores tericos).

10

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Quantidade de NaOH adicionado.

MATERIAL a) Reagentes 800 mL de glicina 0,1 M por laboratrio 1000 mL de KOH 0,5 M por laboratrio

b) Equipamentos e vidrarias (por bancada)

10

1 1 1 1

bureta 25 mL montada em suporte universal agitador magntico com peixinho pHmetro montado em suporte para titulao bquer 200 mL

SEPARAO DE AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

OBJETIVO Apresentar o mtodo cromatogrfico em papel para separao de aminocidos. INTRODUO Os aminocidos so compostos orgnicos constitudos por nitrognio, oxignio, hidrognio e carbono (podendo haver enxofre). Em um aminocido podese evidenciar um grupamento amina (NH2), um grupamento carboxila (COOH), o carbono alfa, o hidrognio e o grupo R, chamado radical, que caracteriza os aminocidos, polaridade/apolaridade formando assim duas e sua ou seja, determina interao com de a suas propriedades e os gua hidrofila/hidrofobia, aminocidos: os apolares classifica. A classificao dos aminocidos dse principalmente pela sua classes principais

(hidrofbicos) e os polares (hidroflicos). Uma maneira prtica de separar aminocidos a cromatografia em papel ascendente, este mtodo consiste na separao dos componentes de uma mistura, tendo por base a distribuio destes em duas fases, uma estacionria e outra mvel, que esto em contato, dessa forma pode-se classificar os aminocidos de acordo com suas propriedades. Procedimento

Pegar um retngulo de papel de filtro (15 X 25).

10

Fazer um risco a lpis, a 2 cm da base do comprimento do papel. 2 cm de uma das extremidades desenhar um crculo de 3 mm de dimetro. Aplicar a soluo de aminocidos cuidadosamente na linha desenhada na tira de papel com auxlio de uma pipeta pasteur. Secar com o secador de cabelos. Colocar fenol saturado de gua um bquer de 1000 mL, at formar uma camada de 1,5 mL no fundo do mesmo. Colocar o papel de filtro, com as solues de aminocidos j aplicadas. Tampar o bquer com papel alumnio. Esperar que o fenol chegue perto da outra extremidade. Remover o papel, abri-lo e marcar a frente do solvente. Pendurar o papel no varal para secar. Borrifar o papel com ninhidrina e aquece-lo at o aparecimento das manchas coloridas. Calcular o Rf dos dois aminocidos.

Cromatografia em papel Materiais (POR BANCADA) Papel de filtro Whatman 1 (retngulos de 15 cm x 25 cm) Secador de cabelos 3 pipetas Pasteur 1 bquer de 1 L de capacidade 3 tubos de ensaio 1 estante para tubos

Reagentes e Materiais (USO GERAL) Soluo de fenol saturado de gua (1000 mL) Soluo de Leucina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de Tirosina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de Glicina a 2 % em gua (50 mL) Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona (400 mL) 3 pipetas graduadas de 5 mL de capacidade 3 pras de borracha 1 grampeador

Soluo de ninhidrina 0,2 % em acetona Ninhidrida ....................................... 400 mg Acetona .......................................... 200 mL

10

Soluo de fenol saturado de gua Fenol .............................................. 100 g gua destilada ................................ 39,5 mL

FERMENTAO ALCOLICA
OBJETIVO Transformao de glicose em etanol a partir da fermentao alcolica por processo anaerbio.

INTRODUO Uma mudana qumica em matria animal e vegetal provocada por . 1) leveduras microscpicas, bactrias, ou mofos chamada de fermentao (Fig. Exemplos de fermentao so o azedamento de leite, o crescimento da massa de po, e a converso de acares e amidos em lcool. Muitas substncias qumicas industriais e vrios antibiticos usados em medicamentos modernos so produzidos atravs de fermentao sob condies controladas. O resultado da fermentao que uma substncia seja quebrada em compostos mais simples. Em alguns casos a fermentao usada para modificar um material cuja modificao seria difcil ou muito cara se mtodos qumicos convencionais fossem escolhidos. A fermentao sempre iniciada por enzimas formadas nas celas dos organismos vivos. Uma enzima um catalisador natural que provoca uma mudana qumica sem ser afetado por isto.

10

Figura 1: Bioqumica da fermentao.

A levedura comum um fungo composto de minsculas celulas tipo vegetais similares s bactrias. Suas enzimas invertase e zimase quebram acar em lcool e gs carbnico. Elas crescem o po e transformam suco de uva em vinho. Bactrias azedam o leite produzindo cidos lctico e buturico. Celulas do corpo humano produzem enzimas digestivas, como pepsina e renina que transformam comida em uma forma solvel. Os produtos de fermentao foram usados desde a antiguidade Habitantes das cavernas descobriram que a carne emvelhecida tem um sabor mais agradvel que a carne fresca. Vinho, cerveja, e po so to velhos quanto a agricultura. Queijo, que envolve a fermentao de leite ou creme outro alimento muito antigo. PARTE EXPERIMENTAL Reagentes: Caldo de cana (4000 mL), fermento biolgico para po (50 g) e accar. Aparelhagem: Balana, proveta de 100 mL, densmetro, balo de fundo chato de 3000 mL, sistema de destilao fracionada (bales de 1000 mL e 500 mL), Funil de Buchner e Kitassato. Determinao da densidade do caldo de cana. Colocar 100 mL de caldo de cana numa proveta, e com o auxlio de um densmetro determinar a densidade. Com o auxlio da Tabela de Stammer (em anexo), fazer a correo da densidade de modo a se obter 14 Brix (a faixa tima de graus Brix entre 12 e 14). Se estiver acima deste valor, fazer a

10

diluio, caso esteja abaixo, adicionar sacarose (acar) de modo a atingir a densidade desejada. Fermentao Aps a correo da densidade, colocar em balo de fundo chato 2000 mL de caldo e adicionar o fermento (numa relao de 2,5 g de fermento para cada 100 mL de caldo). Vedar o balo com algodo de modo a permitir que o gs carbnico produzido possa ser liberado, agitar at diluir o fermento e deixar fermentando por 24 hs. Colocar o erlenmeyer ao abrigo da luz a temperatura ambiente para que a fermentao ocorra mais rapidamente. Filtrao O caldo fermentado dever ser filtrado utilizando-se um sistema a vcuo para a retirada de partculas slidas e impurezas. Se no conseguir filtrar, centrifugar a amostra a 3500 rpm durante 5 minutos. Aps a filtrao / centrifugao, medir o volume de amostra e transferir para o balo de destilao.

Destilao fracionada Montar um sistema de destilao fracionada e colocar o material a ser destilado em balo de 1000 mL de capacidade. Na extremidade do sistema de destilao deve ser acoplado um balo de 500 mL. Ligar a manta de aquecimento, a gua do condensador e evitar que a temperatura ultrapasse 85C. Medir o volume coletado e anotar o resultado. Calcular o rendimento.

10

EXTRAO E CARACTERIZAO DE COLESTEROL DE GEMA DE OVO UTILIZANDO MTODO DE LIEBERMANN-BURCHARD

OBJETIVO Determinar a presena de colesterol na gema de ovos e discorrer sobre a importncia de se evitar o excesso de consumo de colesterol proveniente da alimentao. INTRODUO O colesterol um tipo de lipdeo (Figura 1) encontrado naturalmente em nosso organismo, fundamental para o seu funcionamento normal. O colesterol o componente estrutural das membranas celulares em todo nosso corpo e est presente no crebro, nervos, msculos, pele, fgado, intestinos e corao. Nosso corpo usa o colesterol para produzir vrios hormnios, vitamina D e cidos biliares que ajudam na digesto das gorduras. 70% do colesterol fabricado pelo nosso prprio organismo, no fgado, enquanto que os outros 30% vm da dieta.

10

Figura 1: Estrutura do colesterol

Por que importante entender o colesterol? Quando em excesso (hipercolesterolemia), o colesterol pode se depositar nas paredes das artrias, que so os vasos que levam sangue para os rgos e tecidos, determinando um processo conhecido com arteriosclerose. Se esse depsito ocorre nas artrias coronrias, pode ocorrer angina (dor no peito) e infarto do miocrdio. Se ocorre nas artrias cerebrais pode provocar acidente vascular cerebral. Portanto o colesterol alto um fator de risco para o desenvolvimento de doenas cardiovasculares. O COLESTEROL E OS ALIMENTOS O colesterol do organismo tem duas origens: a produo endgena do seu prprio corpo e o colesterol proveniente da alimentao. O corpo produz colesterol no fgado e esse colesterol produzido capaz de suprir quase toda necessidade do organismo. O restante necessrio deve ser proveniente do que voc come. O colesterol est presente em carnes, leites e derivados, manteiga e gema de ovo. Comer muitos alimentos com colesterol pode fazer seus nveis de colesterol no corpo subirem, o que conhecido por hipercolesterolemia.

10

Frutas, vegetais, e cereais no tem colesterol. No entanto, alguns alimentos que no contm colesterol podem conter gorduras trans, que fazem o seu corpo produzir mais colesterol. Alimentos com gorduras saturadas tambm fazem o seu corpo produzir mais colesterol. Mtodo de Liebermann-Burchard A reao se processa quando o cido sulfrico concentrado adicionado uma soluo de colesterol em anidrido actico. As cores produzidas variam do vermelho ao violeta e ao azul esverdeado. A cor esverdeada devida a formao de um derivado sulfnico do colesterol (Figura 2).

Figura 2: Formao do derivado sulfnico na reao de Liebermann-Burchard. PARTE EXPERIMENTAL Extrao do colesterol da gema do ovo: Colocar a gema do ovo num bquer com capacidade para 200 mL e adicionar 50 mL de uma mistura 1:1 de ter e clorofrmio. Agitar com um basto de vidro por cerca de 3 minutos e filtrar em aparato prprio. Quantificao do colesterol pelo mtodo de Liebermann-Burchard: Preparar a seguinte tabela:

10

Tubo Branco 1 2 3 4 5 Teste

Quantidades 100 L de gua 100 L de colesterol 50 mg/100 mL 100 L de colesterol 100 mg/100 mL 100 L de colesterol 200 mg/100 mL 100 L de colesterol 300 mg/100 mL 100 L de colesterol 400 mg/100 mL 100 L do extrato de gema de ovo

Reagente Cromognico 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL

Levar todos os tubos para aquecer em Banho Maria a 37oC por 20 minutos. Ler as absorbncias em espectrofotmetro a 620 m, fazer a curva padro do colesterol e achar a concentrao de colesterol na gema do ovo.

Para os tcnicos: Preparo do reagente cromognico: Para preparar o reagente cromognico, juntar 220 mL de anidrido actico, 200 mL de cido actico glacial e 30 mL de cido sulfrico concentrado.

Materiais (POR BANCADA)

08 tubos de ensaio Estante para tubos de ensaio 2 bqueres de 200 mL de capacidade 1 basto de vidro 1 suporte com funil soluo de colesterol 50 mg/100 mL cido actico glacial (2 mL) soluo de colesterol 100 mg/100 mL cido actico glacial (2 mL) soluo de colesterol 200 mg/100 mL cido actico glacial (2 mL) soluo de colesterol 300 mg/100 mL cido actico glacial (2 mL) soluo de colesterol 400 mg/100 mL cido actico glacial (2 mL) Reagente cromognico (40 mL por bancada) Pipetadores automticos de 100 uL de capacidade

10

Ponteiras

Material (GERAL) Gaze

QUANTIFICAO DA AMILASE SANGUNEA OBJETIVO Demonstrar a metodologia de doseamento da amilase sangunea. INTRODUO O soro incubado com soluo de amido tamponado em pH 7. Em contato com o iodo, a soluo de amido torna-se azulada. medida que a molcula de amido hidrolisada pela amilase o tom azulado esmaece. Dentro de certos limites, a alterao produzida na cor pelo amido degradado com o iodo proporcional concentrao de amilase no soro. PROCEDIMENTO TCNICO Preparo da soluo de iodo (uso): Transferir todo o contedo de uma ampola de iodo concentrado para um balo volumtrico de 100 mL. Lavar internamente a ampola com gua deionizada e transferir o lquido para o balo. Acertar o volume marca com gua deionizada e guardar em frasco mbar. Rotular dois tubos de ensaio com C (controle) e T (teste). Proceder como segue:

10

C T Substrato 1,0 mL 1,0 mL Incubar durante 5 minutos em banho maria (37C). Amostra 20 uL Agitar e incubar durante, exatamente, 7 minutos e 30 segundos, em banho Maria 37oC. Soluo de iodo (uso) gua destilada 1,0 mL 8,0 mL 1,0 mL 8,0 mL e T (teste)

Misturar bem e determinar as absorbncias do C (controle)

em espectrofotmetro ou fotocolormetro, em 660nm ou filtro vermelho, zerando o aparelho com gua deionizada. A cor final permanece estvel por 5 minutos, temperatura de 20-30C.

CLCULOS Amilase un./dL de soro = absorbncia C - absorbncia T absorbncia C x 800

VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Como orientao sugerimos os seguintes valores: Soro = 60 - 160 un/dL Urina = 50 - 140 un/hora SIGNIFICADO CLNICO A amilase srica apresenta-se aumentada nas pancreatites agudas e crnicas. Pode ainda estar aumentada nas condies em que o paciente portador de pseudo-cisto pancretico, perfurao intestinal com peritonite, gravidez ectpica e patologias que comprometam as vias biliares. A dosagem da

10

amilase srica utilizada como meio laboratorial diagnstico na parotidite epidmica (caxumba) que ocorre principalmente em crianas.

QUANTIFICAO DO COLESTEROL SANGUNEO

OBJETIVO Demonstrar a metodologia de doseamento do colesterol sanguneo total. INTRODUO O colesterol no soro quantificado atravs das seguintes reaes enzimticas: 1. steres de colesterol 2. Colesterol + O2 colesterol livre + cidos graxos colesterona + H2O2

3. 2H2O2 + 4 Aminoantipirina + p-Hidroxibenzoato 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O O produto formado pela oxidao da 4-Aminoantipirina (4-

Antipirilquinonimina) de colorao avermelhada e sua intensidade, diretamente proporcional concentrao de colesterol no soro. A cor vermelha, formada pela reao, medida em espectrofotmetro ou fotocolormetro, com absoro mxima em 510nm. PARTE EXPERIMENTAL Identificar 3 tubos de ensaio com B (branco), T (teste) e P (padro). Proceder como segue: B T P

10

Reagente de cor Soluo Padro Amostra

2,0mL -

2,0mL 20 uL

2,0mL 20 uL -

Misturar por agitao e incubar por 10 minutos, em banho maria, a 37oC. Retirar do banho maria e ler as absorbncias em espectrofotmetro ou fotocolormetro, a 510nm, zerando o aparelho com o branco. A cor desenvolvida permanece estvel por 60 minutos. CLCULO Colesterol (mg/dL) = Absorbncia do teste x 200 Absorbncia padro VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Em termos estatsticos, na populao brasileira adulta, em ambos os sexos, os nveis de colesterol situamse na faixa de 150-240mg/dL. O colesterol e suas fraes so componentes lipdicos de maior importncia na evoluo do quadro de aterognese. Estudos mostram relao entre o aumento da incidncia de doena coronria isqumica (DCI) e o aumento da taxa de colesterol sanguneo, determinando ento os grupos de risco. Como referncia, d-se valor no ao dado estatstico, mas sim aos nveis de colesterol srico que definam prognsticos: Colesterol mg/dL Desejvel Limtrofe Alto risco (DCI) < 200 200 - 239 > 240

SIGNIFICADO CLNICO Aterosclerose um fenmeno degenerativo que compromete as artrias de grande e mdio calibre de nosso organismo. Inicia-se precocemente, tendo papel importante na sua evoluo, determinados fatores raciais e

10

principalmente, alimentares.

Sua expresso anatmica a diminuio da luz

vascular com srias consequncias quando as leses se localizam nas artrias cerebrais ou coronarianas. Grande quantidade de lipdeos, com predominncia de colesterol, esto presentes nas leses. Estudos de Framinghan mostram uma correlao direta entre os nveis sanguneos de colesterol e as leses aterosclerticas.

10